本发明涉及用壳青霉 PRB-2 iPenicillium crustosum PRB-2 ) (保藏编号是： CGMCC 11573 保藏日期： 2015年 11月 03日） 生产一种吲哚生物碱类化合物的方法、 化学合成该类化合物 的方法； 本发明还涉及该类化合物在抗甲型流感病毒中 的用途。

背景技术：

本发明人将壳青霉 PRB-2 (.Penicillium crustosum PRB-2 ) (保藏编号是： CGMCC 11573 ) 在液体培养基中培养时添加吲哚 （终浓度 150 mg/L) ， 从得到的发酵产物中分离出一个吲哚 生物碱类化合物， 且该化合物可以通过化学合成的方法获得。 研宄发现所示该吲哚生物碱化 合物具有显著的抗病毒活性， 表明上述吲哚生物碱进一步有可能开发成新型 抗病毒药物。 发明内容：

本发明的目的是提供一种结构新颖的具有抗病 毒活性的吲哚生物碱类化合物。

本发明的另一目的是提供该吲哚生物碱类化合 物的生产方法。

本发明特别涉及如下实施方案：

1. 式 I ' 化合物或其药学上可接受的盐

其中 为 d_ ₆ 垸基、 C ₂ _ ₆ 烯基或 C ₂ _ ₆ 炔基；

R ₂ 相互独立地为 H、 卤素、 C^垸基、 C^垸氧基、 CM烯基、 CM烯氧基、 C^炔基或 C ₂ _ ₆ 炔氧基；

R ₃ 相互独立地为 H、 垸基、 垸氧基、 CM烯基、 CM烯氧基、 CM炔基或 CM炔 基；

n为 1、 2、 3或 4。

2. 结构如下式所示的化合物

化合物 I。

3. 实施方案 2 所述化合物的制备方法， 其特征是发酵培养壳青霉 PRB-2 {Penicillium crustosum ) ， 并添加吲哚 （在培养基中的终浓度为 150 mg/L) ， 获取含有上述化合物的发酵 物， 然后从发酵物中分离纯化出该化合物。

4. 实施方案 3的制备方法， 其中发酵使用的培养基组成 （克 /升） 为： 可溶性淀粉 40.0， 酵母膏 1.0，味精 2.0，蔗糖 40.0，麦芽糖 30.0，黄豆粉 0.5，蛋白胨 2.0， MgS0 ₄ · 7H ₂ O 0.3， KH ₂ PO ₄ 0.5。

5. 实施方案 3的制备方法， 其中发酵条件为： 在 20°C -30°C内优选 28 Γ静置培养， 培养 时间在 20-40天内优选 30天。

6. 实施方案 3所述的制备方法， 其中将所述发酵物经 Sephadex L DO凝胶柱层析， 甲醇 为溶剂， 再经反相中压 MPLC及反相半制备 HPLC分离纯化得该化合物。

7. 实施方案 1或 2所述化合物的化学合成方法， 其包括

使式 I I I化合物

I I I

其中 R ₃ 如实施方案 1中所定义;

与式 IV化合物

IV 其中 n、 、 R ₂ 如权利要求 1中所定义;

