ESTADO DE LA TÉCNICA La tilosina es un antibiótico macrólido compuesto por una lactona o anillo macrocíclico de 16 miembros al cual se unen 3 azúcares modificados : micarosa, micaminosa y micino- sa. Entre los microorganismos capaces de producir tilosina se hallan el ya mencionado S. fradiae (Seno, E. T. et al., 1977. Antimicrob. Agents. Chemother. 21,758), S. rimosus (Pape, H. and Brillinger, R. H. 1973. Arch. Microbiol. 88, 25-35) y S. hygroscopicus (Jensen, A. L. et al., 1964. In : Antimicrobial agents and chemotherapy-1963, J. C. Sylvester ed., American Society for Microbiology, Washington D. C.).

Para la producción industrial de tilosina se emplea S. fradiae.

El estudio de la ruta de biosíntesis de tilosina ha determinado la existencia de al menos 13 loci implicados (Fishman, S. E. et al. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8248-8252) ; Merson-Davies, L. A. and Cundliffe, E., 1994.

Mol. Microbiol. 13 (2), 349-355 ; Gandecha, A. R. and Cundliffe, E. 1997. Gene 184,197-203), demostrándose ade- más la localización de todos ellos en un agrupamiento o cluster genético que ocupa alrededor de 85 kilobases del genoma de S. fradiae.

La biosíntesis de tilosina comienza por la formación del anillo macrocíclico, mediante un proceso similar al de la biosíntesis de ácidos grasos, pero que difiere de este último en la gran variedad de precursores aislados que pueden incorporarse y en la parcial o total ausencia de reacciones que reducen el grupo p-cetónico formado después de cada extensión de la cadena. El anillo macrocíclico está compuesto por 2 acetatos, 5 propionatos y un butirato. La actividad enzimática encargada de sintetizarlo, denominada poliquétido sintasa, se halla codificada por el gen tylG.

La secuencia de reacciones subsiguientes que conducen al producto final, asi como algunas de las enzimas que par- ticipan en dichos procesos han sido caracterizadas mediante idiotrofías, utilizando mutantes bloqueados en uno o más pasos de la ruta biosintética (Cox, K. L. et al. 1986.

Journal of Natural Products 49 (6), 971-980). Dichas reac- ciones son las siguientes : (I) adición de micaminosa en la posición 5-OH del anillo macrólido para formar 0-micamino- siltilactona ; (II) oxidación del grupo metilo en C-20 para formar 20-dihidro-23-deoxi-0-micaminosiltilactona ; (III) oxidación del hidroximetil en C-20 a grupo formil para pro- ducir 23-deoxi-O-micaminosiltilactona ; (IV) oxidación del

grupo metilo en C-23 a hidroximetil para formar un 0- micaminosiltilonolido ; (V) adición de 6-desoxialosa al grupo OH en C-23 del anillo macrólido para formar demetil- lactona ; (VI) adición de micarosa al 4'OH de la micaminosa para formar demetil-macrocina ; (VII) metilación del 2"'OH de la 6-desoxialosa para formar macrocina y (VIII) me- tilación del 3'''OH de la 6-desoxialosa para dar lugar a tilosina.

Por otra parte, se ha observado que al fermentar industrialmente cepas superproductoras de tilosina desarro- lladas por métodos convencionales de mutagénesis, junto con tilosina se acumulan una serie de compuestos precursores.

Particularmente importantes son las cantidades detectadas de macrocina, compuesto precursor inmediato de tilosina. La actividad enzimática que interviene en este último paso biosintético se denomina macrocina-O-metiltransferasa (MOMT) y está codificada por el gen tylF. La introducción de copias adicionales del gen tylF en S. fradiae origina una reducción de los niveles de macrocina en los caldos de fermentación (Seno, E. T. and Baltz, R. H. 1982.

Antimicrob. Agents Chemother. 21,758-763). De igual modo, la introducción de copias adicionales de genes implicados en la biosíntesis de tilosina podría contribuir a un incremento en los niveles de producción del antibiótico.

