Bewegte Partikel in disperser Verteilung müssen zur Beherrschung vie- ler technischer Prozesse meßtechnisch erfaßt werden. Beispielsweise sind gerührte Suspensionen (Zell-Suspensionen in Bioreaktoren, Kri- stall-Suspensionen), Emulsionen, Aerosole, Staub, Schaum und geschüt- tete Materialien hinsichtlich der Größe und Konzentration ihrer Parti- kel zu kontrollieren.

Eine bekannte Technik dafür ist In Situ Mikroskopie (synonym mit in situ microscopy"oder"inline-microscopy"oder"in process microsco- py"), bei der die Partikel"in situ", direkt im Prozeß, mit einem Vi- deomikroskop beobachtet werden. Das Mikroskop sieht direkt in die be- wegte Partikel-Dispersion hinein, und es erzeugt bei gepulster Be- leuchtung scharfe mikroskopische Bilder bewegter Partikel in einem kleinen Probevolumen. Das Probevolumen kann mechanisch begrenzt sein.

Vorzugsweise bildet es sich aber infolge des Sichtausschnitts und der begrenzten Schärfentiefe des Mikroskops von selbst als virtuell be- grenztes Volumen heraus (vgl. DE 40 32 002 C2, EP 0 990 936 A1).

Vorteilhaft für die letztere Version des In Situ Mikroskops ist der Verzicht auf bewegliche mechanische Teile und die dadurch stark ver- minderte Störanfälligkeit. Ihr Problem ist jedoch die ungebremste schnelle Bewegung der Partikel durch das Probevolumen hindurch. Aus der Partikelbewegung resultiert eine im mikroskopischen Maßstab be- trächtliche Bewegungsunschärfe. Die Kontur eines Partikels beispiels- weise, welches sich mit einer Geschwindigkeit von 0,5 m/s fortbewegt, verwischt sich in einer us bereits um 0,5 um, was für die hochauflö- sende Mikroskopie mit Sub-Mikrometer-Auflösung grenzwertig ist. Um das Auflösevermögen des Mikroskops nicht wesentlich zu beeinträchtigen, sind nach dem Stand der Technik Beleuchtungszeiten von typisch einer us und darunter erforderlich.

Nach dem Stand der Technik bedarf es für die In Situ Mikroskopie be- wegter Partikel gepulster Lichtquellen hoher Intensität. Auf den er- sten Blick bieten sich hier gepulste Laserlichtquellen an. Nachteilig ist deren hoher apparativer Aufwand. Probleme macht auch die hohe Ko- härenz des Laserlichts. Kohärenz ruft störende Beugungsmuster im Bild des In Situ Mikroskops hervor ("Speckle"in der Bildebene), die physi- kalisch schwer zu unterdrücken sind und auch in der Bildverarbeitung nur bedingt herausgerechnet werden können, wenn denn um den Preis ver- mehrter Rechenzeit.

Kein Problem mit Specklemustern in der Bildebene des In Situ Mikro- skops hat man bei der Beobachtung von Fluoreszenzlicht. Das Fluores- zenzlicht optisch kohärent angeregter Objekte hat keine feste Phasen- beziehung und erzeugt deshalb auch keine Speckle. Doch ist es nicht in allen Fällen möglich, die in der DE 195 08 754 C2 behandelte Fluores- zenzmikroskopie anzuwenden, bei der nicht die direkt und kohärent ge- streuten Photonen des anregenden Laserlichts, sondern die spontan emittierten Fluoreszenzphotonen niedrigerer Wellenlänge beobachtet werden, die die Kohärenzbeziehung untereinander verloren haben. Nach- teiligerweise erfordert die Fluoreszenzmikroskopie wegen der sehr ge- ringen Intensität des Fluoreszenzlichts auch den aufwendigen Einsatz von Lichtverstärkern.

Die EP 0 990 936 A1 sieht als Lichtquelle für die In Situ Mikroskopie eine Elektrolumineszenzdiode (LED) vor, die mit kurzen elektrischen Strompulsen bei mehr als dem hundertfachen des Gleichstromnennwerts betrieben wird. Das von der LED emittierte Licht ist inkohärent. Es erzeugt also keine Beugungsmuster. Nachteilig ist die trotz massiver Überlastung der LED immer noch recht geringe Lichtintensität, die die Meßdynamik begrenzt. Die Lebensdauer der LED unter massiver Überla- stung ist kurz. Die EP 0 990 936 AI erwähnt zwar die Möglichkeit, das Licht der LED mit einem Lichtleiter an das Probevolumen heranzuführen.

In der Praxis blieb aber der Einsatz einer LED aus Intensitätsgründen auf Fälle beschränkt, in denen die LED unmittelbar vor dem Probevolu- men angeordnet werden konnte, um dieses direkt zu beleuchten. Nachtei- lig dabei ist die Notwendigkeit, elektrische Anschlüsse zur Ansteue- rung der LED durch die Suspension hindurchzuführen. Nachteilig ist ferner die Behinderung der freien Strömung durch den LED-Glaskörper.

