【발명의 명칭】

적혈구계 세포의 인 비트로 확장 【기술분야】

본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제반호 HI 10C17400200에 의해 이루어진 것으로세 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진홍원， 연구사업명은

"보건의료기술연구개발사업 /보건의료기술연구개발사업 /보건의료기술연구개 발사업" ， 연구과제명은 "줄기세포로부터 적혈구전구세포로의 효율적 분화 및 기전 연구" ， 주관기관은 연세대학교 산학협력단, 연구기간은 2013. 04. 01 2014. 03. 31 이다.

또한 본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 HI 12C0202 에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원， 연구사업명은

"보건의료기술연구개발사업 /보건의료기술연구개발사업 /보건의료기술연구개 발사업" ， 연구과제명은 "줄기세포 분화 및 성숙 유도를 통한 골수형성이상증후군 치료제의 개발" , 주관기관은 한양대학교 산학협력단， 연구기간은 2013. 08. 01 ~ 2014. 7. 31이다.

- 본 특허출원은 2014 년 4 월 7 일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허.출원 제 10-2014-0041320 호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 본 발명은 작혈구계 세포를 인 비트로 환경에서 확장하는 방법에 관한 것이다ᅳ

【배경기술】

인구의 급속한 노령화와 의료적 수요의 증가로 인하여 수혈용 혈액의 공급이 부족해진 반면 혈액제제의 사용량은 증가하였다. 또한 광우병, 신종플루， 말라리아, 에이즈 등 질병의 창궐로 인해 감염으로부터 안전한 혈액에 대한 요구도 증가하였다. 이로 인해 국내는 물론 전 세계적으로 수혈에 필요한 혈액의 부족으로 환자 수술 및 치료에 큰 차질을 빚고 있다. 향후 혈액 부족은 더욱 심각해져서, 2030 년에는 국내 혈액필요량의 55.5%가 부족할 것이라고 예측되고 있다 (한국보건사회연구원 자료， 2005 년). 게다가 수혈로 인하여 발생될 수 있는 수혈전파감염은 수혈자에게 심각한 문제를 야기하며 이를 사전에 발견하기 위한 검사 및 시스템에 막대한 비용이 쓰이고 있지만 감염을 완벽히 검출해 낼 수 ^' 없다 [1] . 이러한 요인들로 인하여 체외에서 생산된 안전한 적혈구의 개발 필요성이 증가하였다.

우리나라에서는 연간 약 210 만 유닛 (unit)의 적혈구 제제가 사용되며 이는 한 unit 당 2X10 ¹² 세포가 있다고 계산하면 약 4X10 ¹⁸ 이상의 세포가 필요하다. 미국에서만 연간 적혈구 수혈을 대치하기 위해서는 최소한 3X10 ¹⁹ 세포가 필요하다고 한다 (15-ιτιΠΠοη units of 2X10 ¹² cells each). CHO 세포같이 잘 연구된 동물세포의 배양을 위해서는 가장 큰 바이오리액터 (bioreactor)가 20,000 L 부피에 최대 5X10 ⁷ 세포 AnL 농도의 세포로 운영할 수 있다. 이 농도라면 필요한 적혈구 생산을 위해 현 최고 기술로는 이론상 30,000 회분 (batch) 배양이 필요하다고 한다 [2] . 즉, 기존의 정치 배양 (static culture), 현탁 배양 (suspension culture), 고정층 반웅기 (fixed bed reactor), 공기리프트 반응기 (airlift reactor)와 같은 배양 조건 (cultivation condi t ion)에서 고안된 동물세포배양법이라면 천문학적인 숫자의 세포와 그에 버금가는 배지와 공간이 필요한 적혈구 배양에서는 현실적으로 적용이 불가능하다. 공간면에서 가장 효율적인 배양법은 세포끼리 서로 뭉쳐있는 (packing) 형태로 배양하는 것이지만， 아직 적혈구 생산을 위해 적아세포를 이런 방법을 배양해 보고된 바가 없다. 본 연구팀은 적혈구 생산 효율을 높이기 위하여 성숙된 적혈구 전구 세포 (erythroid progenitor cell)를 물리적으로 접촉하게 만든 세포 고밀도 조건에서 적혈구계 세포가 세포성숙， 탈핵률， 세포생존도 및 세포이형성 (myelodysplasia) 면에서 더 좋은 효과를 보임을 매개된 부착- 관련 신호 (adhesion-related signal)와 함께 증명한 바 있다 [3] . 또한 이를 3D 로 확장해 적혈구계 세포를 류브에 적층하여 배양하는 방법도 적혈구 생산에 효과적임을 보여준 바 있다. 다른 이전 연구들에서도 2D 플레이트 배양이나 3D 생물반응기 (bi oreactor )에서 전체 배지 볼륨당 세포의 농도를 높이는 시도가 있었지만， 3D 에서 세포를 적층시켜 직접적인 접촉을 유도한 것이 최초로 시도된 것이다.

골수 내에서는 적혈구 세포들끼리 서로 입체적으로 밀착하여 적혈구 모세포섬 (erythrobl as t i c i s l and)이란 공간을 만들어 성숙 및 증식하게 된다. 또한, 골수 내 이런 조혈공간이 얇은 뻐 골격 기등 (bony t rabecul ae) 내에서 구획되어 세포가 눌리는 것을 막게 된다. 본 발명에서는 이런 골수 내 환경에 착안하여 적혈구계 세포들끼리 배양하기 적절한 적층규모를 확인하였고， 이를 지지할수 있는 공극의 크기와 생체 적합한 (bi ocompat i bl e) 다양한 재질 내에서 배양하여 다공성 구조체의 적절한 공극의 규모 및 재질의 적합성을 확인하였다. 또한 3차원 적층 패킹 배양으로 인한 세포의 괴사를 줄이고 신선한 배지 공급을 위해 스핀 필터내에 세포를 적층함으로 세포 배양동안 배지의 교환 및 공급을 원활이 하여， 적혈구의 대량생산올 위한 최적화에 성공하였다. 이는 보고된 바 없는 방법으로서， 배양 공간과 배지량을 최소화 하여 인간 골수내에서와 같이 적혈구를 생산하기 위한 획기적인 방법이다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

【발명의 내용】

【해결하고자 하는 과제】

본 발명자들은 적혈구계 세포의 인 비트로 확장 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 다공성 구조체 내에 적혈구계 세포를 3차원 적층 패킹 (packi ng) 배양하는 경우， 적혈구계 세포의 인 비트로 확장이 달성될 수 있고 그 효과가 매우 우수함을 규명함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서， 본 발명의 목적은 다공성 구조체를 이용하여 적혈구계 세포를 3 차원 적층 패킹 (packing) 배양하는 단계를 포함하는 적혈구계 세포의 인 비트로 확장 방법을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

【과제 해결 수단】

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다공성 구조체를 이용하여 적혈구계 세포를 3 차원 적층 패킹 (packing) 배양하는 단계를 포함하는 적혈구계 세포의 인 비트로 확장 방법을 제공한다. 본 발명자들은 인 비트로 환경에서 적혈구계 세포를 확장하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 다공성 구조체를 이용하여 적혈구계 세포를 3 차원 적층 패킹 배양하는 방법을 통해 , 가장 효율적으로 적혈구계 세포를 인 비트로 확장할 수 있음을 규명하였다.

본 명세서 상의 "적혈구계 세포 ¹ '는 적혈구 전구세포 (erythroid progenitor cell)로부터의 성숙과정에 있는 세포들을 포함하며, 적혈구 전구세포는 다양한 소스， 예컨대 말초혈액， 제대혈 또는 골수로부터 얻을 수 있다. 적혈구 전구세포로서의 CD34 ⁺ 세포는 당업계에 공지된 다양한 세포 분리 방법, 예컨대 CD34 ⁺ 항체를 이용하는 면역자기 -비드 분리방법에 따라 분리할 수 있고, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 CD34 ⁺ 세포는 제대혈로부터 유래된 세포일 수 있다. 적혈구 전구세포는 다음과 같은 단계로 이루어진 적혈구 형성 과정 (erythropoiesis)를 거쳐 성숙한 적혈구 (erythrocyte)로 분화한다: (a) 조혈모세포 (hematopoiet ic stem ceU)에서 전적아세포 (proerythroblast)로 분화하는 단계; (b) 전적아세포에서 호염기성 적아세포 (basophilic erythroblast )로 분화하는 단계; (c) 호염기성 적아세포에서 다염기성 적아세포 (polychromatophilic erythroblast)로 분화하는단계; (d) 다염기성 적아세포에서 정염성 적아세포 (orthochromatic erythroblast )로 분화하는 단계; (e) 정염성 적아세포에서 다염성 적혈구 (polychromatic erythrocyte)로 분화하는 단계; 및 (f) 다염성 적혈구에서 적혈구 (erythrocyte)로 분화하는 단계. 본 발명은 성숙단계의 적혈구 (erythrocyte) 단계 (d, e, f 단계)에 있는 세포들을 포함하는 것이 바람직하다.

