MéTODO DE PRONóSTICO Y/O DIAGNóSTICO IN VITRO DE

HIPERSENSIBILIDAD A ESTRóGENOS O A SUSTANCIAS CON

ACTIVIDAD ESTROGéNICA

CAMPO DE LA INVENCIóN

La presente invención se refiere a la prognosis o diagnosis de enfermedades de base genética cuya etiología se basa en una alteración o cambio en la información genética que porta el individuo, tales como mutaciones o polimorfismos. Concretamente la presente invención se refiere a un método de pronóstico y/o diagnóstico in vitro de hipersensibilidad a estrógenos o a sustancias con actividad estrogénica y, por lo tanto, de enfermedades estrógeno dependientes (ERD), en individuos portadores de dichas mutaciones o polimorfismos.

ANTECEDENTES Y ESTADO DE LA TéCNICA

Los estrógenos son un grupo de hormonas sexuales que se producen a partir de precursores androgénicos mediante la acción del complejo proteico citocromo P450 aromatasa. En humanos se han descrito hasta seis estrógenos distintos, sin embargo sólo tres de ellos: Estradiol (el de mayor potencia), Estrona y Estriol (producto de la oxidación de los dos anteriores), se encuentran en cantidades notables a nivel sistémico.

El complejo citocromo P450 aromatasa está formado por dos proteínas: NADPH- citocromo P450 reductasa ubicua y la citocromo P450 aromatasa que contiene el grupo hemo y el bolsillo de unión a los esteroides. En humanos, la citocromo P450 aromatasa se expresa en varios tejidos: ovarios, testículos, placenta, hígado fetal, tejido adiposo, condrocitos y osteoblastos del hueso, y numerosos sitios en el cerebro incluyendo varias áreas del Hipotálamo, la hipófisis, el sistema límbico y la corteza cerebral.

El mecanismo de acción clásico de los estrógenos se lleva a cabo mediante la interacción de estos con dos tipos de receptores, el Receptor de Estrógenos α (REa) y el

Receptor de Estrógenos β (REβ). La unión de los estrógenos a sus receptores provoca, en última instancia, la modulación de la transcripción de genes estrógeno-dependientes (O'donell y cois., 2001).

El mecanismo de acción clásico o genómico de los estrógenos, ocupa varias horas. Los receptores REa y REβ pueden encontrarse a nivel citoplasmático o nuclear, unidos a ciertas proteínas que sirven como chaperonas estabilizando a los receptores en su estado inactivado o enmascarando el dominio de unión al ADN del receptor. Otras proteínas asociadas a los receptores pueden contribuir a la interacción entre diferentes rutas de señalización. Cuando los estrógenos difunden a la células, se unen al dominio de unión a ligando del receptor. Entonces el receptor se disocia de las chaperonas citoplasmáticas; el complejo estrógeno-receptor pasa al núcleo celular y se unen a secuencias específicas de ADN llamados elementos de respuesta a estrógenos (ERE) como homo (REα-REα o REβ-REβ) o heterodímeros (REα-REβ) donde formarán una plataforma a la que se unirán complejos de coactivadores y factores de transcripción necesarios para la activación transcripcional. Los estrógenos también regulan la expresión de genes que no portan ERE mediante la modulación de la actividad de otros factores de transcripción (O'donell y cois., 2001; Gruber y cois., 2002).

Por otro lado, se han descrito otros mecanismos de acción "no clásicos" o "no geno micos" para los estrógenos, que se dan en intervalos de tiempo de minutos a segundos. En estos mecanismos de acción alternativos intervienen receptores REa y REβ adyacentes o localizados en la membrana plasmática, o proteínas de unión a estrógenos asociadas a la membrana plasmática (Deroo y Korach, 2006). Ejemplos de los efectos mediados por este mecanismo de acción alternativos son la vasodilatación rápida de las arterias coronarias, el efecto rápido insulinotrópico del estradiol sobre las células beta pancreáticas, y la rápida activación de las rutas de señalización mediada por factores de crecimiento en células neuronales (Gruber y cois., 2002).

Las principales funciones de los estrógenos son el desarrollo de las características sexuales secundarias de la mujer y el control del ciclo reproductivo femenino. Además

de estas funciones, los estrógenos presentan un gran número de actividades fisiológicas adicionales sobre diferentes tejidos tanto en hombres como en mujeres:

-Crecimiento óseo y cierre de la epífisis -Regulación del eje hipotálamo-hipófisis-gónadas

-Incremento de la retención de Nitrógeno -Retención de sodio, cloro y agua: acción mineralcorticoide -Mejora del perfil lipídico: aumento del HDL-colesterol y triglicéridos y disminución de LDL-colesterol y lipoproteína alfa -Efectos beneficiosos sobre el sistema cardiovascular: aumento de prostaciclinas y óxido nítrico en el endotelio vascular; disminución de la producción de Tromboxano A2 y endotelina; acción antioxidante; bloqueo de canales de Calcio y apertura de canales de Potasio.

Una gran cantidad de datos provenientes de observaciones clínicas, cultivos celulares y modelos animales han aportado una información muy valiosa sobre la acción de los estrógenos en la salud y la enfermedad.

En este sentido, se ha observado que existe un grupo de enfermedades cuya característica común es una alteración en los niveles o mecanismos de acción de los estrógenos. Este grupo recibe el nombre de Enfermedades Relacionadas con Estrógenos

(ERD) que incluyen un grupo heterogéneo de entidades clínicas como cáncer de mama, cáncer colorectal, cáncer endometrial, cáncer de próstata, osteoporosis, enfermedad de

Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedades cardiovasculares, obesidad, endometriosis e infertilidad masculina y femenina, entre otras (Morón y cois., 2007).

Este hecho ha estimulado a diversos investigadores a estudiar el papel de genes discretos relacionados con la síntesis, el mecanismo de acción y el metabolismo de los estrógenos en las ERD. Por ejemplo, algunas variantes genéticas localizadas en los genes ESRl y ESR2 (que codifican para los receptores REa y REβ, respectivamente) se han estudiado prácticamente en todas las ERD. Estas variantes se han asociado a características clínicas de la osteoporosis como el riesgo de fractura ósea o la baja

densidad mineral ósea en mujeres posmenopáusicas, el riesgo a padecer cáncer de mama, la endometriosis, la enfermedad de Alzheimer o la infertilidad masculina entre otras (Morón y cois., 2007) (http://geneticassociationdb.nih.gov).

Entre las enfermedades ERD localizadas en el estado de la técnica, se encuentran las siguientes:

1. Infertilidad masculina

El término infertilidad queda definido por la Organización Mundial de la Salud (OMS) (www.who.int) como la incapacidad de lograr embarazo tras 12 meses de relaciones sexuales sin hacer uso de ningún tipo de método anticonceptivo. La infertilidad es primaria cuando la pareja nunca ha logrado un embarazo y secundaria cuando la pareja tiene el antecedente de uno o varios embarazos y después del último transcurre más de un año de exposición sin concebir. La esterilidad según la misma organización es la incapacidad permanente de un individuo de tener descendencia.

En general, una de cada diez parejas experimentan infertilidad primaria o secundaria, pero la incidencia de infertilidad varía entre países desde menos del 5% hasta más del 30%. En el 51,2% de las parejas infértiles la incapacidad de concebir tiene su origen en el varón (Tournaye, 2002).

En los últimos años se han publicado un número considerable de trabajos que muestran una tendencia a la reducción de la calidad espermática en varios países desarrollados (Carlsen y cois., 1992; Swan y cois., 1997; Swan y cois., 2000). Se puede afirmar, de manera general, que la calidad espermática ha disminuido en los últimos años en algunos países aunque no en otros; que cuando existe dicha disminución, ésta se acompaña de un deterioro de la motilidad y morfología de los espermatozoides; y que en los lugares donde la calidad espermática ha descendido, se ha observado no sólo una disminución de la misma con el tiempo, sino también lo que se conoce como "efecto del nacimiento en la cohorte", ya que los hombres nacidos en la década de los años 40

tienen mejor calidad espermática que los nacidos en los años 60 del pasado siglo (Joffe 2003).

El estudio más reciente en este sentido sobre la población española comparó la calidad espermática de cerca de 16.000 muestras de semen recogidas entre 1986-1996 y 1997- 2004. De los 244 millones de espermatozoides móviles por eyaculación de promedio registrados en el primer periodo, se experimentó un descenso hasta los 183 millones entre 1997-2004 en el segundo periodo (Nuñez 2005).

Además de la preocupación existente por la disminución de la calidad espermática en determinados países, la implantación generalizada de las Técnicas de Reproducción

Asistida (TRA) es otro aspecto a tener en cuenta en el campo de la medicina reproductiva. Se ha estimado que en algunos países europeos hasta el 5% de todos los nacimientos se deben actualmente al empleo de TRA (Tournaye 2002). Además, una gran cantidad de parejas incapaces de concebir hace pocos años, se han visto beneficiadas por el surgimiento de nuevas TRA como la Inyección Intracitoplasmática de Esperma (en inglés, Intracytoplasmatic Sperm Injection, ICSI) (Lissens, 1999).

En relación con lo anterior, ha surgido una gran preocupación sobre la seguridad de las TRA, ya que la transmisión de defectos genéticos actualmente desconocidos y relacionados con la infertilidad u otras patologías no puede descartarse. Además, la relación coste/efectividad de las TRA, así como la tasa de embarazos múltiples y las consecuencias económicas y de salud derivadas de los mismos, son motivo de un intenso debate en la actualidad (Collins, 2001; Katz y cois., 2002).

Como consecuencia de todo ello, la identificación de factores causantes o que predisponen a la infertilidad es uno de los principales objetivos a los que se enfrenta actualmente la medicina reproductiva.

La infertilidad masculina puede ser el resultado de anomalías urogenitales congénitas o adquiridas, infecciones de las glándulas accesorias masculinas, aumento de la temperatura escrotal, desarreglos endocrinos, anomalías genéticas y factores inmunológicos (WHO, 2000). Sin embargo, en el 40-60% de los varones infértiles las

únicas anomalías detectables se encuentran en los principales parámetros seminales, esto es, en la concentración, la movilidad y/o la morfología de los espermatozoides, mientras que no se identifican alteraciones en el examen físico, ni en los análisis endocrinos. Los individuos con estas características se dice que presentan infertilidad idiopática (Dohle y cois., 2005).

En este punto es conveniente resaltar que la infertilidad es un término que hace referencia a ambos miembros de la pareja, mientras que la oligozoospermia (escaso número de espermatozoides) y la azoospermia (ausencia de espermatozoides) son características específicas del varón. Por ello, ambos términos no son sinónimos, aunque resulta evidente que un individuo con bajas cuentas espermáticas tendrá mayores probabilidades de ser infértil que un individuo normozoospérmico (con un número de espermatozoides normal).

La infertilidad idiopática es una enfermedad compleja resultado de la interacción entre factores ambientales y genéticos. En la actualidad, se han identificado una gran cantidad de productos exógenos con efectos perjudiciales sobre la capacidad reproductora masculina tanto en modelos animales como en humanos (Joffe, 2003; Lottrup y cois., 2006). Sin embargo, aunque se han conseguido identificar un número considerable de factores genéticos responsables de infertilidad en modelos animales (Cooke y cois., 2002), la búsqueda de factores genéticos que predisponen a la infertilidad idiopática masculina en humanos ha sido menos fructífera.

La causa genética más común de oligozoospermia y azoospermia (concentración espermática baja o nula) son las microdeleciones del cromosoma Y (Krausz y

Degl'Innocenti, 2006). Estas microdeleciones son las responsables de la eliminación total o parcial de las regiones de azoospermia (AZFa, AZFb y AZFc) localizadas en el brazo largo del cromosoma Y. Pese a ello, un 85% de individuos azoospérmicos y un

90% de individuos oligozoospérmicos severos no presentan dichas alteraciones en el cromosoma Y (Krausz y cois. 2003).

La mayoría de los estudios de asociación genética publicados hasta la fecha, y cuya finalidad es la identificación de factores genéticos que predisponen a la infertilidad idiopática masculina, han seguido una estrategia de genes candidatos. Esta estrategia se basa en la selección de genes cuya función, perfil de expresión, localización cromosómica, o implicación en patologías relacionadas, los hacen atractivos para ser estudiados con relación a la enfermedad de interés.

En este sentido, uno de los genes que ha sido considerado por algunos como un candidato de interés para su estudio en la infertilidad masculina, es el gen del Receptor de Estrógenos (ESRl). Este gen codifica para el Receptor de Estrógenos alfa, que es una de las piezas clave para la acción fisiológica de los estrógenos tanto en el varón como en la mujer.

Los estrógenos juegan un papel muy importante en la función del tracto reproductor masculino en el hombre. Por ejemplo, el Estradiol facilita el mecanismo de retroalimentación negativo ejercido por la Testosterona sobre el eje Hipotálamo- hipofisario-testicular, interviene en el descenso testicular en la edad fetal, en la modulación de la función de las células de Leydig (las células productoras de testosterona que se encuentran en los testículos) y de Sertoli (cuya función es proteger, alimentar y sostener a las espermatozoides inmaduros hasta su liberación a los túbulos) y además parece ejercer una función antiapoptótica sobre las células germinales

(O'Donnell y cols., 2001).

Por otro lado, la disrupción del gen Esrl en ratones da lugar a infertilidad en el macho debido a una falta de reabsorción de fluido en los conductos eferentes, lo que induce una degeneración progresiva de los túbulos seminíferos (Hess y cois., 2000).

En humanos, sólo se ha descrito un caso de insensibilidad a estrógenos a causa de una mutación en homocigosis en el exón 2 del gen ESRl (Smith y cois., 1994). Esta mutación fue hallada en un individuo varón cuyas características más significativas comprendían el cierre incompleto de la epífisis a los 28 años de edad, la intolerancia a la glucosa con hiperinsulinemia y la reducción de la masa ósea. Este individuo presentaba

rasgos sexuales secundarios normales, eugonadismo (funcionamiento normal de las gónadas, habitualmente identificado a partir de una concentración normal de testosterona en hombres), elevados niveles de estradiol, hormona Folículoestimulante y hormona Luteinizante, y niveles normales de Testosterona. Las cuentas espermáticas de dicho individuo se consideran normales (25 millones de espermatozoides por mililitro de semen eyaculado), aunque la viabilidad de los espermatozoides era reducida (18% frente a un 50% de valor de referencia) (Smith y cois., 1994).

Estudios sobre la secuencia genómica del gen ESRl han permitido identificar un gran número de polimorfismos de un solo nucleótido o "Single Nucleotide Polymorphism" (SNP) en este gen. Por ejemplo, en la base de datos pública de SNP de GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) se incluyen más de 1300 polimorfismos localizados en la región genómica de ESRl, algunos de los cuales se discuten a continuación haciendo referencia a los mismos con la denominación utilizada en dicha base de datos.

Algunos de estos polimorfismos se han utilizado como marcadores para llevar a cabo diversos estudios de asociación genética sobre diversas enfermedades relacionadas con los estrógenos, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis múltiple, enfermedad coronaria, artritis reumatoide, niveles séricos de LDL, índice de masa ósea, menopausia precoz, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer endometrial e infertilidad masculina, entre otras (geneticassociationdb .nih.gov) .

Además, se han divulgado distintas variantes polimórficas del gen ESRl, así como métodos para su detección, y su uso para pronosticar algunas enfermedades o la respuesta del organismo tras la administración de diversos fármacos. La solicitud de patente US 2002/0187495, por ejemplo, describe la asociación entre polimorfismos del

ESRl y la respuesta favorable del organismo ante la terapia de reemplazo de hormonas destinada al control de la hipercolesterolemia. La patente US5834200, por su parte, menciona la relación entre polimorfismos en dicho gen y la predisposición al desarrollo de osteoporosis. Las solicitudes de patente JP2000300295 y JP2001333798 se refieren a sondas y métodos para detectar polimorfismos de ESRl, valorar la sensibilidad de un

individuo que tenga dichos polimorfismos a un agente para la terapia de la osteoporosis y decidir a partir de ello cual es el fármaco más adecuado que se de debe suministrar. En la solicitud US 2002/0123095, se mencionan más enfermedades en las que podrían estar implicados los estrógenos, incluyendo las enfermedades cardiovasculares, el lupus eritematoso, la artritis, la osteoporosis, la enfermedad de Alzheimer y el cáncer de mama, proponiendo la detección de SNPs en el gen ESRl para identificar individuos con riesgo de desarrollar esas enfermedades. En ninguno de estos documentos se menciona una posible asociación entre variantes del ESRl (tomadas dichas variantes como SNPs y/o polimorfismos) y la infertilidad ni qué variantes podrían estar implicadas en el desarrollo de dicho trastorno.

La solicitud de patente JP2006061128 sí hace referencia a la utilización de marcadores genéticos localizados en el gen humano ESRl para la "evaluación de la sensibilidad a enfermedades multifactoriales en la diferenciación sexual", enfermedades que cursan con alteraciones anatomo-fisio lógicas como el desarrollo de micropenes, ausencia de descenso testicular o desarrollo de vulva en varones, es decir, alteraciones que, en el caso de dar lugar a infertilidad, la misma no sería considerada idiopática. Los inventores citados en dicha solicitud publicaron también un artículo en el que proponían la asociación de los marcadores a los que se refiere dicha solicitud con el desarrollo de criptorquidismo en la población japonesa (Yoshida y cois., 2005). Los marcadores citados en ambos casos, sin embargo, son de nuevo polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs), no deleciones que afecten a más de una decena de pares de bases.

El criptorquidismo es un defecto del desarrollo caracterizado por la ausencia de descenso al escroto de uno o ambos testículos. El criptorquidismo es un factor de susceptibilidad para la infertilidad masculina, ya que del 2% al 9% de los varones infértiles tienen antecedentes de criptorquidismo (Baccetti y cois., 2002), y por lo tanto, estos casos no son considerados idiopáticos.

Dada la relación del criptorquidismo con la infertilidad masculina, el grupo de los inventores de la presente invención desarrolló un estudio en el que se analizó si existía asociación de cinco de los marcadores SNP (rs926779, rs3020364, rs6932902,

rs3020371 y rs3020375) incluidos en el trabajo de Yoshida y cois., (2005) con el criptorquidismo en la población Italiana, y con la infertilidad en la población italiana y en la población española (Galán y cois., 2006). Los resultados obtenidos no coincidieron con los presentados por Yoshida et al., (2005) ya que la combinación de estos cinco marcadores (haplotipo) que en la población japonesa suponía un factor de riesgo para el criptorquidismo, actúa como factor de protección para el criptorquidismo en la población italiana. Además, ninguno de estos cinco marcadores o la combinación de los mismos está asociado con la infertilidad idiopática masculina ni en la población italiana, ni en la española (Galán y cois., 2006).

Por otro lado, en un total de cuatro estudios llevados a cabo sobre cuatro poblaciones independientes, se han identificado polimorfismos, localizados en el gen ESRl, asociados con la infertilidad idiopática masculina:

1. Suzuki y cois., (2002) estudiaron el polimorfismo rsl801132 localizado en el exón 4 del gen ESRl en un grupo de 31 individuos azoospérmicos idiopáticos y en un grupo de individuos fértiles, ambos grupos comprenden varones de la población Japonesa. Estos autores detectaron una asociación genética del alelo polimórfico G del marcador rsl801132 con la azoospermia idiopática en la población Japonesa, ya que la frecuencia de dicho alelo era superior en los pacientes azoospérmicos que en los varones fértiles.

2. Kukuvitis y cois. (2002) realizaron un estudio de asociación genética en el que se analizaba un grupo de 64 varones fértiles (grupo A) y tres grupos de individuos infértiles: 29 varones infértiles idiopáticos con oligozoospermia moderada (cuentas espermáticas entre 10 y 20 millones de espermatozoides por mililitro de semen eyaculado) (grupo B); 42 varones infértiles idiopáticos con oligoazoospermia severa (menos de 10 millones de espermatozoides por mililitro de semen eyaculado) o azoospermia (grupo C); y 38 varones infértiles no idiopáticos (grupo D). Todos los individuos incluidos en el estudio procedían de la población general Griega. Kukuvitis y cois., (2002) analizaron tres marcadores, dos SNPs localizados en el intrón 1 del gen ESRl (rs8179176 y rs9340799) y un marcador microsatélite localizado en el extremo amino-

terminal del gen del Receptor de Andrόgenos (RA) [OMIM:313700] consistente en un número variable de repeticiones del trinucleótido CAG. Los autores no encontraron ninguna diferencia estadísticamente significativa cuando compararon las frecuencias alélicas o genotípicas del marcador rs8179176 entre el grupo A y los tres grupos de individuos infértiles. Sin embargo, Kukuvitis y cois., (2002) observaron que el alelo G del marcador rs9340799 se presentaba en una frecuencia estadísticamente superior en el grupo C de pacientes que en el grupo A, por lo que concluyeron que este marcador presentaba una asociación genética con la infertilidad idiopática en individuos griegos oligozoospérmicos severos o azoospérmicos.

Por otro lado, los mismos autores no encontraron diferencias entre las medias ni el rango del número de repeticiones CAG del marcador microsatélite del gen RA, aunque la frecuencia de alelo s con más de 30 repeticiones CAG era superior en cada uno de los tres grupos infértiles comparados con el grupo A. 3. Guarducci y cois., 2006 estudiaron el número de repeticiones del dinucleótido

TA de un marcador microsatélite localizado en el extremo 5 ' del gen ESRl en un grupo de 191 varones con infertilidad idiopática y en un grupo de 156 individuos fértiles. Ambos grupos procedían de la población general Italiana. Los autores descubrieron una correlación entre un mayor número de repeticiones TA del marcador microsatélite con menores cuentas espermáticas en el grupo de individuos infértiles. Además, la presencia en homocigosis o en heterocigosis de alelo s con más de 20 repeticiones TA de dicho marcador estaba asociada con menores cuentas espermáticas en el grupo de individuos fértiles.