Durante los últimos 50 años, el descubrimiento de nue- vos antibióticos para el tratamiento de enfermedades en humanos, animales o plantas se ha conseguido fundamental- mente mediante el aislamiento de nuevos microorganismos productores. Sin embargo, desde finales de la década de los 70, el ritmo de descubrimiento de nuevos compuestos ha de- caído notablemente. Este hecho, junto con el rápido incre- mento en la aparición de microorganismos patógenos resis- tentes a algunos de los antibióticos tradicionalmente em-

pleados, ha obligado a diseñar vías alternativas para el desarrollo de nuevos antibióticos. Una de dichas vias con- siste en la biosíntesis de nuevos antibióticos mediante la manipulación, por técnicas de ADN recombinante, de genes del metabolismo secundario implicados en la biosíntesis de antibióticos. Este nuevo campo de experimentación está permitiendo la obtención de nuevos compuestos que mejoran las propiedades de los antibióticos tradicionalmente cono- cidos, aumentando su espectro de acción y mejorando tanto la efectividad como la tolerancia de los mismos.

La técnica, denominada biosíntesis combinatoria, ha permitido la biosíntesis, entre otros compuestos, de aná- logos de eritromicina y antibióticos peptídicos, de deri- vados de espiramicina y tilosina, asi como de numerosos metabolitos aromáticos y reducidos mediante la manipulación de genes que codifican para poliquétido sintasas (Madduri, K. et al. 1998. Nature Biotechnology 16 : 69-74). Este nuevo enfoque ha sido utilizado para la producción de isovaleril espiramicina por cepas de Streptomyces ambofaciens en las que se ha expresado el gen carE de Streptomyces thermotole- rans, el cual codifica para la actividad enzimática desoxi- hexosa 0-aciltransferasa. Esta enzima provoca la conversión del grupo 4 -hidroxilo del residuo micarosa de la espira- micina en su isovaleril éster (Epp, J. K. et al. 1989. Gene 85 : 293-301). Asimismo, la producción del compuesto anti- tumoral 4'-epidoxorubicina ha sido descrita en una cepa de Streptomyces peucetius en la que se ha inactivado el gen dnmV y se han introducido los genes avrE y/o eryBIV de Streptomyces avermitilis y Saccharopolyspora erythraea res- pectivamente (Madduri, K. et al. 1998. Nature Biotechnology 16 : 69-74).

La introducción de los genes biosintéticos de tilosina descritos en la presente invención en microorganismos pro- ductores de antibióticos macrólidos o relacionados, puede ser usada para la producción de nuevos antibióticos híbridos. De este modo, los genes implicados en la biosín- tesis de los azúcares incluidos en la molécula de tilosina (micarosa, micaminosa y micinosa) podrían ser introducidos en microorganismos productores de antibióticos macrólidos para conseguir biosintetizar antibióticos híbridos. Más concretamente, genes responsables de la biosíntesis de micinosa expresados en un microorganismo productor de eri- tromicina posibilitarán la producción de micinosil deriva- dos de eritromicina.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En la presente invención se utiliza el actinomiceto S. fradiae ATCC 19609 tanto como fuente de ácido desoxirribo- nucleico (en lo sucesivo referido como ADN) como de ácido ribonucleico (en lo sucesivo referido como ARN). Con la finalidad de clonar y caracterizar el extremo izquierdo del agrupamiento de genes biosintéticos de tilosina de S. fradiae ATCC 19609, se construyó una genoteca en el vector fágico lambda-GEM12 (Promega) de acuerdo con procedimientos standard (Sambrook, J. et al. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Para ello se purificaron a través de un gradiente de saca- rosa fragmentos de ADN de 17-20 kb procedentes de diges- tiones parciales Sau3AI. Dichos fragmentos se ligaron a los brazos del fago lambda-GEM12 obtenidos mediante digestión BamHI y purificados a través de un gradiente de sacarosa.

