Die vorliegende Erfindung betrifft ein in-vitro-Testverfahren zur Früherken nung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weibli chen Patientin.

Die Endometriose stellt mit einer Prävalenz von 10-15 % aller Frauen im reproduktiven Alter eine der häufigsten gynäkologischen Erkrankungen dar. Sie wird definiert als das Vorkommen von endometrialen Stroma - und Drü senzellen außerhalb des Corpus uteri (Körper der Gebärmutter). Ihre Leit symptome sind neben der azyklischen, vaginalen Blutung je nach Lokalisa tionsort auch Schmerzen bei der Harnblasen- und Stuhlentleerung sowie Schmerzen beim Geschlechtsverkehr. Ihr Kardinalsymptom sind die star ken Schmerzen während der Periodenblutung (Dysmenorrhoe), die sehr oft die Einnahme von hohen Analgetikadosen nach sich zieht.

Die Adenomyose ist eine Sonderform der Endometriose, bei welcher Endo metriuminseln innerhalb des Myometriums (Gebärmuttermuskulatur) auftre- ten.

Die Folgen einer häufig erst nach Jahren diagnostizierten Endometriose sind für die Patientin äußerst unangenehm: So ist es möglich, dass eine bereits von Beginn an schmerzhafte Endometriose eine kontinuierliche Wei terentwicklung erfährt und massiv pelvine Strukturen befällt. Eine derartige Krankheitsausbildung wird auch als„tief infiltrierende Endometriose“ bzw. „TIE“ bezeichnet. Häufig schließt sich dann eine Historie von operativen Maßnahmen bei der jungen Frau an. Neben den augenscheinlichen Stra pazen für die Patientin gehen mit diesen Maßnahmen auch ökonomische Belastungen des Gesundheitssystems und teilweise langfristige Arbeitsunfähigkeit der Patientin einher. Eine weitere, sehr unerwünschte Folge ist die weitestgehende Unfruchtbarkeit der betroffenen Frau, die mit einer langjährige Endometriose normalerweise einhergeht. Kissler et al. konnten in einem Kollektiv an Sterilitätspatientinnen mit einer Häufigkeit von 35 - 40 % eine bis zur Untersuchung unerkannte Endometriose oder Ade nomyose als häufigste somatische Diagnose stellen (Kissler S, Marx K, Scholtes M, Pfeiffer S, Meier W, Neulen J. Predisposition of subtle endo- metriotic lesions predominantly on the left side assessed by transvaginal hydrolaparoscopy (TFIL) Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 201 1 Oct; 158 (2): 185-88).

Die Dysmenorrhoe als Kardinalsymptom einer Endometriose wird charak terisiert durch eine erhöhte Amplitude und Frequenz der Innendrücke an der nicht-schwangeren Gebärmutter während der Menstruation (Buletti C, de Ziegler D, Polli V, del Ferro E, Palini S, Flamigni C. Characteristics of uterine contractility during menses in women with mild to moderate endo- metriosis. Fertil Steril. 2002 Jun; 77(6): 1 156-61 .).

Die Entstehungsursachen der Endometriose sind noch nicht vollständig auf geklärt. Untersuchungen, an denen auch der Erfinder der vorliegenden An meldung beteiligt war, weisen deutlich auf einen Zusammenhang zwischen Wundheilungsprozessen infolge Autotraumatisierung und der Endometri ose-Entstehung hin. Die beobachteten Wundheilungsprozesse sowie die damit assoziierten molekularen Vorgänge sind nicht organspezifischer Na tur.

Der Goldstandard in der Diagnostik der Endometriose ist seit Jahren die Laparoskopie (LSK) mit einer genauen optischen Inspektion der typischen Prädilektionsstellen im kleinen Becken der Frau für den Sitz einer pelvinen Endometriose. Bei visuellem Nachweis erfolgt über eine Biopsie (Probegewebeentnahme) der histologische Nachweis. Bei der Laparosko pie handelt es sich um einen invasiven Eingriff, die eine belastende Unter suchung darstellen kann. Es besteht die Erfahrung, dass sich aus bei einer in sehr jungem Alter der Frau durchgeführte Laparoskopie häufig keine oder nur sehr schwache Hinweiszeichen auf eine pelvine Endometriose ergeben. Entsprechend konnte weiterhin gezeigt werden, dass aus diesen Gründen eine Latenzzeit von durchschnittlich 7-10 Jahren vergeht, bis der behan delnde Frauenarzt/Frauenärztin über die Laparoskopie zu einer eindeutigen Diagnosestellung kommt. Häufig liegt dann bereits bei der Patientin eine Unfruchtbarkeit vor, die erst im Zusammenhang mit einem unerfüllten Kin derwunsch erkannt wird.