4. El grupo de los presentes inventores llevó a cabo también un estudio de asociación genética en el que se analiza el papel individual y conjunto de cinco genes implicados en la síntesis o el mecanismo de acción de los estrógenos sobre la infertilidad idiopática masculina en la población Española (Galán y cois., 2005), uno de los cuales es el gen ESRl. Los resultados derivados de dicho estudio apoyan la idea de que el gen ESRl juega un papel en la infertilidad idiopática masculina en la población Española:

• El polimorfismo rs8179176, localizado en el intrón 1 del gen humano ESRl, se analizó en un grupo de 104 individuos varones con infertilidad idiopática (grupo caso) y en otro grupo constituido por 95 individuos no relacionados de la misma población (grupo control). Aunque la frecuencia del polimorfismo rs8179176 no difería estadísticamente entre ambos grupos, el estudio del equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) (Hardy, 1908; Weinberg 1908) en estos grupos reveló un exceso de individuos homocigotos para rs8179176 en el grupo caso, y no en el grupo control (Galán y cois., 2005). Las desviaciones moderadas del EHW en el grupo caso y no en el grupo control pueden ser indicativas de la asociación del gen analizado con la enfermedad en estudio (Hoh y cois., 2001).

• También se identificó una desviación del EHW para el marcador rs8179176 en el grupo C de infértiles griegos estudiados por Kukuvitis y cois., (2002). Esta desviación del EHW se debe también a un exceso de individuos homocigotos para el marcador rs8179176 (Galán y cois., 2005).

• El análisis de un marcador microsatélite de elevada heterocigosidad, localizado a 35 Kb del marcador rs8179176, también mostró un mayor número de individuos homocigotos en el grupo caso que en el grupo control de la población española. Sin embargo, las frecuencias alélicas y genotípicas, así como la distribución alélica de dicho marcador no difiere entre ambos grupos (Galán y cois., 2005). Este marcador es el mismo que posteriormente sería estudiado por el grupo de Guarducci y cois., (2006) en población Italiana.

• El análisis multilocus de la ruta estrogénica indica que el gen ESRl podría tener un papel predominante en la infertilidad masculina (Galán y cois.,

2005).

Por lo tanto, los estudios realizados en los que variantes del gen ESRl se relacionaban con la infertilidad masculina se centraban en el análisis de los SNP localizados en dicho gen y repeticiones en microsatélites y en su posible relación con la infertilidad. Hasta ahora, no se habían establecido asociaciones entre deleciones en dicho gen y la infertilidad idiopática masculina. Dado el interés existente en identificar los factores

causantes de la infertilidad o que predisponen a ella, el grupo de los inventores se planteó la hipótesis de que el gen ESRl pudiera contener algún factor genético de susceptibilidad para la infertilidad idiopática masculina. La identificación de la naturaleza de este factor, así como de la frecuencia del mismo en individuos infértiles y en la población general y su posible utilidad para el diagnóstico de la predisposición a padecer infertilidad idiopática masculina fueron los principales objetivos en el desarrollo de la presente invención.

2. Respuesta a la Hipesestimulación Ovárica Controlada (HOC)

La Hiperestimulación Ovárica Controlada (HOC) es un procedimiento dirigido a lograr una suficiente cantidad y calidad ovocitaria y de esta manera mejorar las tasas de embarazo en diferentes técnicas de reproducción asistida. La inducción de la ovulación es una opción importante en reproducción ya que permite un enfoque terapéutico de las causas más frecuentes de infertilidad femenina en países desarrollados. El estudio de su mecanismo de acción amplió el conocimiento de la fisiología del "eje hipotálamo- hipófisis-ovárico" y, en particular, de los mecanismos de control hormonal.

En la actualidad existen diversos protocolos para desarrollar la HOC que incluyen tres fases generalmente:

• Frenado hipofisario: Mediante la administración de agonistas de la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRHa) como es el caso de la Trioptorelina, se consigue la ablación bioquímica del "eje hipotálamo-hipófisis-ovárico" suprimiendo así la producción de estrógenos ováricos.

• Estimulación de la Foliculogénesis: se realiza mediante la administración de fármacos con efectos gonadotrópicos como la gonadotropina menopáusica humana (hMG), la hormona Folículo-Estimulante (FSH) urinaria altamente purificada o la FSH recombinante (obtenida mediante ingeniería genética). • Estimulación de la ovulación: Puede conseguirse mediante la administración de fármacos con actividad similar a la gonadotropina coriónica humana (hCG).

La selección de los distintos protocolos existentes debe diseñarse según la necesidad de cada paciente. No obstante, varios estudios han demostrado una gran variabilidad en los resultados clínicos en las pacientes que son sometidas a tratamiento de HOC y que dependen de factores como la edad y de la reserva ovárica de folículos (Kligman y Rosenwaks, 2001).

Existen cientos de trabajos en la última década que investigan, proponen y evalúan múltiples marcadores bioquímicos y epidemiológicos en relación a la respuesta a HOC y estos trabajos se centran en los principales riesgos que aparecen en estos procedimientos terapéuticos para, de esta manera, poder prevenirlos. Así, entre los principales riesgos que pueden aparecer en un protocolo de HOC, encontramos:

• Una baja o nula respuesta ovocitaria, que provoca la cancelación del tratamiento con el consiguiente riesgo para la paciente y el enorme gasto económico. Uno de los principales biomarcadores de baja respuesta a HOC está relacionado con la reserva ovárica de las mujeres tratadas (Tarlatzis y cois., 2003)

• El embarazo múltiple (más de dos fetos) es una complicación grave, que supone riesgos físicos (sobredistensión uterina, infección, rotura prematura de membranas, polihidramnios, incompetencia cervical e incluso premadurez fetal) y psíquicos, además del elevado coste médico y social que representan.

• El síndrome de hiperestimulación ovárica (SHO) es una complicación iatrogénica desencadenada tras la administración exógena de fármacos en un ciclo de HOC que ocurre principalmente en la fase lútea del ciclo o al principio del embarazo. Aunque generalmente se considera un cuadro iatrogénico debido al uso de gonadotropinas para inducir el desarrollo folicular (Forman y cois.,

1990), se han descrito algunos casos en ciclos naturales (Zalel y cois., 1992). La incidencia del SHO varía según distintas publicaciones entre un 0,6-14% y la de su estadio severo se estima aproximadamente entre el 0,5-5% (Delvigne y Rozenberg, 2002), según los criterios de identificación empleados. El SHO presenta diferentes grados de severidad, incluso se han descrito algunos casos letales (Semba y cois., 2000).

En la actualidad no se conocen muchos datos con respecto a los marcadores genéticos implicados en la variabilidad de la respuesta a HOC. La mayoría de estos estudios han sido realizados en los diferentes genes relacionados con la foliculogénesis y con la producción de estrógenos (de Castro y cois., 2005b; Greb y cois., 2005).

No se ha identificado ninguna patente que presente alguna indicación en la que se incluya la identificación de factores genéticos como factores predictores de la respuesta a la HOC.

3. Infertilidad de pareja

Como se ha comentado anteriormente, el término infertilidad hace referencia a ambos miembros de la pareja ya que el estatus de fertilidad de uno de los miembros de la pareja influye de manera determinarte sobre la capacidad reproductora del otro miembro. Un grado de infertilidad leve no se asocia necesariamente con la infertilidad de la pareja cuando se presenta en uno sólo de los miembros, pero puede reducir la fertilidad de la pareja cuando se presenta en ambos miembros (Dohle y cois., 2005). No obstante, es frecuente el uso de los términos infertilidad femenina o infertilidad masculina cuando se atiende a la capacidad reproductora de un solo individuo.

La infertilidad puede clasificarse atendiendo al origen de la misma en cuatro categorías: factor femenino cuando la causa de infertilidad se encuentra en la mujer (35%), factor masculino cuando la infertilidad de la pareja se debe al varón (30%), factores combinados cuando se detectan anomalías asociadas con la infertilidad en ambos miembros de la pareja (20%) e infertilidad idiopática cuando no se puede dar ningún diagnóstico tras una investigación completa en ambos miembros de la pareja (15%) (Forti y Krausz, 1998).

Se han publicado una gran cantidad de estudios en los que se advierte sobre un descenso en la capacidad reproductora de hombres y mujeres causado por factores ambientales, como las sustancias con actividad deletérea sobre el sistema endocrino

(Joffe, 2003), o por factores sociales como el aumento generalizado de la edad en la que las mujeres tienen su primer hijo (te Velde y Pearson, 2002).

El diagnóstico de infertilidad se suele realizar atendiendo a cada miembro de la pareja por separado. Así, a la mujer se le suele registrar la historia médica y someter a examen físico, evaluación hormonal de la función ovárica, evaluación de la capacidad tubárica, evaluación de factores de cérvix, interacción esperma-moco cervical, examen de anomalías en el útero y análisis genéticos. En el hombre, también se registra la historia médica y se realiza un examen físico, análisis de muestras de semen, medidas hormonales, examen bacteriológico y análisis genéticos (Forti y Krausz, 1998).

En la actualidad no existe ningún método diagnóstico que evalúe la infertilidad a nivel de la pareja, basado en el análisis molecular de factores discretos y que se aplique en la práctica clínica.

Se ha publicado una patente en la que se expone a la futura madre a Factor Transformador del Crecimiento beta (TGFbeta) y algún antígeno de su pareja para provocar una disminución de la respuesta inmune de la futura madre a uno o varios de los antígenos del padre. US7204978, EP1743649, AU6284698: "Treatment and diagnosis of infertility using TGFbeta or activin".

4. Osteoporosis

La Organización Mundial de la Salud (OMS) define osteoporosis como: "Enfermedad sistémica caracterizada por una disminución de la masa ósea y un deterioro de la arquitectura microscópica del tejido óseo que lleva a un incremento de la fragilidad y el consecuente aumento de la susceptibilidad para fracturas óseas" (www.who.int).

La Osteoporosis es debida a un aumento en la resorción ósea, lo que está asociado con la deficiencia de estrógenos. Los estrógenos regulan la homeostasis esquelética en hombres y mujeres mediante la reducción de la resorción del hueso mediada por osteoclastos y el aumento de la formación del hueso mediada por osteoblastos. Tanto los estrógenos como el raloxifeno (un modulador selectivo de los receptores

es itrogénicos) se prescriben actualmente para la prevención de la osteoporosis en m uujjeerreess posmenopáusicas (Herynk y Fuqua, 2004).

El papel del gen ESRl en el desarrollo de la osteopenia y en el crecimiento esquelético se ha puesto de manifiesto en la descripción clínica de un paciente varón con resistencia a estrógenos provocada por una mutación en dicho gen. Este paciente mostraba cierre incompleto de la epífisis y densidad mineral ósea reducida a los 28 años de edad (Smith y cois., 1994).

Existe una larga lista de estudios donde se han analizado la influencia de variantes genéticas de ESRl (especialmente los polimorfismos PvuII y Xbal incluidos en el intrón 1 de dicho gen) con diversos rasgos clínicos relacionados con la osteoporosis (Ioannidis y cois., 2004; Albagha y cois., 2005; Choi y cois., 2005; Morón y cois., 2006; Castellani y cois., 2006; Rivadeneira y cois., 2006), lo que apoya que estas y otras variantes del gen ESRl tengan un efecto real sobre el desarrollo de esta enfermedad.

La osteoporosis suele diagnosticarse mediante la medida de la densidad mineral ósea de un paciente a través de la densitometría, que es un método diagnóstico radiográfico. No obstante, se han publicado diversas patentes que proponen el análisis de variantes localizadas en genes discretos como métodos diagnósticos para osteoporosis como es el caso de:

• WO0216553 referida al gen Bone Strength and Mineralization Regulatory Protein (BSMR)

• US5922542 referida al gen Collagen, Type I, alpha (COLlAl)

• US5998137 referida al gen Transforming Growth Factor beta (TGFB)

La patente KR20030065205 de título "Method for measurement of osteoporosis risk factor by measuring polymorphism of genes involved in osteoporotic process and kit for diagnosis of genetic risk factor of osteoporosis" propone el estudio de variantes en los genes Receptor de Leptina (LEPR), Receptor de la Vitamina D (VDR), Factor

Transformador del Crecimiento beta 1 (TGFBl) y ESRl para el diagnóstico genético de la osteoporosis. Las variantes del gen ESRl incluidas en esta patente son rs8179176 (PvuII) y rs9340799 (Xbal), ambos localizados en el primer intrón de este gen.

5. Cáncer de mama

El cáncer de mama es la principal causa de muerte en mujeres con tumores sólidos. La incidencia anual estimada del cáncer de mama es de aproximadamente 200.000 en USA y 320.000 en Europa (Dumitrescu y Cotarla, 2005). Datos provenientes de observaciones clínicas y estudios sobre modelos animales han puesto de manifiesto la implicación de los estrógenos en el desarrollo del cáncer de mama.

Los estrógenos llevan acabo acciones fisiológicas sobre el tejido mamario que están actualmente bien definidas. Por un lado estimulan el crecimiento y la diferenciación del epitelio ductal de la mama, induciendo la actividad mitótica en las células cilindricas ductales y el crecimiento del tejido conectivo en la mama. Los estrógenos ejercen efectos similares a la histamina sobre la microcirculación en la mama (Gruber y cois., 2002).

Actualmente existen dos hipótesis que explican la relación entre los estrógenos y el desarrollo del cáncer de mama. La primera, propone que la unión de los estrógenos a sus receptores estimula la proliferación de células mamarias aumentando así la división celular y la síntesis de ADN, lo que incrementa el riesgo de errores durante el proceso de replicación de ADN, lo que puede resultar en la adquisición de mutaciones que alteren procesos celulares como la apoptosis, la proliferación celular o la reparación del ADN. La segunda hipótesis propone que el metabolismo de los estrógenos da lugar a la producción de productos genotóxicos que pueden dañar directamente el ADN, resultando en mutaciones puntuales. Existen evidencias que los estrógenos podrían actuar mediante sendos mecanismos para iniciar o promover el cáncer de mama (Herynk y Fuqua, 2004) .

Algunos trabajos epidemiológicos de los años 90 describieron que tanto una edad tardía de menarquia como una menopausia precoz se encontraban asociadas a una disminución del riesgo a padecer cáncer de mama. Así, una fuente adicional de estrógenos circulantes ya sea exógena o endógena podría aumentar el riesgo a desarrollar un cáncer de mama. Sirva como ejemplo el resultado del Dr Huang y colaboradores, donde asociaban el aumento de peso en mujeres de edad adulta, a un mayor riesgo a padecer cáncer de mama ya que el tejido adiposo es una fuente endógena de estrógenos (Huang y cois., 1997).

Se ha propuesto que el gen ESRl está directamente implicado en el desarrollo de la glándula mamaria y en el cáncer de mama. El ratón adulto hembra con ausencia del gen Esrl (ERKO) exhibe glándulas mamarias similares a las que presentan los ratones hembras normales en edad prepuberal, con ausencia del desarrollo ductal y de los botones mamarios. Por otro lado, en modelos murinos con desarrollo de tumores mamarios de largo periodo de latencia, la ausencia del gen Esrl no aumenta la incidencia del desarrollo tumoral. En otros modelos murinos con expresión mamaria constitutiva del oncogén Neu, las hembras ERKO desarrollan tumores mamarios pero de comienzo tardío (Deroo y Korach, 2006). En otros modelos murinos de tumorigénesis mamaria promovida por estrógenos, la incidencia de tumores mamarios se minimiza con la pérdida del gen Esrl (Yoshidome y cois., 2000).

En humanos existen algunas variantes del gen ESRl previamente caracterizadas y asociadas a un riesgo diferencial a padecer cáncer de mama (Yaich y cois., 1992; Shin y cois., 2003; Wedren y cois., 2004; Boyapati y cois., 2005; Onland-Moret y cois., 2005; Shen y cois., 2006; González-Mancha, sometido). Se han publicado también diversas patentes que incluyen el análisis de variantes del gen ESRl como diagnóstico molecular del cáncer de mama:

• US2006166231, WO2006052731: Molecular indicators of breast cáncer prognosis and prediction of treatment response

• WO2006004597: Association of breast cáncer DNA methylation profiles with hormone receptor status and response to tamoxifen

• WO2004065545, US2004058340, WO02103320: Diagnosis and prognosis of breast cáncer patients

• WO2005033336: Materials and methods relating to breast cáncer diagnosis

• US2003186313, WO02057283: Methods and compositions in breast cáncer diagnosis and therapeutics

• US2006154267: Diagnosis and treatment of breast cáncer

Sin embargo, estas variantes por si solas no explican la totalidad de los casos de cáncer de mama, lo que sugiere que existen más variantes localizadas en el gen ESRl o en otros genes de la ruta estrogénica que pueden condicionar la aparición de la enfermedad.

Actualmente existen disponibles numerosas técnicas diagnósticas para el cáncer de mama como son la mamografía (que es una exploración que utiliza rayos X de baja potencia para detectar zonas anómalas en la mama), la ecograña (técnica que emplea ultrasonidos que son transformados en imágenes y sirve para diferenciar tumores líquidos o quistes de tumores sólidos), la Resonancia Magnética Nuclear RMN (emplea los campos magnéticos y los espectros emitidos por el fósforo en los tejidos corporales y los convierte en imagen y permite observar la vascularización del tumor), Tomografía por emisión de positrones (PET) (consiste en inyectar un radio fármaco combinado con glucosa que será captado por las células cancerosas, de existir un cáncer, pues éstas consumen más glucosa. El radio fármaco hará que se localicen las zonas donde se encuentre el tumor) o la biopsia (extracción de tejido para su posterior evaluación). A pesar del desarrollo que ha tenido el diagnóstico precoz del cáncer de mama usando éstas técnicas, sigue existiendo en este momento un gran interés en discernir aquellos grupos poblacionales que por su condición genética tengan un mayor riesgo a padecer cáncer de mama. Por esta razón, identificar patrones genéticos que confieran susceptibilidad a la enfermedad puede convertirse en una herramienta de gran utilidad sanitaria para llevar a cabo campañas de prevención en la población general.

Desarrollado el tumor, sobre el tejido extraído en la biopsia se suelen hacer unos ensayos moleculares destinados a detectar la presencia o ausencia de moléculas

específicas que permiten al médico realizar un diagnóstico molecular y una estimación del pronóstico de la enfermedad así como elegir el tratamiento que más convenga al paciente. Hoy en día se analizan las moléculas HER-2, p53, Ki67 y los receptores de progesterona y estrógenos de manera rutinaria. Estos análisis junto con el tamaño del tumor, el estado del nodo linfático y el grado histológico del tumor permiten al clínico clasificar y tratar el cáncer. Particularmente, el contenido del tumor en receptor de estrógenos es un conocido factor pronóstico favorable para el cáncer de mama, debido a si importante papel como mediador de la respuesta hormonal como la proliferación en tejidos sensibles a estrógenos. Sin embargo, es sabido que tumores aparentemente idénticos desde el punto de vista inmunohistoquímico pueden responder de forma diferencial a un mismo tratamiento. Es por tanto de relevancia encontrar patrones genéticos que puedan predecir que subgrupo de pacientes deberían ser tratadas de forma alternativa, tanto para asegurar la efectividad del tratamiento como para evitar efectos indeseables del mismo.

Por otro lado, se han identificado dos genes Breast Cáncer 1 (BRCAl) cuyas mutaciones son responsables de cáncer de mama en el 45% de las familias con cáncer de mama, y en el 80% de las familias con cáncer de mama y ovario; y Breast Cáncer 2 (BRCA2) responsable del 35% de los cáncer de mama en familias con múltiples casos de esta enfermedad. Sin embargo, es necesario resaltar que más del 90% de los casos de cáncer de mama no cuentan con un componente hereditario claro, ajustándose esta enfermedad así a un modelo de comportamiento poligénico.

Otras patentes cuyo objeto son métodos diagnósticos moleculares para el diagnóstico de cáncer de mama son:

• FR2882754: Detecting cáncer cells for diagnosis of breast cáncer, comprises detection of expression differences of protein kinase C epsilon and reduction in association of LIV 21 with E2F4.

• US2005019782: Diagnostic test kit for determining a predisposition for breast and ovarían cáncer, materials and methods for such determination.

6. Hipertensión arterial

Los estrógenos se han asociado tradicionalmente con un efecto cardioprotector, ya que mejoran el perfil lipídico a nivel sistémico y provocan aumento de prostaciclinas y óxido nítrico en el endotelio vascular; disminución de la producción de Tromboxano A2 y endotelina; acción antioxidante; bloqueo de canales de Calcio y apertura de canales de Potasio.

La hipertensión arterial (HE) es la enfermedad cardiovascular más común con una prevalencia cercana al 27% a nivel mundial. La HE es un factor de riesgo para el infarto, enfermedades cardiacas y enfermedades renales. La presión sanguínea elevada es una enfermedad compleja y multifactorial resultante de la interacción de múltiples factores genéticos y ambientales. Los factores genéticos explican entre un 30 y un 50% de la variabilidad interindividual de la presión sanguínea (PS) (Levy y cois., 2000; Lalouel, 2003; DeStefano y cois., 2004).

El dimorfismo sexual en la regulación de la PS se ha demostrado en varios estudios poblacionales (Burt y cois., 1995; DeStefano y cois., 2004) y en modelos animales (Reckelhoff, 2001). La PS ajustada por edad es mayor en hombres que en mujeres, pero esas diferencias se atenúan cuando las mujeres sufren menopausia. Estos hallazgos sugieren la presencia de mecanismos diferentes en la regulación de la PS en hombres y mujeres, lo que enfatiza la importancia de los niveles de las hormonas sexuales en la determinación de la PS.