在有机溶剂中在 90-150°C、优选 100-120°C、最优选 110Γ反应 3h， 得到实施方案 1的式

I ' 化合物。

在实施方案 7中， 有机溶剂优选自非质子性溶剂二氧六环、 DMSO、 Ν, Ν-二甲基甲酰胺、 四氢呋喃和二氯甲垸等， 更优选二氧六环。

在实施方案 7中， 优选地， 式 IV化合物的 、 R ₂ 为氢或甲基； 和 /或式 III化合物的 R ₃ 为甲基。

8. 实施方案 7的合成方法， 其还包括制备式 III化合物的以下步骤：

a) 使化合物 1

在溶剂 THF中与还原剂 NaBH ₃ (CN)反应， 得到化合物 2，

b) 在 BF ₃ -Et ₂ 0存在下使化合物 2与 R ₃ COOH反应， 得到式 II化合物

其中 R ₃ 如实施方案 1中所定义; c) 使式 II化合物与 HCHO、 NaOAc、 AcOH反应， 得到式 III化合物，

其中 R ₃ 如实施方案 1中所定义。

实施方案 8的步骤 a的反应在室温 （r. t.) 进行， 反应 2h。

实施方案 8的步骤 b的反应在 90Γ进行， 反应 16h。

实施方案 8的步骤 c的反应在 80Γ进行， 反应 16h。

实施方案 8中， 式 II和式 III化合物的 R ₃ 优选为甲基。

9. 药物组合物， 其包含实施方案 1或 2中的化合物或其药学上可接受的盐以及药学� �可 接受的赋形剂。

实施方案 9的药物组合物优选地为片剂、 溶液剂、 混悬剂形式的， 更优选地为滴鼻剂或 鼻喷雾剂形式的。

10. 实施方案 1或 2所述化合物在制备抗病毒药物中的用途。

在实施方案 10中，优选地，所述病毒为甲型流感病毒，例� �� H1N1 (A/California/04/2009; Cal09) ， H1N1 (A/PR8/34; PR8) 和 H3N2 ( A/swine/Minnesota/02719/2009； Minnesota) 。

本发明的化合物可以通过任意适宜的给药途径 包括口服和胃肠外途径来进行给药。 胃肠 外给药包括静脉内、 肌内和皮下注射、 输注或经鼻给药。 口服途径给药的制剂包括但不限于 片剂、 溶液剂、 混悬剂等。 经鼻给药的制剂包括但不限于滴鼻剂或鼻喷雾 剂。

因此，在实施方案 10中，优选地，所述药物为口服和胃肠外给药� ��药物，优选地为片剂、 溶液剂、 混悬剂， 更优选地为滴鼻剂或鼻喷雾剂。 当描述本发明的化合物时， 除非上下文另外指示， 使用的术语按照以下定义解释。 在本 文没有定义的术语和简称以本领域的通用含义 理解。

文中所用的术语 "卤素"包括例如氟、 氯、 溴或碘。

文中所用的术语 "垸基"指完全饱和的支链的或无支链的烃基团� �� 垸基优选包含 1-20个 碳原子， 更优选 1-6个碳原子、 1-4个碳原子或 1-2个碳原子。 垸基的代表性示例包括但不限 于甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 仲丁基、 异丁基、 叔丁基、 正戊基、 异戊基、 新 戊基和正己基等。

文中所用的术语 "垸氧基"指垸基 -0-， 其中垸基是上文所定义的。 优选地， 垸氧基含有 1-6个、 优选 1-4个、 更优先 1-2个碳。 垸氧基的代表性示例包括但不限于甲氧基、 乙氧基、 丙氧基、 2-丙氧基、 丁氧基、 叔丁氧基、 戊氧基、 己氧基、 环丙基氧基、 环己基氧基等。

文中所用的术语 "烯基"指具有一个或多个碳-碳双键的支链或无 支链的烃基团。 烯基优 选包含 2-20个碳原子， 更优选 2-6个碳原子、 2-4个碳原子或 2-3个碳原子。烯基的代表性示 例包括但不限于乙烯基、 丙烯基、 丁烯基等。

文中所用的术语 "烯氧基"指烯基 -0-， 其中烯基是上文所定义的。 烯氧基优选包含 2-6 个碳原子、 更优选 2-4个碳原子或 2-3个碳原子。 烯氧基的代表性示例包括但不限于乙烯氧 基、 丙烯氧基、 丁烯氧基等。

文中所用的术语 "炔基"指具有一个或多个碳-碳叁键的支链或无 支链的烃基团。 炔基优 选包含 2-20个碳原子， 更优选 2-6个碳原子、 2-4个碳原子或 2-3个碳原子。炔基的代表性示 例包括但不限于乙炔基、 丙炔基、 丁炔基等。

文中所用的术语 "炔氧基"指炔基 -0-， 其中炔基是上文所定义的。 炔氧基优选包含 2-6 个碳原子、 更优选 2-4个碳原子或 2-3个碳原子。 炔氧基的代表性示例包括但不限于乙炔氧 基、 丙炔氧基、 丁炔氧基等。