Dem Kardinalsymptom der Endometriose, der Dysmenorrhoe, wird durch den Frauenarzt/Frauenärztin häufig nicht gleich die nötige Aufmerksamkeit gewidmet, da die Dysmenorrhoe meist sehr früh (primär), also mit Einsetzen der Regelblutung (Menarche) oder nur eine kurze Zeitspanne später (se kundär) nach der Menarche einsetzt. Bei solch jungen Frauen oder Mäd chen will der betreuende Frauenarzt/Frauenärztin meist nicht sofort zu einer Laparoskopie raten, da sie einen invasiven Eingriff darstellt und somit auch oft abgelehnt wird. Wenn im Rahmen einer Laparoskopie dann nach mehr jährigem Erkrankungsprozess eine pelvine Endometriose oder eine uterine Adenomyose festgestellt werden, hat im Regelfall schon eine Zerstörung der zarten inneren Muskelschichten begonnen. Diese Muskelschichten sind jedoch für die uterine Kontraktilität und den gerichteten Spermientransport erforderlich. Bei einer funktionellen Beeinträchtigung ist mit einem Rück gang der Fertilität zu rechnen.

In jüngerer Vergangenheit konnte gezeigt werden, dass die Dauer einer be stehenden Dysmenorrhoe als Leitsymptom einer Endometriose mit der Aus prägung der uterinen Adenomyose positiv korreliert ist (Kissler et al. 2, Parker et al. 3). Bei einer länger bestehender Endometriose weisen etwa 80 % der Frauen Wandveränderungen an der uterinen Architektur auf. Ap parativ-diagnostisch kann dieser Nachweis über die transvaginale Ultra schall-Untersuchung oder über T2-gewichtete Magnetresonanztomogra phie gestellt werden. Hierbei können diffuse oder lokale Verdickungen der Gebärmutterwand, Veränderungen der Wandtextur oder eine Verdickung der subendometrialen Schichten (HALO, Junktionalzone) festgestellt wer den. Diese uterinen Veränderungen sind bei der invasiv-operativen Endo metrioseabklärung dem Operateur nicht zugänglich und bleiben daher ohne zusätzliche Untersuchungen mit bildgebenden Verfahren unerkannt.

Die WO201601 1377 beschreibt einen in-vitro-Test zum Nachweis der En dometriose, bei der die Menge an Transkripten von einem der Gene CCL3LI, CCL3, FAM180A, THBS2, PDGFRL, FNI, CLEI IA, CCNA2, KIF20A, BUBIB, HSDI 7B6, HSDI IBI, C7, C3, CXCL2, CXCL12, CXCL13, PDGFC, CXCL14, ACTA2, TAGLN, oder SORBSI in Gewebeproben ge messen wird. Die in der WO201601 1377 vorgeschlagene Methode erfordert eine Gewebeentnahme, beispielsweise eine Biopsie.

Die DE10048633 beschreibt einen in-vitro-Test zum Nachweis der Endo metriose, bei der die Menge an Transkript oder an Proteingenprodukt von mindestens einem der Gene Fibronectin, Insulin-like growth factor binding protein-2, Transmembrane receptor PTK7, Platelet-derived growth factor receptor alpha, Collagen type XVIII alpha 1 , Subtilisin-like protein (PACE4), Laminin M chain (Merosin), Elastin, Collagen type IV alpha 2, p27 Interferon alpha-inducible gene, Reticulocalbin, Aldehyde Dehydrogenase 6, Gravin, Nidogen und Phospholipase C Epsilon in einer Patientinnenprobe bestimmt und mit einer Kontrollprobe verglichen wird. Eine geringere Menge an dem Genprodukt weist ausweislich DE10048633 auf das Vorliegen einer Endometriose hin. Die untersuchten Proben entstammen einer Endometri umbiopsie (Strichcurettage).

Die JP2009168646 schlägt zum Nachweis der Endometriose im Blutserum einen Biomarker vor, der ein Molekulargewicht von 5830 aufweist und mit SELDI-TOF-Massenspektroskopie nachgewiesen wird. Die Sensitivität und die Spezifität des Nachweises betragen ausweislich JP2009168646 jeweils mindestens 80 %.

Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, die Diagnose der Endometriose und ihrer Sonderform Adenomyose weiter zu erleichtern. Ins besondere lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, bei Frauen, insbesondere bei jungen Frauen, einen Vorsorgetest zu entwickeln, um eine Endometriose und ihre Sonderform Adenomyose möglichst früh zeitig nachweisen zu können. Wünschenswert war es hierbei, ein Testver fahren mit hoher Spezifität bereitzustellen, das auf einfache Weise und ohne belastende Eingriffe in den Körper der Frau durchgeführt werden kann. Das Testverfahren sollte sich auch für Reihenuntersuchungen eig nen. Somit könnten dann durch geeignete Behandlungskonzepte die wei tere Ausbreitung einer Endometriose bis zu ihrem Vollbild mit stärksten Schmerzzuständen sowie unerfülltem Kinderwunsch vermieden werden.