Por ejemplo, los inhibidores de la enzima CYP 19 aromatasa encargada de la producción de estradiol presentan efectos antihipertensivos en animales con hipertensión genética y experimental (Griffing y cois., 1991; Melby y cois., 1993). Por lo tanto, variantes en genes que intervienen en la síntesis, el mecanismo de acción o el metabolismo de los estrógenos puede jugar un papel importante en la regulación de la PS.

La patente WO8808457 incluye el análisis de diversas variantes en el gen ESRl como método pronóstico para el desarrollo de hipertensión y osteoporosis.

Otras patentes que incluyen el análisis de variantes genéticas como métodos diagnóstico y/o pronóstico de la hipertensión son las siguientes:

• JP2007053995: "Method for judging essential hypertension" afecta a polimorfismos incluidos en el gen del Receptor de la hormona Folículo- estimulante (FSHR)

• CN 1912137: "Method for testing GRK4 gene polymorphic related to human essential hypertension" afecta al polimorfismo Ala486Val del gen Receptor de Kinasa 4 acoplado a proteína G, en inglés G protein-coupled receptor kinase 4 (GRK4)

• WO2004070057: "Use of a novel polymorphism in the hsgkl gene for the diagnosis of hypertension and use of the sgk gene family for the diagnosis and therapy of the long q/t syndrome" incluye el abálisis de los homólogos humanos de la familia génica serum/glucocorticoid regulated kinase (sgk). • JP2006101790, JP2006101789, US2006099594: "Method for evaluating risk of hypertension" incluye el análisis de polimorfismos genéticos pero no se indica el nombre de los genes.

• JP2006067902: "Diagnosis of hypertension risk using combination of genetic polymorphism and lifestyle" incluye el análisis de polimorfismos genéticos pero no se indica el nombre de los genes.

7. Síndrome Metabólico

El Síndrome Metabólico (SM) se define como la agregación en un individuo de múltiples alteraciones metabólicas que conllevan un significativo aumento del riesgo de enfermedades cardiovasculares.

Recientemente (Abril, 2005), la Federación Internacional de Diabetes (IDF,

International Diabetes Federation) ha hecho pública una definición del SM consensuada por expertos de todo el mundo (Alberti y cois., 2005). En esta nueva definición el criterio central es la presencia de obesidad abdominal, definida como una

circunferencia de cintura > 94 cm en hombres y 80 cm en mujeres. Además debe cumplir dos de los siguientes requisitos:

• Triglicéridos >150 mg/dl o en tratamiento específico. • HDL-colesterol < 40 mg/dl en hombres, 50 mg/dl mujeres o en tratamiento específico

• Hipertensión arterial: Presión arterial sistólica >130 mmHg o Presión arterial diastólica > 85 mmHg o en tratamiento antihipertensivo.

• Glucosa basal > 100 mg/dl o diagnóstico de DMII.

La influencia de los estrógenos sobre el SM viene demostrada por la implicación de estas hormonas sobre las características clínicas que definen al propio síndrome. Muestra de ello es la descripción de un individuo con deficiencia en el gen de la CYP 19 aromatasa. Este individuo mostraba SM caracterizado por obesidad abdominal, hiperinsulinemia, acantosis nigricans y enfermedad grasa del hígado no alcohólica (Maffei y cois., 2007). Esta observación pone de manifiesto el papel de los estrógenos en la etipoatogenia del SM.

Por otro lado, se ha publicado un estudio reciente en el que se propone la asociación de variantes del gen ESRl (PvuII y Xbal) con el riesgo a padecer infarto de miocardio en pacientes con SM (Lazaros y cois., 2007).

La única patente localizada que propone el análisis de polimorfismos genéticos como método diagnóstico para el Síndrome Metabólico es la JP2007054002 "Diagnosis and prevention of metabolic syndrome" que comprende el análisis de variantes en el gen Angiopoietin-1 (ANGPTl).

La presente invención por primera vez y de forma sorprendente relaciona la presencia o ausencia de una deleción en el gen ESRl con la hipersensibilidad a estrógenos. Para ello, en la presente invención, se ha observado de forma inesperada que la presencia de la deleción ESRl-NCDl tiene una relación directa con el crecimiento endometrial, en respuesta a estrógenos, en mujeres portadoras de la misma. El crecimiento endometrial

es un test conocido y equivalente a los tests uterotróficos empleados en modelos animales para detectar agentes xenoestrogénicos, al ser la proliferación de las células del endometrio completamente dependiente del estrógeno: estradiol. Asimismo, los estrógenos regulan tanto el tracto reproductivo femenino como masculino por lo que una mutación como la descrita en la presente invención en mujeres portadoras determina la hipersensibilidad a estrógenos y, cuando se detecta en hombres, dicha hipersensibilidad se relaciona directamente con la infertilidad masculina idiopática. Del mismo modo, la predisposición a padecer toda una serie de enfermedades estrógeno dependientes entre las que se citan: osteoporosis, cáncer de mama, infertilidad de pareja, hipertensión arterial o síndrome metabólico, se determina, como pone por primera vez de manifiesto la presente invención, analizando en muestras de individuos la presencia o ausencia de la deleción ESRl-NCDl.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención se refiere a un método de pronóstico y/o diagnóstico in vitro de hipersensibilidad a estrógenos o a sustancias con actividad estrogénica y, por lo tanto, de enfermedades ERD, mediante la identificación de una variante del gen humano del receptor de estrógenos alfa (ESRl), en el genoma de un individuo portador.

Más concretamente, la invención se refiere a un método en el que se determina la existencia en el ADN del individuo considerado de una deleción de 2244 nucleótidos localizada en el intrón 6 de dicho gen y/o se determina el nucleótido presente en la localización correspondiente a al menos un poliformismo seleccionado entre rs851995, rs3020314, o rs910416 del gen ESRl o rs4986938 del gen ESR2. Asimismo la invención también se refiere a los oligonucleótidos útiles para detectar variantes en dicho gen, kits que comprenden oligonucleótidos que facilitan llevar a cabo el método de la invención y al uso de una variante del gen ESRl que presenta la deleción de 2244 nucleótidos en el intrón 6 para fabricar dichos kits.

En la presente invención se expresan los resultados del análisis de la variante ESRl- NCDl en las enfermedades relacionadas con estrógenos arriba mencionadas,

demostrando que dicha deleción provoca un aumento de la sensibilidad de los estrógenos y sustancias con capacidad estrogénica en individuos que portan dicha variante en su ADN. Por lo tanto, la presente invención propone un método pronóstico y/o diagnóstico in vitro de enfermedades estrógeno dependientes, mediante la identificación de la presencia de la deleción ESR-NCDl en el genoma del individuo.

Así, la infertilidad masculina idiopática se considera como enfermedad estrógeno dependiente y, por lo tanto, la presente invención proporciona el uso de una variante genética del gen ESRl humano, denominada ESRl-NCDl, caracterizada por la presencia de una deleción de 2244 nucleótidos localizada en el intrón 6 de dicho gen, para pronosticar y/o diagnosticar in vitro la infertilidad masculina humana idiopática y/o la hipersensibilidad a estrógenos o sustancias con actividad estrogénica, bien porque la presencia de dicha variante se determine de forma independiente, o bien porque se determine adicionalmente el nucleótido presente en la localización correspondiente a al menos un polimorfismo del gen ESRl seleccionado de rs851995, rs3020314 o rs910416 o el polimosfismo rs4986938 del gen ESR2.

La identificación de la deleción de 2244 nucleótidos localizada en el intrón 6 del gen humano ESRl es totalmente novedosa, ya que no existe ningún trabajo publicado anteriormente, ni ninguna base de datos de acceso público, en los que se haga constar la existencia de la misma.

Tal y como se ha citado anteriormente un aspecto de la presente invención se basa en el diagnóstico y/o pronóstico de la infertilidad masculina idiopática ya que el gen ESRl humano influye de forma determinante en la producción espermática en el varón. La presencia en varones de la deleción a que se refiere la presente invención, una deleción de 2244 nucleótidos en el intrón 6 del gen ESRl, supondría una predisposición a que la producción de espermatozoides se viera disminuida, con lo que estos individuos tendrían más posibilidades de ser infértiles. Es por ello que otro objeto de la invención es un método de pronóstico y/o diagnóstico in vitro de la predisposición a padecer infertilidad masculina humana idiopática que comprende el aislamiento de una muestra de ADN genómico del individuo y la determinación en el mismo de la presencia o

ausencia de al menos una variante del gen del receptor de estrógenos alfa (ESRl) que se selecciona entre:

a) al menos un alelo portador de la deleción ESRl-NCDl en el intrón 6 de dicho gen; b) al menos un alelo portador de la forma del polimorfismo rs851995 en la que el nucleótido situado en la posición correspondiente a dicho polimorfismo es el que tiene como base nitrogenada adenina; c) al menos un alelo portador de la forma del polimorfismo rs3020314 en la que el nucleótido situado en la posición correspondiente a dicho polimorfismo es el que tiene como base nitrogenada citosina; d) al menos un alelo portador de la forma del polimorfismo rs910416 en la que el nucleótido situado en la posición correspondiente a dicho polimorfismo es el que tiene como base nitrogenada timina.

Se prefiere especialmente que se determine al menos la presencia o ausencia de la deleción ESRl-NCDl.

La determinación de la presencia o ausencia de la deleción ESRl-NCDl se puede realizar mediante el análisis de fragmentos del gen ESRl, previamente amplificados por PCR utilizando cebadores y condiciones de tiempo y temperatura que permitan la amplificación de un fragmento que comprenda parte o la totalidad de los 2244 nucleótidos de la deleción ESRl-NCDl a partir del alelo normal y que permitan también la amplificación de algún fragmento de secuencia del gen ESRl a partir del alelo portador de la deleción. Los cebadores y las condiciones de amplificación se elegirán de manera que las secuencias de los fragmentos amplificados a partir del alelo normal y del alelo portador de la deleción sean diferentes, pero la diferencia puede consistir en el que fragmento amplificado a partir del alelo portador de la deleción sea igual al fragmento amplificado a partir del alelo normal salvo porque el primero carezca de los nucleótidos correspondientes a la zona de la deleción o también es posible, como se explica más adelante, que los cebadores y condiciones se elijan para que las

diferencias en la secuencia de los fragmentos amplificados a partir de uno u otro alelo sean otras.

Una posibilidad para el diseño de la PCR es elegir los cebadores y las condiciones de reacción para que el fragmento amplificado a partir del alelo normal comprenda la zona correspondiente a la deleción en su totalidad y, por lo tanto, sea de un tamaño 2244 pb mayor que el fragmento amplificado a partir del alelo con la deleción. Esto puede conseguirse utilizando una pareja de cebadores cuyos respectivos sitios de unión estén localizados de manera que la zona correspondiente a la deleción esté comprendida entre ellos, es decir, el sitio de unión de uno de los cebadores estará más próximo a uno de los límites de la deleción mientras que el sitio de unión del otro cebador estará más próximo al límite opuesto de la deleción. Independientemente de esta condición, para que la amplificación sea posible, cada uno de los cebadores deberá unirse a una hebra diferente del cromosoma y se elegirán de manera que su orientación permita la amplificación del fragmento del cromosoma situado entre ellos.

La discriminación entre los productos de PCR amplificados a partir del alelo normal o a partir del alelo portador de la deleción aprovechando su diferencia de tamaño puede realizarse tras someterlos a electroforesis convencional, tal como, por ejemplo, en geles de agarosa polimerizados sobre superficies planas en los que se detecta la posición de las bandas por tinción con bromuro de etidio. En ese caso, para facilitar la detección y la discriminación de ambos fragmentos amplificados se prefiere que los cebadores de amplificación se elijan de manera que el alelo portador de la deleción de lugar a fragmentos de un tamaño de al menos 100 pares de bases, para facilitar la detección en el gel de la banda correspondiente al fragmento teñida con bromuro de etidio, pero que su tamaño no supere el orden de las decenas de kilobases, para facilitar su separación de la banda correspondiente al fragmento amplificado a partir del alelo normal y la discriminación entre ambas bandas. La región a la que corresponde SEQ ID NO:81, de 4800 pb, comprendida entre las zonas complementarias a los oligonucleótidos Al (SEQ ID NO:37) y A2 (SEQ ID NO:40) y que comprende la zona en la que puede presentarse la deleción, es una zona adecuada para la elección de los oligonucleótidos a utilizar como cebadores. Así, por ejemplo, puede utilizarse como cebador directo de

amplificación el oligonucleótido ED-F (SEQ ID NO:46), combinado con distintos cebadores de amplificación que se unen a zonas próximas a la zona de la deleción pero en el extremo contrario que el oligonucleótido ED-F (SEQ ID NO:46), como pueden ser los cebadores inversos R2 (SEQ ID NO:44), R3 (SEQ ID NO:45) ó A2 (SEQ ID NO:40), que dan lugar, respectivamente, a bandas de 239 pb (-0,3 kb), 809 pb (-0,8 kb) y 1696 pb (-1,7 kb) a partir del alelo portador de la deleción y a bandas de 2483 pb (-2,5 kb), 3053 pb (-3,0 kb) y 3940 pb (-3,9 kb) a partir del alelo normal, fácilmente separables de las correspondientes al alelo portador de la deleción. También puede utilizarse como cebador directo el oligonucleótido Al (SEQ ID NO:37), combinándolo, por ejemplo, con los oligonucleótidos R2 (SEQ ID NO:44), R3 (SEQ ID NO:45) ó A2 (SEQ ID NO:40) como cebadores inversos, dando lugar, respectivamente, a bandas de 1099 pb (-1,1 kb), 1669 pb (-1,7 kb) y 2556 pb (-2,6 kb) a partir de alelo portador de la deleción y a bandas de 3343 pb (-3,3 kb), 3913 pb (-3,9 kb) y 4800 pb (4,8 kb) a partir del alelo normal. De entre todas ellas, se prefiere la pareja de cebadores Al y R2, por dar lugar a bandas de tamaños (-1,1 y -3,3 kb) fáciles de discriminar tras aplicar una electroforesis convencional y detectables a simple vista con facilidad una vez teñidas con bromuro de etidio

Como medida de control adicional, las bandas separadas mediante electroforesis en geles de agarosa, pueden ser purificadas y secuenciadas. Se entiende por secuenciación la determinación del orden en el que se encuentran dispuestas las unidades constituyentes de una molécula de ADN, lo que, en el presente caso, significa la determinación del orden en el que aparecen los nucleótidos constituyentes de los productos de PCR o de fragmentos de los mismos. El análisis de la secuencia obtenida permitirá asegurar inequívocamente que los productos de PCR amplificados, separados por electroforesis y purificados se corresponden a fragmentos del alelo normal o del alelo portador de la deleción.

La secuenciación puede realizarse por cualquier método conocido de la técnica, como puede ser el método enzimático propuesto por Sanger (Sanger y cois., 1977) o alguna variante del mismo. El método Sanger de secuenciación del ADN se fundamenta en la síntesis interrumpida de una cadena de ADN, complementaria a la cadena sencilla que

actúa como molde y cuya secuencia queremos analizar. La síntesis se inicia a partir de un único cebador, el cebador de secuenciación, que se une específicamente a la región en que queremos iniciar la secuenciación. El cebador permite la incorporación de nucleótidos en dirección 5 '-3' mediada por la ADN polimerasa. Esta acción se ve interrumpida por la incorporación de nucleótidos sin el grupo hidroxilo en el carbono 3 '(2 '-3' dideoxinucleótido 5 ' trifosfato: ddNTP), y por tanto incapaces de enlazar con el nucleótido siguiente. Para la determinación del orden de los nucleótidos en la secuencia analizada, los productos de la reacción de secuenciación son separados posteriormente mediante métodos electroforéticos que discriminan por tamaño productos con un solo nucleótido de diferencia, obteniéndose así el orden en el que aparecen los nucleótidos en cada producto de PCR. Se prefiere, sin embargo, emplear una modificación de dicho método de secuenciación en la que la reacción de secuenciación se realiza en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos marcados con una molécula fluorescente distinta, realizándose la detección de los productos de la reacción mediante fluorescencia inducida por láser en cuatro canales espectrales específicos para cada marcador fluorescente, metodología utilizada para la identificación de la deleción en el Ejemplo 3 que aparece más adelante en la presente memoria.

Para realizar la secuenciación, se puede emplear como cebador de secuenciación, por ejemplo, cualquiera de los cebadores de amplificación usados para llevar a cabo las PCR en cada segmento específico. Por ejemplo, si para la reacción de PCR se han usado los cebadores de amplificación Al y A2, la secuenciación de los productos de PCR correspondientes al alelo con la deleción (2556 pb) y al alelo normal (4800 pb), una vez hayan sido separados mediante electroforesis y purificados, se podrá realizar en cada uno de los casos bien con el cebador Al o bien con el cebador A2. Si la secuenciación del fragmento amplificado a partir del alelo normal se realiza con el cebador Al se obtendrá la secuencia SEQ ID NO:81. Si la secuenciación del mismo fragmento se realiza con el cebador A2, se obtendrá la secuencia complementaria (y de sentido contrario) a la secuencia SEQ ID NO:81. En el caso de la secuenciación del fragmento amplificado a partir del alelo con la deleción, se obtendrán las mismas

secuencias que en el caso anterior aunque en cada una de ellas se advertirá la ausencia de los 2244 pb correspondientes a la deleción ESRl-NCDl.

En el caso de que vayan a procesarse un gran número de muestras, como podría ser el caso en la práctica clínica, se prefiere recurrir a otras técnicas para discriminar entre los productos amplificados a partir del alelo normal y los amplificados a partir del alelo portador de la deleción. En este caso, se prefiere a una estrategia de amplificación en la que la PCR se lleva a cabo en presencia de tres cebadores, uno de los cuales (directo o inverso) híbrida con el ADN genómico, en la zona correspondiente a la deleción y que, por tanto, sólo encontrará una secuencia complementaria a la que unirse en el caso del alelo normal, mientras que los otros dos cebadores (uno directo, complementario a una región situada en 5 ' con respecto a la deleción, y otro inverso, complementario a una región situada en 3' con respecto a la deleción) sí son complementarios a secuencias que se encuentran tanto en el alelo normal como en el alelo portador de la deleción. En ese caso, las condiciones de amplificación de la PCR se eligen de manera que el alelo normal sólo pueda dar lugar a la amplificación del fragmento del mismo comprendido entre el cebador unido a la zona de la deleción y el correspondiente cebador (bien el directo o bien el inverso, según el caso) con el que pueda formar una pareja de amplificación y que se una a una zona del gen ESRl presente tanto en el alelo normal como en el alelo portador de la deleción deleción. Un ejemplo de dicha estrategia de amplificación para la posterior secuenciación mediante pirosecuenciación se describe en el Ejemplo 4, en el que el oligonucleótido ED-RW (SEQ ID NO:47), utilizado como cebador inverso, es específico para el alelo normal, por encontrar una secuencia complementaria sólo en la zona de la deleción, mientras que los oligonucleótidos ED-F (SEQ ID NO:46) (cebador directo) y R2 (SEQ ID NO:44) (cebador inverso), encuentran zonas complementarias a las que unirse tanto en el alelo normal como en el alelo portador de la deleción, uniéndose el primero a la zona situada en 5' con respecto a la deleción y el segundo a la situada en 3' con respecto a la misma. Sin embargo, las condiciones de amplificación utilizadas en dicho Ejemplo 4 son tales que, en el caso del alelo normal, la distancia entre ED-F y R2 resulta excesiva para que se amplifique el fragmento completo situado entre ambos cebadores, de manera que, en el caso del alelo

normal, en presencia de los tres cebadores, sólo se amplifica el fragmento comprendido entre ED-F (SEQ ID NO:46) y ED-RW (SEQ ID NO:47).

La elección de esta estrategia de amplificación posibilita la obtención de fragmentos de tamaños adecuados para ser analizados recurriendo a metodologías como, por ejemplo, la secuenciación a tiempo real de los productos de PCR por pirosecuenciación. Se tiene preferencia por la utilización de esta técnica, pues facilita el procesamiento de un gran número de muestras, la automatización del mismo y el acortamiento de los tiempos de ensayo. Las bases técnicas de esta técnica pueden encontrarse en la página web http://www.pysequencing.com. Brevemente, la técnica se basa en la adición de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) uno por uno al ADN molde monocatenario previamente amplificado por PCR y al que está unido un oligonucleótido que actúa como cebador en la reacción de secuenciación, la detección de la incorporación del desoxinucleótido añadido a la cadena naciente complementaria a dicho ADN molde mediante la detección del piro fosfato liberado acoplándolo a una pareja de reacciones que dan lugar a la emisión de luz y la degradación de los dNTP no incorporados gracias a la presencia de la enzima apirasa en la mezcla de reacción.

Se prefiere especialmente que los tres cebadores utilizados para la amplificación previa a la pirosecuenciación sean precisamente los utilizados en el Ejemplo 4, ED-F (SEQ ID

NO:46), ED-RW (SEQ ID NO:47) y R2 (SEQ ID NO:44), lo cuales, tanto en el caso del alelo normal como en el caso del alelo portador de la deleción, dan lugar a fragmentos de longitudes adecuadas para ser analizados por pirosecuenciación. En dicho Ejemplo 4, el cebador de secuenciación usado es ED-S (SEQ ID NO:48). Este cebador se une al segmento complementario a la zona en 5 ' contigua a la deleción tanto en el alelo normal como en el alelo portador de la deleción. Los 5 nucleótidos del extremo 3 ' del cebador ED-S (SEQ ID NO:48) se unen a los 5 nucleótidos complementarios al extremo 5 ' de la región afectada por la deleción, mientras que en el alelo con la deleción, los 5 nucleótidos del extremo 3' del cebador ED-S (SEQ ID NO:48) se unen a los 5 nucleótidos complementarios a la región en 3' contigua a la región afectada por la deleción. Por tanto, el cebador ED-S (SEQ ID NO:48) puede

utilizarse como cebador de secuenciación tanto para el alelo normal como para el alelo portador de la deleción.