文中所用的术语 "药学上可接受的盐"指保持本发明化合物的生� ��学效应和性能的盐， 并且该盐在生物学上或其它方面不是不被期望 的。 所述盐的非限制性示例包括本发明化合物 的无毒的、 无机或有机的碱或酸的加成盐。 在许多情况下， 由于碱性或酸性基团的存在， 本 发明化合物能够形成酸盐和 /或碱盐。 可以用无机酸和有机酸形成药学上可接受的酸 加成盐。 可以由其衍生得到盐的无机酸包括例如盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸、 磷酸等。 可以由其衍生 得到盐的有机酸包括例如乙酸、 丙酸、 羟基乙酸、 丙酮酸、 草酸、 马来酸、 丙二酸、 琥珀酸、 富马酸、 酒石酸、 柠檬酸、 苯甲酸、 肉桂酸、 扁桃酸、 甲磺酸、 乙磺酸、 对甲苯磺酸、 水杨 酸等。 可以用无机和有机碱形成药学上可接受的碱加 成盐。 可以由无机碱衍生得到的盐包括 例如钠、 钾、 锂、 铵、 钙、 镁、 铁、 锌、 铜、 锰、 铝盐等； 特别优选的是铵、 钾、 钠、 钙和 镁盐。 可以由其衍生得到盐的有机碱包括例如伯胺、 仲胺和叔胺、 取代的胺 (包括天然存在的 取代的胺)、 环状的胺等， 尤其例如异丙胺、 三甲胺、 二乙胺、 三乙胺、 三丙胺和乙醇胺。 其 它合适的盐的清单可以见于 Remington氏药物科学 (Remington's Pharmaceutical Sciences) ， 第 20版， Mack出版公司 （Mack Publishing Company) ， Easton, Pa., ( 1985 ) ， 将其引入 文中作为参考。

文中所用的术语 "药学上可接受的赋形剂"包括在制备药物组合� ��时可以使用的任何溶 剂、 分散介质、 包衣、 表面活性剂、 抗氧化剂、 防腐剂 （例如抗菌剂、 抗真菌剂） 、 等渗剂、 吸收延迟剂、 盐、 防腐剂、 药物、 药物稳定剂、 粘合剂、 赋形剂、 崩解剂、 润滑剂、 甜味剂、 矫味剂、 染料、 所述类似的物质和其组合， 其是本领域普通技术人员所公知的， 见， 例如，

Remington氏药物禾斗学（Remington's Pharmaceutical Sciences)，第 18版， Mack出版公司（Mack Printing Company) ， 1990， pp.1289- 1329, 引入文中作为参考。 附图说明

图 1: 化合物 I的化学合成方法。

图 2: 化合物 I的体外抗甲型流感病毒作用。 A) 化合物 I对于病毒 PR8 (MOI=0.1) 的 抑制作用。 B) 化合物 I对于病毒的直接灭活作用。 C) 化合物 I抗病毒的广谱性。 D) 化合 物 I的病毒抗药性。

图 3: 化合物 I通过靶向 HA蛋白抑制甲型流感病毒复制。 A)化合物 I在体外发挥作用 的阶段测试。 HA滴度为 Mean ±S.D. (n = 3) ， *P<0.05vs. 病毒对照组。 B)化合物 I对于 PR8毒株的 NA蛋白活性的抑制作用。 C) 化合物 I和抗 HA抗体对甲型流感病毒株 Cal09， PR8和 H3N2 (Minnesota) 中的鸡红细胞凝集的抑制效果。 D)化合物 I对病毒 HA介导的膜 融合的抑制作用。

图 4: 化合物 I的体内抗甲型流感病毒活性评价。 A)化合物 I对感染甲型流感病毒小鼠 肺部病毒滴度的影响。 数值为士 S.D. (n = 4) ， Significance: *P<0.05， **P<0.01 vs. 病毒 对照组。 B)化合物 I对感染甲型流感病毒小鼠的生存率的影响。 Significance: *P<0.05， **P < 0.01 vs. 安慰剂组。 C)化合物 I对感染甲型流感病毒小鼠体重的影响。数值� �士 S.D. (n = 6)。 D)化合物 I对小鼠肺部组织所产生的细胞因子 TNF- α和 IL-6量的影响。数值为士 S.D. (η = 3) ， Significance: ##P<0.01 vs. 正常组； *P<0.05， **P<0.01 vs. 病毒对照组。 本发明的化合物 I可通过微生物在含吲哚的发酵培养条件下来� �取含有该类化合物的发 酵物，然后从发酵物中采用 SephadexLH20凝胶柱层析， 反相中压 MPLC， 反相半制备 HPLC 方法分离纯化得到； 该化合物还可以通过化学合成的方法获得。