Zur Lösung der Aufgabe wird ein in-vitro-Testverfahren nach Anspruch 1 zur Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weiblichen Patientin vorgeschlagen.

Erfindungsgemäß werden weiterhin ein Nachweis-Kit sowie zum Nachweis geeignete PCR-Primer und Antikörper vorgeschlagen. Das von dem Erfinder der vorliegenden Anmeldung vorgeschlagene in- vitro-Testverfahren zur Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weiblichen Patientin, umfasst zumindest die folgen den Schritte: a) Bereitstellung von Menstruationsblut der zu untersuchenden Patientin, b) Bestimmen einer Expression der Gene ESR2 und/oder CXCL12 und/o der CXCR4 im Vergleich zu mindestens einer Kontrollprobe, wobei eine er höhte Expression einer oder mehrerer der Gene auf eine Endometriose und/oder uterine Adenomyose hinweist.

ESR2 ist die Bezeichnung für das Gen, welches den„Estrogenrezeptor- beta“ (ER-beta bzw. ERß, Gen ESR2, Gen ID 2100) kodiert.

CXCL12 ist die Bezeichnung für das Gen, welches den„stromal cell-derived factor 1“, ein Zytokin (Gen ID 6387) kodiert.

CXCR4 ist die Bezeichnung für das Gen, welches den„SDF-1 -Rezeptor““, (Gen ID 7852) kodiert.

Aus Untersuchungen der Expression der Gene ESR2, CXCL12 und CXCR4 in Proben von Menstruationsblut ergaben sich Flinweise, dass eine erhöhte Expression der genannten Gene auf Frühstadien der Endometriose hindeu ten können, insbesondere bei Patientinnen mit Dysmenorrhoe.

Die diagnostische Methode kann ohne belastender Gewebeentnahmen durchgeführt werden. Das Verfahren ist vergleichsweise kostengünstig und kann für Reihenuntersuchungen eingesetzt werden.

Das in Schritt a) bereitgestellte Menstruationsblut kann beispielsweise mit tels einer vaginalen Untersuchung, insbesondere mittels einer gynäkologischen Speculumuntersuchung der Patientin gewonnen werden. Alternativ kann das Menstruationsblut aus einem von der Patientin verwen deten Tampon stammen, welcher unmittelbar nach der Entnahme bei min destens -25°C tiefgefroren wird und/oder in ein spezielles Behältnis, in dem sich eine geeignete Konservierungsflüssigkeit befindet, verbracht wird. Al ternativ kann für das diagnostische Verfahren auch Menstruationsblut ver wendet werden, welches mittels einer Vaginalkappe gesammelt und mittels einer Konservierungsflüssigkeit stabilisiert oder bei mindestens -25°C tief gefroren wurde.

Das Menstruationsblut kann aus einer an einem der Zyklustage 1 bis 3, vor zugsweise am Zyklustag 2, durchgeführten vaginalen Untersuchung der Patientin stammen. Falls der in-vitro-Test unter Verwendung eines von der Patientin zur Verfügung gestellten Tampons durchgeführt wird, sollte der Tampon gleichfalls an einem der Zyklustage 1 bis 3, vorzugsweise am Zyk lustag 2, verwendet worden sein. Entsprechendes gilt bei Verwendung ei ner Vaginalkappe.

Das in-vitro-Testverfahren kann besonders vorteilhaft bei Patientinnen ein gesetzt werden, bei denen eine Dysmenorrhoe vorliegt, insbesondere bei solchen, die sich diesbezüglich in gynäkologischer Behandlung befinden, da bei dieser Patientinnen-Gruppe eine besonders hohe Spezifität des Tests zu erwarten ist.

Es gibt keinen leitliniengerechten Score zur Klassifizierung der Dysmenor rhoe. In der gynäkologischen Praxis des Erfinders der vorliegenden Anmel dung wurde jedoch zur Quantifizierung der Dysmenorrhoe anhand der sub jektiv wahrgenommenen Ausprägung des Schmerzempfindens der Patien tinnen die nachfolgend wiedergegebene Klassifikation entwickelt und ein geführt: Dysmenorrhoe 0°: es liegen keine Schmerzen bei der Menstruation vor.

Dysmenorrhoe : leichte bis mittelgradige Schmerzen bei der Menstruation ohne Schmerzmitteleinnahme.

Dysmenorrhoe I : mittelgradige bis starke Schmerzen bei der Menstruation ohne Schmerzmitteleinnahme.