Aus der DE 101 30 821 Al ist es bekannt, Laserlicht zur homogenen flä- chigen Ausleuchtung des Objektfeldes eines Mikroskops durch einen Mul- timode-Lichtleiter zu schicken, um die Kohärenz des Laserlichts aufzu- brechen und die Störeinflüsse durch Speckle so weit möglich zu verrin- gern. Es geht dort um Specklemuster in der Objektebene, die durch die räumliche Kohärenz des Laserlichts bedingt sind und die Homogenität der Ausleuchtung beeinträchtigen. Ein Anwendungsgebiet ist die Mikro- lithographie-Simulationsmikroskopie, bei der extrem glatte Oberflächen im tiefen UV betrachtet werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, eine In Situ Mikroskopsonde der eingangs genannten Art mit verbesserter Beleuchtung zu schaffen, bei der der Mikroskoptubus nur eine dünne Lichtfaser von ca. 0,2 mm Durchmesser aufzunehmen braucht, in die intensives Licht zur Bilderzeugung mit der Primärwellenlänge-also ohne Fluoreszenz-eingekoppelt wird. Speck- lemuster im Mikroskopbild sollen nicht oder nicht in nennenswertem Maß auftreten.

Gelöst wird diese Aufgabe durch eine solche Mikroskopsonde, bei der die Lichtquelle eine Superlumineszenzdiode (SLD) ist, und bei der we- nigstens ein Abschnitt des Lichtleiters von einer Multimode-Lichtfaser gebildet ist.

Grundsätzlich sind Halbleiterlaser und Superlumineszenzdioden (SLD) die natürlichen Wunschkandidaten für den Lichttransport durch eine Fa- ser, da sie ausreichend intensiv und gut gebündelt und zudem kompakt und einfach handzuhaben sind. Gemeinsam ist beiden Lichtquellen, daß sie im Gegensatz zu konventionellen Lichtquellen auf induzierter statt spontaner Lichtemission beruhen, daß sie also kohärentes Licht aussen- den, dessen Teilwellen in einer festen Phasenbeziehung stehen. Diese Eigenschaft war bisher ein Ausschlußkriterium für die direkte Bilder- zeugung (ohne Fluoreszenz), denn sie führt im Mikroskop zu kon- trastreichen Bildartefakten durch interferierendes Streulicht von nicht fokussierten Partikeln in der beobachteten Suspension (statisti- sche Beugung, Speckle in der Bildebene). Die Bilder enthalten also kontrastreiche Strukturen aufgrund von statistischen Beugungsmustern, die sich den reellen Bildern fokussierter Partikel überlagern und ihre Detektion extrem aufwendig oder unmöglich machen. Daher war bisher die Anwendung induzierter Lichtstrahlung von Laser oder SLD nicht geeignet zur Beleuchtung eines In Situ Mikroskops auf der Primärwellenlänge- trotz ihrer vorteilhaft hohen Intensität und guten Bündelung.

Die Erfindung eröffnet der In Situ Mikroskopie die Wunschkombination von Lichtfaserbeleuchtung mit intensiver induzierter Emission auf der Primärwellenlänge, indem sie durch einen technischen Kunstgriff die Strahlungskohärenz einer SLD schwächt und dadurch die Interferenzkon- traste so stark verringert, daß sie die Bilder nicht mehr stören kön- nen.

Die SLD hat eine besonders günstige Ausgangsposition für die Kohärenz- schwächung. Im Gegensatz zu einem Laser gibt es in der SLD keine Rück- kopplung des induzierten Lichtes durch Spiegel, wodurch die Phasen des emittierten Lichtes von vornherein stärker differieren können. Daher ist die induzierte SLD-Strahlung bereits in ihrer Entstehung breitban- diger und weniger kohärent als Laserstrahlung. Die Kohärenzlänge der SLD-Strahlung ist bei gleicher Wellenlänge um ca. eine Größenordnung geringer als die eines Lasers, beispielsweise Halbleiterlasers. Die SLD emittiert im Infraroten, grenzwertig sichtbaren Roten. In diesem Wellenlängenbereich können die bei der In Situ Mikroskopie mit SLD- Strahlung auftretenden Interferenzeffekte durch den Einsatz einer Mul- timodefaser soweit reduziert werden, daß Speckle das Mikroskopbild nicht oder nicht nennenswert mehr stören.

