Melaninbedingte Hyperpigmentierungen der Haut stellen ein großes medizinisches und therapeutisches Problem dar. Zu den angeborenen Hyperpigmentierungen zählen beispielsweise die Café-au-lait-Flecken, d. h. milchkaffeefärbene rundliche Hautflecken, die oft als Teilsymptom bei Phakomatosen, wie z. B. der Neurofibromatose von Recklinghausen, auftreten und auf grund ihrer Zahl und Ausdehnung kosmetisch störend wirken können. Zu den erworbenen Hypermelanosen zählen beispielsweise das Melasma (Chloasma), Hyperpigmentierungen als Folge entzündlicher Prozesse, Lichtdermatosen als Folge phototoxischer bzw. photoallergischer Reaktionen (z. B. Berloque- Dermatitis, Riehl-Melanosis), Hyperpigmentierungen als Folge von Verletzungen, insbesondere Verbrennungen, umschriebene Hyperpigmentierungen in Abhängigkeit von chronischer oder akuter Sonnenexposition (z. B. Lentigo simplex, Lentigo solaris, Epheliden) sowie Hyperpigmentierungen als Folge einer systemischen oder topischen Anwendung von Medikamenten.

Indes sind die Möglichkeiten für eine therapeutische Beeinflussung von Hyperpigmentierungen begrenzt. Neben einer nicht immer möglichen Ursachenbeseitigung kommt auch die adjuvante Anwendung potenter UV-Filter in Betracht, da eine vermehrte Exposition gegenüber UV-Licht zu einer Verstärkung der melaninbedingten Hyperpigmentierung führen kann. Methoden der Camouflage werden ebenfalls eingesetzt. Als sogenannte Bleichmittel kamen eine Vielzahl von Substanzen zur Anwendung. Weitgehend nur noch historisches Interesse haben Quecksilber und seine Verbindungen sowie Peroxide und Chlorate (H, Natriumhypochlorit). Zu den phenolischen Formulierungen zählt Hydrochinon. Infolge Hemmung der enzymatischen Oxidation von Tyrosin zu Dihydroxyphenylalanin (Dopa) und auf Grund der Hemmung weiterer metabolischer Reaktionen in Melanocyten bewirkt lokal appliziertes Hydrochinon eine Depigmentierung pathologischer Hyperpigmentierungen der Haut.

Hydrochinon wirkt daher als kompetitiver Inhibitor der Melaninsynthese.

Bleichmittel, insbesondere Hydrochinon, können jedoch zu Irritationen der Haut und zu allergischen Reaktionen führen oder sogar eine exogene Ochronose bzw. pigmentierte Kolloidmilien hervorrufen. Zu den nicht-phenolischen Bleichmitteln gehören die Vitamin-A-Säure und ihre Derivate sowie Azelainsäure. Vitamin-A- Säure greift selbst nicht spezifisch in die Melaninsynthese ein, sondern bewirkt eine gewisse Bleichung der Haut über eine gesteigerte Zellproliferation in der Epidermis.

Weitere Methoden zur Behandlung von Hyperpigmentierungen stellen das sog. chemical peeling, die Kryotherapie und die Laserbehandlung dar. Diese Methoden sind aber mit einem invasiven Vorgehen verbunden.

Es besteht daher nach wie vor ein erheblicher Bedarf an Mitteln und Substanzen zur Behandlung von melaninbedingten Hyperpigmentierungen. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, Substanzen zur Behandlung solcher melaninbedingten Hyperpigmentierungen zur Verfügung zu stellen, welche die Nachteile der wenigen oben beschriebenen, im Stand der Technik bekannten Mittel und Verfahren nicht aufweisen und mit deren Hilfe innerhalb einer kurzen Behandlungsdauer (wenige Wochen) sich sichtbare Heilerfolge erzielen lassen.

Erfindungsgemäß wurde überraschend gefunden, daß eine bestimmte Subpopulation der Hefegattung Malassezia, insbesondere die Hefe-Spezies Malassezia furfur, bei spezifischem Nährstoffangebot in der Lage ist, potente, neuartige Inhibitoren der Phenoloxidase zu synthetisieren. Wird Malassezia als vorwiegende Stickstoffquelle die Aminosäure Tryptophan (als L-oder D-Isomer oder auch als Racemat) angeboten, lassen sich aus einer derart konditionierten Hefe Verbindungen isolieren, mit welchen in vitro die Phenoloxidase-Reaktion in verschiedenen Modellen gehemmt werden konnte und bei freiwilligen Versuchspersonen bei topischer Anwendung nach wenigen Tagen eine Aufhellung vorbestehender melaninbedingter Hyperpigmentierungen erzielt werden konnte.