Dysmenorrhoe II : starke Schmerzen bei der Menstruation mit Schmerz mitteleinnahme.

Das in-vitro-Testverfahren sollte vorzugsweise bei Patientinnen angewandt werden, welche entsprechend der hier beschriebenen Klassifikation der Gruppe ll° oder lll°, insbesondere der Gruppe lll° zuzuordnen sind. Bei Pa tientinnen der Gruppe lll° sind die Aussichten einer erfolgreichen Behand lung der Endometriose oder Adenomyose dann als gut einzustufen, wenn die Behandlung rechtzeitig aufgenommen wird, so dass diese Patientinnen in besonderem Maße von dem Früherkennungstest profitieren.

Bezüglich der Diagnosestellung Dysmenorrhoe wird gleichzeitig auf den ICD (International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems) verwiesen, wobei hier auf den ICD-10 Bezug genommen wird. ICD N 95-4 kennzeichnet die primäre Dysmenorrhoe, N 94-5 die sekundäre Dysmenorrhoe.

Entsprechend ist die hier, gemäß einer besonders bevorzugten Ausfüh rungsform vorgeschlagene Erfindung, auf ein in-vitro-Testverfahren zur Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weiblichen Patientin gerichtet, mit den Schritten a) Bereitstellung von Menstruationsblut der zu untersuchenden Patientin, und b) Bestimmen ei ner Expression der Gene ESR2 und/oder CXCL12 und/oder CXCR4 im Ver gleich zu mindestens einer Kontrollprobe, wobei eine erhöhte Expression einer oder mehrerer der Gene auf eine Endometriose und/oder uterine A- denomyose hinweist, und wobei die Patientin akut an Dysmenorrhoe leidet und/oder eine Vorgeschichte von Dysmenorrhoe aufweist, insbesondere an primärer Dysmenorrhoe (ICD 94-4) oder an sekundärer Dysmenorrhoe (ICD 94-5), und/oder welche nach dem in der vorliegenden Anmeldung beschrie benen Klassifikationssystem der Klasse ll° oder lll°, insbesondere der Klasse lll°, zuzuordnen ist.

Nach den Erkenntnissen des Erfinders der vorliegenden Anmeldung könnte die Dysmenorrhoe einen Auslöser für das Entstehen der Endometriose dar stellen. Infolge der vermehrten Kontraktilität aller uterinen Wandschichten kommt es zu der eingangs erwähnten Autotraumatisierung der Uterusmus kulatur, vor allem im Bereich der entwicklungsgeschichtlich ältesten uteri nen Funktionseinheit, dem endometrialen-myometrialen Übergang bzw. dem Bereich des sogenannten basalen Endometriums. Dieser bei den be troffenen jungen Frauen frühzeitig einsetzende Prozess setzt sich kontinu ierlich monatlich fort und es kommt zu einer Abschilferung und Ausstoßung von Fragmenten basalen Endometriums während der Menstruation. Dieses Phänomen wurde bei symptomfreien Frauen ohne das Vorliegen einer Dys menorrhoe nicht beobachtet. Die Autotraumatisierung der Uterusmuskula tur setzt ubiquitär im humanen Körper vorkommende zelluläre und moleku larbiologische Prozesse der Wundheilung in Gang, in deren Folge es zu einer erhöhten Steroidogenese der endometrialen Stromazellen kommt, die dann zu einer erhöhten parakrinen Estradiolproduktion führt (Leyendecker G, Wildt L, Mall G. The pathophysiology of endometriosis and adenomyosis: tissue injury and repair. Arch Gynecol Obstet. 2009 Oct; 280(4): 529-38). Estradiol spielt eine führende Rolle in der Vermehrung uteriner Kontraktilität und unterstützt daher den Prozess der Autotraumatisierung.

Das Estradiol bindet an den Estrogenrezeptor-beta (ER-beta). Bereits frühere Arbeiten des Erfinders der vorliegenden Anmeldung wiesen auf ei nen Zusammenhang zwischen einer erhöhten ER-beta Expression im ab geschilferten Menstrualblut und den Auftreten von Dysmenorrhoe hin (Kis- sler S, Schmidt M, Keller N, Wiegratz I, Kohl J, Baumann R, Kunz G, Kauf mann M, Leyendecker G Real-Time PCR-Analyse für Östrogen-Rezeptor beta, Progesteronrezeptor und P-450-Aromatase im Menstrualblut - eine Pilotstudie über die Bedeutung des basalen Endometriums in der Pathoge nese der Endometriose. Geburtshilfe Frauenheilkd 2007; 67 - A24). Weitere Forschungsarbeiten konnten aufzeigen, dass ER-beta ein Präkursor für die Chemoattraktion des Chemokins CXCL 12 darstellt. Zusammen mit dem auf der Oberfläche von mesenchymalen Stammzellen (MSC) exprimierten Rezeptor CXCR4 bilden ER-beta und CXCL 12 einen zusammenhängen den„morphogenetischen Komplex“.