本发明的下述实施例中列举了利用 PRB-2 (.Penicillium crustosum PRB-2) (保藏编号是: CGMCC 11573)制备本发明式 I化合物的实例、 化学合成本发明式 I化合物的实例及本发明 式 I化合物的抗病毒活性测试的实例。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物 I的化学结构 （结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳 原子或氮原子的标位） 是：

化合物 I

实施例 1 化合物 I的发酵生产及分离精制

1. 发酵生产

生产菌的发酵培养： 按培养微生物的常规方法， 取壳青霉 PRB-2 (.Penicilli m crustos m PRB-2 ) (保藏编号是： CGMCC 11573 ) 适量， 接种到 PDA固体平面培养基上， 在 28 Γ培养 箱中培养 4天。

取固体平面培养 4天的壳青霉 PRB-2 (.Penicillium crustosum PRB-2 ) 适量， 接种到装有 300 mL培养基 [培养基组成（克 /升） ： 可溶性淀粉 40.0， 酵母膏 1.0， 味精 2.0， 蔗糖 40.0， 麦芽糖 30.0， 黄豆粉 0.5， 蛋白胨 2.0， MgS0 ₄ · 7¾0 0.3， KH ₂ P0 ₄ 0.5]的 1000 mL锥型瓶 中， 并加入吲哚（45mg， 由 50(^L DMSO溶解） ， 使其在培养基中的终浓度为 150mg/L， 在 28 Γ条件下静置培养 30天， 获得发酵产物。

2. 浸膏的获得

将所得发酵液直接用等量乙酸乙酯萃取三次， 合并乙酸乙酯相， 减压浓缩， 得粗浸膏， 共 1.2克。

3. 化合物的分离精制

浸膏 （1.2克） 用甲醇溶解后， 以甲醇为溶剂进行 LH20柱层析， 分为 4个流份。 组分 2 先以 C-18 0DS中压柱层析， 以甲醇 -水为溶剂进行梯度洗脱， 最后经反相半制备高效液相色 谱 （甲醇： 水 =75 :25 ) 得化合物 I ( 15 mg) 。

化合物 I 乳白色粉末， 分子式 C ₂₈ H ₂₇ N0 ₆ ， HR-ESI-MS m/z: 474.1910 [M+H] ⁺ , 计算值 474.1911。 IR (KBr) v _max 3345 , 2923， 1625， 1330， 744 cm^ o 1H和 ¹³ C-NMR数据见表 1。

表 1 化合物 I的 ¾和 ¹³ C NMR数据 （500和 125 MHz, in DMSO-i ₆ ) ^a

No. (5c <5 _H (Jin Hz) HMBC (H→C) ^b

1-NH 9.74 s 2, 3 ,4, 9

2 135.1

3 108.8 4 128.4

5 118.7 7.39 d (8.0) 7, 9

6 118.1 6.72 t (7.0) 4, 8

7 119.8 6.81 1 (7.0) 5, 9

8 111.1 7.18 d (8.0) 4, 6

9 135.5

18.3 4.08 s 2, 3, 4, 2', , T

2' 115.5

3' 161.1

4' 112.8

ο

ό 5' 131.8 7.60 s 4', 6'

6' 116.4

Ί' 161.2

8' 203.6

9' 26.7 2.50 s 4', 8'

10' 16.8 2.17 s 5', 6', 7

3'-ΟΗ 13.07 s 2 y ,4'

7'-ΟΗ 9.49 s 2', 6', 7'

1" 20.1 4.24 s 2, 3, 2", 3", 7"

2" 113.5

3" 161.1

4" 113.0

5" 131.2 7.52 s 4", 6"

6" 116.2

7" 161.1

8" 203.7

9" 26.7 2.54 s 4", 8"

10" 16.8 2.15 s 5", 6", 7"

13.04 s 2", 3" ,4"