본 명세서 상에서 "적혈구 전구세포 (erythroid progenitor cell)' '는 성숙이 끝난 적혈구를 제외한 적혈구 형성 과정에 포함된 모든 세포를 의미한다ᅳ

본 명세서 상에서 "3 차원 적층 패킹 (packing) 배양"이란 적혈구계 세포를 충분히 적층 가능한 높이의 배양용기， 구체적으로 예를 들면 류브를 사용하여 적혈구계 세포를 가라앉혀 적층되도록 하여 배양하는 것을 말한다. 본 명세서 상의 "다공성 구조체 "는 수 마이크로미터 단위 내지 수 밀리미터 단위 크기의 공극을 다수 포함하는, 세포 배양을 돕기 위한 구조체를 의미한다. 본 발명의 다공성 구조체는 그 형태 및 크기에 특별한 제한이 없으며， 발명의 실시 형태 및 규모에 따라 적절히 선택 가능하다. 본 발명의 다공성 구조체는 폴리에틸렌, 실리카， 셀를로오스, DEAE- 덱스트란, 유리, 폴리스티렌 폴라스틱, 아크릴아마이드 또는 콜라겐을 포함하는 물질로부터 만들어 질 수 있지만， 이에 제한되는 것은 아니며， 세포 배양에 부정적인 영향을 주지 않는 소재를 적절히 선택하여 활용 가능하다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 다공성 구조체는 "마이크로캐리어" 또는 "스캐폴드" 구조체이다. 본 발명의 마이크로캐리어는 대략 100 ym 내지 수 隱 정도 직경을 갖는 세포 배양을 위한 .다공성 지지 구조체를 의미하고， 대략 30—500 ym 정도의 공극을 포함한다ᅳ 다수의 마이크로캐리어 단위체의 집합을 적혈구계 세포의 배양에 이용함으로써 배양 규모를 조절하는 것이 가능하다. 구체적으로 예를 들면， 본 발명의 일 실시예에서 이용한 Cytopore, Cytoline 1 을 들 수 있다. 또한 본 발명의 스캐폴드는 대략 수십에서 수백 μηι 크기의 공극을 포함하는 세포 배양을 위한 지지 구조체로서 , 다수의 단위 구조체의 집합을 이용하는 마이크로캐리어와는 달리， 배양 규모에 맞추어 직경과 높이가 조절된 일체형의 구조체를 의미한다. 본 발명의 스캐폴드는 공극 사이즈가 대략 10 ym 내지 1 麵 정도일 수 있고, 바람직하게는 30 μηι 내지 600 μηι, 더 바람직하게는 30 ym 내지 500 ym, 더욱 바람직하게는 50 μηι 내지 500 ym, 더욱 더 바람직하게는 50 ym 내지 400 um 정도 일 수 있다. 본 발명의 스캐폴드는 소재에 대한 특별한 제한이 없고, 금속， 세라믹, 합성고분자 및 /또는 천연고분자에서 선정한 소재를 자유롭게 이용가능하며， 구체적으로 예를 들면， 콜라겐, 실크 (Silk), 알지네이트 (Alginate), PE(polyethylene) , PLA(poly( lact ic acid)) , PGA(poly(glycol ic acid)) , PLA 및 PGA 공중합체, PTFE(polytetrafluoroethylene),

PVC(polyvinyl chloride) , PDMS(polydimethylsi loxane) ,

PCL(polycaprolactone) , PU(polyurethane) , 알루미나 (alumina)， 수산화아파타이트 (hydroxyapatite), 니켈， 티타늄, 코발트 -크롬 합금 및 /또는 스테인레스 스틸을 이용할 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 스캐폴드의 예로써 Honeycomb (KOKEN, Tokyo, Japan) 또는 Biomerix 3D (Biomerix, Fremont , CA 있다.

한편, 본 발명의 "다공성 구조체" 는 구조체 자체가 다공성을 내포하는 구성 뿐만 아니라 구조체 자체가 공극을 내포하지는 않지만， 구조체를 구성하는 소 단위체의 집합 형태에 있어서, 소 단위체 간의 갭 (gap)이 발생되고, 상기 갭이 다공성 구조체의 공극과 같은 역할을 하는 것이 가능한 구조체를 포함한다. 이는 매크로 다공성 구조체가 구조체의 소 단위체 자체에 공극을 내포하는 특성과 상반되지만, 소 단위체 간의 갭이 상기 공극과 같은 역할을 하여 유사한 적혈구계 세포의 적층 패킹 배양 효과를 발휘할 수 있다. 구체적으로 예를 들면 30 ym 내지 1500 μηι 의 갭이 생기기에 충분한 크기의, 소재의 제한이 없는 비드 (beads)를 이용할 수 있고， 본 발명의 일 실시예에서 이용한 마이크로캐리어 디스크 (micro carrier disk)를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 다공성 구조체는 30-1500 μιιι 크기 분포를 갖는 공극을 포함한다. 30-1500 um 크기 분포를 갖는 공극을 '포함한다'는 것은 해당 범위를 벗어나는 크기의 공극이 배제되지 않음을 내포하는 것으로 이해되며， 30-1500 μπι 의 공극 크기는 본 발명의 적혈구계 세포의 확장에 바람직한 다공성 마이크로캐리어의 공극의 크기 분포를 나타내고, 부분적으로 해당 범위를 벗어나는 크기의 공극이 존재할 수 있다. 상기 공극은 모두 동일 또는 유사 크기로 형성된 공극일 수 있으며， 30-1500 μηι 범위 내의 다양한 크기의 공극이 흔재되어 있을 수 있다. 상기 공극 크기의 하한은 적혈구계 세포가 공극 내부로 유입되어 3D 적층환경을 구성하기 위한 최소한의 크기를 의미하며， 상기 공극 크기의 상한은 골수 환경과 유사 환경을 제공하기 위하여 설정된 것이다. 상기 공극의 크기분포는 바람직하게 30—1000 μ ηι , 더 바람직하게 30-700 y m , 더욱 더 바람직하게는 30-500 μ πι , 가장 바람직하게는 50-500 u m 크기분포를 갖는다. 가장 바람직한 공극 크기분포를 갖는 경우， 적혈구계세포의 3차원 적층 패킹에 의한 우수한 배양효과가 극대화 된다. 본 발명의 일 구현예에 있어서， 본 발명의 다공성 구조체는 매크로다공성 (macroporous ) 마이크로캐리어이다. 본 명세서에서의 용어 "마이크로캐리어' '는 대략 100 μ ιη 내지 수 mm 정도 크기를 갖는 세포 배양을 위한 지지 구조체를 의미한다. 본 발명의 마이크로 캐리어는 다수의 공극을 포함하며, 포함하는 공극의 직경에 따라, 매크로다공성 (macroporous ) , 메조다공성 (niesoporous ) , 마이크로다공성 마이크로캐리어로 구분할 수 있다. 매크로다공성 구조체는 공극의 평균 직경이 대략 50 μ ηι 이상이고， 메조다공성의 경우에는 대략 2-50 y m , 그리고 마이크로다공성의 경우에는 대략 2 μ ηι 이하인 것을 말한다. 본 발명의 매크로다공성 마이크로캐리어는 평균 직경이 대략 50 u m 이상인 다수의 공극을 포함하는 마이크로캐리어를 의미한다. 본 발명자들은 적혈구계 세포의 인 비트로 확장을 위하여 매크로다공성 캐리어를 이용함이 효과적이라는 결과를 도출하였다. 매크로다공성 캐리어를 적혈구계 세포 배양에 이용하는 경우， 매크로다공성 캐리어의 공극의 크기가 적혈구계 세포가 3 차원 적층 패킹 배양되기에 충분한 정도로 크고 , 지나치게 큰 규모로 적층되어 세포의 눌림， 기체 또는 영양 교환이 원활하게 이루어지지 못하는 현상 등이 발생하는 것을 예방할 수 있다는 것을 밝혀내었다. 상기 기체 또는 영양 교환 효율은 본 발명의 마이크로캐리어 자체의 유동성에 의해 극대화 된다. 유동성이 없이 고정된 대규모 구조체에 배양하는 경우에 비하여 마이크로캐리어를 이용하는 경우, 적혈구계 세포의 3 차원 적층 패킹 배양 환경을 유지하면서도, 구조체 자체의 유동성에 의해 기체 또는 영양 교환이 원활하게 이루어질 수 있다. 또한， 적혈구계 세포의 3 차원 적층 패킹 배양에 있어서， 배양 규모를 확장하여 단위 바닥면적당 적혈구계 세포 수를 확장하는 경우에도 마이크로 캐리어의 공극 구조 제공을 통해 적정한 세포 적층 규모를 유지할 수 있어, 적혈구계 세포의 배양 규모를 손쉽게 확장할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 배양에 이용되는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 배지를 이루는 기본배지는 당업계의 통상적인 배지, 예컨대 Eagle's MEM[Eagle's minimum essensial medium, Eagle, H. Science 130： 142(1959)] , a -MEM[Stanner , CP. et al., NAT. New Biol. 230 :52(1971)] , Iscove's MEM[Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147：923(1978)] , 199 medium [Morgan et al .， Proc. Soc. Exp. BioMed. , 73:1(1950)] , CMRL 1066, RPMI 1640[Moore et al .， J. A er. Med. Assoc. 199：519(1967)], F12[Ham, Pro. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)], F10[Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)]， DMEM[Dulbecco' s modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al . , virology 8:396(1959)], DMEM 및 F12 의 흔합물 [Barnes, D. et al . , Anal. Biochem. 102:225(1980)] , Way-mouth's MB752/l[Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)] , 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove's modified Dulbecco 's medium), 이스코브 변형 피셔 배지 또는 이스코브 변형 이글 배지， McCoy's 5A [McCoy, T. A. , et al , Pro. soc. Exp. Bio. Med. 100:115(1959)].， MCDB 의 시리즈 [Ham, R.G et al . , In Vitro 14:11(1978)], AIM-V 배지 , 및 이의 변형배지를 포함한다. 배지의 상세한 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cel Is, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc. , New York 에서 알 수 있으며 , 상기 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.