Otro método alternativo para la detección de la presencia de la deleción ESRl-NCDl analizando fragmentos generados utilizando la estrategia de amplificación descrita en la que la PCR se lleva a cabo en presencia de tres cebadores consiste en la discriminación de los fragmentos amplificados a partir del alelo normal y del alelo portador de la deleción sometiéndolos a electroforesis capilar y detectándolos gracias a que se acoplan a alguna molécula marcadora, preferiblemente una molécula fluorescente, lo que permite recurrir a electroforesis capilar acoplada a fluorescencia. Para ello, el cebador de amplificación común a ambos fragmentos amplificados, o alternativamente los dos cebadores específicos para cada fragmento amplificado, han de estar marcados en su extremo 5' con una molécula fluorescente. La determinación del tamaño de cada fragmento amplificado se realiza comparando el tiempo que tarda en detectarse la señal correspondiente al marcador acoplado a cada fragmento amplificado con respecto al tiempo que tarda en captarse la fluorescencia de marcadores de tamaño conocido. Al igual que en el caso de la pirosecuenciación, se prefiere que los cebadores utilizados para la amplificación de fragmentos que vayan a ser analizados mediante esta metodología sean los utilizados en el Ejemplo 4, ED-F (SEQ ID NO:46), ED-RW (SEQ ID NO:47) y R2 (SEQ ID NO:44).

Constituye también un objeto de la invención uno cualquiera o cualquier combinación de los oligonucleótidos diseñados para el desarrollo y ejecución de la invención, los oligonucleótidos cuya secuencia se indica en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 (Al), SEQ ID NO:38 (A3), SEQ ID NO:39 (A4), SEQ ID NO:40 (A2), SEQ ID NO:41 (Fl), SEQ ID NO:42 (F2),

SEQ ID NO:43 (Rl), SEQ ID NO:44 (R2), SEQ ID NO:45 (R3), SEQ ID NO:46 (ED- F), SEQ ID NO:47 (ED-RW), SEQ ID NO:48 (ED-S), SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO:62 o las combinaciones de los mismos. De ellos, se tiene especial preferencia por los del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:37 (Al), SEQ ID NO:38 (A3), SEQ ID NO:39 (A4), SEQ ID NO:40 (A2), SEQ ID N0:41 (Fl), SEQ ID NO:42 (F2), SEQ ID NO:43 (Rl), SEQ ID NO:44 (R2), SEQ ID NO:45 (R3), SEQ ID NO:46 (ED- F), SEQ ID NO:47 (ED-RW), SEQ ID NO:48 (ED-S) y sus combinaciones, por su proximidad a las zonas en las que se encuentran los polimorfismos rs851995, rs3020314, rs910416 y la deleción NCDl-ESRl cuya presencia o ausencia se detecta en el método de la invención.

Las composiciones que comprendan al menos uno de los oligonucleótidos cuya secuencia se indica en SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:14, SEQ ID N0:15, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37 (Al), SEQ ID NO:38 (A3), SEQ ID NO:39 (A4), SEQ ID NO:40 (A2), SEQ ID NO:41 (Fl), SEQ ID NO:42 (F2), SEQ ID NO:43 (Rl), SEQ ID NO:44 (R2), SEQ ID NO:45 (R3), SEQ ID NO:46 (ED-F), SEQ ID NO:47 (ED-RW), SEQ ID NO:48 (ED-S), SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61 y SEQ ID NO: 62 o combinaciones de los mismos, están comprendidas también dentro del alcance de la presente invención.

Los oligonucleótidos que poseen las secuencias SEQ ID NO:37 (Al), SEQ ID NO:38 (A3), SEQ ID NO:39 (A4), SEQ ID NO:40 (A2), SEQ ID NO:41 (Fl), SEQ ID NO:42 (F2), SEQ ID NO:43 (Rl), SEQ ID NO:44 (R2), SEQ ID NO:45 (R3), SEQ ID NO:46 (ED-F), SEQ ID NO:47 (ED-RW) son oligonucleótidos complementarios a zonas del intrón 6 que pueden ser utilizados como cebadores para la amplificación de fragmentos de ADN de dicho intrón en los que puede aparecer la deleción ESRl-NCDl y que son, por tanto, útiles para llevar a cabo el método de pronóstico y/o diagnóstico de la invención. Cualquier kit de ensayo que comprenda al menos uno de los oligonucleótidos Al (SEQ ID NO:37), ), A3 (SEQ ID NO:38), A4 (SEQ ID NO:39), A2 (SEQ ID NO:40), Fl (SEQ ID NO:41), F2 (SEQ ID NO:42), Rl (SEQ ID NO:43), R2 (SEQ ID NO:44), R3 (SEQ ID NO:45), ED-F (SEQ ID NO:46), ED-RW (SEQ ID NO:47) o ED-S (SEQ ID NO:48) o combinaciones de los mismos constituye también un objeto de la invención. Al (SEQ ID NO:37), A4 (SEQ ID NO:39), Fl (SEQ ID NO:41), F2 (SEQ ID NO:42), ED-F (SEQ ID NO:46) y ED-S (SEQ ID NO:48) se unen a la hebra complementaria a aquella de la que se muestra un fragmento de secuencia en SEQ ID NO:63 y SEQ ID NO:81 y pueden ser utilizados como cebadores directos de amplificación o de secuenciación para una región que comprenda parte o la totalidad de la zona que se pierde en el alelo portador de la deleción, mientras que A3 (SEQ ID NO:38), A2 (SEQ ID NO:40), Rl (SEQ ID NO:43), R2 (SEQ ID NO:44), R3 (SEQ ID NO:45) y ED-RW (SEQ ID NO:47) pueden ser utilizados como cebadores inversos de amplificación o de secuenciación de una región que comprenda parte o la totalidad de la zona que se pierde en el alelo portador de la deleción. Los kits de la invención pueden comprender uno o más de los oligonucleótidos del grupo de Al (SEQ ID NO:37), A4 (SEQ ID NO:39), Fl (SEQ ID NO:41), F2 (SEQ ID NO:42), ED-F (SEQ ID NO:46) y ED-S (SEQ ID NO:48) y/o uno o más de los oligonucleótidos del grupo de A3 (SEQ ID NO:38), A2 (SEQ ID NO:40), Rl (SEQ ID NO:43), R2 (SEQ ID NO:44), R3 (SEQ ID NO:45) y ED-RW (SEQ ID NO.47). Se prefieren los kits que comprendan al menos un oligonucleótido del grupo de los que pueden actuar como cebador directo y un oligonucleótido del grupo de los que pueden actuar como cebador inverso, kits que facilitan llevar a cabo las distintas realizaciones del método de la invención anteriormente descritas. Son realizaciones posibles de los kits de ensayo de la

invención aquellos que comprendan al menos una pareja de oligonucleótidos seleccionada de las parejas: a) Al (SEQ ID NO:37) y R2 (SEQ ID NO:44); b) Al (SEQ ID NO:37) y R3 (SEQ ID NO:45); c) Al (SEQ ID NO:37) y A2 (SEQ ID NO:40); d) ED-F (SEQ ID NO:46) y ED-RW (SEQ ID NO:47); e) ED-F (SEQ ID NO:46) y R2 (SEQ ID NO:44), f) ED-F (SEQ ID NO:46) y R3 (SEQ ID NO:45); g) ED-F (SEQ ID NO:46) y A2 (SEQ ID NO:40);

o combinaciones de las mismas y, opcionalmente, el oligonucleótido ED-S (SEQ ID NO:48).

La presencia de posibles marcadores acoplados a los oligonucleótidos, los marcadores concretos elegidos, los restantes componentes presentes en el kit y los oligonucleótidos concretos elegidos para el mismo dependerán de la realización del método de la invención en la que vayan a utilizarse. Por ser particularmente adecuadas para realizaciones del método de la invención descritas en la presente memoria, se tiene preferencia por los kits que comprenden: i.i. al menos la pareja de oligonucleótidos Al (SEQ ID NO:37) y R2 (SEQ ID

NO:44) y, opcionalmente, dNTPs, una ADN polimerasa I o el fragmento Klenow de la misma y un tampón, concentrado o a una concentración tal que pueda actuar en él dicha polimerasa; i.ii. al menos la pareja de oligonucleótidos Al (SEQ ID NO:37) y R2 (SEQ ID NO:44) y, opcionalmente, dNTPs, una ADN polimerasa termoestable y un tampón, concentrado o a una concentración tal que pueda actuar en él dicha polimerasa ; i.iii. al menos la pareja de oligonucleótidos ED-F (SEQ ID NO:46) y R2 (SEQ ID NO:44) y la pareja de oligonucleótidos ED-F (SEQ ID NO:46) y ED-RW (SEQ ID NO:47), es decir, el trío de oligonucleótidos ED-F, R2 y ED-RW y, opcionalmente, dNPTs, una ADN polimerasa termoestable, un tampón, concentrado o a una concentración tal que pueda actuar en él dicha polimerasa y, también opcionalmente, el oligonucleótido ED-S (SEQ ID NO:48), kit en el que al menos un miembro de cada una

de las parejas de oligonucleótidos está acoplado por su extremo 5' a un marcador que permite su detección. Una posibilidad es que los oligonucleótidos ED-RW (SEQ ID NO:47) y R2 (SEQ ID NO:44) estén marcados en 5'; de entre los marcadores, un marcador posible es la biotina. Otra posibilidad es que el oligonucleótido ED-F (SEQ ID NO:46) esté marcado en 5'; de entre los marcadores, son marcadores posibles los fluorocromos como, por ejemplo, Cy5.

Adicionalmente, cualquiera de los kits puede contener uno o más de los oligonucleótidos del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, lo que les haría especialmente útiles en realizaciones del método de la invención en las que, adicionalmente a determinar la presencia o ausencia del alelo portador de la deleción, se determine el nucleótido presente en las localizaciones correspondientes a al menos uno de los polimorfismos rs851995 (SNPl), rs3020314 (SNP7) o rs910416 (SNP 14) del gen ESRl humano. Se prefiere que, cuando el kit comprenda uno o más de los oligonucleótidos del grupo de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28, comprenda también el correspondiente oligonucleótido con el que pueda formar pareja para actuar como cebadores para la amplificación de una zona en la que esté comprendido el polimorfismo al que estén próximos, es decir, que el kit comprenda al menos una de las parejas seleccionadas del grupo de:

h) SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2; i) SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO: 14; j) SEQ ID NO:27 y SEQ ID NO:28,

o combinaciones de las mismas. Se prefiere especialmente que uno de los oligonucleótidos de cada pareja esté acoplado en 5' a un marcador, marcador que puede ser, por ejemplo, biotina.

La utilidad de la invención se pone de manifiesto presentando un estudio de asociación genético de infertilidad idiopática masculina en 166 varones infértiles idiopáticos y 465

individuos procedentes de la población general española., que se detalla e ilustra mediante los Ejemplos y Figuras que aparecen a continuación.

Dicho estudio es compatible con observaciones realizadas en animales portadores de mutaciones en el gen ESRl (Korach, 1994), como en otros estudios de asociación genética recientemente publicados en los que se describe la asociación de otras variantes del gen ESRl humano con la infertilidad idiopática masculina (Kukuvitis y cois., 2002; Suzuki y cois., 2002; Galán y cois., 2005; Guarducci y cois., 2006).

En la presente invención además del hallazgo relacionado con la influencia del gen ESRl humano en la producción espermática del varón que posibilitó el pronóstico y/o diagnóstico de la infertilidad masculina idiopática, o la predisposición a padecerla, mediante la determinación de la presencia o ausencia de una deleción de 2244 nucleótidos localizada en el intrón 6 del gen humano del receptor de estrógenos alfa (ESRl), se concluyó que la presencia y ausencia de dicha deleción en el ADN genómico del individuo era también una herramienta de pronóstico y/o diagnóstico in vitro de la hipersensibilidad a estrógenos o de la predisposición a padecer otras enfermedades estrógeno dependientes (ERD) entre las que se encuentran entre otras: cáncer de mama, osteoporosis, hipertensión arterial, infertilidad de pareja o síndrome metabólico. La presente invención comprende, además, que el pronóstico/diagnóstico de la infertilidad masculina idiopática o, en general, de la hipersensibilidad a estrógenos, se base en la detección, conjuntamente con la deleción ESRl-NCDl, de alguno de los siguientes polimorfismos del gen ESRl: rs851995, rs3020314 y rs910416. Es más, la invención también contempla, en el caso del pronóstico/diagnóstico de la hipersensibilidad a estrógenos, que dicho pronóstico/diagnóstico se base, además de en una deleción y los polimorfismos anteriormente mencionados en el gen ESRl, en la detección del polimorfismo rs4986938 del gen ESR2.

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 muestra un esquema que representa al gen humano ESRl. Las líneas verticales gruesas situadas sobre la horizontal representan los ocho exones del gen, mientras los fragmentos situados entre ellas representan los intrones. Las flechas indican la localización de los polimorfismos que constituyen el panel de marcadores utilizado en proceso de identificación de ESRl-NCDl descrito más adelante. El recuadro que incluye varias flechas sirve para resaltar los marcadores a los que se hace referencia en el documento JP2006061128.

La Fig. 2 representa el resultado de la genotipación del marcador SNP 13 (rs3020375) en el núcleo familiar NF 18. El cuadrado representa al progenitor masculino, el círculo a su derecha representa al progenitor femenino y el círculo situado en la parte inferior representa al descendiente femenino. El genotipo del marcador SNP 13 de cada miembro del NF 18 se indica con letras bajo el correspondiente símbolo.

La Fig. 3 muestra los gráficos obtenidos en el estudio de parentesco en diferentes núcleos familiares. Cada recuadro abarca los resultados obtenidos en un núcleo familiar para el marcador microsatélite cuya denominación se indica sobre el recuadro. En cada recuadro, el gráfico superior fue el obtenido para la madre, el gráfico intermedio fue el obtenido para el padre y el gráfico inferior fue el obtenido para el descendiente de ambos. En cada gráfico, los picos de superior altura junto a los cuales aparece un número recuadrado corresponden a los alelos de cada marcador presentes en cada individuo analizado, mientras el número recuadrado corresponde al tamaño en nucleótidos de cada alelo. Los picos de menor altura junto a los cuales no aparece ningún número recuadrado corresponden al marcador de peso molecular.

La Fig. 4 muestra los gráficos obtenidos en el núcleo familiar NF 18 tras la secuenciación de los marcadores SNP15, SNP16, SNP17, SNP18 y SNP19, que aparecen junto a su correspondiente pareja de gráficos junto al borde izquierdo de la página. La columna derecha de gráficos corresponde al padre del NF 18, mientras la columna izquierda corresponde a la madre. La posición exacta de cada marcador analizado se indica delimitándolo entre barras. Las letras que aparecen sobre los picos indican los nucleótidos presentes en cada posición mediante la abreviatura de su

correspondiente base nitrogenada: A: adenina; G: guanina; C: citosina; T: timina; R: guanina y adenina; K: guanina y timina; M: adenina y citosina; S: guanina y citosina.

La Fig. 5 es una representación esquemática de la región crítica del intrón 6 del gen ESRl humano comprendida entre los polimorfismos rs3798573 (SNP 15) y rs9397483

(SNP 16) dentro de la cual se localiza la deleción ESRl-NCDl y de los cebadores útiles para su análisis. Las flechas verticales gruesas indican la localización de cada uno de dichos polimorfismos, mientras la flecha vertical más delgada indica la localización del rs3020375 (SNP 13). Las flechas horizontales cortas, situadas sobre la línea horizontal gruesa que representa al fragmento del intrón, indican los lugares a los que se unen los cebadores indicados sobre las flechas.

La Fig. 6 muestra los gráficos obtenidos en la secuenciación del alelo normal de referencia (gráfico superior, marcado como ESRl-NM) y del alelo que presenta la deleción (gráfico inferior, marcado como ESRl-NCDl), ambos obtenidos del padre del núcleo familiar NF 18. Las barras verticales delimitan la posición a partir de la cual difieren los alelos y, por tanto, el límite de la deleción ESRl-NCDl.

La Fig. 7 muestra la secuencia del fragmento de 3343 nucleótidos del intrón 6 del gen ESRl humano comprendido entre los lugares a los que se unen los cebadores Al (SEQ ID NO:37) y R2 (SEQ ID NO:44). Las zonas con las que hibridan dichos cebadores se indican con fondo oscuro sobre los nucleótidos correspondientes. Los nucleótidos subrayados son los que se pierden en la variante ESRl-NCDl.

La Fig. 8 se refiere a la genotipación de la variante ESRl-NCDl. La Fig. 8a, es una representación de los alelos normal (ESRl-NM) y con la deleción (ESRl-NCDl), en la que las líneas continuas representan la zona genómica común a ambos alelos y la línea discontinua representa la zona genómica que comprende la deleción ESRl-NCDl. Sobre ambos alelos se indican con flechas los lugares a los que se unen los cebadores de amplificación ED-F (SEQ ID NO:46), ED-RW (SEQ ID NO:47) y R2 (SEQ ID NO:44) y el cebador de secuenciación ED-S (SEQ ID NO:48). La Fig. 8b muestra gráficas obtenidas en la genotipación de individuos respecto a los alelos correspondientes a la

ausencia (ESRl-NM) o presencia de dicha variante (ESRl-NCDl). Los gráficos de la izquierda, encabezados por la abreviatura "PyrSq" se obtuvieron utilizando la técnica de pirosecuenciación, mientras los gráficos de la derecha, encabezados por la abreviatura "FluoSq", se obtuvieron utilizando electroforesis capilar acoplada a la detección fluorescente de los alelo s. El resultado obtenido en la genotipación se indica a la izquierda de cada pareja de gráficos obtenidos por una técnica diferente: Hom DD: individuo homocigótico para la variante en la que está presente la deleción; Hom ll: individuo homocigótico para el alelo normal, es decir, la variante en la que está ausente la deleción; Het ID: individuo heterocigótico.

Fig. 9. Representación de la distribución en campana de gauss a la que se ajusta la producción de folículos en mujer sometidas a hiperestimulación ovárica controlada. En el eje de abscisas se representa la frecuencia y en el eje de ordenadas en número de folículos.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

Sujetos incluidos en el estudio

Para llevar acabo esta invención se seleccionaron varios grupos de individuos con las enfermedades en estudio y otros individuos sanos. Todos los individuos incluidos en el estudio son de raza caucásica y proceden de la población general Española. Este criterio de selección se aplicó con el objetivo de evitar problemas de estratificación en los análisis genéticos que se realizaron durante la invención, es decir, para no tener que hacer divisiones de la población en subgrupos separados, cada uno de los cuales tuviera que ser muestreado independientemente.

Todos los individuos incluidos en el estudio aportaron un consentimiento informado para la participación en el mismo. Los comités éticos de los centros de referencia y Neocodex S. L. han aprobado todos los protocolos llevados a cabo en este estudio. El almacenamiento de ADN y los análisis genéticos en este estudio cumplen con las regulaciones internacionales referidas a la colección, tratamiento, almacenamiento y uso

de los datos genéticos (International Bioethics Committee, UNESCO SHS- 503/200 l/CIB-8/3).

Infertilidad idiopάtica masculina

- Grupo 1: Grupo de casos constituido por 166 varones con infertilidad idiopática. Todos estos individuos cumplían los siguientes criterios de inclusión para los pacientes en nuestro estudio: i) azoospermia u oligozoospermia severa (menos de 5 millones de espermatozoides por mililitro de semen eyaculado); ii) ausencia de cualquier causa conocida de infertilidad como criptorquidismo, varicocele (presencia de venas varicosas en el escroto), azoospermia obstructiva, infecciones recurrentes, infertilidad iatrogénica (provocada por tratamiento médico), hipogonadismo hipogonadotrópico, o anomalías en el cariotipo; iii) ausencia de microdeleciones en el cromosoma Y según la metodología propuesta por Simoni y cois., (2004).

- Grupo 2: Grupo de controles constituido por 465 individuos varones no relacionados.

- Grupo 3: 129 núcleos familiares (NF) formados por los dos progenitores y al menos un descendiente. Los progenitores de estos NF se sometieron a la técnica ICSI para conseguir tener descendencia. Además, se incluyeron en este grupo dos NF que pudieran actuar como controles negativos de parentesco en los estudios de paternidad, por ser núcleos familiares en los que los progenitores masculinos son donantes anónimos de esperma de los que no se disponen de muestras de ADN; en cada uno de esos dos grupos, por tanto, el miembro del grupo que figuraba como "padre" no era realmente el padre biológico del correspondiente descendiente.

Respuesta a la Hiperestimulaciόn Ovάrica Controlada (HOC)

Se analizaron un total de 366 mujeres sometidas a ciclos de reproducción asistida mediante ICSI o fertilización in vitro (FIV). Las pacientes recibieron un tratamiento con rFSH para la estimulación ovárica, junto con un GnRHa para el frenado hipofisario. El desarrollo y crecimiento folicular se evaluó por sonografía transvaginal a partir del sexto

día de estimulación y cada uno de los días posteriores. Finalmente, la ovulación es inducida por una simple inyección (5000-10000 IU) de hCG en mujeres con un mínimo de 3 folículos y un diámetro mayor a 18 mm. Los oocitos fueron obtenidos por métodos convencionales previamente descritos, a través de punción transvaginal dirigida mediante una ecografía (Dellenbach y cois., 1985). La técnica de FIV o ICSI se realizaron de acuerdo al protocolo original (Lopata y cois., 1980; Edwards y cois., 1980).