9.64 s 2", 6", 7"

a) 本表信号归属基于 HMQC及 HMBC图谱解析结果。

b) 此栏中的数字和代号分别代表在 HMBC谱中与相应行中的 ¾给出偶合相关信号的 ¹³ C 核。

实施例 2 化合物 I的化学合成方法

如图 1所示， 化合物 I的合成反应中的试剂和条件为： a) NaBH ₃ (CN)， THF， r. t.， 2h， 89%； b) BF ₃ .Et ₂ 0， AcOH, 90°C， 16h， 70%； c) HCHO， NaOAc， AcOH, 80°C， 16h， 65%； d) indol, dioxane, 110°C， 3h， 33%。

1. 化合物 4的合成

将 2.00 g ( 14.5 mmol)化合物 1和 3.00g (47.6 mmol)化合物 NaBH ₃ (CN)溶于 30 ml THF 中， 室温搅拌， 反应 2小时后， 加入 lOOml lM HCl搅拌 2小时， 乙酸乙酯萃取 （50ml χ3 ) 。 合并有机相， 无水 Na ₂ S0 ₄ 干燥， 减压浓缩， 柱层析分离 （石油醚： 乙酸乙酯 =50: 1 ) ， 得浅 黄色固体 2 ( 1.60 g， 89%) 。

将 1.00 g ( 8.06 mmol)化合物 2溶于 10.0 ml BF ₃ Et ₂ 0中， 缓慢加入 0.92 ml ( 16.1 mmol)

AcOH, 升温至 90°C，搅拌 16小时， 加饱和的 Na ₂ C0 ₃ 淬灭反应， 乙酸乙酯萃取（50 ml x3 )。 合并有机相， 无水 Na ₂ S0 ₄ 干燥， 减压浓缩， 柱层析分离 （石油醚： 乙酸乙酯 = 15: 1至石油 醚： 乙酸乙酯 =5: 1变梯度） ， 得浅黄色固体 3 (930 mg， 70%) 。

将 795 mg (4.80 mmol)化合物 3和 65 mg (0.48 mmol) NaOAc溶于 30.0 mlAcOH中， 缓 慢加入 1.06 ml (37%的水溶液， 14.4 mmol) HCHO溶液， 升温至 80°C， 搅拌反应 16小时后， 将反应液冷却至室温， 滤除不溶物， 滤液加入到 200 ml饱和 Na ₂ C0 ₃ 溶液中进行中和， 然后 用乙酸乙酯萃取 （50ml x3) 。 合并有机相， 无水 Na ₂ S0 ₄ 干燥， 过滤， 减压浓缩， 柱层析分 离 （石油醚： 乙酸乙酯 = 15: 1至石油醚： 乙酸乙酯 =5:1变梯度） ， 得浅黄色固体 4 (737 mg, 65%)。 1HNMR (500 MHz, CDC1 ₃ ) δ 13.24 (s， 1Η)， 9.41 (s， 1H)， 7.51 (s， 1H)， 5.24 (s， 2H) ， 2.55 (s， 3H) ， 2.19 (s， 3H) ， 2.14 (s， 3H) 。

2. 化合物 I的合成

将 40mg (0.168 mmol) 化合物 4和 9.83 mg (0.084 mmol) 吲哚溶于 1 ml 二氧六环中， 110°C搅拌反应 3小时后， 将反应液冷却至室温， 减压浓缩， 用 1ml DMSO溶解后加 1 ml甲 醇稀释， 过滤不溶物， 用 HPLC分离， 首先用乙腈、 水 （乙腈： 水 = 50% - 100%变梯度） 为流动相制备， 再用甲醇、 水 （甲醇： 水 =75%， 含千分之一的三氟乙酸） 为流动相制备， 得浅黄色固体化合物 I (13.3 mg， 34%) 。

实施例 3 化合物的抗病毒活性测试

1. 体外抗病毒活性测试

(1) 实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制 测试样品为上述实施例 1和 2中分离精制的化合物 I纯品。 精 密称取适量样品， 用 DMSO配制成所需浓度的溶液， 供测活性。