본 발명에서 이용되는 배지는 적혈구 전구세포의 증식 및 분화를 촉진시키기 위해 SCF(stem cell factor), IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-11, GM-CSF ( gr anu 1 ocy t e inacr ophage ^~ co 1 ony stimulating factor) , M— CSF(Macrophage Colony-St imulat ing Factor) , G-CSF ( gr anu 1 ocy t e~co 1 ony stimulating factor) 및 EPCKerythropoiet in)로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 성분을 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 배지는 전적아세포에서 호염기성 적아세포로 분화시키는 단계에서 하이드로코티손， SCF, IL-3 및 EP0 를 포함하며; 호염기성 적아세포에서 다염기성 적아세포로 분화시키는 단계에서 SCF, IL-3 및 EPO 를 포함하고; 다염기성 적아세포에서 정염성 적아세포로 분화시키는 단계에서 EP0 를 포함하며; 정염성 적아세포에서 다염성 적혈구 (즉ᅳ 망상적혈구)로 분화시키는 단겨 K즉 탈핵 단계)에서는 사이토카인을 포함하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 있어서， 본 발명의 적혈구계 세포의 배양은 지속적인 유동 ( f low)에 의한 전단 응력이 인가되는 배지 내에서 이루어진다. 본 명세서에서의 "지속적인 유동"은 규칙적이거나 불규칙적인 주기로, 또는 연속적으로 배지에 대한 교반 또는 교환이 이루어지는 것을 의미한다. 이를 통해 적층 패킹된 배양 세포층의 내부로 산소를 비롯한 필수생장요소들이 원활히 공급되어 세포 확장을 돕는다.

본 발명의 일 구체예에 있어서， 적혈구계 세포의 배양을 위한 지속적인 유동은 교반에 의해 형성된다. 상기 교반은 구체적으로 예를 들어， 자석 교반기를 통한 교반일 수 있으며， 스피너 플라스크 내에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서， 상기 유동은 교반에 의해 형성된다. 더욱 구체적으로 상기 유동은 1-50 rpm 의 교반에 의해 형성된다. 구체적으로 상기 유동은 1—40 rpm , 더 구체적으로 5—35 rpm , 보다 더 구체적으로 5-30 rpm 의 교반에 의해 형성된다 . 더욱 높은 rpm 으로 교반이 이루어지는 경우에는 배양 세포에 가해지는 전단 웅력이 너무 커져 세포들 간의 적층 구조가 무너지고 세포들 간의 3차원 접촉 효과가 감소하게 된다. 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 배양은 지속적인 유동에 의한 다공성一마이크로캐리어로부터의 적혈구의 이탈을 방지하기 위하여 배지 내부에 포함되는 필터 내에서 이루어진다. 상기 필터는 마이크로캐리어와 적혈구계 세포가 받는 전단웅력에 의한 3 차원 적층 패킹 배양 환경에 대한 변화를 최소화시키고, 배지의 원활한 유동을 가능하게 하여 , 효과적인 세포 확장에 도움을 준다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 필터는 메쉬 (Mesh) 크기가 1-8 y m 인 것을 특징으로 한다. 구체적으로 본 발명의 필터의 메쉬 크기는 1-5 μ ηι , 더 구체적으로 2-5 μ ιη , 보다 더 구체적으로 3-4 y m 이다. 적혈구의 평균 직경에 비하여 작은 메쉬 크기를 갖는 필터를 이용함으로써， 적혈구가 마이크로구조체의 공극으로부터 이탈하여 배지 내에서 부유하는 것을 방지하면서도， 배지의 유동 (flow)에 의한 효과를 배가시킬 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서， . 본 발명의 적혈구계 세포는 조혈모세포에서 벗어나 적혈구 계열로 분화된 _. 세포이며， 특히 성숙과정이 거의 완료되어가고 있는 적혈구계 세포로서 , 바람직하게는 최종 성숙 (terminal maturation) 단계에 진입한 것을 포함한다. 이러한 최종 성숙 (terminal maturation) 단계 말에 적혈구의 탈핵 (enucleat ion) 과정이 이루어진다. 최종 성숙 단계에 진입한 적혈구계 세포는 조혈모세포와는 세포의 특성 및 성장 환경에서 큰 차이를 보인다ᅳ 다공성 마이크로구조체 내에서의 3D 적층 패킹 배양에 의한 우수한 배양 효과는 조혈모세포에서 벗어나 적혈구 계열로 분화된 세포， 더 나아가 최종 성숙 단계에 진입한 세포에 대하여 발휘된다. 적혈구계 세포 3D 적층 패킹 배양에 있어서， 적층 규모를 적정 수준 이상 증가시키는 경우, 세포 눌림， 기체 또는 영양 교환 효율 저하 등이 발생하여 세포 배양 효율이 감소하는 문제가 있었다. 그러나 본 발명자들은 다공성 마이크로캐리어를 적혈구계 세포의 3D 적층 패킹 배양에 최초로 도입함으로써, 적정 수준의 적층 규모 이상으로 적혈구계 세포를 밀집 배양하면서도， 마이크로캐리어의 공극을 통해 원활히 세포 배양이 이루어질 수 있는 적층 규모를 유지할 수 있는 효과가 발휘될 수 있도록 하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 3D 배양된 적혈구계 세포는 DLC KDeleted in Liver Cancer 1)， ICAM-4( Intercel lular Adhesion Molecule-4) 및 VLA-4(Very Late Antigen-4) 중 하나 이상의 접착 관련 유전자를 발현한다. ⁰ 1러한 접착 -관련 유전자 발현에 의해 세포간 신호교환 활성이 증가함으로써 적혈구계 세포의 생산율이 높아질 수 있다. 상기 DLC 1， ICAM-4 및 /또는 VLA-4 단백질은 배지에 인위적으로 첨가시킬 수도 있다. 본 발명의 일 구현예에 있어서， 본발명의 적혈구계 세포를 3 차원 적층 패킹 (packing) 배양하는 단계는 중간엽줄기세포， 골아세포 내피 세포 (endothelial cell), 단구 (monocyte)， 대식세포 (macrophage) 및 조직구 (histiocyte)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 적혈구계 세포와 흔합하여 공배양하는 것이다. 본 발명의 중간엽줄기세포， 골아세포, 내피 세포 (endothelial cell), 단구 (monocyte)， 대식세포 (macrophage) 및 조직구 (hist iocyte)는 골수의 성분을 이루는 세포들로서， 본 발명의 적혈구계 세포의 배양 환경을 골수 내 환경과 유사하게 하기 위해 이용되었고， 본 발명자들은 골수의 성분을 이루는 세포들과 적혈구계 세포를 공배양 하는 경우, 적혈구계 세포의 성숙이 원활이 일어나도록 한다는 결과를 도출하였다. 중간엽줄기세포， 골아세포, 내피 세포 (endothelial cell), 단구 (monocyte)， 대식세포 (macrophage) 및 조직구 (histiocyte)로부터 2 이상의 성분이 선택되는 경우， 흔합 비율에 특별한 제한은 없지만， 바람직하게는 체내 환경과 유사한 비율로 흔합할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서， 본 발명의 중간엽즐기세포 골아세포， 내피 세포 (endothelial cell), 단구 (monocyte) , 대식세포 (macrophage) 및 조직구 (histiocyte)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상과 상기 적혈구계 세포는 1:10 내지 2:1 의 세포 수 비율로 흔합할 수 있다. 상기 흔합비는 체내 환경과 유사한 환경을 조성하기 위한 비율이지만, 적혈구계 세포의 배양을 위한 본 발명의 목적에 따라 적혈구계 세포의 함량을 적절하게 높인 범위를 포함한다.

【발명의 효과】

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 다공성 구조체를 이용하여 적혈구계 세포를 3 차원 적층 패킹 (packing) 배양하는 단계를 포함하는 적혈구계 세포의 인 비트로 확장 방법을 제공한다. 、

(b) 본 발명에 따르면 적혈구 전구세포로부터 적혈구의 인 비트로 생산성을 크게 향상시킬 수 있다.