Las reacciones de ligación se encapsidaron con el kit Giga-

pack II Gold (Stratagene) y seguidamente se infectaron en E. coli NM539 obteniendo alrededor de 35. 000 ufps. El ras- treo de la genoteca se realizó con un oligonucleótido sin- tético (5 GCTCGATGTAGAGATCG 3 ) diseñado en función de la secuencia nucleotídica del gen tylF previamente descrita (Fishman, S. E. et al. 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 8248-8252 ; Cox et al. 1987. European Patent Specification 0238323B1). De esta forma se consiguieron purificar una serie de clones portadores de un inserto que hibridaba específicamente con el oligonucleótido anteriormente men- cionado. El plásmido pALF1A (figura 2) se construyó mediante subclonación de un fragmento SacT de 11, 5 kb en pBluescript I KS (+). Asimismo, se purificó un fragmento PvuII, el cual incluía tanto inserto del fago recombinante como una parte perteneciente al brazo del vector lambda- GEM12. Una vez eliminada la parte correspondiente a lamda- GEM12, se subclonó el fragmento resultante (aproximadamente 16 kb) en pBluescript II SK (+) dando lugar al plásmido pALF2A (figura 2). La cepa E. coli DHSa portadora del plásmido pALF2A ha sido depositada con fecha 19. 06. 1998 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjasot, 46100 BURJASOT (Valencia) con el número de acceso CECT 5060.

El plásmido pALF1A se propagó en la cepa E. coli DH5a con objeto de obtener, mediante el procedimiento de lisis alcalina (Sambrook, J. et al. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press), suficiente cantidad de ADN para los procesos sucesivos. La localización del gen tylF se determinó mediante hibridación por la técnica de Southern del oligonucleótido sintético anteriormente mencionado (S'GCTCGATGTAGAGATCG 3') con di- gestiones del plásmido pALF1A con una serie de endo-

nucleasas de restricción. El gen tylF se identificó en un fragmento BamHI de 5, 7 kb y en otro BglII-BamHI de 4, 1 kb.

Asimismo, se elaboró un mapa de restricción preliminar de la zona (figura 2), el cual se utilizó como base para el proceso de secuenciación. La determinación de la secuencia de nucleótidos (ejemplo 1) de un fragmento de 12. 905 pares de bases (en adelante referido como pb) mostró la exis- tencia de 11 marcos abiertos de lectura (en adelante refe- ridos como ORF), de los cuales 10 pertenecen al cluster biosintético de tilosina. A continuación se abordó la tarea de construir plásmidos recombinantes que incluyen uno o va- rios de los genes comprendidos en esa zona, utilizando el plásmido bifuncional E. coli - Streptomyces spp. denominado pULVK99 (Chary VK, et al. 1997. Appl Environ Microbiol 63 : 2977-2982). Mediante digestión del DNA correspondiente a los fagos recombinantes previamente purificados con las endonucleasas de restricción SacI, BglII, BamHI, PvuII o Xhol se obtuvieron fragmentos de ADN que fueron subclonados en el vector pULVK99. De esta forma se obtuvo el plásmido pALFIB, el cual incluye la región secuenciada completa (fi- guras 2 y 3). Tomando como base el mapa de restricción pre- viamente elaborado, el fragmento BamHI de 5, 7 kb fue sub- clonado en el vector pULVK99 dando lugar al plásmido pALF287 (figuras 2 y 4). Los plásmidos, pALF287 ó pALFlB, los cuales contienen una serie de genes biosintéticos de tilosina, se introdujeron en la cepa de colección S. fradiae ATCC 19609 y en las cepas superproductoras de tilosina S. fradiae 302 y S. fradiae 455, consiguiéndose una disminución en los niveles acumulados de macrocina y un incremento en el nivel de producción de tilosina respecto de las cepas parentales.