抗 H1N1流感病毒活性测试采用 CPE抑制， 空斑实验等方法进行评价， 以抗病毒药物金 刚垸胺为阳性对照药， 比较化合物对流感病毒引起的细胞病变 （CPE) 的抑制作用以及对于 病毒增殖的抑制作用。 将流感病毒 H1N1 A/PR8/34 (PR8) (MOI=0.1) 加到 MDCK细胞上 于 37Γ吸附 1小时，弃上清液，加入含待测化合物 的 DMSO 溶液（终浓度 6.25-50 z^g/ml) , 37°C保温 48 小时。 一方面收集细胞培养液离心去细胞碎片后进行 血凝试验测定病毒滴度来 评价化合物对于病毒增殖的影响。 另一方面将细胞用 PBS 洗 3次后， 用结晶紫溶液 （1%的 结晶紫溶解于 20%乙醇和 3.7%甲醛的水溶液中） 染色， 之后置于酶标仪上测定 630nm处的 光密度 OD 值用于计算病毒抑制率。 抑制率按照以下公式计算： 病毒抑制率 （％) = (药物 对照组 OD值 -病毒对照组 OD值） I (细胞对照组 OD值 -病毒对照组 OD值） *100%。 化合 物 I对于病毒的直接灭活作用利用空斑实验测定� � 大约 50-100 PFU/的 PR8病毒与化合物 I (0， 6.25， 12.5， 25， 50 g/ ml) 在 37°C预处理 60 min， 病毒液其后利用病毒空斑实验检测 空斑形成。 化合物 I抗病毒的广谱性和病毒抗药性也进行了评价� � 化合物 I抗病毒的广谱性采用三 种不同甲型流感病毒流行株 H1N1 (A/PR8/34; PR8) 、 H1N1 ( A/California/04/2009; Cal09) 和 H3N2 ( A/swine/Minnesota/02719/2009； Minnesota)结合 MDCK细胞模型进行评价， MDCK 细胞感染高剂量的 PR8、 Cal09或 Minnesota (MOI = 3.0) ， 然后利用不同浓度的化合物 I处 理细胞， 24h后利用 HA试验检测病毒滴度， 以相对病毒对照组的 HA滴毒的百分率来表示 抑制率高低。 化合物 I的病毒抗药性通过利用低剂量的化合物 I (25 /^g/ml)和金刚垸胺（25 /^g/ml) 处理 PR8毒株并连续传代 5代进行抗性试验， 然后检测细胞上清中的病毒滴度来评 价。

(2) 实验结果

抗 H1N1流感病毒活性测试显示化合物 I对流感病毒引起的细胞病变 （CPE) 有明显的 抑制作用， 且在 6.25-50 /^g/ml的范围内呈现明显的剂量依赖性 （图 2A) ， 化合物 I的 IC ₅₀ 为 34 /^1， 优于阳性对照药金刚垸胺 （IC _5Q 为 157 /Λ1) 。 病毒空斑实验结果表明化合物 I在 6.25 g/ml以上浓度预处理病毒还能够显著抑制病毒� �斑形成 （图 2B) ， 说明其对于病毒颗 粒还有直接的灭活作用。

化合物 I在 3.125-50 ig/ml的浓度范围内对于 PR8， Cal09和 Minnesota病毒株的增殖都 具有显著的抑制作用 （图 2C) ， 说明化合物 I具有广谱的抗甲型流感病毒作用。 抗性试验研 宄表明金刚垸胺在病毒传代 4代和 5代时对于病毒增殖的抑制作用明显下降 (抑制率减为 60% 和 40%) ， 说明产生了抗药性； 而化合物 I对于病毒的抑制作用在病毒传代 5代之后仍然接 近 90%， 明显优于金刚垸胺 （图 2D) 。

综上所述， 化合物 I具有显著的抗甲型流感病毒作用， 且具有广谱性和不易产生耐药性 的特点。

2. 化合物 I抗病毒靶点的确定

( 1 ) 实验方法

化合物 I体外抗病毒作用的阶段利用时间依赖的添加� �验 （time-of-addition assay) 来确 定。 先将 MDCK细胞用四种不同的处理方法来感染甲型流� �病毒株 PR8 (MOI=0.1): i)预处 理病毒： 在感染前， 用 50 /^g/ml的化合物 I在 37°C下将病毒预处理 lh; ii)预处理细胞： 在 感染前， 用 50 g/ml的化合物 I先预处理 MDCK细胞 lh; iii) 吸附时处理： 将 MDCK细胞 在含有 50 /^g/ml化合物 I的培养基中进行感染， 在吸附 lh后， 换不含化合物 I的培养液继 续培养； iv) 吸附后处理： 感染 lh后， 移除未吸附的病毒， 然后将含有 50 /^g/ml化合物 I的 培养液加入细胞中。在 24小时后， 利用 HA试验来检测细胞上清中的病毒滴度来评价抗� ��毒 活性高低。