Um trotz der von Haus aus im Vergleich mit einem Laser zwar schwachen, bei direkter Einstrahlung aber störenden Kohärenz der SLD-Strahlung ungestörte Bilder eines In Situ Mikroskops zu erhalten, wird das von der SLD abgestrahlte Licht durch eine oder mehrere Multimode- Lichtfaser (n) geleitet. In Multimodefasern existieren je nach Einkopp- lungwinkel unterschiedliche Lichtwege mit unterschiedlichen Viel- fachreflexionen für die eingekoppelten Teilstrahlen. Weiter gibt es Schwankungen des Brechungsindexes, die durch mechanische Spannungen oder Temperaturgradienten ausgelöst und verstärkt werden können. Alle diese Effekte führen zu unterschiedlichen Laufzeiten der Teilstrahlen in der Faser, so daß die Phasen der Teilstrahlen sich relativ zueinan- der verschieben und neu mischen. Die ursprünglich vorhandene Kohärenz (ist gleich konstante Phasenbeziehung) geht dadurch teilweise verlo- ren. Eine Polymer-Lichtfaser mit etwa ein m Faserlänge genügt, um die Kohärenz einer SLD soweit zu schwächen, daß die Strahlung gute Bilder im In Situ Mikroskop erzeugt.

Nach alledem beruht die Erfindung auf der Erkenntnis, daß eine Multi- mode-Lichtfaser geeignet ist, die relativ geringe Kohärenz langwelli- ger SLD-Strahlung aufzubrechen, so daß in dem In Situ Mikroskopbild bewegter Partikel auf der Primärwellenlänge Specklemuster in allen- falls geringem Maß auftreten. Eventuelle restliche Specklemuster las- sen sich mit vergleichsweise unaufwendiger Bildverarbeitung eliminie- ren.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die SLD gepulst.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die SLD kontinuierlich be- trieben. Trotz der erforderlichen hohen Lichtintensität ist das mög- lich, da die SLD ihr Licht kohärent und gerichtet abstrahlt. Die Ein- kopplungsverluste in den Lichtleiter sind gering.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine SLD mit Pigtail-Aus- kopplung verwendet.

Der Lichtleiter kann eine oder mehrere Multimode-Lichtfaser (n) hinter- einander aufweisen. Letztere ist/sind vorzugsweise in einer gekrümmten Bahn verlegt. Wenigstens eine Multimode-Lichtfaser sollte unmittelbar vor dem Probevolumen enden und es beleuchten.

Die oder wenigstens eine Multimode-Lichtfaser kann aus Kunststoff be- stehen. Multimode-Lichtfasern aus Kunststoff sind recht inhomogen, so daß eine effektive Aufbrechung der Kohärenz des SLD-Lichts erreicht wird.

Die oder wenigstens eine Multimode-Lichtfaser kann aber auch aus Glas bestehen. Eine Glasfaser hat gegenüber einer Kunststoff-Faser den Vor- teil, daß sie den hohen Temperaturen beim Sterilisieren eines Bioreak- tors standhält.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform hat die Sonde eine Kamera mit Kurzzeitverschluß. Das ist sowohl bei gepulster, als auch bei kontinu- ierlicher Beleuchtung von Vorteil, um Hintergrundlicht zu unterdrük- ken.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines in der Zeichnung schema- tisch dargestellten In Situ Mikroskops näher erläutert.

Der Tubus eines In Situ Mikroskops mit einer CCD-Kamera 3 taucht mit dem frontseitigem Sichtfenster in eine gerührte Partikelsuspension 4.

Eine SLD 5 mit Pigtail 6 dient zur Beleuchtung des Probevolumens. Der Pigtail 6 ist eine vom Hersteller kompakt und unlösbar an die SLD an- gekoppelte Faser zur Auskopplung der emittierten Strahlung. Der Pig- tail 6 liefert an seinem offenen Ende intensives induziertes Licht, dessen Kohärenz bei direkter Verwendung zur Beleuchtung des Probevolu- mens Bilder mit störenden Beugungsartefakten liefern würde. Zur Minde- rung der Interferenzstörungen wird das Licht zunächst über eine Faser- kopplung 7 in eine möglichst oft gebogene Multimode-Lichtfaser 1 aus Kunststoff oder Glas eingekoppelt. Das offene Ende der Multimode- Lichtfaser 1 ist zur Beleuchtung des Probevolumens direkt davor in der bewegten Suspension positioniert. Restliche Beugungsartefakte werden durch automatische Bildverarbeitung herausgefiltert.

Kern der Erfindung ist die Vermeidung störender Beugungseffekte bei SLD-Beleuchtung eines In Situ Mikroskops, indem eine Multimodefaser ausreichender Länge eingesetzt wird, welche die Beugungseffekte ent- scheidend verringert.

Ein entscheidender Vorteil dieser Erfindung ist die erstmalige Ver- wendbarkeit induzierter SLD-Strahlung in der In Situ Mikroskopie auf der Primärwellenlänge, also ohne Fluoreszenz. Damit steht ausreichend Intensität zur Verfügung, um über Lichtfasern zu beleuchten. Die Lichtfaser ist der elektrischen Zuleitung von Energie zur Beleuchtung bei weitem vorzuziehen, weil sie eine große Vereinfachung des Aufbaus mit viel größerer Betriebssicherheit ermöglicht.

Liste der Bezugszeichen 1 Multimode-Lichtfaser 2 Tubus 3 CCD-Kamera 4 Partikelsuspen sion 5 SLD 6 Pigtail 7 Faserkopplung