Asimismo se construyó el plásmido pALF250 (figura 5), el cual esta formado por pULVK99 más un fragmento de ADN de

aproximadamente 1, 4 kb que contiene el gen trlB, deter- minante de resistencia a tilosina de S. fradiae. pALF250 se introdujo mediante transformación en células hospedantes de S. lividans ATCC 1326 y S. parvulus DSM 40048, utilizando el marcador de resistencia a tilosina como método selectivo para mantener el plásmido pALF250 autónomamente en dicho hospedador. Los transformantes de S. lividans portadores de dicho plásmido se seleccionaron empleando concentraciones de tilosina de 250 a 500 ag/ml, aunque algunos de ellos eran capaces de crecer en concentraciones de 3, 5 mg/ml, siendo la concentración mínima inhibitoria de tilosina para S. lividans sin transformar de 200 pg/ml. Por su parte, los transformantes de S. parvulus eran capaces de crecer en concentraciones de 200 tg/ml de tilosina, siendo la concen- tración mínima inhibitoria de tilosina para S. parvulus sin transformar de 100 g/ml. Este nuevo marcador de resis- tencia es de gran utilidad, ya que el número de marcadores genéticos seleccionables en Streptomyces spp. no es muy amplio y el empleo del gen tlrB expande ese restringido campo.

La presente invención se ilustra con más detalle en los ejemplos siguientes.

EJEMPLO 1 Clonación y secuenciación de un fragmento de ADN corres- pondiente al extremo izquierdo de cluster biosintético de tilosina de S. fradiae.

Con la finalidad de secuenciar el extremo izquierdo del cluster de biosíntesis de tilosina se subclonaron en los vectores pBluescript I KS (+) y pBC KS (+) los siguientes

fragmentos de ADN (figura 2) : (1) fragmento BglII de 5, 5 kb que dio lugar a los plásmidos pALF17 y pALF18 (ambas orientaciones del mismo inserto) ; (II) fragmento BamHI de 5, 7 kb que solapa con el anterior e incluye el gen tylF y que dio lugar a los plásmidos pALF32 y pALF33 ; (III) fragmento BamHI de 1 kb adyacente al anteriormente mencionado de 5, 5 kb que dio lugar a los plásmidos pALF13 y pALF15; (IV) fragmento BamHI de 2, 1 kb adyacente al ante- rior que dio origen a los plásmidos pALF14 y pALF20. Poste- riormente, los plásmidos pALF17 y pALF18 fueron subdivi- didos en fragmentos menores empleando los 2 sitios de res- tricción BamHI y el sitio único SacI. Los fragmentos resul- tantes fueron subclonados en el vector pBluescript I KS (+) dando lugar a los plásmidos siguientes: pALF71, pALF72, pALF73, pALF74, pALF76 y pALF77 (figura 2). Asimismo, el plásmido pALF32 fue digerido doblemente con las enzimas BamHI y BglII, los fragmentos obtenidos (de 4, 1 kb y 165 pb) fueron subclonados en pBluescript II KS (+). Los plásmidos obtenidos se denominaron pALF2 y pALF10 (fragmento de 4, 1 kb) y pALF21 (fragmento de 165 pb) (figura 2). Además, mediante el empleo de enzimas de restricción se obtuvieron dos nuevos plásmidos, pALF16 y pALF267. El primero cubre el sitio de restricción BamHI que separa el fragmento BglII-BamHI de 4, 1 kb y el fragmento BamHI de 1 kb y el segundo hace lo propio sobre el sitio BamHI que separa este último del fragmento BamHI de 2, 1 kb (figura 2).

Los plásmidos mencionados anteriormente, se propagaron en E. coli DH5a y seguidamente se abordó la tarea de obte- ner clones de secuencia apropiados con el kit comercial "Erase a base" (Promega), generando deleciones secuenciales de alrededor de 300 a 500 pb. Todos los plásmidos así