化合物 I对病毒 NA蛋白和 HA蛋白的抑制作用利用祌经氨酸酶（NA)活性抑� ��实验和 血凝抑制实验 （hemagglutination inhibition assay) 来评价。 祌经氨酸酶活性抑制实验， 即在 96孔荧光酶标板中分别加入不同浓度化合物 I ( 12.5-200 /^g/ml) 10 μ ， 加入适量的 PR8粗 酶液 30 /^， 混匀后室温反应， 以扎那米韦 （zanamivir) 为阳性对照药。 30 min后加入 10 水， lO L MES (2-N-吗啡啉-乙磺酸） （pH=3.5 ) 缓冲液， 10 CaCl ₂ 溶液和 30 底物 MUNANA溶液至总体积 100 μ ， 充分混匀后 37 °C孵育 30 min后加入终止液， 利用荧光酶 标仪测定荧光强度值 （ex=355 nm， em=460 nm) ， 并计算抑制率。 而血凝抑制试验则是先将 化合物 I或抗 HA抗体先于流感病毒 PR8, Cal09或 Minnesota于 37°C共孵育 lh， 其后在 96 孔板中 2倍梯度稀释， 并在各孔中加入鸡红细胞并混匀后于 4Γ放置 l-2h后观察结果。

化合物 I对膜融合的抑制作用利用血凝素蛋白介导的� �胞融合实验 （HA syncytia assay) 来观察。 即将表达 PR8 HA的质粒转染 Vero 细胞 16h后先用 TPCK-胰酶处理 10 min后， 在 化合物 I存在下培养 15 min, 然后将 pH 降低至 5.0， 并在化合物 I存在下继续培养 10 min。 接下来换成完全培养基后在 37°C孵育 2h后利用改良吉菩萨染液 Hema3Stat Pak染色后观察多 核体的生成， 并用显微镜拍照。

(2) 实验结果

时间依赖的添加实验结果如图 3A所示， 无论在病毒的吸附期还是在预处理病毒时添加 化合物 I都可以显著地降低细胞上清中病毒的滴度， 说明化合物 I通过直接作用于病毒颗粒 来阻断甲型流感病毒的吸附过程。 其次， 病毒吸附后加入化合物 I也能抑制病毒的增殖但不 具有统计学意义的显著性 （图 3A) 。

NA活性抑制实验的结果如图 3B所示， 在 12.5-200 g/mL浓度范围内化合物 I对于 NA 的活性没有显著的抑制作用， 最大抑制率低于 20%， 远低于阳性药物扎那米韦 （87%) 。 因 此， 化合物 I不是靶向于病毒的 NA蛋白。 血凝抑制试验结果如图 3C所示， 抗 HA蛋白抗 体在 0.3125-5 g/mL浓度下显著抑制流感病毒 PR8， Cal09和 H3N2 (Minnesota)引起的鸡红 细胞凝集现象， 暗示抗 HA蛋白抗体可以通过结合 HA蛋白来阻碍病毒附着到红细胞； 而化 合物 I在 3.125-50 g/mL浓度范围内也可以显著地抑制三种流感病� �引起的鸡红细胞凝集， 说明化合物 I潜在作用靶点为 HA蛋白。

HA介导的膜融合实验结果如图 3D所示， 在不加化合物时， pH 7.0降低至 5.0引起了表 达 HA蛋白的 Vero细胞形成了很多的多核体 （大的黑点区域） ， 而保持 pH 7.0则无多核体 形成；在加入 50 g/ml浓度的化合物 I之后可以显著抑制 Vera细胞中 HA介导的多核体形成， 特别是酸化前和酸化阶段都加入化合物 I的抑制效果最显著（图 3D)， 说明化合物 I还可以 抑制 HA介导的膜融合。