(c) 본 발명에 따르면 적혈구계 세포의 밀집 배양 규모를 손쉽게 확장하면서도, 마이크로캐리어의 공극을 통해 원활히 세포 배양이 이루어질 수 있는 적층 규모를 유지할 수 있는 효과를 발휘한다.

(d) 본 발명에 따르면 임상-등급의 적혈구를 인 비트로 배양 방법으로 얻을 수 있다. 【도면의 간단한 설명】

도 1 은 2D 플레이트 배양， 2D 고농도 배양， 매크로다공성 마이크로캐리어 유형의 Cytoline 1 을 이용한 적혈구계 세포 적층 패킹 배양, Cytopore 를 이용한 적혈구계 세포 적층 배양, Biomatrix 3D, Honeycomb 를 이용한 적혈구계 세포의 적층배양, 배지 순환 조건을 위한 스피너 플라스크， 교반기 및 원통형으로 제작한 스핀 필터를 나타낸다.

도 2 의 A 는 다염성 /정염성 적아세포를 2D 플레이트， 3D 세포 적층 배양하고 1 일， 2 일 후 Wright-Giemsa 염색하여 관찰한 결과를 나타낸다. 별표시는 탈핵된 최종 성숙 적혈구 세포를 나타내며, 화살표는 정염성 적아세포 (X200)를 나타낸다.

도 2 의 B 는 도 2 의 A 와 관련하여 각 조건에서의 세포 성숙 및 적혈구 생산비율을 비교한 결과를 나타낸다.

도 3 은 정염성 적아세포 세포를 2D 플레이트， 3D 고농도 패킹 배양시 배양 농도를 달리하여 1 일 2 일 배양 후 관찰한 결과를 나타낸다. 도 3 의 A 는 정염성 적아세포의 Wright-Giemsa 염색 결과를 나타내며， 적색 별표는 탈핵된 최종 성숙 적혈구 세포， 청색 화살표는 정염성 적아세포， 혹색 화살표는 골수성 세포, 백색 별표는 탈핵 진행중인 세포 (x200), 혹색 별표는 세포내 형성이상증 (dysplasia)세포를 나타낸다. 도 3의 B는 도 3의 A와 관련하여 세포 성숙 정도 및 적혈구 생산율을 비교한 결과를 나타낸다. 도 4 의 a 는 다공성 마이크로캐리어인 Cytopore 와 Cytoline 1 을 SEM 으로 찍은 사진 (좌측)과 세포를 넣어 배양한 것 (가운데)， 류브 (위쪽 넓은 부분의 직경이 6.5 麵)에 넣어 배양하는 모습 (우측)을 나타낸다. 도 4 의 b 의 좌측 도는 스핀필터를 원통형으로 만든 것 (직경 6.5 mm, 높이 15 I画)이고, 우측 도는 원통형 스핀필터를 이용하여， 적혈구계 세포를 10 ⁷ 세포 /ml 농도로 12웰 안의 배지에 넣어서 키운 것을 나타낸다.

도 5 는 Cytopore 을 사용하여 1 일， 2 일， 3 일간 배양한 경우 생존한 적혈구계 세포를 나타낸다.

도 6 은 Cytoline 1 을 사용하여 적층 배양 한 경우에 생존한 세포를 나타낸다. 도 7은 Cytoline 1을 사용하여 배양 1일, 2일 후 세포 성숙 단계를 나타낸다.

도 8 은 동시에 진행한 다른 제대혈 유래 케이스 2 의 경우 적층 후 1 일까지 비교하였는데， 정염성 적아세포는 대조군에서 39%, 실험군 II 에서 94.1%로 세포 성숙이 매우 크게 증가함을 확인하였다. Cytoline 1 을 넣고 3D 적층 배양 시 세포간의 접촉이 증가하며， 세포 성숙이 더 효과적으로 진행됨을 확인 하였다 (참조: 도 8， 9).

도 10 의 A 는 적아세포를 스피너 플라스크에 넣어 가라앉힌 후 마이크로캐리어 없이 RPM 25 로 돌리면서 배양한 것을 2D 폴레이트 배양한 것과 비교한 결과를 나타낸다ᅳ 도 10 의 B 는 배양 기간에 따른 세포 성숙 단계를 나타낸다.

도 11 은 스피너 풀라스크 내에서 Cytopore 를 이용하여 세포를 배양한 결과를 나타낸다.

도 12 는 스피너 플라스크 내에서 Cytoline 1 을 이용하여 3D 배양한 경우의 세포성숙 단계를 비교한 것을 나타낸다.

도 13 은 Cytoline 1 및 필터를 이용하여 PM 0 및 RPM 25 의 유동 (flow) 조건에서 세포를 배양하여 Wright-Giemsa 염색한 결과를 나타낸다. 빨간별표는 탈핵된 적혈구 세포, 파란 화살표는 정염성 적아세포， 검은 별표는 죽은 세포， 검은 화살표는 다염성 적아세포 (X200)를 나타낸다. 도 14는 도 13의 조건에서의 세포 성숙 단계를 나타낸다，

도 15 는 도 13 과 다른 제대혈 케이스로 적혈구 생성 효과를 비교한 것을 나타낸다.

도 16 내지 18 은 적혈구계 세포를 2D 고농도, 3D 고농도 패킹 배양하여 세포를 관찰한 결과를 나타내고， 구체적으로 도 16 은 세포 Wright-Giemsa 염색 결과를 나타내며, 빨간 별표는 탈핵된 최종 성숙 적혈구 세포, 검은 별표는 죽은 세포， 검은 화살표는 미성숙 적혈구 세포 (i画 ature erythroid cell), 나머지 모든 세포는 정염성 적아세포 세포 (X200)를 나타낸다.

도 17은 도 16의 조건에서 세포 성숙 단계를 나타낸다.

도 18 은 다양한 재질 및 다양한 공극 사이즈의 다공성 구조체를 이용한 적혈구계 세포의 배양 실험 결과를 나타낸다. 좌측은 다공성 구조체내에서 세포를 배양한 후 수거한 성숙된 적혈구계 세포의 군집 (pe l l et )을 나타내며 , 우측은 세포 생존률을 나타낸다.

도 19 는 적혈구계 세포를 2D 고농도， 3D 적층 패킹 배양한 세포의 Wr ight-Gi emsa 염색 결과를 나타낸다. 빨간 별표는 탈핵된 적혈구를 나타내고; 배율은 200X ; 스케일 바는 50 μ ηι 이다.

도 20 은 다양한 다공성 구조체 상에서 적혈구계 세포 배양시 세포의 성숙 정도를 비교한 그래프를 나타낸다.

도 21 은 3D 적층 패킹 배양 (3 일간) 동안 적혈구 생성 마커 ( ICAM-4 , GATA-l , Hb-beta , Hb-ga讓 a)와 접착 -관련 신호 (DLC 1ᅳ ICAM-4)를 qPCR 로 확인한 결과를 나타낸다.

도 22 는 체외에서 생산한 적혈구의 기능 검사에서 건강한 공여자의 말초혈과 유사한 결과를 얻을 수 있음을 나타내는 그래프이다.

도 23 은 적혈구계 세포의 3D 적층 패킹 배양에 이용 가능한 다양한 구조체들의 모습을 나타낸다.

도 24 는 부착세포인 MSC 와 골아세포 (osteobl ast )를 먼저 다공성 구조체에 넣고 부착되기를 기다렸다가， 3 시간 후 적혈구계 세포를 추가로 넣어 실험한 군 (윗줄 3h ; 실험 A군)이며， 위 세 종류의 세포를 동시에 넣은 후 192 시간 동안 공배양 (아래줄 mix ;실험 B 군) 한 후 세포의 구성을 분석한 결과를 나타낸다.

도 25 는 3D 다공성 구조체 내에서 대식세포와 단핵 백혈구 세포를 포함하는 골수 세포와 적혈구계 세포를 72 시간 동안 공배양하는 것을 통해 다공성 구조체 내에서 입체적 상호작용을 유발하여 적혈구계 세포의 성숙 및 최종 적혈구 세포의 생산에 미치는 효과를 실험으로 확인한 결과를 나타낸다. 좌측은 48 시간 배양하여 구조체 내부의 모습올 현미경으로 관찰한 사진이며, 우측은 48 시간, 72 시간 배양하여 세포를 염색한 결과이다 (검은색 화살표는 미성숙 적혈구계 세포; 빨간 화살표는 성숙 적혈구계 세포 ; 흰 별표는 대식세포 ; 나머지세포는 단핵세포를 나타낸다) . 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】

이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예

실험방법

실시예 1: 세포배양 및 계수

면역자성 마이크로비드 분리법 (immunomagnet ic microbead select ion method) 및 EasySep CD34 분리키트 (StemCeU Technologies)를 사용하여 건강한 기증자의 제대혈로부터 CD34 ⁺ 세포를 분리하였다. CD34 ⁺ 세포들은 일부는 분리 후 바로 배양에 이용되고, 냉동상태로 보관하다가 해동하여 사용되기도 하였다. 이 세포들은 17 일 동안 기질 및 혈청이 없는 조건에서 배양하였다 [3, 4].