obtenidos fueron introducidos en E. coli WK6 con el fin de convertirlos en ADN de cadena sencilla con ayuda del fago M13K07 de acuerdo con técnicas standard (Sambrook, J. et al. 1989. Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Los plásmidos de cadena sencilla se emplearon como molde para las reacciones de se- cuenciación por el método de los didesoxinucleótidos (San- ger, F. et al. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. 74 : 5463-5467) utilizando el kit comercial"Sequenase 2. 0" (U. S. Bio- chemicals) y el isótopo 35S . El conjunto de todos los clones secuenciados se agrupó finalmente en una secuencia con- tinua de ADN de 12. 905 pb. (SEQ ID NO : 1 y su hebra complementaria SEG ID NO : 2). Mediante su análisis con el programa GENEPLOT (DNASTAR), empleando un patrón de uso de codones apropiado para Streptomyces spp., se detectó la presencia de 11 ORFs, los cuales se corresponden con los siguientes genes : ORF1 con el gen ddcA, ORF2 con el gen tlrB, ORF3 con el gen tylN, ORF4 con el gen tylE, ORF5 con el gen tylD, ORF6 con el gen tylH2, ORF7 con el gen tylHl, ORF8 con el gen tylF, ORF9 con el gen tyl0, ORF10 con el gen tylP y ORF11 con el gen tylQ.

EJEMPLO 2 Transformación de S. fradiae.

La preparación de protoplastos de S. fradiae se realizó inoculando 50 ml de medio TSB suplementado con 0. 4% de glicina y 5 mM de MgCl2, en un matraz de 500 ml, con una suspensión de esporas de la cepa a transformar. El micro- organismo se creció a 30°C y 250 r. p. m. durante 48 horas. Transcurrido ese tiempo, el micelio se recogió por centri- fugación a 3. 000 r. p. m. durante 7 minutos a temperatura

ambiente en dos tubos Sorvall SS34. El sedimento se lavó con 25 ml de sacarosa 10%, centrifugando en las condiciones anteriores. El sedimento procedente de 25 ml de cultivo se resuspendió en 5 ml de buffer P conteniendo 1 mg/ml de lisozima y se añadieron bolas de vidrio de 0. 4 mm de diámetro. El resto del cultivo puede congelarse a -20°C, resuspendido en 25 ml de sacarosa 10%, para ser utilizado en posteriores transformaciones. El micelio resuspendido en el buffer P se incubó a 19°C agitando periódicamente el tubo para homogeneizar el micelio con las bolas de vidrio.

La incubación se prolongó hasta que se observó al microscopio que una gota de suspension del micelio se liso completamente al añadir una gota de una solución de SDS al 10%. Finalizada la formación de protoplastos, se añadieron 5 mi más de buffer P y se filtró toda la suspensión a través de un algodón estéril, recogiéndose los protoplastos en un nuevo tubo de centrífuga. El filtrado se centrifugó a 2. 500 r. p. m. durante 15 minutos a temperatura ambiente para sedimentar los protoplastos y eliminar la solución de lisozima. El sedimento se resuspendió en la gota de buffer que quedó después de centrifugar. Este proceso se repitió resuspendiendo los protoplastos en 5 ml de buffer P y volviendo a centrifugar como en el punto anterior. Al eli- minar el sobrenadante se resuspendieron los protoplastos en un volumen de buffer P determinado de acuerdo con el vo- lumen del sedimento (nunca en más de 2 ml). Posteriormente, se repartieron en alícuotas de 200 pl, las cuales se alma- cenaron congeladas a -80°C.

El proceso de transformación comenzó por descongelar en un baño a 37°C una de las alícuotas de la suspensión de protoplastos. Seguidamente, se añadió 1 tg del ADN que pre- tendíamos introducir y se mezcló mediante agitación suave