In dem durch die uterine, verstärkte Kontraktilität der Frau mit Dysmenor rhoe entstehenden Wundgebiet kommt es somit zu einer Anreicherung von mesenchymalen Stammzellen, sodass die früheste Entstehung einer Endo metriose als eine uterine Erkrankung mit Aktivierung des mesenchymalen Stammzellsystems zu verstehen sein könnte.

Möglicherweise sind die veränderten Expressionsmuster, die bei dem hier offenbarten in-vitro-Frühtest erfasst werden, erste molekularbiologisch nachweisbare Anzeichen eines beginnenden Destruktionsprozesses.

Es wird empfohlen, das in-vitro-Testverfahren vorzugsweise bei Patientin nen anzuwenden, welche ein Alter von 18 bis 35 Jahren aufweisen oder bei denen zum Zeitpunkt der Testdurchführung noch keine Schwangerschaft vorlag („nulligravide“). Vorzugsweise sind die die Patientinnen 18 bis 30 Jahre alt und nulligravide. Gerade bei dieser Patientinnengruppe kann durch eine frühzeitige Behandlung vorteilhaft versucht werden, die weitere Ausbreitung einer Endometriose zu unterdrücken.

Der Erfinder der vorliegenden Anmeldung geht zudem davon aus, dass die Spezifität des Testverfahrens verbessert wird, wenn die zu untersuchende Patientin innerhalb von 3 Monaten vor der Entnahme des Menstruations blutes keine Hormontherapie durchgeführt hat. Auch sollten, um eine Stö rung des Testes zu vermeiden, mindestens eine Woche vor der Entnahme des Menstruationsblutes keine Schmerzmittel eingenommen werden.

Die Expression der Gene ESR2, CXCL12 und CXCR4 sollte vorzugsweise bei der zu testenden Probe ebenso wie bei der oder den Kontrollproben im Vergleich zu einem konstitutiv exprimierten Haushalts-Gen, beispielsweise c-Abl, bestimmt werden, so dass eine Normalisierung der Expression er möglicht wird.

Besonders bevorzugte Ausführungsformen (i), (ii) oder (iii) der Erfindung sind darauf gerichtet, dass in Schritt b) des in-vitro-Testverfahren zur Früh erkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose (i) gleichzeitig die Expression der Gene ESR2 und CXCL12, oder (ii) gleichzeitig die Ex pression der Gene der Gene ESR2 und CXCR4 oder (iii) gleichzeitig die Expression der Gene der Gene CXCL12 und CXCR4 bestimmt wird. Erst eine Erhöhung der Expression beider Gene ESR2 und CXCL12 (Ausfüh rungsform (i)), oder ESR2 und CXCR4 (Ausführungsform ii) oder CXCL12 und CXCR4 (Ausführungsform iii) stellt bei diesen Ausführungsformen ein positives Testergebnis, somit also einen Hinweis auf das Vorliegen von En dometriose und/oder uteriner Adenomyose dar. Gemäß einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform (iv) wird gleichzeitig die Expres sion der Gene ESR2, CXCR4 und CXCL12 bestimmt. Nur eine Erhöhung der Expression aller drei Gene ESR2, CXCR4 und CXCL12 wird im Zusam menhang mit dieser Ausführungsform (iv) als positives Testergebnis gewer tet.

Des Weiteren wird vorgeschlagen, dass von einer für die Diagnosestellung relevanten Erhöhung der Expression auszugehen ist, wenn die Expression um mindestens den Faktor 1 ,5, vorzugsweise 2,0, besonders bevorzugt Faktor 2,5 gegenüber der mindestens einen Kontrollprobe erhöht ist. Wer den bei der Untersuchung mehr als eine Kontrollprobe verwendet, so sind Durchschnittswerte der Expression der Kontrollproben zum Vergleich her anzuziehen.

Die Kontrollproben sollen vorzugsweise aus dem Menstruationsblutproben von Frauen stammen, die keinerlei Historie einer Dysmenorrhoe aufweisen und bei denen keine laparoskopisch nachweisbare Endometriose oder ute rine Adenomyose vorliegt. Weiterhin sollten die Spenderinnen der Kontroll proben vorzugsweise nulligravide sein und bei der Probenentnahme ein Al ter von 18 - 35 Jahren aufweisen.