여러 가지 사이토카인을 CD34 ⁺ 세포의 분화 및 증식을 위해 첨가하였다. 0 일에서 7 일까지， 세포들을 1 ίΐΜ 하이드로코르티손 (Sigma), 100 ng/ml 줄기세포인자 (SCF; R&D Systems), 10 ng/ml 인터루킨 (IL)-3(R&D Systems), 그리고 6 IU/ml 에리쓰로포이에틴 (EP0; Calbiochem)으로 보층된 배지에서 배양하였다. 7 일에서 13 일까지 50 ng/ml SCF, 10 ng/ml IL-3 및 3 IU/ml EP0 를 첨가한 배지에서 염기성 적아세포 (basophi 1 ic erythroblast)를 배양하였다. 13 일부터 17 일까지는 2 IU/ml EP0 를 첨가하였다 [3, 4] . 17 일경 다염성 적아세포 (polychromatic. erythroblast)와 정염성 적아세포 (orthochromatic erythroblast )가 50% 이상이 되었을 때 3D 비교실험에 들어갔다. 배양 17 일 때, 3D 배양시는 2 IU/ml EP0, 5% 제대혈 플라즈마 유래 혈청 (cord blood pl sma derived serum)을 첨가하였다 [5]. 배지는 2 일마다 교체하였다. 세포들을 C0 ₂ 인큐베이터 (Sanyo)에서 37 ^° C, 5% C0 ₂ 의 조건으로 배양하였다. 트리판 블루 염색으로 생존한 세포의 수를 계산하였고 세포손상여부 (cell integrity) 및 성숙정도를 Wright- Giemsa 염색 (Sigma-Aldrich) 후 각 군마다 맹검법 (blinded manner)으로 (세포를 계수하는 연구자는 세포 배양조건이 무엇인지 모르게 함) 두 숙련된 연구자가 최소 400개의 세포들을 계수하여 분석하였다. 실시예 2: 적혈구 세포의 영상화

세포를 세포원심분리기 (Cellspin, Hanil Science Industrial)를 이용해 슬라이드에 도말 후 Wright-Giemsa 염색 (Sigma-Aldr ich) 후 성숙 단계 마다 세포 성숙단계 및 세포이형성증 (myelodysplasia)과 세포손상여부 등을 분석하였다. 실시예 3: 2D plate 배양， 3D 적층 세포 배양

배양 15-17 일경， 후반 성숙단계 (terminal maturation)에 이른 적혈구계 세포 (다염성 -/정염성 -적아세포)를 도 1 에 나타낸 바와 같이 각 조건으로 ^' 나누어 배양하였다. 대조군은 6-well 에 2D 플레이트 배양으로서 IxlO ⁶ 세포 /mL 농도로 배양하였다. 실험군은 튜브에 2xl0 ⁷ 세포 /niL로 세포를 넣어 자연적으로 적층되게 한 후 튜브를 세워서 배양하였다. 대조군과 실험군 모두 기본 배지는 플라즈마 -유래 혈청 5%를 첨가하여 배양하였다 [5]. 24 시간과 48. 시간 동안 배양하예 세포수와 생존율을 확인하고， Wright- Giemsa 염색법을 사용하여 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 4: 3D 배양시기 결정

적층 배양을 시작하기에 적절한 적아세포의 성숙시기를 알기 위해 염기성 적아세포가 50% 이상 남아 있을 때 (배양 13 일경)와 다염성 /정염성 적아세포가 50% 이상일 때 적층배양에 들어갔다. 실시예 5: 2D 플레이트 배양， 3D 100 μ 1, 200 μΐ 적층 배양

세포수가 증가하면 영양소가 세포 적층 부분 안으로 확산해 가기 어렵거나 C02 나 락테이트 같은 독성 대사물질 (toxic metabolite)이 바깥쪽으로 빠져나오기 어려을 수 있다. 따라서， 다염성 /정염성 적아세포를 적층 배양시 적절한 적층 규모를 확인하기 위해 각 조건에서 적혈구의 생성률과 탈핵률 ( enucleation rate)을 비교하였다. 대조군은 6-well 에 IxlO ⁶ 세포 /mL 로 배양하고， 실험군 I 은 IxlO ⁷ 세포 Anl 의 세포를 류브에 넣어 세포를 가라앉혀 적층시킨 후 배양하고， 실험군 II 는 2xl0 ⁷ 세포 /2 ml 의 세포를 넣어 2 배 부피의 세포 적층 규모로 배양 한다. 사용한 류브는 상기 실험군 I 및 II 의 세포가 층분히 쌓여 3D 적층 환경을 구성할 수 있는 정도의 크기를 갖는 것을 사용하였다. 배양액은 동일하며， 24 시간과 48 시간 동안 배양하여， 세포수와 생존율을 확인하고， Wright-Giemsa 염색법을 사용하여 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 6: 다공성 구조체 내에서의 2D, 3D 적층 배양

다염성 /정염성 적아세포의 적층규모를 키우기 위해 입체적으로 골수내 골격 (bony trabeculae) 환경을 재현하고자 하였다. 골수내 골격 공간과 비슷한 직경 및 공간으로 이투어진 재질 중 인체에 적용 가능한 재질을 찾아 비교하였다. 첫번째 사용 재질은 100% 셀를로오스로 만들어진 CytoporeCGE healthcare)이며 평균 공극 크기 30 μηι, 밀도 1.03 g/ml, 입자직경 200-280 urn, 유효 표면 영역 (1.1 m ² /g, 부피 40 ml/g 의 다공성 캐리어였다. 두번째 재질 Cytoline KGE healthcare)은 폴리에틸렌과 실리카로 만들어졌으며 공극의 크기 1-400 urn, 밀도 1.32 g/ml, 침강 속도 120-220 cm/분， 길이 1.7-2.5 cm, 두께 0.4—1.1 cm, 표면 영역 0.3 m ² /g 이상으로 골수 골격 내 공간과 유사하였다.

3D 실험군에 대한 대조군은 위의 2D 플레이트 조건과 같았다. 실험군 I 은 튜브에 Cytopore 를 넣고， 실험군 II 는 Cytoline 1 을 넣은 후 (참조: 도 4)， 여기에 다염성 /정염성 적아세포를 넣고 lxlO ⁷ 세포 /ml 로 적층하여 배양하였다. 최종 성숙단계에 이를 때까지 배양하며， 24 시간과 48 시간 동안 배양하여， 세포수와 생존율을 확인하고, Wright-Giemsa 염색법을 사용하여 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 7: 스피너 플라스크 내의 3D 적층

우선 성숙단계의 세포가 3D 적층상황에서 세포가 눌리지 않고 약한 유동 (flow)의 전단 웅력 (shear stress)에 견디는지 확인하기 위해 실험하였다. 대조군은 위와 동일시하며，, 실험군은 Cytoline 1 에 l.OxlO ⁷ cell/ml 로 넣은 후 스피너 플라스크에 넣어 배양하였다. 일반적으로 층전층 바이오리액터 (packed bed bioreactor )에서 세포들은 움직일 수 없게 고정화 (i隱 obilized)되지만， 본 실험에서 적아세포는 부착세포 (adherent cell)가 아닌 부유세포에 가까우므로 공극 공간 안에 들어가 있었다 하더라도 일부는 배지 유동 (media flow)에 의해 마이크로캐리어 밖으로 나와 배지에 부유 (floating)하게 된다.

적아세포는 유체의 유동에 의한 전단 응력에 매우 약하다는 것을 여러 RPM 조건에서 확인 실험을 하였다. 따라서， 바이오리액터를 돌리는 최저속도인 RPM 25로 전단 웅력을 최소화하여 최종 성숙 단계까지 배양하여， 24 시간 단위로 대조군과 실험군 각각을 트리판 불루로 염색하여 살아 있는 세포의 수를 확인 하고， Wright-Giemsa 염색법을 사용하여 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 8: 스피너 플라스크에서의 Cytopore 및 Cytoline 1 을 이용한 3D 적층

골수 내 상황을 고려한 스케일-업 배양을 위해 큰 부피의 대량의 세포 적층에도 아래 세포가 눌리지 않고 배지가 원활히 교환되는 조건을 알아보고자 스피너 플라스크에 Cytopore 혹은 Cytoline 1 을 넣고 배양 하였다. 대조군의 조건은 위와 동일하며, 실험군은 스피너 플라스크에 lxlO ⁷ cell /ml 로 넣고 배양하였다. 24 시간 단위로 대조군과 실험군 각각을 Wright-Giemsa 염색법을 사용하여 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 9: 스피너 플라스크에서의, Cytoline 1 을 이용한 스핀 필터 내의 3D 배양 (배지 교환)