Infertilidad a nivel de pareja

Para el estudio del efecto de la variante ESRl-NCDl sobre la infertilidad a nivel de pareja seleccionamos dos grupos de individuos. El primer grupo está constituido por 129 parejas infértiles que no lograron embarazo por métodos naturales y que tuvieron que ser sometidos a la técnica de reproducción Inyección Intracitoplasmática de Esperma, en inglés Intacytoplasmatic Sperm Injection (ICSI). Estas parejas infértiles son las que se incluyeron en la patente original para la identificación y caracterización de la variante ESRl-NCDl. El segundo grupo está constituido por 100 parejas de fertilidad probada que lograron embarazo por métodos naturales.

Osteoporosis

Se estudiaron un total de 949 mujeres posmenopáusicas de etnia caucasiana procedentes de la misma localización geográfica. Para cada mujer se obtuvieron los datos de Densidad Mineral ósea (DMO) empleando técnicas densitométricas. La definición de osteoporosis empleada aquí es la siguiente:

Valores de T score derivados de la densitometría mineral ósea lumbar vertebtal (L1-L4) por debajo de -2,5 o el diagnóstico previo de fractura osteoporótica (Ettinger y cois., 1998). Finalmente, el grupo de mujeres analizadas quedaron divididas en 445 (46,89%) osteoporóticas y 504 (53,11%) no osteoporóticas.

Los valores de DMO pueden ser referidos como unidades de T score. El término T score se refiere al número de desviaciones estándar a partir del valor medio de referencia para

adultos jóvenes. La OMS define DMO normal si ésta se encuentra dentro de una desviación estándar a partir del valor medio de referencia para un adulto joven (T score > -1). La osteopenia se define por un T score entre -1 y -2,5. Mientras que la osteoporosis se define como un T score meor de -2,5.

También desarrollamos un intenso análisis clínico y epidemiológico de cada mujer incluida en este estudio. Los datos clínicos se obtuvieron usando un cuestionario desarrollado por los investigadores clínicos implicados en este estudio. Varias características clínicas consideradas previamente como factores de riesgo para la osteoporosis como la edad, el peso, el consumo de alcohol y el hábito de fumar también se recogieron para cada mujer. Además, se evaluó la causa de manopáusia (natural, benigna o cáncer) y distribución de grasa corporal (ginecoide, androide o ninguna). Los resultados epidemiológicos referentes a los factores de riesgo conocidos apoyan la validez de la selección de las mujeres y la fidelidad del registro de los datos clínicos y epidemiológicos llevados a cabo.

Cáncer de mama

Los individuos analizados consisten en 507 mujeres que desarrollaron un cáncer de mama entre los 23 y 88 años de edad, que fueron operadas de cáncer de mama entre 1989 y 2006. En todas estas mujeres se realizaron biopsias del tumor donde se desarrolló el diagnóstico anatomopatológico, se obtuvieron datos relativos al tratamiento, y un seguimiento detallado hasta detectarse el primer evento de progresión, entendiéndose ésta como la aparición de metástasis o una recidiva local.

Como población de referencia se estudiaron 715 muestras de ADN de mujeres Españolas de entre 34 y 82 años, provenientes de la misma área geográfica (centro y sur peninsulares) con en fin de evitar posibles confusiones en los resultados atribuibles a fenómenos de microestratificación.

Tanto en caso de las pacientes de cáncer de mama como en aquellas mujeres incluidas en el estudio como controles se recogieron varios datos epidemiológicos asociados al riesgo

de cáncer de mama como la edad de menarquia, edad de menopausia, paridad, etc, a fin de ajustar los estimadores estadísticos al analizar los datos genéticos. Es necesario mencionar que la serie de estudio del cáncer de mama contaba ya con varios marcadores genéticos de la ruta estrogénica y otras rutas metabólicas (ESRl, ESR2, CYP 19, BMP 15, RIP 140, entre otros), lo que nos ha permitido hasta la fecha subclasificar a cada paciente de acuerdo con su fondo genético y nos ha ayudado a determinar diversos factores de riesgo genéticos en la población general. En la literatura se pueden encontrar una serie de trabajos de base genética que han contribuido recientemente a un mayor conocimiento de la etiología del cáncer de mama en nuestra población. Es por tanto una serie de estudio previamente evaluada por revisores externos y una fuente fiable sobre la que contrastar las hipótesis generadas en el laboratorio (Royo y cois., 2006).

Hipertensión arterial

Para analizar el efecto de la variante ESRl-NCDl sobre la hipertensión arterial, se reclutaron un total de 1219 mujeres de la población general española. Para desarrollar las correlaciones genotipo-fenotipo los individuos incluidos en el estudio se clasificaron en dos grupos atendiendo a dos parámetros:

1) Hipertensión sistólica: Presión sanguínea sistólica mayor o igual a 130 mmHg

2) Hipertensión diastólica: Presión sanguínea diastólica mayor o igual a 90 mmHg

Las presiones sanguíneas sistólicas y diastólicas se midieron tres veces en posición de reposo tras diez minutos de descanso.

Síndrome Metabόlico

Para analizar el efecto de la variante ESRl-NCDl sobre la probabilidad de padecer SM, analizamos un total de 1135 individuos de etnia caucasiana provinientes de la población general española. Estos individuos fueron divididos en dos grupos atendiendo a si

presentaban SM según la definición de la IDF en individuos con SM (n=517) y sin SM (n=618).

Extracción de ADN genómico

Todos los individuos incluidos en el estudio aportaron una muestra de 5 mi de sangre periférica. El ADN genómico de cada individuo se extrajo a partir de los leucocitos presentes en cada muestra de sangre. La extracción de ADN se llevó a cabo en la estación automática MagNa Puré LC (Roche Diagnostics, Suiza) usando el kit MagNa Puré LC Isolation kit Large Volume (Roche Diagnostics, Suiza) según las instrucciones del fabricante. Para los análisis genéticos se prepararon alícuotas de ADN genómico a una concentración de 10 ng/μl, el resto del stock se criopreservó a -2O ⁰ C. Secuencia nucleotídica empleada

La secuencia de ADN empleada para llevar a cabo el estudio, corresponde a la secuencia genómica del gen ESRl . Esta secuencia está incluida en un "Contig" o un conjunto de segmentos genómicos contiguos (Contig Genómico NT 025741) que está disponible para el público en general en la base de datos pública GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Dicho "Contig" comprende los nucleótidos 95.937.265 a 157.582.649 del cromosoma 6 humano en la construcción 36.2 del genoma humano.

El gen ESRl humano se encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma 6, en la región 6q25.1. Este gen comprende unas 296 Kilobases de ADN genómico y está constituido por 8 exones separados por siete intrones. La información concerniente a cualquier polimorfismo localizado en este gen y que se haya usado en este trabajo se obtuvo a partir de la base de datos de SNP de GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) o de la base de datos del Proyecto Internacional HapMap (www.hapmap.org).

En la presente memoria se indica la secuencia de los fragmentos de la región correspondiente al Contig Genómico NT 025741 relevantes para la comprensión de la presente invención y de su desarrollo. La localización cromosómica de dichas secuencias

y de los polimorfismos utilizados para el desarrollo de la invención se han obtenido a partir de la segunda fase del proyecto internacional HapMap (Julio de 2006) en la liberación pública de datos 21. Estos datos se basan en la construcción 35 del genoma humano del National Centre for Biotechnology Information NCBI.

Cálculos estadísticos

Para la comparación de las frecuencias alélicas y distribuciones genotípicas entre los grupos de individuos incluidos en la invención, así como para el análisis del Equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) de los marcadores analizados en los mismos grupos se emplearon tests estadísticos adaptados de Sasieni (1997). Estos cálculos se desarrollaron utilizando la web del Instituto de Genética Humana de Munich, Alemania (http://ihg.gsf.de).

Para el análisis de las distribuciones haplotípicas entre casos y controles se empleó fundamentalmente el software THESIAS (http://www.genecanvas.org), basado en el algoritmo SEM (Tregouet y cois., 2004). Este software realiza la construcción de haplotipos y la estimación de frecuencias. Este programa permite, además, la estimación de los efectos haplotípicos mediante comparación con el haplotipo de referencia, normalmente el haplotipo más frecuente en la población. Para los datos cualitativos, los resultados se expresan como odds ratio (OR).

Para analizar el efecto de la deleción ESRl-NCDl sobre otras variables continuas (presencia o ausencia de la enfermedad en estudio) empleamos test de ji cuadrado (χ ² ). Siempre que fue posible, ajustamos estos análisispor factores influyentes para la enfermedad previamente conocidos, desarrollando análisis de regresión lineal con la aplicación General Lineal Model (GLM) del programa estadístico SPSS 13.0. Tal es el caso de los estudios llevados a cabo sobre la osteoporosis.

Empleamos test de ANOVA para analizar la influencia de variables dicotómicas (presencia o ausencia de la variante ESRl-NCDl) sobre variables continuas. En el caso de disponer de factores previamente conocidos con influencia sobre las variables

continuas, ajustamos los análisis por estos factores empleando test de regresión lineal. Para estos análisis también empleamos el programa estadístico SPSS 13.0. Para comparar los valores discretos observados frente a los esperados empleamos el test de hipótesis exacto bitest para variables binomiales incluido en el programa STATA (StataCorp LP).

EJEMPLO 1. Diseño y genotipación de un panel de marcadores genéticos de tipo SNP en el gen ESRl.

Para llevar a cabo el clonaje posicional de la variante genómica ESRl-NCDl, se diseñó un panel de marcadores, (en este caso polimorfismos de un sólo nucleótido o "Single Nucleotide Polymorphism" (SNP)), localizados a lo largo de la secuencia genómica del gen ESRl humano. Para mayor simplicidad, estos polimorfismos se han renombrado como SNPl a SNP 14, empezando por el que está situado en el extremo 5 ' del gen. La localización en el gen de cada uno de los polimorfismos que constituyen el panel de marcadores, utilizado en el estudio, así como la denominación con la que aparecen en GenBank, se presenta en la Fig. 1.

El diseño de marcadores utilizado ofrece una densidad media de 30,5 Kb de ADN genómico por marcador (Fig. 1). Los marcadores SNP9 al SNP13 son los cinco marcadores incluidos en el estudio de Yoshida y cois., (2005), así como en la solicitud de patente JP2006061128, como se ha comentado anteriormente.

El estudio del panel de marcadores de tipo SNP en el gen humano ESRl se realizó en el Grupo 1 de individuos (166 varones con infertilidad idiopática) y en 372 individuos del Grupo 2 (individuos no relacionados procedentes de la población española). La genotipación de los 14 polimorfismos se realizó mediante secuenciación de ADN en tiempo real empleando tecnología Pyrosequencing (Biotage AB, Suecia). Para ello, se diseñaron cebadores de amplificación mediante Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), y cebadores de secuenciación de ADN específicos para cada uno de los polimorfismos que constituyen el panel de marcadores.

Las PCR se llevaron a cabo en un termociclador GeneAmp ^® PCR System 9700 (Applied Biosystems, EE.UU.) a un volumen final de 20 μl que contenían 20 ng de ADN geno mico inicial, 5 pmoles de cada cebador de amplificación, 5 nmoles de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP Master Mix, Ecogen, España), 2 μl de PCR Reaction Buffer 10X (Roche Diagnostics, Suiza), y 2 UI de Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics, Suiza). Las condiciones en las que se llevaron a cabo las PCR, las secuencias de los cebadores de amplificación y las secuencias de los correspondientes cebadores de secuenciación se muestran todas ellas en la Tabla 1, incluyendo una "B" al comienzo de aquellas secuencias que corresponden a cebadores marcados con biotina. En dicha Tabla 1 se reflejan también los polimorfismos analizados, su localización en el cromosoma 6 y los dos posibles nucleótidos que pueden aparecer en cada una de dichas localizaciones de polimorfismos. Además, en el listado de secuencias de esta memoria se indican todas las secuencias genómicas amplificadas mediante estos protocolos de PCR.

En el procesamiento de los productos de PCR para su posterior análisis mediante pirosecuenciación, hay que quedarse con la hebra de ADN a la que se pueda unir, por complementariedad de bases, el cebador de secuenciación, y eliminar la hebra complementaria a ésta. La molécula de biotina es necesaria para el aislamiento de la hebra de ADN de interés y, por lo tanto, la biotina deberá ir unida al extremo 5' del cebador de amplificación a partir del cual se sintetizará dicha hebra. Por lo tanto, en aquellos polimorfismos en los que el cebador de secuenciación se ha de unir a la región homologa a la que aparece en dirección 5 ' a partir del polimorfismo, el cebador de amplificación marcado con biotina ha de ser el inverso. Por el contrario, si el cebador de secuenciación se une a una región en dirección 3' a partir del polimorfismo, el cebador de amplificación marcado con biotina ha de ser el directo. Independientemente del cebador que se haya utilizado para la secuenciación, por claridad en la interpretación, las secuencias amplificadas mediante los protocolos de PCR se han referido todas ellas a una misma hebra.

Tabla 1: Marcadores tipo SNP de ESRl, cebadores de amplificación, condiciones de PCR y cebadores de secuenciación utilizados en su genotipación

O

Tabla 1 (continuación)

t: tiempo, T: Temperatura, di: desnaturalización inicial, d: desnaturalización, a: anillado (annealing), e: elongación, NC: número de ciclos, ef: elongación final

Los productos de las PCR se genotiparon usando el kit PSQ 96 GoId (Biotage AB, Suecia) en un instrumento Pyrosequencing PSQ 96 (Biotage AB, Suecia) según las instrucciones del fabricante.

Aunque el panel de marcadores está constituido por 14 polimorfismos, el polimorfismo SNP8 no pudo ser genotipado en las series de casos y controles mencionadas, ya que los resultados de la genotipación del mismo no mostraban una calidad adecuada para el análisis diseñado.

Las frecuencias alélicas y las distribuciones genotípicas de los 13 marcadores restantes en los individuos analizados se presentan en la Tabla 2, en la que la columna del "Análisis Estadístico" muestra los resultados obtenidos al efectuar sobre los datos cuatro pruebas diferentes: (a) el test exacto para el equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW), que sirve para analizar si la distribución genotípica observada del marcador en estudio es similar a la que cabría esperar según la frecuencia alélica del marcador en los grupos de casos y controles; (b) el test para la diferencia de frecuencias alélicas, que indica si la frecuencia alélica del marcador en estudio es estadísticamente diferente entre casos y controles; (c) el test de positividad alélica, que compara la frecuencia genotípica del marcador en estudio entre casos y controles asumiendo un modelo dominante de herencia de la enfermedad, y (d) el test de tendencia de Armitage, prueba estadística que mide la tendencia del riesgo a presentar la enfermedad según el nivel de exposición a un factor, en este caso, el polimorfismo en estudio.

Para cada uno de estos tests se muestra el valor de p, la razón de tantos a favor y en contra (abreviada como OR a partir de su denominación en inglés, odds ratio) y el intervalo de confianza (IC) de la misma, excepto en el caso del test exacto para el EHW, en el que sólo se muestra el valor de p, y el del test de tendencia de Armitage, para el cual se muestra el valor de p y la OR. Además, del valor de p, que indica si las diferencias entre los grupos son estadísticamente significativas (cuando presenta un valor inferior a 0,05), se presentan los otros dos valores por ser de mucha utilidad en el análisis de relaciones entre variantes de secuencias y enfermedades: los valores de odds ratio, por ejemplo, reflejan la probabilidad de un individuo portador de un determinado

alelo de padecer la enfermedad (un valor de OR>1 significa predisposición a padecer la enfermedad y un valor de OR<1 indica protección frente a la enfermedad, es decir, menor probabilidad de padecerla), mientras que el intervalo de confianza ayuda a valorar la precisión con que un parámetro poblacional ha sido estimado, pues es el intervalo dentro del cual se encuentra la población con una probabilidad que viene determinada por el nivel de confianza que, en este caso, se estableció en el valor del 95%.

Tabla 2.- SNPs de ESRl: Frecuencias alélicas, distribuciones genotípicas y estudios estadísticos

(a) Test exacto para el EHW en controles/varones infértiles. (b) Test para la diferencia de frecuencias alélicas. (c) Test de positividad alélica. (d) Test de tendencia de Armitag

Los resultados de los análisis estadísticos univariantes de estos polimorfismos en las series elegidas se resumen a continuación:

• Los marcadores SNP3, SNP4, SNP5, SNP6, SNP9, SNPlO, SNPl 1 y SNP 12 no presentan diferencia alguna entre los grupos de casos y controles.

• La desviación del EHW en el grupo de casos que se observó para el marcador SNP4 en el trabajo anterior de los mismos inventores no está presente en este nuevo análisis.

• El marcador SNP7 muestra una asociación nominal con la infertilidad masculina. El alelo C de este polimorfismo tiene una frecuencia alélica del

34,34% en casos y del 26,20% en controles, lo cual es estadísticamente significativo (véase la Tabla 2). Este hallazgo podría indicar la existencia de un factor de susceptibilidad genético para la infertilidad masculina en desequilibrio de ligamiento con el marcador SNP7. La medida del efecto de este marcador sobre la infertilidad masculina en la población en estudio viene dada por los valores de OR en cada test. Así, los portadores varones del alelo C del SNP7 tendrían un 64% más de posibilidades de presentar infertilidad masculina que los hombre no portadores de dicho alelo (O. R. del test de positividad alélica = 1,64). Si la exposición al factor de predisposición aumenta, es decir, según se tengan cero, una o dos copias del alelo C del SNP7, la probabilidad de presentar infertilidad masculina aumenta un 49% por cada nivel de exposición (O. R. del test de tendencia de Armitage = 1,49).

• Por otro lado, la frecuencia alélica del marcador SNP 14 no difiere estadísticamente entre el grupo de casos y de controles. Sin embargo, se observa un valor de p significativo en el test de positividad alélica para este marcador. El tamaño del efecto aportado por este test indica que los individuos portadores del alelo T del marcador SNP 14 son un 54% más susceptibles de presentar infertilidad masculina que los individuos que no portan dicho alelo.

• La frecuencia del polimorfismo SNPl no difiere entre casos y controles. No obstante, este marcador se desvía del EHW sólo en el grupo control. La desviación del EHW en el grupo control se debe a un exceso de individuos homocigotos para los genotipos GG y AA del marcador SNPl. El hecho de que

este fenómeno se dé sólo en controles y no en casos sugiere que el marcador SNPl esté en desequilibrio de ligamiento con un factor de protección frente a la infertilidad masculina.

• De manera similar, la frecuencia alélica del polimorfismo SNP 13 no difiere entre casos y controles. Sin embargo, este polimorfismo muestra una desviación muy acusada del EHW tanto en casos como en controles. La desviación del

EHW se debe a un exceso de individuos homocigotos para los genotipos AA y

CC del marcador SNPl 3.

De modo general, los resultados derivados del análisis del panel de marcadores del gen ESRl apoyan la existencia de al menos un factor de susceptibilidad para la infertilidad masculina en que se localice en dicho gen. Por ello, se decidió profundizar en el estudio de estos marcadores para intentar localizar dicho factor.

EJEMPLO 2. Estudio de marcadores genéticos del gen ESRl en núcleos familiares

Con el objetivo de analizar en profundidad los polimorfismos con valores estadísticamente significativos en los estudios univariantes del panel de marcadores (SNPl, SNP7, SNP13 y SNP14), se llevó a cabo un análisis de segregación de los mismos en un grupo de 50 Núcleos Familiares (NF). Debido a que el marcador SNP4 se asoció en dos trabajos anteriores a la infertilidad masculina (Kukuvitis y cois., 2002; Galán y cois., 2005), se decidió incluir también a este marcador en los análisis de segregación de los NF.

Todos los NF analizados inicialmente mostraban segregación mendeliana de los marcadores SNPl, SNP4, SNP7 y SNP14. Sin embargo, cuatro NF (8%) presentaron segregación no mendeliana para el marcador SNP 13. En la Fig. 2 se muestra la segregación de SNP 13 en el NF 18. En la misma puede observarse que el genotipo del progenitor masculino es AA, mientras que el del progenitor femenino es CC. Según las leyes de la herencia de Mendel, la descendiente debería heredar una copia del marcador SNP 13 de cada progenitor y, por lo tanto habría de presentar el genotipo AC en lugar de

CC, que es el que realmente presenta. Por este motivo, se consideró que la segregación del marcador SNP 13 en este NF no es mendeliana.

Para tener seguridad de que estas observaciones no se debían a errores de genotipación, se volvió a extraer ADN geno mico a partir de las muestras de sangre de cada uno de los miembros de estos 4 NF y se repitió la genotipación del marcador SNP 13 en estas nuevas muestras de ADN. Los resultados de la genotipación de estas nuevas muestras coincidieron al 100% con los resultados obtenidos para las mismas inicialmente.

Posteriormente, se realizó el estudio de segregación del marcador SNP 13 en los 79 NF restantes incluidos en la invención. Se pudo detectar segregación no mendeliana del marcador SNP13 en cuatro nuevos NF. Por lo tanto, 8 de los 129 NF analizados (6,20%) presentaban segregación no mendeliana del marcador SNPl 3.

Con el objetivo de descartar que las segregaciones no mendelianas observadas en los 8 NF para el marcador SNP 13 fueran consecuencia de una discordancia de paternidad o maternidad, se llevó a cabo un estudio de parentesco entre los miembros de esos 8 NF, mediante el análisis de 4 marcadores microsatélites. En los análisis de parentesco se incluyeron dos NF como controles negativos de parentesco, NF en los que se analizaron la madre, el descendiente y el padre putativo (no biológico). Para realizar el estudio, se eligieron cuatro marcadores microsatélites muy informativos y se observó su segregación. La información concerniente a la secuencia, y a los distintos ale los de estos cuatro marcadores microsatélites se obtuvo a partir de la base de datos de STS de GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Los cuatro marcadores microsatélites empleados en la invención se nombrarán según su número de acceso en esta base de datos (D3S1358, CSFlPO, D13S317 y D21S11). Estos cuatro marcadores están constituidos por un número variable de repeticiones de una secuencia constituida por cuatro nucleótidos, que es específica para cada marcador, repeticiones que se indican en la Tabla 3. El estudio de los marcadores microsatélites en los individuos de interés se llevó a cabo mediante PCR convencionales, discriminación de los alelos de los distintos marcadores mediante electroforesis capilar de los productos de las PCR y posterio detección de los alelos por fluorescencia. Para realizar las PCR se utilizaron los cebadores de

amplificación incluidos en GenBank para cada marcador, según se muestra en la Tabla 3.