del tubo, añadiendo inmediatamente después 500 pl de PEG 50% disuelto en buffer P. Seguidamente, el contenido del tubo se mezcló mediante inversiones rápidas y la mezcla de transformación se incubó durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se plaquearon 5 ml de R5 soft (medio R5 conteniendo 0. 6-1% de agar), con los protoplastos transformados (protoplastos, ADN y PEG), en 1-2 placas Petri de medio R5. Dichas placas se incubaron a 30°C durante 20-27 horas y seguidamente se añadieron a cada placa 3 ml de medio SNA (Hopwood, D. A. et al. 1985. Genetic manipulation of Streptomyces. A laboratoty Manual. The John Innes Foundation) conteniendo una concentración del antibió- tico deseado del orden de 7 veces superior a la concentra- ción final deseada en la placa (el antibiótico debe difun- dir por toda la placa, y por tanto, ha de tenerse en cuenta el volumen final que tendremos después de añadir el agar de selección). En el caso de utilizar tiostreptona se añadió a una concentración final de 50 pg/ml, mientras que cuando se utilizó tilosina se añadió a una concentración final de 500 pg/ml para S. lividans y de 200 g/ml para S. parvulus. Por último, se incubaron las placas a 30°C durante 5 a 8 dias tiempo suficiente para detectar la aparición de trans- formantes y seleccionar el fenotipo deseado.

EJEMPLO 3 Fermentación de S. fradiae.

Las cepas transformantes obtenidas mediante el proce- dimiento descrito en el ejemplo 2 fueron fermentadas de acuerdo con protocolos previamente descritos (Baltz R. H. and Seno E. T., 1981, Antimicrobial Agents and Chemotherapy

20 : 214-225 ; Cox K. L. et al. 1994. European Patent Specifi- cation 0238323B1), adicionando tiostreptona (antibiótico al que confiere resistencia el plásmido) a una concentración de 5 pg/ml. Los transformantes correspondientes a los plás- midos pALFlB (figuras 2 y 3) y pALF287 (figuras 2 y 4) mostraron incrementos significativos (10-50% dependiendo de la cepa hospedadora) en la producción de tilosina cuando se compararon con la cepa parental. Asimismo, debido a que ambos plásmidos incluyen el gen tylF, los transformantes presentaban una drástica disminución (25-50 veces) en la acumulación del precursor macrocina en los caldos de fer- mentación.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS FIGURA 1. - Región del genoma de S. fradiae que incluye el agrupamiento de genes biosintéticos de tilosina.

1: ORF1 (ddcA) 2: ORF2 (tlrB) 3: OFR3 ( tylN) 4: ORF4 ( tylE) 5: ORF5 ( tylD) 6 : ORF6 (tylH2) 7 : ORF7 (tylHl) 8: ORF8 ( tylF) 9: ORF9 ( tylO) 10: ORF10 ( tylP) 11: ORF11 ( tylQ) 12: t1rD 13 ccr 14: ty1m1 15: ty1M2 16 ORF desconocido 17: ty1G 18 : ty1I 19: ty1B 20: ty1A1 21: ty1A2 22 ORF desconocido 23: t1rC FIGURA 2. - Mapa de restricción de la región del genoma de S. fradiae que incluye el agrupamiento de genes biosintéti- cos de tilosina. En la parte inferior se muestran los dife- rentes plásmidos construidos. El inserto correspondiente a

los plásmidos pALFlA y pALF2A consiste en fragmentos de 11, 5 kb Sacl y 16 kb PvuII respectivamente, mientras que el inserto del plásmido pALF1B se corresponde con un fragmento de 12, 9 kb BglII-BamHI. Los clones que aparecen con punta de flecha son aquellos utilizados en el proceso de secuen- ciación.

1: ddcA ( ORF1) 2: tlrB (ORF2) 3: tylN ( ORF3) 4: ty1E (ORF4) 5: tylD ( ORF5) 6 : tylH2 (ORF6) 7 : tylhl (ORF7) 8: tylF (ORF8) 9: tylO (ORF9) 10: tylP (ORF10) 11: tylQ (ORF11) FIGURA 3. - Mapa de restricción del plásmido de 20, 8 kb pALF1B, el cual incluye el agrupamiento de genes biosinté- ticos de tilosina descrito en la presente invención.

FIGURA 4. - Mapa de restricción del plásmido de 13, 5 kb pALF287, el cual incluye parte del agrupamiento de genes biosintéticos de tilosina descrito en la presente inven- ción.

FIGURA 5. - Mapa de restricción del plásmido de 9, 2 kb pALF250, el cual incluye el gen de resistencia a tilosina tlrB descrito en la presente invención.