In vitro 골수내 환경 재현을 위한 더 적합한 3D 적층배양용 다공성 구조체로 Cytoline 1 을 선택하였다. 적혈구계 세포가 부착 세포가 아니기 때문에 다공성 마이크로캐리어 안에 들어가도 고정되어 있지 않고， 일부가 캐리어 밖으로 나와 현탁액 (suspension) 상태로 돌아다니는 것을 발견하였다. 이 경우 세포의 상호간 접촉이 되지 않으므로, 공극 내에서 적층하여 키우면서도 배지의 교환이 원활하도톡 원통형으로 만든 스핀 필터 안에 캐리어와 세포를 가두고 배양기 가운데 고정시켜 배양하였다. 일반적으로 바이오리액터에 사용되는 8 μηι 필터는 공극 직경이 넓어 , 가장 작은 세포에 속하는 적혈구계 세포가 쉽게 빠져나왔다. 따라서 필터 메쉬 크기 (mesh size)가 3 μηι로 작은 스핀 필터에 가두어 놓고 배양액이 서서히 교환되게 세포를 배양하였다. 대조군은 위와 동일하며, 실험군 I 은 스핀 필터로 세포를 lxlO ⁷ 세포 /ml 농도로 가두어 놓고 CytoHne 1 과 함께 정지상태에서 (RPM 0) 배양하였다. 실험군 II 는 RPM 25 로 흔들어주며 (shaking) 배양하였다. 24시간마다 대조군과 실험군 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 10: 2D 고농도 배양， Cytoline 1올 이용한 3D 적층 배양

위 실험들을 통해， 2D 플레이트 배양보다 3D 적층 세포 배양시 세포 생존율이나 세포 성숙도가 높음을 확인하였다. 다공성 구조체를 사용하여 3D 적층 배양의 세포생존율이 낮으나， 세포 성숙도가 월등히 높음을 확인 할 수 있었다. 이는 in vitro 골수 환경의 재현의 결과라 할 수 있으며, 높은 농도의 조건에서 최종 성숙단계인 적혈구 세포의 생성을 위한 획기적인 방법이라 할 수 있다.

본 발명자들은 이전에 2D 플레이트에서도 일반적인 세포 농도보다 플레이트 바닥에 세포가 서로 접촉할 수 있을 만큼 세포를 많이 넣어 배양하면 세포 생존율이나 세포 성숙이 더 잘됨을 발표한 바 있다. 본 발명자들은 이러한 2D 풀레이트에서 고농도 배양과 비교해 3D 배양시 접촉정도가 더 많아져 적혈구 생성이 잘 되는지와 적층 시 배지교환 등에 문제가 없는지 알기 위해 비교실험을 하였다. 배양액은 동일하며 대조군은 2D 폴레이트 24-웰에 lxlO ⁶ 세포 /ml 를 넣어 고밀도로 배양하였다. 실험군 -'

I 은류브에 lxlO ⁷ 세포 /ml 를 넣어 Cytoline 1 과 배양하였다. 또한 실험군

II 는 스핀 필터 안에 1x10? 세포 /ml 의 세포를 Cytoline 1 과 함께 배양하였다. 24 시간 단위로 대조군과 실험군 각각을 트리판 블루로 염색하여 살아 있는 세포의 수를 확인 하고, Wright-Giemsa 염색법을 사용하여 세포의 성숙 단계를 분석하였다. 실시예 11: 다공성 구조체의 선정을 위한추가 실험

적혈구 세포의 최종 성숙 (terminal maturation) 단계에 이른 세포를 3D 다공성 구조체 (매크로다공성 마이크로캐리어， 스캐폴드)에 고밀도 적층 배양하여 배양 효과를 확인하였다. 3D 다공성 구조체는 세포의 상호작용을 자극하기 위한 수많은 다공을 갖고 .있으며, 체내 골수 내 골격의 다공성을 재현할 수 있고, 세포의 손상을 줄일 수 있는 재질로서 적합한 구조체의 선별을 위해 공극 크기 (pore size)와 골격의 모양 및 재질성분을 다양하게 하여 실험해 적용 가능성 여부를 확인 하였다. 각 재질의 공극 크기 ( iim)와 재질은 표 1 에 기재하였다. 대조군은 6-웰에 2D 플레이트 배양으로서 lxlO ⁶ 세포 /mL 농도로 배양하였다.

【표 1】

성숙 단계에 이른 적혈구계 세포를 lxlO ⁷ 세포 AnL 의 농도로 각각의 다공성 구조체에 넣어 스핀 필터 안에 넣고 3 일간 배양 하였다. 신선한 배지를 전체 배지의 반을 매일 교환해 주었으며, 세포의 상태를 Wright- Giemsa 염색을 통해 확인 하였다. 실시예 12: 배양 세포의 산소 운반능 측정

3D 스캐폴드에서 적층 패킹 배양하여 생산된 최종 적혈구를 Hemox analyzer (TCS Scientific)를 사용하여 산소 평형 커브 (Oxygen equi 11 ibr ium curves)를 정상인의 말초혈액을 대조군으로 하여 비교 측정하였다. 실시예 13: 적혈구계 세포 3D 배양을 위한 구조체 선정을 위한 추가실험

적혈구 세포의 배양에 적합한 공극 크기와 재질을 결정하기 위해 다양한 3D 구조체를 이용하여 세포 적층 실험을 진행하였다ᅳ 세포 내 골격 구조를 재현하기 위한 500 μηι 이내의 공극 구조와 골수 구성 세포들을 지지해 줄 수 있기에 층분한 강도를 가지고 있는 재질， 그리고, 세포들의 배양 후 수거에 용이한 구조를 가지고 있는 구조체를 선정하기 위해 3D- 프린트된 스캐폴드, 마이크로캐리어， 공극이 없는 디스크 유형， 금속 재질 (Ni, Stainless steel)로 나누어 실험을 진행하였다. 대조군과 실험군의 세포의 농도와 배양 배지의 조건은 앞의 실험 조건과 동일하다. 표 2는 다양한 3D 구조체의 사양을 나타낸다.

【표 2】

실시예 14: 골수 성분 세포들과의 공배양 효과의 확인

인체의 조혈과정이 활발히 일어나고 있는 골수내 공간을 모방한 3D 구조체내에 골수 성분의 세포들과 적혈구계 세포를 공 배양함으로 실제 골수내 적혈구 모세포섬 (erythroid island)을 재현하여 세포의 성숙이 원활이 일어나도록 하였다. 중간엽줄기세포 (Mesenchymal stem cells, MSC), 골아세포 (Osteoblast), 성숙한 적혈구계세포를 일정한 비율을 유지하며 (MSC: 골아세포 : 성숙 적혈구계세포 =2: 1:10)， 192 시간 동안 공배양하여 2D 플레이트 배양과 비교하였다. 세 종류의 세포를 공배양하기 적합한 기본 배지 조건으로 Stem line II 와 Dulbecco Modified Eagle Medium low glucose 배지를 9:1 의 비율로 흔합하여 사용하였으며， 배지 교환은 전체 배지양의 일부만 매일 교환 하였다. 이후 유동 세포분석기 (flow cytometry)로 세포의 개체군 (populat ion) (골수 세포에 대한 CD45, 적혈구계 세포에 대한 CD71, MSC 에 대한 CD51 및 CD90)을 확인 하였다. 배양의 최적의 조건 확립을 위해 실험에 다양성을 두어， 구성 세포들을 모두 동시에 배양하거나 혹은 MSC와 골모세포 (osteoblast)를 먼저 배양한 후 3 시간 뒤 적혈구계 세포를 공배양하는 조건으로 나누어 진행 하였다. 실험 결과

1. 호염기성 /다염성 적아세포의 적층 효과 (2D plate 배양, 3D 세포 적층 배양)

제대혈에서 분리한 조혈모세포를 적아세포의 배양용 배지에 13- 17 일간 분화시켜 호염기성 /다염성 적아세포가 50% 이상이 될 때 세포를 고농도로 적층하였다. 대조군은 플레이트에서 배양하였으며, 실험군은 2xl0 ⁷ 세포 /ml 농도로 튜브에 적층하여 1 일， 2 일 때 적혈구세포의 성숙 정도 및 생존도를 관찰하였다 (참조: 도 2A). 2D 플레이트에서와는 달리 3D 튜브법에서는 적혈구계 세포들이 골수내 적혈구 모세포섬 (erythroid island)과 유사하게 세포 간에 밀접한 접촉을 유지하며 배양되었다 (참조: 도 2A). 배양 1 일, 2 일 후 대조군은 정염성 적아세포가 38.5%， 57.8% 관찰되었지만, 3D 적층한 실험군에서는 50.9%, 49.6%가 관찰되었다 (참조: 도 2B). 탈핵한 적혈구는 대조군 (13.7%， 7.5%)보다 3D 적층배양에서 적혈구가 증가하였다 (20.6^ 25.2%). 2 일에 정염성 적아세포 비율이 대조군보다 실험군에서 감소한 이유는 탈핵이 더 많이 되어 적혈구가 되었기 때문으로 보인다. 또한, 배양환경이 좋지 않아 핵이 제대로 분열돠지 못하고 ^개지거나 한 세포질 내에 여러 개의- 핵이 남아 있는 세포이형성증 (myelodysplasia)이 1 일과 2 일에 대조군 (5.1%, 6.1¾>)과 실험군 (2.3%, 3.1%)에서 각각 감소하였다. 따라서， 3D 적충배양에서 감소하여 배양 환경이 세포 성숙과 적혈구 생산에 더 적합함을 확인할 수 있었다. 2. 정염성 적아세포 세포 적층 규모