Tabla 3: Marcadores microsatélite utilizados en estudios de parentesco

t: tiempo; T: Temperatura; di: desnaturalización inicial; d: desnaturalización; a: anillado; e: elongación; NC: número de ciclos; ef: elongación final.

Las PCR se realizaron de manera similar a las empleadas para la genotipación del panel de marcadores descrito en el apartado anterior. La separación e identificación de los alelo s de los marcadores microsatélites se realizó en un secuenciador automático CEQ

8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, EE.UU.), usando el marcador de peso molecular CEQ DNA Size Standard-600 (Beckman Coulter, CA, EE.UU.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cebadores directos de los cuatro marcadores microsatélites estaban marcados en su extremo 5' con el fluorocromo Cy5, lo que posibilita la detección de los distintos alelos del marcador por fluorescencia en el sistema CEQ 8000.

Los estudios de parentesco confirmaron la relación paterno-fϊlial entre todos los miembros de los 8 NF analizados con una certeza del 99,9%. Como era de esperar, la segregación de los cuatro marcadores microsatélites demostró la discordancia de paternidad en los dos NF control. La Fig. 3 muestra la segregación de los cuatro marcadores microsatélites analizados en distintos NF, ninguno de los cuales eran los NF incluidos como controles negativos.

EJEMPLO 3. Identificación de una deleción localizada en el intrón 6 del gen humano ESRl

El patrón de segregación no mendeliana del marcador SNP 13 en los 8 NF es compatible con la existencia de una deleción que cubre parte o la totalidad de la región genómica en la que se encuentra localizado dicho marcador. Como ejemplo, se puede tomar el análisis del marcador SNP13 en el NF18 (Fig. 2). En este caso, la presencia de un alelo del marcador SNP 13 deletado en el padre y que posteriormente heredara su hija, podría explicar fácilmente este patrón de segregación.

Para testar la presencia de la posible deleción, se decidió analizar inicialmente a los miembros del NF 18 exclusivamente. La estrategia que siguió consiste en localizar dos marcadores, lo más cercano posible al marcador SNP 13 en sentido 5' y 3', para los que el padre del NF 18 (del que se suponía que era portador de la deleción) sea heterocigoto. De este modo se delimita la región genómica donde ha de localizarse la deleción. Posteriormente se procede al análisis a nivel nucleotídico de la región así delimitada.

Inicialmente se analizaron los marcadores SNP 12 y SNP 14 en el NF 18 ya que se disponía de la metodología de genotipación para ambos polimorfismos. El padre del NF 18 resultó ser heterocigoto para ambos marcadores, por lo que la región crítica se estableció inicialmente en 49.082 nucleótidos.

Para delimitar la región crítica hasta un tamaño que fuera abordable por técnicas de biología molecular convencionales, se decidió analizar marcadores adicionales más cercanos a SNPl 3. Con esta finalidad secuenciamos dos regiones geno micas, una de

estas regiones se localiza a menos de 1 Kb en dirección 5' del marcador SNP 13 y contiene al polimorfismo rs3798573 (SNP 15), la otra región se encuentra a unas 4 Kb en dirección 3' de SNP13 y contiene a los marcadores rs9397483 (SNP16), rs3778087 (SNP17), rs3778088 (SNPl 8) y rs3778089 (SNP 19). Estos cinco marcadores se estudiaron exclusivamente en el NF 18, mediante PCR y secuenciación directa de los mismos. Los cebadores de amplificación y las condiciones se ambas PCR se indican en la Tabla 4.

Tabla 4,- Polimorfismos utilizados en la delimitación de la posible deleción

t: tiempo; T: Temperatura; di: desnaturalización inicial; d: desnaturalización; a: anillado; e: elongación; NC: número de ciclos; ef: elongación final. Los signos + y - indican la dirección de los marcadores en 5' y 3' con respecto al SNP 13 respectivamente.

Los productos de PCR se sometieron a electroforesis convencional en geles de agarosa y fueron purificados con el kit NucleoSpin ^® Extract (Macherey-Nagel, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Posteriormente, los productos de PCR purificados fueron secuenciados usando los cebadores de amplificación directos mediante el kit GenomeLab™ DTCS Quick Start (Beckman Coulter, EE.UU.) en un termociclador Tpersonal (Whatman Biometra, Alemania). La secuencia del producto de PCR correspondiente a la amplificación llevada a cabo con los cebadores Al (SEQ ID NO:37) y A3 (SEQ ID NO:38) se muestra como SEQ ID NO:79, mientras que la

secuencia del producto de PCR correspondiente a la amplificación llevada a cabo con los cebadores A4 (SEQ ID NO:39) y A2 (SEQ ID NO:40) se muestra como SEQ ID NO:80.

Los productos de la secuenciación se purificaron mediante precipitación con etanol y se introdujeron en el secuenciador automático CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, EE.UU.) donde se realizó una electroforesis capilar según las instrucciones del fabricante. Para análisis de los datos crudos y la comparación de los mismos con las secuencias de referencia se utilizó el programa informático CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, EE.UU.).

La Fig. 4 muestra las gráficas derivadas de la genotipación de los cinco marcadores mediante secuenciación automática en el padre y la madre del NFl 8. Como puede observarse en dicha Figura, el análisis de las dos regiones genómicas consideradas reveló que el padre del NF 18 era heterocigoto para los cinco marcadores estudiados, mientras la madre era homocigótica para todos ellos. La región crítica de homocigosidad se veía reducida a la comprendida entre los marcadores SNP 15 y SNP 16 (4399 nucleótidos).

En la actualidad no hay descrito ningún polimorfismo de tipo SNP que sea lo suficientemente informativo y que se localice en una posición más cercana a SNP 13 que los analizados hasta ahora. Por este motivo se decidió estudiar la región crítica mediante secuenciación. Para ello, según se muestra en la Fig. 5, se diseñaron cebadores de amplificación (Fl, F2, Rl, R2 y R3) que dividían la región crítica en segmentos solapantes, recurriendo también como cebador directo al utilizado previamente para la genotipación del marcador SNP15, (SEQ ID NO:37), que aparece en la Fig. 5 indicado como Al. Los restantes marcadores utilizados fueron los siguientes:

Directos:

- Fl: 5 -TCCAC AGATGGGGTGGTGT AG-3 ' (SEQ ID NO:41)

- F2: 5 -GTCTCATCAAGTCACTGGACC-3 ' (SEQ ID NO:42)

Inversos:

- Rl: 5 -GGCTAAGTGCTGTGAGTTTGG-3' (SEQ ID NO:43)

- R2: 5 -TTTACCATCAGATCATGAGGTC-3 ' (SEQ ID NO:44)

- R3: 5 -CACTTACGTGTTTAACAGCATC-3 ' (SEQ ID NO:45)

De esta manera, utilizando PCR convencionales y mediante la combinación de pares de cebadores específicos, se intentaron amplificar segmentos discretos de la región. Este proceso se llevó a cabo usando las muestras de ADN genómico de los miembros del NF18.

La región geno mica delimitada por los cebadores Al y R2 fue amplificada mediante PCR en un termociclador GeneAmp ^® PCR System 9700 (Applied Biosystems, EE.UU.) a un volumen final de 20 μl que contenían 20 ng de ADN genómico inicial, 5 pmoles de cada cebador de amplificación (Al: SEQ ID NO:37 y R2: SEQ ID NO:44), 10 nmoles de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP Master Mix, Ecogen, España), 2 ul de PCR Reaction Buffer 10X (Roche Diagnostics, Suiza), y 2 UI de Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics, Suiza). La mezcla se sometió a 95 ⁰ C durante 5 minutos; 50 ciclos de 95 ⁰ C durante 1 minuto, 62 ⁰ C durante 30 segundos y 72 ⁰ C durante 1 minuto y una fase de extensión final de 7 minutos a 72 ⁰ C.

Tras llevar acabo la electro foresis convencional en geles de agarosa al 1% con los productos de la PCR delimitada por los cebadores Al y R2, marcada en la Fig. 5 mediante una línea situada debajo de la línea que representa al gen, se observó una banda de ADN correspondiente al tamaño esperado para el segmento amplificado de 3343 nucleótidos en todos los miembros del NF18. Sin embargo, en las muestras procedentes del padre y de la hija de dicho NF se observó una banda adicional de un tamaño menor (1099 nucleótidos).

Ambos productos de PCR fueron purificados, secuenciados y analizados por separado, de forma similar a la utilizada para la genotipación de los marcadores SNP15-SNP19.

Como cebadores para la reacción de secuenciación se usaron los oligonucleótidos Al

(SEQ ID NO:37) y R2 (SEQ ID NO:44). Las gráficas correspondientes a la

secuenciación de ambos productos de PCR se indican en la Fig. 6. El análisis de las secuencias de ambos productos de PCR reveló que el producto de PCR de mayor tamaño correspondía a la secuencia de referencia incluida en GenBank para este segmento, mientras que el producto de PCR de menor tamaño era el resultado de una deleción de 2244 nucleótidos de dicha región. Gracias al análisis de la secuencia de este producto de PCR se pudieron delimitar a nivel nucleotídico los límites de la deleción. En la Fig. 7 puede observarse la secuencia del segmento de 3343 nucleótidos delimitados por los cebadores Al y R2, que se indica también como SEQ ID NO:63. En dicha Fig. 7 aparecen subrayados los 2244 nucleótidos afectados por la deleción y que están ausentes en una de las copias del gen ESRl en el padre y la hija del NFl 8. La secuencia de nucleótidos que componen dicho fragmento de 3343 nucleótidos (el fragmento del intrón 6 del gen ESRl humano, comprendido entre los lugares de unión de los cebadores Al y R2, en el que puede aparecer la deleción ESRl-NCDl ) se indica como SEQ ID NO: 63.

Según la nomenclatura propuesta por den Dunnen y Antonarakis (2001), la deleción identificada en esta invención habría de denominarse como: g.IVS6+7731_IVS6+9974del. Como autores del descubrimiento de esta deleción y de la presente invención, los autores de la invención proponen el nombre alternativo "ESRl Non Coding Deletion 1" con la abreviación "ESRl-NCDl" para la misma.

EJEMPLO 4. Elección del protocolo para la detección protocolizada de la deleción

Tras la identificación de la deleción ESRl-NCDl en el padre y la hija del NF 18, se llevó a cabo el diseño y la puesta a punto de dos protocolos de genotipación de alto rendimiento alternativos para dicha deleción, para comprobar cuál de ellos era más adecuado para la detección protocolizada de la deleción identificada.

Uno de los protocolos se basó en la secuenciación en tiempo real utilizando la tecnología de pirosecuenciación mediante el sistema Pyrosequencing (Biotage AB,

Suecia). Las bases técnicas de esta tecnología pueden encontrarse en la página web http://www.pysequencing.com. Brevemente, la técnica se basa en la adición de

desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) uno por uno a una mezcla de reacción que contiene el ADN molde monocatenario previamente amplificado por PCR y que lleva unido un oligonucleótido que actúa en la reacción de secuenciación como cebador, en la determinación de la existencia de incorporación del desoxinucleótido añadido a la cadena naciente complementaria a dicho ADN molde mediante la detección del pirofosfato liberado acoplándolo a una pareja de reacciones que dan lugar a la emisión de luz y en la degradación de los dNTP no incorporados gracias a la presencia de la enzima apirasa en la mezcla de reacción.

El segundo protocolo se basa en la electro foresis capilar acoplada a la detección, mediante fluorescencia, del alelo normal y del alelo portador de la deleción ESRl- NCDl, proceso que, en este caso, se llevó a cabo en el secuenciador automático CEQ 8000 Genetic Análisis System (Beckman Coulter, EE.UU.). La electroforesis capilar en gel es la adaptación de la electroforesis en gel tradicional aplicada en capilares, usando polímeros en solución para crear un tamiz molecular también conocido como gel físico reemplazable. Esto permite que los analitos (en nuestro caso los alelo s a analizar) tengan razones carga/masa similares para que sean resueltos por tamaño. Para la detección de los alelos por fluorescencia el sistema excita, mediante un láser diódico, una molécula fluorescente unida a los alelos. Tras esta excitación, la molécula fluorescente emitirá fluorescencia en una longitud de onda que captará el sistema. El tiempo que tarda el sistema en registrar la fluorescencia procedente de cada alelo es directamente proporcional al tamaño de los mismos. De este modo, comparando el tiempo en el que el sistema capta la fluorescencia de cada alelo con respecto al tiempo en el que capta la fluorescencia de marcadores de peso molecular de tamaño conocido, el sistema puede determinar automáticamente el tamaño de los alelos de interés.

Ambos protocolos necesitan de una reacción de PCR previa en la que se amplifique el fragmento deseado. Para ello se utilizaron tres cebadores de amplificación, que son los que se indican a continuación:

- Directo:

ED-F: 5 -TGAAAACTACTGGCATCGAC-3 ' (SEQ ID NO:46)

- Inversos:

ED-RW: 5 -GTCTCTGC AGCACTCAAT AC-3 ' (SEQ ID NO:47) R2: 5 -TTT ACCATC AGATCATGAGGTC-3 ' (SEQ ID NO:44)

Los cebadores ED-F y R2 son comunes a los dos alelos, mientras que el cebador ED- RW es específico para el alelo normal. Las zonas en las que los cebadores se unen a cada uno de los alelos del gen se muestran en la Fig. 8a.

En ambos protocolos, el alelo normal es amplificado por los cebadores ED-F y ED- RW, mientras que el alelo portador de la deleción ESRl-NCDl es amplificado por la pareja de cebadores ED-F y R2. A pesar de que el cebador R2 se une a ambos alelos, la amplificación del alelo normal con este cebador no es posible en las condiciones de PCR utilizadas, ya que la distancia entre ED-F y R2 (1648 nucleótidos) en el alelo normal es excesiva para las condiciones de PCR incluidas en ambos protocolos.

Las condiciones de PCR son idénticas para ambos protocolos de genotipación. La PCR se lleva a en un termociclador GeneAmp ^® PCR System 9700 (Applied Biosystems, EE.UU.) a un volumen final de 20 μl que contiene 20 ng de ADN genómico inicial, 2,5 pmoles de cada cebador de amplificación (ED-F, ED-RW y R2), 5 nmoles de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP Master Mix, Ecogen, España), 2 μl de PCR Reaction Buffer 10X (Roche Diagnostics, Suiza), y 2 UI de Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics, Suiza). La mezcla se somete a 95 ⁰ C durante 5 minutos; 35 ciclos de 95 ⁰ C durante 30 segundos, 62 ⁰ C durante 30 segundos y 72 ⁰ C durante 30 segundos y una fase de extensión final de 7 minutos a 72 ⁰ C.

En esas condiciones, las secuencias amplificadas son las siguientes:

- Alelo normal:

TGAAAACTACTGGCATCGACAATTGAATTTCCACTAAAATAAAATAGCTCTCTAGTA TATTACAAAACTA TGAGTAAGGTCCACTTCCTCCATGGACTGGGTTGGGTAGGAGGCAAAGATAATTAACCAA TTATTTTAAT ATTATGAGTTCAGGGTTGTAATGAAAGTAAGTATTGAGTGCTGCAGAGAC (SEQ ID NO: 64)

- Alelo con la deleción

TGAAAACTACTGGCATCGACAATTGAATTTCCACTAAAATAAAATAGCTCTCTAGTA TATTACAAAACTA

TAGGGACAACTCCCTAGCAGCGACCCAGTGCTCATATCAATAGTGGTAACAATTAGG AAGGCAGCTCCTA

CCTCAAAGACCTCATGATCTGATGGTAAA (SEQ ID NO: 65)

En estas secuencias los nucleótidos subrayados de los extremos corresponden a las zonas a las que se unen los cebadores de amplificación, los nucleótidos con doble subrayado corresponden a la zona a la cual se une el cebador de secuenciación ED-S (SEQ ID NO:48), los nucleótidos en cursiva corresponden a nucleótidos que forman parte del fragmento que está ausente del alelo con la deleción y los nucleótidos en negrita corresponden a la zona situada en 3' con respecto a la deleción.La tecnología de detección de la deleción es la principal diferencia entre ambos protocolos:

- Protocolo I: Secuenciación en tiempo real mediante el sistema Pyrosequencins (Biotage AB, Suecia).

Para el desarrollo de esta tecnología es necesario que ambos cebadores inversos (en este caso, R2 (SEQ ID NO:44) y ED-W (SEQ ID NO:47)) estén marcados en su extremo 5 ' con biotina. Además se ha de utilizar un cebador de secuenciación que se una a una región genómica común para ambos alelos que, en este caso, fue el cebador ED-S: 5'-

ACTGTGCCAGGCACTGC-3 ' (SEQ ID NO:48) (véase la Fig. 8a). El orden de dispensación de los nucleótidos se estableció como sigue: GCTCGTC. Para la secuenciación en tiempo real de los productos de PCR se siguieron las instrucciones del fabricante.

Protocolo II: Genotipación mediante electroforesis capilar acoplada a la detección de los alelos por fluorescencia en el secuenciador automático CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, EE. UU.).

Para este método, el cebador directo (en este caso, ED-F (SEQ ID NO: 46)) se ha de marcar en su extremo 5' con el flurocromo Cy5. La electroforesis capilar se llevó a cabo en un secuenciador automático CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter) usando el marcador de peso molecular CEQ DNA Size Standard-600 (Beckman Coulter, CA, EE.UU.) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Para el análisis de los alelos detectados por el sistema, se usa el programa informático CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter).

Las condiciones utilizadas en la electroforesis capilar fueron como sigue:

Desnaturalización: 9O ⁰ C durante 2 minutos - Inyección de muestras: 2 KV durante 30 segundos

Fase de separación: 5O ⁰ C, 8 KV durante 35 minutos

En la Fig. 8b se muestran las gráficas correspondientes a la genotipación de la deleción mediante ambos protocolos. La parte izquierda, marcada como "PySq", corresponde a resultados obtenidos utilizando la técnica de pirosecuenciación; la parte derecha, marcada como "FluoSq", corresponde a resultados obtenidos mediante electroforesis capilar acoplada a la derección de los alelo s por fluorescencia. Ambas técnicas parecen ser válidas para la detección protocolizada de la deleción.

EJEMPLO 5. Análisis del efecto de ESRl-NCDl en la infertilidad idiopática masculina

Para estudiar el papel de ESRl-NCDl en la infertilidad idiopática masculina, se llevó a cabo la genotipación de la misma en los Grupos 1 y 2 de individuos anteriormente definidos. La genotipación de estos individuos se realizó utilizando la tecnología de la pirosecuenciación (Pyrosequencing /Biotage AB, Suecia) ya que este protocolo es menos costoso y más rápido que el protocolo alternativo de electroforesis capilar acoplada a fluorescencia ensayado en el Ejemplo 4. Las condiciones de PCR y secuenciación fueron las descritas en dicho Ejemplo 4

Los resultados de la genotipación de ESRl-NCDl se incluyen en la Tabla 5. De forma análoga a la Tabla 2, en la que la columna del "Análisis Estadístico" se muestran los resultados obtenidos al efectuar sobre los datos cuatro pruebas diferentes: el test exacto para el equilibrio de Hardy-Weinberg (EHW) en controles/varones infértiles (a), el test para la diferencia de frecuencias alélicas (b), el test de positividad alélica (c) y el test de tendencia de Armitage (d). Para cada uno de ellos se muestra el valor de p, la razón de tantos a favor y en contra (abreviada como OR a partir de su denominación en inglés,

odds ratió) y el intervalo de confianza (LC.) de la misma al nivel del 95%, excepto en el caso del test exacto para el EHW, en el que sólo se muestra el valor de p y la OR.

Tabla 5.- Frecuencias alélilas, distribuciones genotípicas y estudios estadísticos referentes a la presencia de la deleción ESRl-NCDl en los Grupos 1 y 2

(a) Test exacto para el EHW en controles/varones infértiles. (b) Test para la diferencia de frecuencias alélicas. (c) Test de positividad alélica. (d) Test de tendencia de Armitage. II: homocigótico para el alelo normal. ID: heterocigótico DD: homocigótico para la deleción

La frecuencia alélica de ESRl-NCDl en la población general española es del 9,72%, mientras que en el grupo de individuos con infertilidad idiopática incluido en la invención es del 13,75%. La diferencia de la frecuencia de ESRl-NCDl en ambos grupos es estadísticamente significativa. El aumento de la predisposición a padecer infertilidad idiopática debido a la presencia de la deleción ESRl-NCDl viene definida por los valores de odds ratio (O. R.) obtenidos en los análisis estadísticos. De este modo, un varón portador de ESRl-NCDl tiene un 55% más de posibilidades de ser infértil que un individuo que no porta dicha deleción (O. R. del test de positividad alélica = 1,55). Además la O. R. obtenida en el test de tendencia de Armitage (1,55) sugiere que, según se aumenta la exposición al factor de predisposición (al pasar de la situación en la que la deleción ESRl-NCDl está ausente del genoma a tener una copia de la misma y, después, a tener dos copias), la probabilidad de ser infértil aumenta un 55% en cada nivel de exposición. La O. R. del test de diferencia alélica considera los alelo s individualmente y no en parejas. Este hecho hace que la O. R. de este test no sea adecuada para medir el efecto real de la deleción sobre una población que es diploide.