Grundsätzlich ist es möglich, die Expression der zu untersuchenden Gene auf der Ebene der mRNA oder auf der Ebene des entstehenden Proteins zu bestimmen. Für beide Bestimmungsmethoden sind dem Fachmann eine Reihe sehr empfindlicher und reproduzierbarer Messverfahren bekannt, die allesamt für die Expressionsbestimmung nach Verfahrensschritt b) einge setzt werden können.

Für die Proteinbestimmung soll insbesondere auf die im Zusammenhang mit der Erfindung vorteilhaft verwendbaren in-vitro-Testverfahren„Western- Blot“, Immuno-Assay, insbesondere ELISA oder Protein-Microarray hinge wiesen werden, wobei die Erfindung nicht auf die genannten Verfahren be schränkt ist.

Zur mRNA-Bestimmung kann - ohne die Erfindung auf die nachfolgend ge nannten Verfahren zu beschränken - insbesondere auf die in-vitro-Testver- fahren „Northern-Blot“, in-situ-Hybridisierung, RNAse-Protection Assay, RNA-Microarray oder vorzugsweise PCR, insbesondere quantitative Real- Time-PCR, eingesetzt werden. Die sehr gut etablierte und in kommerziellen Laboratorien verfügbare quantitative Real-Time-PCR wird als besonders empfehlenswert vorgeschlagen. Die quantitative Real-Time-PCR wird be sonders bevorzugt in einer Multiplex-Reaktion durchgeführt, wobei gleich zeitig eine Amplifikation eines konstitutiv exprimierten Haushalts-Gen zur Normalisierung erfolgt.

Bei der hier besonders bevorzugten quantitativen Real-Time-PCR wird in den Proben enthaltene mRNA mittels Random-Hexamer-Primern auf be kannte Weise zunächst in cDNA umgeschrieben. Die nachfolgende quanti tative Real-Time-PCR kann dann mittels Scorpion-Primern, Lux-Primern, Lanthanoid-markierten Sonden oder vorzugsweise mittels FRET-Sonden, insbesondere TaqMan-Sonden, durchgeführt werden.

Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf ein in-vitro-Testkit zur Verwendung bei der Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weiblichen Patientin auf Basis von real-time-PCR. Ein derartiges Testkit umfasst mindestens ein oder mehrere zu transkribierten Bereichen (Exons) der Gene ESR2 und/oder CXCL12 und/oder CXCR4 homologe Oli- gonukleotid-Primerpaare sowie mindestens eine zu dem Zieltranskript oder den Zieltranskripten homologe FRET-Sonde. Vorzugsweise umfasst das Testkit weitere für die Probenvorbereitung und/oder für die Testreaktion er forderliche Komponenten, insbesondere ein RNA-Stabilisierungsreagens, ein Reagenzienset zum Extrahieren von mRNA aus einer Blutprobe, ein Reagenzienset zum Umschreiben von mRNA in cDNA und ein zu dem transkribierten Bereich eines Haushaltsgen, insbesondere c-Abl, homolo ges Oligonukleotid-Primerpaar.

Primerpaare können auf an sich bekannte Weise Exon-übergreifend konzi piert werden, um die Amplifikation genomischer DNA zu unterdrücken.

Die Erfindung umfasst gleichfalls ein in-vitro-Testkit zur Verwendung bei der Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weiblichen Patientin auf Basis eines Immunoassays, insbesondere ELISA. Hierbei enthält das das Testkit mindestens einen oder mehrere an die Gen produkte der Gene ESR2 und/oder CXCL12 und/oder CXCR4 bindende An tikörper. Der Testkit enthält vorzugsweise weitere für die Probenvorberei tung und/oder für die Testreaktion erforderliche Komponenten, insbeson dere ein Protein-Stabilisierungsreagens, ein Reagenzienset zum Extrahie ren von Protein aus einer Blutprobe und ein an das Genprodukt eines Haus haltsgens, insbesondere c-Abl, bindender Antikörper sowie geeignete Nachweisreagenzien wie beispielsweise der sekundäre Antikörper.

Im Rahmen der Erfindung werden weiterhin ein zu den Transkripten der Gene ESR2 und/oder CXCL12 und/oder CXCR4 homologe Oligonukleotid- Primerpaare zur Verwendung bei der Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei Patientinnen vorgeschlagen. Die hier genannte Verwendung bezieht sich in besonders vorteilhafter Weise auf eine Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei Patientinnen, welche an Dysmenorrhoe leiden und/oder eine Vorgeschichte von Dysmenorrhoe aufweisen, insbesondere wenn die Patientinnen bis zur Testdurchführung nulligravide sind und bei der Probenentnahme ein Alter von 18 - 35 Jahren aufweisen. In entsprechender Weise schlägt die Erfindung an die Genprodukte von ESR2 und/oder CXCL12 und/oder CXCR4 bindende Antikörper zur Ver wendung bei der Früherkennung von Endometriose und/oder uteriner Ade nomyose bei Patientinnen vor, bevorzugt bei Patientinnen, welche an Dys menorrhoe leiden und/oder eine Vorgeschichte von Dysmenorrhoe aufwei sen, insbesondere bei Patientinnen, die bis zur Testdurchführung nulligra- vide sind und bei der Probenentnahme ein Alter von 18 - 35 Jahren aufwei sen.