Insbesondere wurde auch gefunden, daß bei Verabreichung von an 4-, 5-, 6- und/oder 7-Position des Indolrings substituiertem Tryptophan diese Substituenten nahezu unverändert in die von Malassezia synthetisierten, der Erfindung zu Grunde liegenden Indolderivate eingebaut werden. Dies ist besonders dann von Interesse, wenn die aus reinem Tryptophan synthetisierten relativ hydrophoben Indolderivate, z. B. mittels Hydroxy-Substituenten, hydrophiler gemacht werden sollen.

Die aus Malassezia isolierten Verbindungen weisen folgende allgemeine Struktur auf, in welcher bedeuten : Z = H oder OH ; M = NH, OH oder Y unter den Bedingungen, wenn X = dann ist M = Y = \C=0 und Z = H, und über X und Y liegt ein Ringschluss vor, und wenn dann ist M = OH oder, NH, und wenn M = OH ist, dann ist undwennM=, NH, istY= \C=O undistzusammenmit NH unterRingschluss zu einem Azepin-Ringsystem zyklisiert, wobei die Indolringsysteme an der 4-, 5-, 6-und/oder 7-Position jeweils einzeln oder in Kombination mit Substituenten, ausgewählt aus der Gruppe OH, F, Cl, Br, NO2, NH"COOH, HSO3 substituiert sein können oder Aza-Verbindungen bilden.

Die Verbindungen mit den folgenden Strukturen sind bevorzugt : Besonders bevorzugt sind die Verbindungen der beiden oberen Strukturen mit den Summenformeln C2, H"N304 bzw. C2, H, 7N303.

Die ersten drei Verbindungen enthalten ein Asymmetriezentrum. Es zeigte sich, daß sowohl die reinen Stereoisomeren als auch das Racemat die Phenoloxidase wirksam zu hemmen vermögen.

Ein weiteres mit den obigen Verbindungen strukturell verwandtes Indolderivat mit ausgeprägten Phenoloxidase-Inhibitor-Eigenschaften, welches sich ebenfalls aus Malassezia isolieren läßt, weist die folgende Struktur auf : Auch bei dieser Verbindung können die Indolringsysteme an der 4-, 5-, 6- und/oder 7-Position jeweils einzeln oder in Kombination mit den oben angegebenen Gruppen substituiert sein.

Im folgenden wird beispielhaft die Gewinnung der obigen Verbindung mit der Summenforme1C2, HI7N303und der Bezeichnung K027 beschrieben : Einer Hefe-Subpopulation der Gattung Malassezia, insbesondere der Species Malassezia furfur, wird die Aminosäure Tryptophan (L-, D-Isomer oder Racemat) als alleinige Stickstoffquelle angeboten. Aus den unter diesen Bedingungen von Malassezia gebildeten Pigmenten und Fluorochromen lassen sich die oben genannten Phenoloxidaseinhibitoren sowie Derivate davon (Oxidationsprodukte), die ebenfalls eine Hemmwirkung auf Phenoloxidase ausüben, isolieren.

Als geeignetes Nährmedium werden 30 ml Tweens 80 ultra (Sigma, St. Louis, USA) und 20 g Agar reinst (Merck), mit Wasser zu 1L aufgefüllt, autoklaviert.

Nach Abkühlen auf 50°C wird sterilfiltriertes D-oder L-Tryptophan oder DL- Tryptophan (Trp ; Sigma) in einer Konzentration von beispielsweise 0.3 Gew.-% zugesetzt. Das pH wird auf 5.5 eingestellt. 10 ml des Mediums werden in sterile Petrischalen ausgegossen (10 cm Durchmesser) und eine entsprechende Population von Malassezia furfur (CBS 1878) darauf ausgestrichen. Die Substanzen lassen sich auch in Flüssigmedium (unter Verzicht auf den Agaranteil) gewinnen.