Es interesante resaltar que la deleción ESRl-NCDl no se desvía del EHW en los grupos de casos y controles, a diferencia de lo que ocurría con el marcador SNP 13, situado sólo a 21 nucleótidos de distancia desde el inicio de la deleción ESRl-NCDl.

De hecho, esta deleción incluye la región genómica donde se une el cebador de amplificación inverso diseñado para la genotipación del polimorfismo SNP13. Por lo tanto, los individuos heterocigotos para el marcador SNP 13 que porten una copia de la variante ESRl-NCDl se genotipan como "falsos homocigotos" ya que el alelo portador de ESRl-NCDl no podría ser genotipado para el marcador SNP 13 según nuestro protocolo.

Finalmente, si se considera únicamente los individuos genotipados para el marcador SNP 13 y que, a su vez, no portan ningún alelo con la variante ESRl-NCDl, no se observa desviación alguna del EHW para el marcador SNP 13 ni en casos (p=0,15) ni en controles (p=0,84). Por ello, se concluyó que la desviación del EHW observada inicialmente para el marcador SNP 13 se debe a la presencia de la deleción ESRl-NCDl que provocaba que individuos heterocigotos para SNP 13 se genotiparan como homocigotos para el mismo marcador, aumentando así en exceso el número total de homocigotos para el marcador SNP13.

Estos resultados ponen de manifiesto que la variante ESRl-NCDl del gen humano ESRl puede provocar una reducción en la producción espermática en humanos. Este hecho resalta la importancia de los estrógenos en general, y del receptor de Estrógenos alfa en particular sobre la función reproductora del varón en humanos. Debido a que esta variante se presenta también en la población general, es posible que ESRl-NCDl necesite de otros factores genéticos o ambientales para mostrar sus efectos deletéreos sobre la espermatogénesis en humanos. Por lo tanto, estos hallazgos no excluyen la presencia de otra variante genómica en el gen ESRl que también pudiera influir sobre la producción espermática en humanos.

En cualquier caso, estos datos demuestran que la presencia de la deleción ESRl-NCDl aumenta la probabilidad de que un varón presente infertilidad y, por tanto, apoyan la

utilidad de la determinación de la presencia o ausencia de esa deleción para valorar la predisposición de un individuo a presentar oligozoospermia o azoospermia e infertilidad ligada a las mismas.

EJEMPLO 6. Relación entre ESRl-NCDl y los polimorfismos SNPl, SNP7, SNP14

Para analizar la relación existente entre la variante ESRl-NCDl y los polimorfismos que mostraron valores estadísticamente significativos en el estudio del panel de marcadores (SNPl, SNP7 y SNP 14), llevamos a cabo un estudio de ligamiento genético con estos marcadores mediante el programa estadístico Thesias. Este estudio se llevó a cabo sobre los 166 individuos infértiles y 372 controles en los que se analizó el panel de marcadores del gen ESRl.

Con el término "desequilibrio de ligamiento" (LD) entre marcadores se alude a la tendencia de estos a transmitirse juntos como consecuencia de la distancia física a la que se encuentran en el mismo cromosoma. Aunque la distancia entre los marcadores es el principal factor determinante del grado de LD entre ellos, la tasa de recombinación en la región comprendida entre ambos puede modificar dicha relación. En ocasiones, marcadores muy alejados físicamente se transmiten juntos con mayor frecuencia de la esperada por la distancia entre ambos y, por oto lado, la existencia de puntos calientes o hot-spots de recombinación en el genoma puede determinar qué marcadores muy próximos en el cromosoma se transmiten de manera independiente con una frecuencia elevada. El grado con el que dos marcadores tienden a transmitirse juntos se cuantifica mediante el parámetro de Lewontin (D'), cuyos valores oscilan de -1 a +1. Un valor de D' = ± 1 indica desequilibrio completo de ligamiento entre ambos marcadores, es decir, siempre se transmiten juntos. El signo es positivo cuando se transmiten juntos los alelos menos frecuentes de cada polimorfismo y negativo, cuando se transmiten juntos el más frecuente de uno y el menos frecuente del otro (Lewontin y Kojima, 1960).

Los resultados de este análisis muestran que ninguno de los tres marcadores analizados presenta desequilibrio de ligamiento con la variante ESRl-NCDl, ni entre ellos. Es decir, que la transmisión de los alelos de los marcadores SNPl, SNP7 y SNP 14 de una

generación a la siguiente es independiente de la presencia o ausencia de la variante

ESRl-NCDl, así como del alelo presente en cada marcador. La tabla 6 muestra los valores de D' para las distintas parejas de los marcadores analizados en casos y controles.

Tabla 6.- Estudio de ligamiento entre los marcadores SNPl, SNP7 y SNP14 y la variante ESRl-NCDl.

El programa Thesias también permitió analizar las combinaciones alélicas de los arcadores SNPl, SNP7 y SNP 14 con la presencia o ausencia de la variante ESRl- NCDl, y el efecto de las mismas sobre la infertilidad idiopática masculina. De las 16 posibles combinaciones (combinaciones de cuatro elementos con dos valores posibles 2 ⁴ =16) alélicas, sólo seis de ellas superaban un 5% de frecuencia en casos y controles. En la tabla 7 se indican las frecuencias de las seis combinaciones alélicas analizadas en los grupos de casos y controles, así como el análisis estadístico realizado sobre las mismas.

Tabla 7.- Análisis estadístico de las frecuencias de los haplotipos resultantes de las combinaciones alélicas de los marcadores SNPl, SNP7, SNP14 y de la variante ESRl-NCDl en los grupos de casos y controles.

*Combinación usada como referencia. Para cada combinación las posiciones 1, 2, 3 y 4 indican el alelo correspondiente de los marcadores SNPl (G o A), SNP7 (T o C), ESRl-NCDl (I para la ausencia de la deleción o D para la presencia de la deleción) y SNP14 (C o T). Nótese que la

deleción ESRl-NCDl no está presente en ninguno de los seis haplotipos con frecuencia mayor al 5% en casos y controles.

El análisis estadístico reveló que las frecuencias de las combinaciones alélicas estudiadas no difieren entre casos y controles (ninguno de los valores p es menor que

0,05). El efecto de las combinaciones alélicas sobre la infertilidad masculina, medidas por las O.R. en cada caso, con respecto a la combinación alélica más común (GTIC), mostraron valores muy próximos a 1, con lo que se concluyó que ninguna de estas seis combinaciones parece estar asociada con la infertilidad masculina en la población analizada.

Por lo tanto, el efecto observado para los marcadores SNPl, SNP7 y SNP 14, así como el efecto de la variante ESRl-NCDl sobre la infertilidad idiopática masculina en la población española son independientes unos de otros.

Ejemplo 7. Estudio de la variante ESRl-NCDl sobre la respuesta a Hiperestimulación Ovárica Controlada (HOC)

A continuación presentamos aquellos parámetros que se recogieron durante los ciclos de HOC y que se ven afectados por la presencia de la variante ESRl-NCDl :

• Crecimiento endometrial:

El crecimiento endometrial es una consecuencia de la HOC que depende, en gran medida, de la producción de estrógenos derivada de la foliculogénesis. Para comprobar el efecto de la variante ESRl-NCDl sobre el crecimiento endometrial empleamos test de regresión lineal ajustando por los niveles de estradiol de las pacientes sometidas a HOC tras la estimulación de la foliculogénesis.

Los análisis estadísticos muestran cómo la presencia de la variante ESRl-NCDl hace que las mujeres que la portan presenten un mayor crecimiento endometrial (media del 20% de crecimiento) en comparación con aquellas mujeres que no presentan la variante ESRl-NCDl cuando se someten a ciclos de HOC. Así, el crecimiento endometrial

medio de las mujeres portadoras de la deleción ESRl-NCDl es de 13,32 mm y el de las mujeres no portadoras es de 11,41 mm. Esta diferencia es estadísticamente significativa (p=0,035).

Esta se puede considerar una prueba funcional de la acción de la deleción ESRl-NCDl. Teniendo en cuenta que el tejido endometrial responde a las sustancias estrogénicas mediante un engrosamiento del mismo, y que las mujeres portadoras de la deleción presentan una mayor proliferación del tejido endometrial cuando son sometidas a ciclos de HOC, podemos inferir que la deleción provoca un aumento de la actividad estrogénica en este tejido a través de un aumento de la hipersensibilidad a estos compuestos.

De hecho, se ha propuesto un bio-ensayo llamado ensayo uterotrópico a través del cual se evalúa la capacidad estrogénica de determinadas sustancias (endógenas o no). Este ensayo consiste en la administración de distintas dosis del compuesto en estudio, usando como referencia algún compuesto de actividad estrogénica conocida (por ejemplo el estradiol), a un modelo animal (normalmente rata o ratón) y evaluar la razón peso del útero / masa corporal en estos animales para compararla con las obtenidas en los modelos animales a los que se es ha administrado el compuesto de referencia (Yamagashi y cois., 2003).

Por lo tanto, estos datos ofrecen una evidencia funcional (crecimiento del endometrio en mujeres sometidas a HOC) que confirma que la deleción ESRl-NCDl actúa aumentando la sensibilidad de las mujeres que la portan a la acción de los estrógenos o sustancias con actividad estrogénica.

• Producción de folículos:

Como se comentó anteriormente, la producción de folículos en los ciclos de HOC se suele estimular mediante la administración de sustancias con actividad gonado trópica.

El número de folículos que se producen tras la administración de dichas sustancias es un claro indicador de la respuesta a la HOC. La producción de folículos en mujeres

sometidas a HOC se ajusta perfectamente a una distribución en campana de gauss tal y como muestra la figura 9.

Teniendo en cuenta esta observación, nuestro grupo propuso la clasificación de respuesta a HOC atendiendo a la producción de folículos en tres grupos (de Castro y cois., 2003):

• Baja respondedoras: pacientes que producen <3 folículos (Fridstrom M y cois., 1997) • Alta respondedoras: pacientes que producen >12 folículos y pertenecientes al percentil 90

• Normorespondedoras: pacientes que producen entre 4 y 11 folículos.

Cuando se comparó la frecuencia de la deleción ESRl-NCDl entre los grupos de baja y alta respondedoras, se observó que existía una diferencia estadísticamente significativa entre ambos grupos (p=0,023; O.R. =3,709). De este análisis se deriva que la variante

ESRl-NCDl es más frecuente en aquellas mujeres con una alta respuesta a la HOC a nivel folicular y que consecuentemente, esta variante podría usarse como un predictor de alta respuesta a la HOC. Este resultado, vuelve a sugerir que los portadores de la deleción son más sensibles los estrógenos pues no hay que olvidar que el principal y más clásico test para medir la respuesta durante la HOC son los niveles de estradiol que se alcanzan durante la inducción. También se conoce que la producción intrafolicular de estradiol (inducida durante HOC) regula los mecanismos de reclutamiento folicular y el fenómeno de la dominancia en la fase estrogénica del ciclo ovárico de los mamíferos.

• Frenado hipofisario:

Como se ha comentado anteriormente, el frenado hipofisario consiste en la supresión de la actividad del "eje hipotálamo-hipófisis-ovárico". La eficacia del frenado hipofisario (tiempo que transcurre desde el comienzo del tratamiento hasta que se reducen los niveles sistémicos de estradiol por debajo de 50 pg/ml) va a depender de la edad de la paciente, de la cantidad y el tipo de GnRHa administrado y de los niveles de estradiol

previos a este tratamiento. Para evaluar el efecto de la variante ESRl-NCDl sobre este parámetro desarrollamos análisis de la varianza (ANOVA) del frenado hipofisario ajustado por los parámetros arriba mencionados.

Mediante estos análisis se pudo comprobar que la presencia de la deleción influye de manera determinante sobre el tiempo de frenado hipofisario de tal modo que las mujeres portadoras de dicha variante logran un frenado hipofisario casi cuatro días de media antes que las que no lo portan (p=0,05).

Esta observación indica nuevamente que la deleción ESRl-NCDl presenta un efecto de hiperseñalización de la acción de los estrógenos ya que, a niveles iguales de estrógenos endógenos, las mujeres portadoras de ESRl-NCDl consiguen una ablación del eje hipotálamo-hipófisis-ovario anterior al de las no portadoras de dicha variante. Este efecto está mediando por mecanismos de retroalimentación negativa de los estrógenos sobre dicho eje. Por lo tanto, las mujeres con mayor sensibilidad a los estrógenos a este nivel tendrán un mecanismo de retroalimentación negativa más intenso y lograrán un frenado hipofisario más rápido que aquellas mujeres en las que la sensibilidad a estrógenos (y consecuentemente el mecanismo de retroalimentación negativa) sea menos acusado.

Los análisis llevados a cabo sobre la respuesta a la HOC ponen de manifiesto que la variante ESRl-NCDl aumenta la sensibilidad del receptor de estrógenos ESRl a la acción de los estrógenos y otras sustancias con actividad estrogénica.

Ejemplo 8. Análisis de la variante ESRl-NCDl sobre la infertilidad a nivel de pareja

La frecuencia alélicas y distribución genotípica de la variante ESRl-NCDl en los grupos NF-ICSI y NF-FP no difieren estadísticamente.

Por otro lado, atendiendo a la frecuencia de portadores de la deleción ESRl-NCDl en hombres y mujeres se calculó el número de parejas en las que ambos miembros habrían de ser portadores de esta variante.

Frecuencia de ESRl-NCDl en varones infértiles: 28,68% Frecuencia de ESRl-NCDl mujeres infértiles: 22,48%

Frecuencia esperada de parejas infértiles en las que ambos miembros son portadores de ESRl -NCD 1 : 0,2868 x 0,2248 = 0,0645

La frecuencia observada de parejas infértiles en la que ambos miembros son portadores de la deleción ESRl-NCDl es de 0,1008 (13/129).

El test de contraste de hipótesis bitest indica que el número de parejas infértiles en las que ambos miembros son portadores de la deleción ESRl-NCDl, es estadísticamente superior al esperado (p=0,03).

Para comprobar si la deleción ESRl-NCDl muestra un comportamiento similar en parejas de fertilidad probada realizamos el mismo análisis.

Frecuencia de ESRl-NCDl en varones fértiles: 19,00%

Frecuencia de ESRl-NCDl mujeres fértiles: 30,00%

Frecuencia esperada de parejas fértiles en las que ambos miembros son portadores de

ESRl-NCDl: 0,19 x 0,30 = 0,057

La frecuencia observada de parejas infértiles para las que ambos miembros son portadores de la variante ESRl-NCDl (6%) es prácticamente idéntico al valor esperado

(P=I)-

Teniendo en cuenta estos resultados, se ve como la frecuencia de parejas infértiles en las que ambos miembros son portadores de la deleción ESRl-NCDl (10,08%) es superior que en el caso de las parejas fértiles (6%). Además el número de parejas infértiles en las que ambos miembros son portadores de la deleción ESRl-NCDl es estadísticamente superior al que cabría esperar atendiendo a la frecuencia de esta variante en hombres y mujeres infértiles.

Los resultados están de acuerdo con observaciones previas en otros estudios en los que se demuestra un efecto adverso de sustancias exógenas con capacidad estrogénica sobre la salud reproductiva en hombres y mujeres (Joffee, 2003). Consideramos pues, que las parejas en las que ambos miembros son portadores de la deleción ESRl-NCDl podrían ser más sensibles a la acción deletérea de estas sustancias y que, por lo tanto, esta variante proporciona una mayor sensibilidad a estas sustancias exógenas perjuidiciales para la salud reproductiva.

Ejemplo 9. Análisis de la variante ESRl-NCDl sobre la osteoporosis

Los análisis estadísticos llevados a cabo sobre la variante ESRl-NCDl muestran que dicha variante presenta un efecto de protección efecto de protección para la osteoporosis en mujeres posmenopáusicas. El valor p de significación estadística es de 0,037 y el valor del riesgo relativo es de 0,673 siendo los límites de confianza inferior y superior de 0,464 y 0,976 respectivamente. Estos resultados indican que los individuos portadores de la variante ESRl-NCDl presentan un 32,7% menos de riesgo de padecer osteoporosis.

Teniendo en cuenta el efecto de protección que ejercen los estrógenos a nivel óseo, los resultados de la presente invención indican nuevamente que la delección ESRl-NCDl presenta un efecto de protección frente a la osteoporosis gracias a un aumento de la sensibilidad del receptor a la acción de los estrógenos o sustancias estrogénicas también a nivel óseo.

Ejemplo 10. Análisis de la variante ESRl-NCDl en el cáncer de mama

Tras el análisis de los datos genéticos y epidemiológicos de la serie, se pudo observar que la variante ESRl-NCDl interactuaba significativamente (OR=0,68; p=0,013) con una variante del gen ESR2 (rs4986938) siguiendo un modelo de doble dominante según el software de análisis HFCC (PCT/EP2007/050264)

La Tabla 8 representa el modelo de interacción de ESRl-NCDl con la variante rs4986938 de ESR2 asociado al riesgo a padecer cáncer de mama en población española.

II: Ausencia de la variante ESRl-NCDl; ID: una copia de la variante ESRl-NCDl; DD: dos copias de la variante ESRl-NCDl.

En HFCC se compara usando un test de χ ² con un grado de libertad la presencia del patrón descrito entre casos (1) y controles (0).

Este tipo de interacciones ya se ha reportado anteriormente para otra enfermedad relacionada con los niveles de estrógenos endógenos como es la osteoporosis en un sentido opuesto, lo que casa con las teorías establecidas, que clasifican el cáncer de mama y la osteoporosis como fenotipos opuestos y estrógeno-dependientes (Morón y cois., 2006).

A la luz de éstos resultados se puede concluir que la presencia de la deleción ESRl- NCDl aumenta el riesgo a la aparición del cáncer de mama en determinados grupos de mujeres de la población general, dependiendo probablemente de otros factores tanto ambientales como genéticos. Como ejemplo de ésta interacción se muestra el efecto que ambas variantes ESRl-NCDl y la variante rs4986938 de ESR2.

Otro descubrimiento significativo se determinó a raíz de un estudio realizado sobre los distintos tipos tumorales y el efecto que ESRl-NCDl pudiera estar ejerciendo sobre

cada uno de ellos. Desde la década de los 80 se conoce que la expresión del receptor de estrógenos en el tumor se asocia a un grado histológico con un mayor nivel de diferenciación celular, y éste parámetro es precisamente uno de los mayores indicadores con valor pronóstico usado en la práctica clínica (Fisher y cois., 1981). Al estudiar el papel que ESRl-NCDl pudiera estar ejerciendo sobre los tumores ER(+) (aquellos que expresan el receptor de estrógenos alfa) se pudo observar que la presencia de ESRl- NCDl por si sola condicionaba la aparición de un subtipo de cáncer de mama con mayor grado de diferenciación (Grado 1(27%), Grado 2(13%), Grado 3 (13%),χ =6,5, p=0,04) La Tabla 9 muestra la distribución de ESRl-NCDl de acuerdo al grado histológico en tumores ER(+):

II: Ausencia de la variante ESRl-NCDl; ID: una copia de la variante ESRl-NCDl; DD: dos copias de la variante ESRl -NCD 1.

Usando un test de χ ² con dos grados de libertad la presencia del alelo D se encuentra significativamente sobre-representado entre aquellas mujeres con tumores de grado histológico I(χ ² =6,5, p=0,04).

Este dato sugiere que aquellas células expresando receptor de estrógenos y que además cuentan con al menos un alelo mutante de ESRl-NCDl, presentan un fenotipo de hipersensibilidad a los niveles de estrógenos que correlaciona con un mayor grado de diferenciación celular.

Paralelamente, se puso de manifiesto que ESRl-NCDl estaba asociado a una menor incidencia de metástasis a debut (presencia de metástasis en el primer diagnóstico) entre aquellos tumores ER(+). Si bien un 5% de los casos de cáncer de mama presentaban una metástasis en el momento de diagnóstico, la presencia de un alelo solamente disminuía

a menos de la mitad el riesgo de mostrar metástasis a debut (p=0,05), lo que se entiende como un valor de mejor pronóstico.

Por otro lado, existían dos resultados que de nuevo sugerían un papel funcional de ESRl-NCDl en el desarrollo y pronóstico del tumor. En primer lugar, aquellas mujeres portadoras de la variante ESRl-NCDl tenían menos probabilidad de desarrollar un tumor multifocal (8,5% vs 3,4%, p=0.04). Además, aquellas mujeres con tumores únicos que presentaban la deleción ESRl-NCDl contaban con tumores menores en diámetro (2,83cm vs 2,38cm, p=0,07).

Tomando en cuenta éstos datos en su conjunto, se puede decir que la presencia de la variante mutante de ESRl-NCDl condiciona la capacidad de proliferación y diferenciación de las células tumorales, probablemente al responder de una forma diferencial a los niveles extracelulares de estrógenos, lo que finalmente acarrea una progresión diferencial del tumor atendiendo al subtipo tumoral y a la presencia de ESRl-NCDl.

Se puede concluir que existen claras evidencias de que la presencia de ESRl-NCDl condiciona diferencialmente el riesgo a padecer cáncer de mama en una parte significativa de la población española. Esto se debe probablemente a que las células de aquellas mujeres portadoras de la variante ESRl-NCDl muestran una sensibilidad diferencial a los estrógenos circulantes. Además, existen evidencias estadísticamente significativas de que el papel de ESRl-NCDl no se ve circunscrito a la susceptibilidad a cáncer de mama, sino que influencia la propia progresión del tumor en un subgrupo claramente determinado de pacientes ya que afecta al grado de agresividad del tumor.