Figuren:

Figur 1 Primer und Sonde für Zielgen CXCL12

Figur 2 Sequenzen der Primer und Sonde für Zielgen ESR2

Figur 3 Balkendiagramm-Darstellung der Expression der Zielgene CXCL12 und ESR2

Ausführungsbeispiel 1 - Untersuchung von Proben mittels quantitativer Real-Time-PCR

Es wurden bei drei jungen, nulligraviden Frauen (mittleres Alter: 31 Jahre) mit einer Analgetika-pflichtigen, schweren Dysmenorrhoe in der Praxis des Studienleiters am Zyklustag 2 (ZT 2) bei einer vaginalen Untersuchung Menstrualblutproben entnommen. Alle drei Frauen wurden entsprechend dem oben beschriebenen System zur Klassifizierung der Dysmenorrhoe der Gruppe IIG zugeordnet. Bei zwei der drei Frauen lag ein laparoskopischer Nachweis einer frischen Endometriose vor. Bei der dritten Frau waren lapa roskopische Flinweiszeichen auf eine bereits seit langem bestehende, äl tere Endometriose und möglicherweise Adenomyose vorhanden. Als Kontrollen dienten Menstrualblutproben von drei jungen, nulligraviden Frauen (mittleres Alter: 31 Jahre), die keine Historie einer Dysmenorrhoe aufwiesen und gynäkologisch gesund waren.

Alle Patientinnen einschließlich der Kontrollgruppe durften innerhalb von 3 Monaten vor der Menstrualblutuntersuchung keine Hormontherapie einge nommen haben bzw. direkt vor der Menstrualblutentnahme (24 Stunden) auch keine Analgetika eingenommen haben.

Menstrualblut, in dem sich menstrual abgeschilfertes, basales Endometrium befindet, wird mit etwa 1 -2 uterinen Kontraktionen pro Minute aus dem Ute rus ausgestoßen. Das Menstrualblut wurde bei der hier vorgestellten Unter suchung mittels einer gynäkologischen Speculumuntersuchung (sog.„Spie geleinstellung“) gewonnen (alternativ könnte das Blut auch über eine Spritze mit aufgesetzter, steriler Knopfkanüle oder über das hintere Schei- denspeculum problemlos aufgenommen werden). Ein bis zwei Milliliter des entnommenen Menstrualblutes wurde unverzüglich in ein steriles, handels übliches Nunc-Röhrchen gegeben. Die Proben wurden sofort nach der Un tersuchung im Labor der Praxis bei - 30 ° C gelagert.

Die Aufbereitung der Menstrualblutproben und die Expressionsanalysen wurden wie folgt durchgeführt:

Die gesamt-RNA wurde aus den Menstrualblutproben durch den Direct-zol Miniprep Kit (Zymo Research, Irvine, California, United States) nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert.

Die Komplementär-DNA (cDNA) wurde danach unter Benutzung der Super- ScriptTM Reverse Transcriptase (InvitrogenTM, Carlsbad, California, United States) in Kombination mit Random Hexamer Primern nach Herstel lerangaben synthetisiert.

Es wurde eine quantitative PCR (qPCR) unter Verwendung einer TaqMan Sonde mit einem 7500 Real Time PCR System durchgeführt (Applied Bio- systemsTM, California, United States). Zielgene waren CXCL12 (Gene ID: 6387, Chromosom 10q1 1 .21 ) und ESR2 (Gen ID: 2100, Chromosom 14q23.2-q23.3). Als Quencher wurde BBQ verwendet, als Reporter-Fluo reszenzfarbstoff 6FAM.

Die Sequenzen der Primer und Sonde für Zielgen CXCL12 sowie die Posi tionen der Oligonukleotide auf dem Gen können Figur 1 entnommen wer den. Es wurden vier Primerkombinationen eingesetzt. Dabei entspricht der Ansatz CXCL-2, 1 der Primerkombination CXCL12F/CXCL12As, der Ansatz CXCL-2,2 der Primerkombination CXCL12F/CXCL12Lo, der Ansatz CXCL- 2,3 der Primerkombination CXCL12Se/CXCL12As und der Ansatz CXCL12-2,4 der Primerkombination CXCL12Se/CXCL12Lo.