위의 실험에서 2D 폴레이트 세포 배양보다 3D 고농도 적층 세포 배양이 in vivo 골수 환경의 재현으로 세포간의 접촉을 증가시켜 세포 성숙에 효과적임을 확인 하였다. 3D 고농도 적층 배양시 최적의 세포 적층규모를 찾기 위해 성숙 단계에 이른 적아세포를 2D 플레이트 배양 대조군과 실험군 I， II 를 비교하였다. 실험군 I 은 세포를 lxlO ⁷ 세포 /ml 농도로 3D 적층 환경을 구성할 수 있는 좁은 튜브에 넣어 쌓아 배양하고, 실험군 II 는 2xl0 ⁷ 세포 /ml 로 쌓아 배양하였다. 배양 1 일， 2 일 후 정염성 적아세포는 대조군에서 40.7%, 22.6%가 관찰되었으며， 실험군 I 에서는 43.3%, 23.1%, 실험군 II 에서는 36.0%, 18.2%로 관찰되었다. 실험군 I 의 조건이 3D 적층 ᅳ 배양시 세포 성숙이 더 효과적으로 진행됨을 확인하였다 (참조: 도 3A, 3B). 탈핵 효과로 인한， 최종 성숙 적혈구 세포는 배양 1, 2 일에 대조군 (16.1%, 22.6%)보다 실험군 I， II 가 각각 (23.8%， 46.1%), (23.0%, 30.1¾>)로 적층시 탈핵된 적혈구가 더 증가하였다. 그리고 실험군 I 이 II 보다 적층에 대한 효과가 증대됨을 확인 하였다. 또한， 세포이형성증이 2 일 때 대조군과 실험군 I， II 에서 각각 3.8%, 2.7%, 2.6%로 적층시 더 감소하였다. 세포 생존도는 실험군 I, II 가 대조군에 비해 1 일 때 4.6%， 5.4% 증가하였고， 2 일 때 5.7%, 5.9% 더 증가하였다 (참조: 도 3B).

3. 다공성 구조체에서 3D 적층 배양

성숙 단계에 이른 세포를 in vitro 골수내 골격 환경을 재현하여 세포를 배양하기 위해, 성숙 단계에 이른 적아세포를 대조군과 Cytopore 및 Cytoline l에서 배양한 것을 비교하였다 (참조: 도 4) .

Cytopore 의 경우 배양 1 일, 2 일, 3 일 관찰 결과 대조군보다 적혈구계 세포의 생존율이 낮았다. 이는 도 4 에 나타낸 것과 같이 공극의 공간이 세포접촉과 배지 순환을 유발하기에 너무 작기 때문으로 생각되었다 (참조: 도 5).

Cytoline 1 의 경우 적층배양시 세포 성숙이 효율적이어시 (참조: 도 6), 1 일， 2 일 후 정염성 적아세포가 대조군에서는 (38.3%, 15.6%)가 관찰되었으몌 Cytoline 1 케이스 1 에서는 (67.5%, 14.1%)로 관찰되었다. 또한 탈핵 후 적혈구는 대조군 (6.1%， 7.2%)보다 Cytoline 1 의 케이스 1， 케이스 2 각각 (26.9%, 80.0%)로 적층 시 적혈구가 매우 증가하였다ᅳ 또한, 세포이형성증이 대조군과 Cytoline 1 에서 각각 (26.9%, 4.0%), (2.8%, 0.0%)로 감소하였다 (참조: 도 7). 동시에 진행한 다른 제대혈 유래 케이스 2 의 경우 적층 후 1 일까지 비교하였는데, 정염성 적아세포는 대조군에서 39%, 실험군 II 에서 94.1%로 세포 성숙이 매우 크게 증가함을 확인하였다. Cytoline 1 을 넣고 3D 적층 배양 시 세포간의 ¾촉이 증가하며, 세포 성숙이 더 효과적으로 진행됨을 확인 하였다 (참조: 도 8, 9). 세포 생존율은 대조군의 경우 살아있는 세포는 적혈구계 세포가 아니라 다른 계열 세포이므로 의미가 없어 비교하지 않았다.

4. 적아세포의 스피너 플라스크에서 공극 없이 배양효과 비교

스피너 풀라스크에서 성숙 단계에 이른 다염성 /정염성 적아세포가 약한 유동의 전단 웅력 (유체역학적 손상)에 견디는지 확인하기 위해 실험하였다 (참조: 도 10A). 스터링 (Stirring) RPM 25 로 전단 웅력을 최소화하여 4 일까지 배양하였고， 이 속도에서 세포는 거의 뜨지 않고 바닥에서 가라앉아 있었다. 대조군은 정염성 적아세포가 24 시간마다 (9.1%, 5.9%, 46.2%, 41.6%)가 관찰되었으며， 실험군 I 에서는 (35.0%, 12.8%， 36.0%, 12.8%)가 관찰 되었다 (참조: 도 10B). 또한 적혈구 생성율도 대조군에서 (0.0%, 2.7%, 5.8%, 3.4%), 실험군 I 에서 (6.5%, 9.0%, 26.0%, 59.3%)로 스피너 플라스크에서 더 효과가 좋았다. 따라서, Cytoline 1 에 넣어 스피너 플라스크 배양도 세포성숙 및 적혈구 생성에 효과적임을 알 수 있었다. 그러나， 전단 응력으로 인해 세포 생존율이 대조군보다 낮고 적혈구의 형태를 잘 유지하고 있지 않아 배지의 전단 응력으로부터 공극 안에서 배양하는 것이 적합함을 알 수 있었다 (참조 : 도 10A).

5. 스피너 플라스크에서 Cytopore에 배양

큰 부피에서 세포 눌림과 전단 웅력을 줄이기 위해 3D 적층 스피너 플라스크 배양시 Cytopore, Cytoline 1 을 각각 넣어 배양하였다. Cytopore 의 경우 스피너 플라스크 내에서도 앞선 실험 결과와 마찬가지로 성숙한 적혈구계 세포가 증가하지 않아 적혈구계 세포 배양에 적합하지 않음을 재차 확인하였다 (참조: 도 11) .

6. 스피너 플라스크에서 Cytol ine 1 에 배양

대조군은 정염성 적아세포 ( 11.8%， 3.9%, 34.7%)가 관찰되었으며， 실험군은 (34.1%， 9.7%, 3. 관찰되었다. Cytol ine 1 을 넣고 3D 적층 스피너 플라스크 배양 시 세포간의 접촉이 증가하며， 세포 성숙이 더 효과적으로 진행됨을 확인하였다 (참조: 도 12) . 탈핵 효과로 인한， 최종 성숙 적혈구 세포는 배양 1ᅳ 2 , 3 일에 각각 대조군 (0%ᅳ 2.3%, 4.2%)보다 실험군에서 ( 12.2%, 32.3%, 90.6%) 탈핵된 적혈구가 증가하였다. 따라서 Cytol ine 1 내에서 적층 효과를 유지하면서 전단 유동에 영향을 덜 받아 최종 단계인 적혈구 세포의 생산에 효과적임을 확인할 수 있었다.

7. 스피너 플라스크 내에서 스핀필터 및 Cytol ine 1 을 이용한 3D 배양 및 교반 속도 (shaking RPM)에 따른 효과 비교

세포가 마이크로캐리어 밖으로 빠져나와 적층되지 않고 배지 유동에 의한 전단 웅력을 받는 것을 방지하기 위해, 스핀 필터 (3 y m)에 마이크로캐리어와 세포를 가두어 적층효과를 그대로 유지하면서 배양액이 서서히 교환되게 실험을 진행 하였다. 실험군 I 은 스핀 필터로 세포를 가두고 Cytol ine 1 과 함께 배양하며 전단 응력을 고려하여， RPM 0 으로 하고， 실험군 I I 는 RPM 25 로 흔들어주며 (shaking) 배지교환이 보다 원활하게 하였다. 배양 1 일， 2 일 후 대조군은 정염성 적아세포 (51.4%, 64.2%)가 관찰되었으며， 실험군 I 에서는 (66.4%, 70.0%) , 실험군 I I 에서는 (63.2%, 59.4%)관찰되었다. 탈핵 적혈구는 대조군 (8.6%， 10.7%)보다 실험군 I , I I 에서 각각 ( 15.0%, 25.6%) , (25.5%, 32.3%)로 대조군 보다 탈핵된 적혈구가 증가하였고, 대조군 I I 에서 더 높았다. 또한， 세포이형성증아 대조군에 비해 실험군 I， I I 에서 각각 배양 1 일에 5.7%， 1.0%, 2.0%로 감소하였다 (도 13 내지 15) . 스핀 필터에 세포 찌꺼기가 끼는 현상은 관찰되지 않았다. 즉， 다공성 구조체를 이용해 적층효과를 유지하면서， 스핀 필터를 이용해 배지 유동에 의한 전단 웅력을 줄이면서도 배양액의 원활한 교환을 유도한 것이 세포의 성숙 및 적혈구 세포 생산에 가장 효과적임을 확인하였다.