De nuevo todos estos hallazgos confirman que los portadores de la deleción tienen una mayor sensibilidad a los estrógenos: por una parte se ha demostrado más allá de toda duda que la carcinogénesis mamaria es estrógeno dependiente. Por otra parte también se ha comprobado por grupos científicos independietes que los tumores mamarios que adquieren durante su proceso tumorigénico un mayo número de copias en ESRl tienen mejor evolución y repuesta tamoxifeno. Este tipo de mutación somática que aparece en

las líneas tumorales sería equivalente al de los portadores de la deleción germinal NCDl pero provocaría la sobreseñalización de la ruta de ESRl por un mecanismo molecular radicalmente distinto.

Ejemplo 11. Análisis de la variante ESRl-NCDl sobre la hipertensión arterial

La comparación de la frecuencia de la variante ESRl-NCDl en ambos grupos nos indicó lo siguiente.

Esta variante no está asociada a la presión arterial diastólica. Sin embargo, ESRl-NCDl sí que presenta un efecto de protección sobre la presión arterial sistólica (p=0,042; O.R.= 0,65; I.C.95% [0,43-0,98]). Estos resultados indican que los individuos portadores de la variante ESRl-NCDl presentan un 35% menos de probabilidades de presentar hipertensión sistólica.

Por otro lado, también se pudo detectar el efecto de la variante ESRl-NCDl en el grupo de individuos con presión sanguínea sistólica > 130 mmHg y presión sanguínea diastólica < 85 mmHg (p=0,02; O.R.= 0,66; I.C.95% [0,46-0,94]).

De nuevo, el efecto de la variante ESRl-NCDl sobre un rasgo independiente (en este caso la hipertensión arterial), indica que la variante ESRl-NCDl incrementa los efectos de los estrógenos (protección frente a la hipertensión arterial) lo que apoya que esta variante presenta un efecto de sensibilización a las acciones de los estrógenos y/o sustancias con capacidad estrogénica.

Ejemplo 12. Análisis de la variante ESRl-NCDl en el Síndrome Metabólico Los análisis estadísticos muestran una asociación nominal de la variante ESRl-NCDl con el SM. Según los resultados de la presente invención, dicha variante actúa como un factor de protección reduciendo el riesgo de padecer SM en un 64% (p=0,007; O.R.= 0,36; I.C.95% [0,18-0,76]).

Teniendo en cuenta estos resultados en la presente invención se propone la determinación de la variante ESRl-NCDl como método de pronóstico y/o diagnóstico para la predisposición a padecer SM.

Al igual que en el caso de la hipertensión arterial, el efecto observado para la variante ESRl-NCDl sobre el SM, pone de manifiesto que esta variante tiene el efecto de aumentar la actividad estrogénica mediante un incremento de la sensibilidad a la acción de los mismos.

REFERENCIAS

Albagha OM, Pettersson U, Stewart A, McGuigan FE, MacDonald HM, Reid DM, Ralston SH (2005) Association of oestrogen receptor alpha gene polymorphisms with postmenopausal bone loss, bone mass, and quantitative ultrasound properties of bone. J Med Genet 42, 240-246.

Alberti KG, Zimmet P, Shaw J; IDF Epidemiology Task Forcé Consensus Group (2005)

The metabolic syndrome~a new worldwide definition. Lancet, 366, 1059-1062. Baccetti B, Capitani S, Collodel G, Strehler E, Piomboni P (2002) Recent advances in human sperm pathology. Contraception 65, 283-287.

Boyapati SM, Shu XO, Rúan ZX, Cai Q, Smith JR, Wen W, Gao YT, Zheng W (2005) Polymorphisms in ER-alpha gene interact with estrogen receptor status in breast cáncer survival. Clin Cáncer Res 11, 1093-1098. Burt VL, Whelton P, Roccella EJ, Brown C, Cutler JA, Higgins M, Horan MJ, Labarthe D (1995) Prevalence of hypertension in the US adult population. Results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988-1991. Hypertension 25, 305-313.

Carlsen E, Giwercman A, Keiding N, Skakkebaek NE (1992) Evidence for decreasing quality o f semen during past 50 years. BMJ 305, 609-613.

Castellani C, Malerba G, Sangalli A, Delmarco A, Petrelli E, Rossini M, Assael BM, Mottes M (2006) The genetic background of osteoporosis in cystic fibrosis: association analysis with polymorphic markers in four candidate genes. J Cyst Fibras 5, 229-235. Choi JY, Shin A, Park SK, Chung HW, Cho SI, Shin CS, Kim H, Lee KM, Lee KH, Kang C, Cho DY, Kang D (2005) Genetic polymorphisms of OPG, RANK, and ESRl and bone mineral density in Korean postmenopausal women. Calcif Tissue Int. 77, 152-159.

Collins J (2001) Cost-effectiveness of in vitro fertilization. Semin Reprod Med 19, 279- 289.

Cooke HJ, Saunders PT (2002) Mouse models of male infertility. Nat Rev Genet 3, 790- 801.

de Castro F, Ruiz R, Montoro L, Perez-Hernandez D, Sánchez-Casas Padilla E, Real

LM, Ruiz A (2003) Role of follicle-stimulating hormone receptor Ser680Asn polymorphism in the efficacy of follicle-stimulating hormone. Fértil Steril 80, 571-

576. de Castro F, Morón FJ, Montoro L, Real LM, Ruiz A (2005) Pharmacogenetics of controlled ovarían hyperstimulation. Pharmacogenomics 6, 629-637. Dellenbach P, Nisand I, Moreau L, Feger B, Plumere C, Gerlinger P (1985)

Transvaginal sonographically controlled follicle puncture for oocyte retrieval. Fértil

Steril 44, 656-662. Delvigne A, Rozenberg S (2002) Epidemiology and prevention of ovarían hyperstimulation syndrome (OHSS): a review. Hum Reprod Update 8, 559-577. Deroo BJ, Korach KS (2006) Estrogen receptors and human disease. J Clin Invest 116,

561-570.

DeStefano AL, Larson MG, Mitchell GF, Benjamin EJ, Vasan RS, Li J, Corey D, Levy D (2004) Genome-wide sean for pulse pressure in the National Heart, Lung and

Blood Institute's Framingham Heart Study. Hypertension 44, 152-155. den Dunnen JT, Antonarakis SE (2001) Nomenclature for the description of human sequence variations. Hum Genet 109, 121-124.

Dohle GR, Colpi GM, Hargreave TB, Papp GK, Jungwirth A, Weidner W; The EAU Working Group on Male Infertility (2005) EAU guidelines on male infertility. Eur

Urol 48, 703-711. Dumitrescu RG, Cotarla I (2005) Understanding breast cáncer risk — where do we stand in 2005?. J CeIl Mol Med 9, 208-221.

Edwards RG, Steptoe PC, Purdy JM (1980) Establishing full-term human pregnancies using cleaving embryos grown in vitro. Br J Obstet Gynaecol 87, 737-756.

Ettinger B, Pressman A, Sklarin P, Bauer DC, Cauley JA, Cummings SR (1998)

Associations between low levéis of serum estradiol, bone density, and fractures among elderly women: the study of osteoporotic fractures. J Clin Endocrinol Metab

83, 2239-2243. Fisher ER, Osborne CK, McGuire WL, Redmond C, Knight WA 3rd, Fisher B,

Bannayan G, Walder A, Gregory EJ, Jacobsen A, Queen DM, Bennett DE, Ford HC

(1981) Correlation of primary breast cáncer histopathology and estrogen receptor content. Breast Cáncer Res Treat 1, 37-41. Forman RG, Frydman R, Egan D, Ross C, Barlow DH (1990) Severe ovarían hyperstimulation syndrome using agonists of gonadotropin-releasing hormone for in vitro fertilization: a European series and a proposal for prevention. Fértil Steril 3,

502-509. Forti G, Krausz C (1998) Clinical review 100: Evaluation and treatment of the infertile couple. J Clin Endocrinol Metab 83, 4177-4188.

Galán JJ, Buch B, Cruz N, Segura A, Morón FJ, Bassas L, Martinez-Pineiro L, Real LM, Ruiz A (2005) Multilocus analyses of estrogen-related genes reveal involvement of the ESRl gene in male infertility and the polygenic nature of the pathology. Fértil Steril 84, 910-918. Galán JJ, Guarducci E, Nuti F, González A, Ruiz M, Forti G, Ruiz A, Krausz C (2006)

ESRl gene áGATA haplotype in human cryptorchidism and male infertility. Hum Reprod (sometido).

González-Mancha R, Galán JJ, Crespo C, Iglesias-Pérez L, Gonzalez-Perez A, Morón

FJ, Moreno-Nogueira JA, Real LM, Hidalgo-Pascual M, Ruiz A, Royo JL (2007)

ERa germline PvuII marker is significantly associated to familial forms of breast cáncer and correlates with specific inmunohistochemical parameters. Med Sci Monit. Sometido.

Greb RR, Grieshaber K, Gromoll J, Sonntag B, Nieschlag E, Kiesel L, Simoni M (2005)

A common single nucleotide polymorphism in exon 10 of the human fo Hiele stimulating hormone receptor is a major determinant of length and hormonal dynamics of the menstrual eyele. J Clin Endocrinol Metab 90, 4866-4872. Griffmg GT, Melby JC, Holbrook M, Johnston ON (1991) Antihypertensive effeets of an aromatase inhibitor in inbred salt-sensitive rats. Hypertension 17, 771-775. Gruber CJ, Tschugguel W, Schneeberger C, Huber JC (2002) Production and actions of estrogens. N Engl J Med 346, 340-352.

Guarducci E, Nuti F, Becherini L, Rotondi M, Balercia G, Forti G, Krausz C (2006) Estrogen receptor alpha promoter polymorphism: stronger estrogen action is coupled with lower sperm count. Hum Reprod 21, 994-1001. Hardy GH (1908). Mendelian proportion in a mixed population". Science 28:49-50.

Hess RA, Bunick D, Lubahn DB, Zhou Q, Bouma J (2000) Morphologic changes in efferent ductules and epididymis in estrogen receptor-alpha knockout mice. J Androl

21, 107-121.

Herynk MH, Fuqua SA (2004) Estrogen receptor mutations in human disease. Endocr Rev. 25, 869-898. uHoh J, Wille A, Ott J (2001) Trimming, weighting, and grouping SNPs in human case- control association studies. Genome Res 11, 2115-2119. Holst F, Stahl PR, Ruiz C, Hellwinkel O, Jehan Z, Wendland M, Lebeau A, Terracciano

L, Al-Kuraya K, Janicke F, Sauter G, Simón R (2007) Estrogen receptor alpha (ESRl) gene amplification is frequent in breast cáncer. Nat Genet 39, 655-660.

Huang Z, Hankinson SE, Colditz GA, Stampfer MJ, Hunter DJ, Manson JE, Hennekens

CH, Rosner B, Speizer FE, Willett WC (1997) Dual effects of weight and weight gain on breast cáncer risk. JAMA 278, 1407-11.

Ioannidis JP, Ralston SH, Bennett ST, Brandi ML, Grinberg D, Karassa FB, Langdahl B, van Meurs JB, Mosekilde L, Seo lien S, Albagha OM, Bustamante M, Carey AH,

Dunning AM, Enjuanes A, van Leeuwen JP, Mavilia C, Masi L, McGuigan FE,

Nogues X, PoIs HA, Reid DM, Schuit SC, Sherlock RE, Uitterlinden AG;

GENOMOS Study (2004) Differential genetic effects of ESRl gene polymorphisms on osteoporosis outeomes. JAMA 292, 2105-2114. Joffe M (2003) Infertility and environmental pollutants. Br Med BuIl 68, 47-70.

Katz P, Nachtigall R, Showstack J (2002) The economic impact of the assisted reproductive technologies. Nat CeIl Biol 4 Suppl, s29-s32. Kligman I, Rosenwaks Z (2001) Differentiating clinical profiles: predicting good responders, poor responders, and hyperresponders. Fértil Steril 76, 1185-1190. Korach KS (1994) Insights from the study of animáis lacking functional estrogen receptor. Science 266, 1524-1527. Krausz C, Forti G, McElreavey K (2003) The Y chromosome and male fertility and infertility. Int J Androl 26, 70-75.

Krausz C, Degl'Innocenti S (2006) Y chromosome and male infertility: update, 2006. Front Biosci 11, 3049-3061.

Kukuvitis A, Georgiou I, Bouba I, Tsirka A, Giannouli CH, Yapijakis C, Tarlatzis B,

Bontis J, Lolis D, Sofϊkitis N, Papadimas J (2002) Association of oestrogen receptor

alpha polymorphisms and androgen receptor CAG trinucleotide repeats with male infertility: a study in 109 Greek infertile men. Int J Androl 25, 149-152. Lalouel JM (2003) Large-scale search for genes predisposing to essential hypertension.

Am J Hypertens 16, 163-166. Lazaros L, Markoula S, Xita N, Giannopoulos S, Gogou P, Lagos G, Kyritsis AP,

Georgiou I (2007) Association of estrogen receptor-alpha gene polymorphisms with stroke risk in patients with metabolic syndrome. Acta Neurol Scand. En prensa. Levy D, DeStefano AL, Larson MG, O'Donnell CJ, Lifton RP, Gavras H, Cupples LA,

Myers RH (2000) Evidence for a gene influencing blood pressure on chromosome 17. Genome sean linkage results for longitudinal blood pressure phenotypes in subjeets from the framingham heart study. Hypertension 36, 477-483. Lewontin RC, Kojima K. (1960). The evolutionary dynamics of complex polymorphisms. Evolution 14: 458-472

Lissens W (1999) Genetics of male reproductive dysfunction. En: Fauser BCJM, Rutherford AJ, Strauss III JF, Van Steirteghen A. Molecular Biology in reproductive medicine. New York: The Parthenon Publishing Group. Lopata A, Johnston IW, Hoult IJ, Speirs AI (1980) Pregnancy following intrauterine implantation of an embryo obtained by in vitro fertilization of a preovulatory egg.

Fértil Steril 33, 117-120. Lottrup G, Andersson AM, Leffers H, Mortensen GK, Toppari J, Skakkebaek NE, Main

KM (2006) Possible impact of phthalates on infant reproductive health. Int J Androl

29, 172-180. Maffei L, Rochira V, Zirilli L, Antunez P, Aranda C, Fabre B, Simone ML, Pignatti E,

Simpson ER, Houssami S, Clyne CD, Carani C (2007) A novel compound heterozygous mutation of the aromatase gene in an adult man: reinforced evidence on the relationship between congenital oestrogen deficieney, adiposity and the metabolic syndrome. Clin Endocrinol (Oxf) 67, 218-224. Melby JC, Azar ST, Delaney M, Holbrook M, Griffmg GT, Johnston JO. 19-Nor- corticosteroids in genetic hypertension (1993) Effects of inhibitors of 11 beta, 18, 19-hydroxylase activity. J Steroid Biochem Mol Biol 45, 13-18.

Morón FJ, Mendoza N, Vázquez F, Molero E, Quereda F, Salinas A, Fontes J,

Martinez-Astorquiza T, Sánchez-Borrego R, Ruiz A (2006) Multilocus analysis of

estrogen-related genes in Spanish postmenopausal women suggests an interactive role of ESRl, ESR2 and NRIPl genes in the pathogenesis of osteoporosis. Bone 39, 213-221.

Morón FJ, Galán JJ, Ruiz A (2007) Controlled ovarían hyperstimulation pharmacogenetics: a simplified model to genetically dissect estrogen-related diseases. Pharmacogenomics 8, 775-85.

Nuñez R (2005) Descenso de la calidad seminal en España. XII Congreso Nacional de Andrología. A Coruña. España.

O'Donnell L, Robertson KM, Jones ME, Simpson ER (2001) Estrogen and spermatogenesis. Endocr Rev 22, 289-318.

Onland-Moret NC, van GiIs CH, Roest M, Grobbee DE, Peeters PH (2005) The estrogen receptor alpha gene and breast cáncer risk (The Netherlands). Cáncer Causes Control 16, 1195-1202.

Ramirez-Lorca R, Grilo A, Martinez-Larrad MT, Manzano L, Serrano -Hernando FJ, Morón FJ, Perez-Gonzalez V, González- Sánchez JL, Fresneda J, Fernandez-Parrilla

R, Monux G, Molero E, Sánchez E, Martinez-Calatrava MJ, Saban-Ruiz J, Ruiz A,

Saez ME, Serrano-Rios M (2007) Sex and Body Mass Index Specific Regulation of

Blood Pressure by CYP 19Al Gene Variants. Hypertension. En prensa.

Reckelhoff JF (2001) Gender differences in the regulation of blood pressure. Hypertension 37, 1199-1208.

Rivadeneira F, van Meurs JB, Kant J, Zillikens MC, Stolk L, Beck TJ, Arp P, Schuit SC, Hofman A, Houwing-Duistermaat JJ, van Duijn CM, van Leeuwen JP, PoIs HA, Uitterlinden AG (2006) Estrogen receptor beta (ESR2) polymorphisms in interaction with estrogen receptor alpha (ESRl) and insulin-like growth factor I (IGFl) variants influence the risk of fracture in postmenopausal women. J Bone

Miner Res 21, 1443-1456.

Royo JL, Moreno-Nogueira JA, Galán JJ, Gonzalez-Martin A, Ruiz A, González- Mancha R, Real LM (2006) Lack of association between NOS3 Glu298Asp and breast cáncer risk: a case-control study. Breast Cáncer Res Treat 100, 331-333. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Nati Acad Sci U S A 74, 5463-5467.

Sasieni PD (1997) From genotypes to genes: doubling the sample size. Biometrics 53,

1253-1261. Semba S, Moriya T, Youssef EM, Sasano H (2000) An autopsy case of ovarían hyperstimulation syndrome with massive pulmonary edema and pleural effusion. Pathol Int 50, 549-52.

Shen Y, Li D.K, Wu J, Zhang Z, Gao E (2006) Jo int effects of the CYPlAl MspI,

ERalpha PvuII, and ERalpha Xbal polymorphisms on the risk of breast cáncer: results from a population-based case-control study in Shanghai, China. Cáncer

Epidemiol Biomarkers Prev 15, 342-347. Shin A, Kang D, Nishio H, Lee MJ, Park SK, Kim SU, Noh DY, Choe KJ, Ahn SH,

Hirvonen A, Kim JH, Yoo KY (2003) Estrogen receptor alpha gene polymorphisms and breast cáncer risk. Breast Cáncer Res Treat 80, 127-31. Simoni M, Bakker E, Krausz C (2004) EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y-chromosomal microdeletions. State of the art 2004. Int J Androl 27, 240-249.

Smith, E. P.; Boyd, J.; Frank, G. R.; Takahashi, H.; Cohén, R. M.; Specker, B.;

Williams, T. C; Lubahn, D. B.; Korach, K. S (1994) Estrogen resistance caused by a mutation in the estrogen-receptor gene in a man. New Eng. J. Med 331, 1056-

1061. Suzuki Y, Sasagawa I, Itoh K, Ashida J, Muroya K, Ogata T (2002) Estrogen receptor alpha gene polymorphism is associated with idiopathic azoospermia. Fértil Steril 78,

1341-1343. Swan SH, Elkin EP, Fenster L (1997) Have sperm densities declined? A reanalysis of global trend data. Environ Health Perspect 105, 1228-1232. Swan SH, Elkin EP, Fenster L (2000) The question of declining sperm density revisited: an analysis of 101 studies published 1934-1996. Environ Health Perspect 108, 961-

966. Tarlatzis BC, Zepiridis L, Grimbizis G, Bontis J (2003) Clinical management of low ovarian response to stimulation for IVF: a systematic review. Hum Reprod Update 9, 61-76. te Velde ER, Pearson PL (2002) The variability of female reproductive ageing. Hum

Reprod Update 8, 141-154.

Tournaye H (2002) Gamete source and manipulation. En Vayena E, Rowe PJ, Griffin

PD (eds). Current practices and controversies in assisted reproduction. World Health

Organization, Geneva, Switzerland, pp. 83-101.

Tregouet DA, Escolano S, Tiret L, Mallet A, Golmard JL (2004). A new algorithm for haplotype-based association analysis: the Stochastic-EM algorithm. Ann Hum

Genet. 68(Pt 2): 165-77. Wedren S, Lovmar L, Humphreys K, Magnusson C, Melhus H, Syvanen AC, Kindmark

A, Landegren U, Fermer ML, Stiger F, Persson I, Barón J, Weiderpass E (2004)

Oestrogen receptor alpha gene haplotype and postmenopausal breast cáncer risk: a case control study. Breast Cáncer Res 6, R437-49.

Weinberg W. (1908). über den Nachweis der Vererbung beim Menschen". Jahresh.

Verein f. vaterl. Natkd in Wüttemberg 64:368-382. World Health Organization (WHO) (2000) WHO Manual for the Standardised

Investigation and Diagnosis of the Infertile Couple. Cambridge: Cambridge University Press.

Yaich L, Dupont WD, Cavener DR, Parí FF (1992) Analysis of the PvuII restriction fragment-length polymorphism and exon structure of the estrogen receptor gene in breast cáncer and peripheral blood. Cáncer Res 52, 77-83.

Yoshida R, Fukami M, Sasagawa I, Hasegawa T, Kamatani N, Ogata T (2005) Association of cryptorchidism with a specific haplotype of the estrogen receptor alpha gene: implication for the susceptibility to estrogenic environmental endocrine disruptors. J Clin Endocrinol Metab 90, 4716-4721. Yoshidome K, Shibata MA, Couldrey C, Korach KS, Green JE (2000) Estrogen promotes mammary tumor development in C3(l)/SV40 large T-antigen transgenic mice: paradoxical loss of estrogen receptoralpha expression during tumor progression. Cáncer Res 60, 6901-6910. Zalel Y, Katz Z, Caspi B, Ben-Hur H, Dgani R, Insler V (1992) Spontaneous ovarían hyperstimulation syndrome concomitant with spontaneous pregnancy in a woman with polycystic ovary disease. Am J Obstet Gynecol 67, 122-124.