综上所述， 我们的研宄结果表明化合物 I主要通过靶向病毒 HA蛋白来抑制甲型流感病 毒的感染和增殖。

3. 体内活性测试

(1) 实验方法

利用鼠肺适应株 H1N1 (A/PR/8/34) 病毒液滴鼻感染 SPF级的 Jamming小鼠建立动物模 型，用此小鼠模型检验化合物 I在体内抗 IAV感染的效果。将 14-16 g的 SPF级的雌性 Jamming 小鼠 70只按体重分为病毒对照组（模型组） ， 正常对照组， 阳性药奥司他韦 （10mg/kg/day) 组， 化合物 I灌胃组 （5 和 10 mg/kg/day) ， 化合物 I滴鼻组 （20 和 40 /^g/day) ， 每组 10 只。 除正常组外， 其它各组均在乙醚轻度麻醉下以 4 HAU/ml滴度的 IAV病毒液滴鼻感染， 每鼠 40/^。 连续给药 7天， 其中每组在感染 4天后各取 4只小鼠断食 8 h， 称重后解剖并测 定小鼠的肺指数 （肺指数= (肺重 /体重） X100) 和肺指数抑制率 （肺指数抑制率 = (病毒组 平均肺指数一实验组平均肺指数） /病毒组平均肺指数 X100%)。此外，将肺组织匀浆之后， 利用空斑实验检测肺病毒滴度高低， 利用 ELISA 检测炎症因子的表达。 利用高滴度 （8 HAU/ml) 的病毒感染小鼠， 分组和给药方式同上， 连续观察 14天， 在小鼠体重减轻为初始 体重的 75%以下且皮毛异常行动缓慢时，对小鼠实行安 乐死。最后统计 14天内每天的小鼠死 亡和体重情况。

(2) 实验结果

空斑试验结果如图 4A所示， 通过化合物 I 口服或滴鼻给药 4天后， 肺部病毒滴度与病 毒对照组相比均显著降低 （p<0.05) ， 阳性药奥司他韦 （10 mg/kg/day) 组也能使小鼠肺病 毒滴度明显降低 （p<0.05) ， 特别是 40 g/day剂量的化合物 I滴鼻给药组对于肺病毒滴度 的抑制作用最为显著 （p < 0.01) (图 4A) ， 优于奥司他韦组。 生存试验结果如图 4B及 4C 所示， 化合物 I口服或滴鼻给药均可提高病毒感染小鼠的生� �率， 且化合物 I40 g/day滴鼻 给药时， 相对于安慰剂组其对生存率的提高最为显著 （p < 0.01) 。 在感染 14天时， 安慰剂 组只有 40%的小鼠生存， 而化合物 I (40 g/day)滴鼻给药组的生存率达到 100%， 优于奥司 他韦 （10 mg/kg/day) 给药组 （80%) ； 而安慰剂组小鼠的体重在感染后第 4天 （4 pi) 时开 始下降，一周后相对初始重量大约减少 23%-24%，而化合物 I给药组小鼠的体重则逐渐增加， 无下降趋势， 且滴鼻给药（40 g/day)组效果最佳（图 4C) 。 ELISA试验结果如图 4D所示， 流感病毒感染小鼠肺部组织产生的炎性细胞因 子 TNF-α和 IL-6的含量与正常组相比明显增加 (P<0.01)， 而在化合物 I口服或滴鼻给药 4天后， TNF-α和 IL-6的量与病毒对照组相比均 显著减少 （P<0.05) ， 其中滴鼻给药 （40 g/day) 组抑制效果最佳 （P<0.01) (图 4D) 。 综上所述， 动物实验结果显示化合物 I滴鼻给药和灌胃给药方式均能显著降低甲型� �感 病毒感染小鼠的肺病毒滴度， 提高小鼠生存率， 抑制体重下降趋势并减少炎性因子的分泌， 体现出很好的体内抗甲型流感病毒作用。

4. 结论

化合物 I在体外和体内活性测试时均具有较好的抗甲� �流感病毒活性， 具有开发成为新 型滴鼻剂， 鼻喷雾剂或口服制剂的潜力， 用于预防和治疗甲型流感病毒引起的呼吸道感 染。

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