Die Sequenzen der Primer und Sonde für Zielgen ESR2 sowie die Positio nen der Oligonukleotide auf dem Gen können Figur 2 entnommen werden. Im Falle von ESR2 wurden zwei Primerkombinationen eingesetzt. Dabei entspricht der Ansatz ESR-2, 1 der Primerkombination ESR2_Ex2 S/ESR2_Ex2/3 A, der Ansatz ESR-2,2 der Primerkombination ESR2_Ex2 F/ESR2_Ex3 R.

Alle Reaktionen wurden als Doppeluntersuchungen mit einem Endvolumen von 30 Mikrolitern unter Benutzung von 5 x Hot Start Taq Probe qPCR Mix (Axon Labortechnik, Kaiserslautern, Deutschland) durchgeführt.

Es wurden folgende Zyklen durchgeführt: Zyklus Nr. Temperatur Dauer

1 . 50.0° 2:00 min

2. 95.0° 10:00 min

3. - 45. 95.0° 0:05 min

60.0° 0:32 min

72.0° 0:32 min

Die relative Quantifizierung (RQ) der mRNA Expression wurde berechnet mit der 2(- Delta Delta CT) Methode (Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(- Delta Delta C(T)) Method. Methods 2001 ;25:402-408) unter Benutzung ei nes Pools normaler Proben als Kalibrator. Das Referenzgen ABL1 (Gen ID: 25, Chromosom 9q34.12) wurde für die Normalisierung der mRNA-Menge eingesetzt.

Ergebnis:

Die relative Expression der Gene CXCL 12 und ESR2 bei der Testgruppe (T) und bei der Kontrollgruppe (K) ist in der nachfolgenden Tabelle sowie in

Figur 1 dargestellt.

Alle drei Patientinnen mit schwerer Dysmenorrhoe zeigten eine deutliche Überexpression des CXCL12 -ESR2 -Komplexes im Vergleich zu den drei Kontrollpatientinnen auf. Dies kann durch den signifikant verstärkten An stieg des Expressionsmusters im Vergleich mit dem House-Keeping-Gene (Ct abl) festgestellt werden.

Die deutliche Überexpression von essentiellen Bestandteilen (CXCL12 und ESR2) des morphogenetischen Komplexes deuten darauf hin, dass es im Rahmen der uterinen Wundheilung nach Autotraumatisierung zu einer In vasion und Aktivierung mesenchymer Stammzellen kommt. Ein Nachweis der Überexpression der Genprodukte der genannten Gene aus dem Menst- rualblut ermöglicht eine Diagnose der Erkrankung Endometriose oder Ade nomyose in einem sehr frühen Stadium.

Entsprechend kann unter Verwendung des hier vorgestellten in-vitro-Ver- fahrens ein Vorsorgetest für Frauen, insbesondere für junge Frauen mit massiver Dysmenorrhoe, entwickelt werden. Bei positivem Testergebnis könnten adäquate Vorsorgemaßnahmen zur Verhinderung eines Fort- schreitens der uterinen Destruktion bei Endometriose oder Adenomyose er griffen werden. Vorgeschlagen wird auch, den Vorsorgetest zur Quantifizie rung des Ausmaßes der Endometriose oder Adenomyose, auch bei einer bereits diagnostizierten Endometriose oder Adenomyose, einzusetzen. Eine derartige Quantifizierung ermöglicht eine Optimierung der Therapieop tionen, insbesondere mit Blick auf die Behandlung der Infertilität. Es ist näm lich bekannt, dass sowohl die spontane Schwangerschaftsrate als auch die Schwangerschaftsrate nach assistierter reproduktiver Technik (ART) umgekehrt proportional mit der Ausprägung einer uterinen Adenomyose verbunden sind.

Ausführungsbeispiele 2:

Die in Ausführungsbeispiel 1 näher dargestellte Analyse der Expression der Gene ESR2 und CXCL12 kann in analoger Weise bei den Genpaaren ESR2 und CXCR4 sowie CXCL12 und CXCR4 durchgeführt werden. Es ist auch möglich die Expression aller drei Gene ESR2, CXCL12 und CXCR4 für das Testverfahren heranzuziehen.

Für die praktische Durchführung des in-vitro-Testverfahren zur Früherken nung von Endometriose und/oder uteriner Adenomyose bei einer weibli chen Patientin ist neben dem in Ausführungsbeispiel 1 beschriebenen Ver- fahren die Untersuchung der Expression der Gene CXCL12 und CXCR4 von besonderer Bedeutung: Patientinnen mit schwerer Dysmenorrhoe zeig ten eine deutliche Überexpression des CXCL12-CXCR 4-Komplexes im Vergleich zu Kontrollpatientinnen.