8. 2D고 농도， Cytoline 1을 이용한 3D적층 배양

본 발명자들은 실험결과를 재차 입증하기 위해， 결과가 좋았던 실험을 재현하였다. 대조군은 2D 폴레이트 배양으로 고농도로 배양하며, 실험군 I 은 튜브에 Cytoline 1 을 넣어 3D 적층 배양하며， 실험군 II 는 스핀 필터 안에 Cytoline 1 과 함께 세포를 3D 적층 배양 했다. 배양 1 일， 2 일 후 대조군은 정염성 적아세포 (60.0¾， 66.7%)가 관찰되었으며, 실험군 I 에서는 (45.1%， 56.5%), 실험군 II 에서는 (31.7%, 44.3%)관찰되었다. 실험군의 조건이 3D 적층 배양 시 세포성숙에 더 효과적으로 진행됨을 확인하였다 (조: 도 16 내지 18). 탈핵 효과로 인한， 최종 성숙 적혈구 세포는 대조군 (7.2%, 24.2%)보다 실험군 I, II 가 각각 (22. ， 43.5%), (24.4%, 50.4%)로 대조군보다 탈핵된 적혈구가 증가하였다. 그리고 실험군에서 세포간 ^' 접촉이 증가하였으며， 따라서 적층에 대한 효과가 증대됨을 확인하였다. 또한, 세포이형성증이 대조군과 실험군 I, II 에서 각각 (2.0%, 1.0%), (4.2%, 0.0%), (0.0%, 1.7%)로 감소하였다 (참조: 도 16 내지 18). 9. 다공성 구조체의 선정

3 일간 배양되는 동안 적혈구로의 성숙이 대조군보다 3D 다공성 구조체에서 더 진행되었고, 헤모글로빈이 축적되어 세포 펠릿이 더 붉은색을 나타냄을 확인하였다. 또한 1 일 배양시에는 Cytoline 1 이 다른 스캐폴드보다 눈에 띄게 붉은색의 세포 펠렛 (pellet)을 나타내었으나， 배양일이 경과하면서 Bioemrix 3D, Honeycomb 스캐폴드에서도 배양된 세포의 펠렛이 붉은색을 띄는 것을 확인 하였다. 구조체에 따라 세포의 성숙 속도가 다를 수 있기는 하지만 모든 3D 적층 패킹 배양 환경에서 적혈구 생산이 효율적이고 적합함을 확인하였다. 도 19 는 세포 염색 사진 (좌측), 도 20 은 세포 성숙 정도를 나타낸다. 특히, Biomerix 3D, Honeycomb 스캐폴드에 배양된 세포의 경우 배양일이 지날수록 세포의 생존율 (참조: 도 18， 우측)도 대조군보다 증가하였으며， 배양 4 일째에 Biomerix 3D 의 세포 염색 (참조: 도 19)에서 탈핵된 적혈구의 수가 더 증가됨을 확인 할 수 있었다.

고밀도 적층 배양 (3 일 동안) 세포와 배양 전 (Oh) 세포를 비교하여 세포 신호전달을 확인 하였다. 적아세포 접착 -관련 마커 (erythroblast adhesion-rela ed markers)인 DLC-l(delet ion in liver cancer— 1)과 ICAM- 4( intercel lular adhesion molecule— 4) , 전사인자 (transcript ion factor) GATA-1 과 적혈구 세포 성숙 마커 (erythroid cell maturation markers)인 Hb-beta와 Hb-ga隱 a의 mRNA 발현을 확인 하였다 (참조: 도 21). 배양 1일에 DLC-1 의 mRNA 발현량은 Oh 대조군보다 Biomerix 3D 에서 253.2 배 증가 하였으며， ICAM-4 의 mRNA 발현량은 104.9 배 증가 되었다. GATA-1 mRNA 발현률은， 배양 2 일경， Biomerix 3D 에서 배양한 적혈구계 세포에서 9.1 배 증가 하였으며, Hb-beta 의 mRNA 발현률은, 배양 3 일째, Biomerix 3D 에서 313.0 배， Honeycomb 스캐폴드에서 298.2 배로 크게 증가 되었다. Hb-gamma mRNA 발현률 또한 배양 3 일째, Biomerix 3D 스캐폴드에서 203.3 배 증가 되는 것을 확인 하였다. 따라서 성숙된 적혈구계 세포가 다공성 구조체 내에서 적층되어 배양됨으로 세포간의 접촉이 증가 하여 세포 접착력 (cell adhesion), 세포 성숙을 매우 효과적으로 증진 시키는 것을 확인 하였다.

10. 배양 세포의 산소 운반능 측정

도 22 의 좌측 도는 세포 펠릿이 배양한 성숙한 적혈구이다. 배양한 성숙 적혈구 세포의 0 ₂ 운반 능력이 대조군과 유사함을 확인하였다 (p50=20.8, _P 50=25.8; 생산한 적혈구， 대조군) (참조: 도 22).

11. 골수 성분 세포들과의 공배양 효과의 확인

적혈구계 세포를 골수 성분 세포들과 공배양한 결과 두 조건의 세포 개체군 (population)이 달랐으며, 구성된 모든 세포를 동시에 3D 구조체에 넣어 배양하는 것이 적혈구계 세포의 분화에 더 도움이 된다는 것을 확인하였다 (참조: 도 24).

도 24 는 다공성 구조체에 골수 내 세포인 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSC) 및 골아세포 (osteoblasts)와 성숙된 적혈구계 세포를 공배양한 결과이다. 실험 A 군에서는 부착세포인 MSC 와 골아세포를 먼저 다공성 구조체에 넣고 부착되기를 기다렸다가， 3시간 후 적혈구계 세포를 추가로 넣어 배양하였으며 , 실험 B군에서는 상기 세종류 세포를 동시에 넣은 후 192 시간 동안 공배양하였다. 동시에 배양된 실험 B 군의 경우는 192 시간、후 MSC 를 나타내는 CD51+CD90+의 퍼센트가 2D 배양보다 3D 배양에서 3.1%증가되어 유지 되었고, 미성숙 적혈구계 세포를 나타내는 CD45+CD71+는 16.0% 증가 되었으며, 성숙한 적혈구 세포를 나타내는 CD45-CD71+도 대조군과 비슷하였다. 적혈구계 세포를 부착세포보다 나중에 넣은 실험 A 군의 경우 192 시간 후 MSC 를 나타내는 세포 마커인 CD51+CD90+ 세포의 퍼센트가 2D 배양보다 3D 배양에서 0.7%정도 낮았으나 미성숙 적혈구계 세포를 나타내는 CD45+CD71+가 21.4% 높아 적혈구계 세포를 3D 다공성 구조체 내에서 유지， 증식 시키는데 효과적임을 확인 하였다. 또한 골수 내에서는 적혈구 세포들끼리 서로 입체적으로 밀착하여 적혈구 모세포섬 (erythroblast ic island)이란 공간을 만들어 성숙 및 증식하게 된다. 골수 내에서 적혈구 모세포섬은 미성숙 적혈구계 세포가 성숙되기 위해 대식세포 (Histiocytes)와 긴밀하게 상호작용하는 중요한 공간이다. 마찬가지로, 3D 다공성 구조체내에도 대식세포와 단핵 백혈구를 세포를 포함하는 골수 세포와의 공배양을 통해 적혈구계 세포의 성숙 및 최종 적혈구 세포의 생산을 극대화 시킬수 있는지를 실험으로 확인 하였다. 3D 스테인리스 강 (Stainless steel) 다공성 구조체에 골수 단핵세포 (Bone marrow mononuclear cells, BM MNC)를 lxlO ⁸ 세포 /mL 의 농도로 세포를 넣고 3 _U m 의 스핀필터로 감싸 72 시간 동안 배양하였다 (실험군). 2D 대조군의 조건과 배양 배지 및 배지 교환 조건은 위와 동일하였다. 24 시간 간격으로 다공성 구조체내에서 세포들이 밀착되어 3D 적층을 형성하는 모습을 현미경으로 관찰하였다 (참조: 도 25， 좌측). 또한 동일한 시간 간격으로 다공성 구조체 내에서 세포간의 입체적 상호작용으로 인한 적혈구계 세포의 성숙을 Wright-Giemsa 염색을 통해 확인 하였다 (참조: 도 25, 우측). 배양 48 시간에는 2D 대조군에 비해 3D 실험군에서 미성숙 적혈구계 세포가 눈에 띄게 관찰되었다 (검은색 화살표는 미성숙 적혈구계 세포이고， 나머지 세포는 단핵세포 및 대식세포를 나타낸다). 배양 72 시간에도 대조군 보다 실험군에서 성숙 적혈구계 세포와 대식세포의 모습이 관찰되는 것을 확인 할 수 있었다 (검은색 화살표는 미성숙 적혈구계 세포; 빨간 화살표는 성숙 적혈구 세포; 흰 별표는 대식세포를 나타낸다). 이는 3D 다공성 구조체 내에서도 골수 세포들 끼리 입체적 상호작용이 적혈구계 세포의 성숙에 중요한 역할을 함을 보여준다-. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌

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