Nach einer Inkubationszeit von etwa 14 Tagen bei 30-37°C wird der Nährboden bzw. das flüssige Nährmedium mit Ethylacetat extrahiert und die Phenoloxidase- Inhibitoren mittels Säulenchromatographie, Dünnschichtchromatographie und präparativer High Performance Liquid Chromatographie (HPLC) isoliert.

So beträgt der Rf Wert der Verbindung K027 mit dem Laufmittel Toluol- Ethylformiat-Ameisensäure (10 : 5 : 3) auf Kieselgel 60 Platten (Merck) etwa 0,38.

Die mittels HPLC ermittelte Retentionszeit dieser Verbindung in Acetonitril/Wasser 2 : 3 (V/V) auf einer Merck-Hitachi Anlage, bestückt mit einer Rpl8-Säule, 4mm2 Durchmesser bei einem Fluß von lml/min und einem Druck von 140-160 bar, einer Empfindlichkeit von 0,3 (mVolt) und einer Meßfrequenz des Detektors von 220 nm und einem linearen Gradienten aus Wasser mit steigendem Anteil Acetonitril (von 0 bis zu 100 % in Schritten von 1%/min) beträgt 27 min.

Hemmung der Phenoloxidase-Aktivität in vitro : A) Enzymkinetische Messungen Die Ermittlung der Hemmwirkung erfolgte mit folgendem Ansatz : 2,5 mg Dopa (L-3,4-Dihydroxyphenylalanin) in 2 ml 0, 05M Phosphatpuffer, 150 U Phenoloxidase aus Pilzen (EC 1.14.18.1) in 320 ml Phosphatpuffer, 1,4 ml 0, 05M Phosphatpuffer, Verbindung in 100 pI DMSO.

Die Konzentration des Dopa (MG. : 197,2) betrug 2,94 10-3 Mol.

Die Messung wurde in Küvetten von 1 cm Schichtdicke mit einem Beckmann DU-68 Spektralphotometer durchgeführt. Gemessen wurde der Anstieg der optischen Dichte bei 475 nm des von der Phenoloxidase aus Dopa gebildeten Dopachrom. Der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, die Inkubationstemperatur betrug 20°C. Der Leerwert bestand aus Phosphatpuffer und DMSO.

Als eine weitere enzymkinetische Messmethode läßt sich ein Assay nach Shin et al. (Biochem. Biophys. Res. Comm. 243,801-803,1998) einsetzen, das sich folgendermaßen zusammensetzt.

Es werden 40 Ill 25 mM L-Dopa, 80 pI Phosphatpuffer (67 mM, pH 6,8), 40 Ill Phosphatpuffer mit oder ohne Testsubstanz in einer Microtiterplatte vorgelegt und gemischt. Danach werden mit einer 8-Kanal Pipette in jedes Well 40 p1 Tyrosinase-Lsg (EC 1.14.18.1 in Phosphatpuffer ; 125 U/ml, d. h. im Assay 5 U/well) zugegeben. Anschließend erfolgt die Messung bei 492 nm mittels Elisa- Reader jede 30 sec für ca. 40 min.

Aus den Extinktionszunahmen wurde die Maximalgeschwindigkeit der Reaktion bestimmt nach Lineweaver-Burk ausgewertet.

Die Verbindung K027 erwies sich als kompetitiver Inhibitor der Mushroom- Tyrosinase mit einer Ki von 1.1 x 10-3, was aus der Figur ersichtlich ist.

B) Hemmung der Phenoloxidaseaktivität in humaner Haut : Frisch entnommene humane Haut wurde zunächst in 2N Na-Bromidlösung bei 37°C über einen Zeitraum von 45 Minuten inkubiert, um die Epidermis von der Dermis zu lösen. Nach dem Abtrennen wurde die Epidermis bei 37°C in einer 0,1% Lösung von Dopa in 0, 05M PBS bei pH 7,4 inkubiert. Die Lösung wurde stündlich erneuert (insgesamt über einen Zeitraum von 2-5 Stunden), bis Dopa- positive Melanocyten erkennbar waren. Dann wurde in 3% Formaldehyd fixiert.

Durch Zugabe der obigen Verbindung ließ sich die Dopa-Phenoloxidase-Reaktion wirksam unterdrücken. Mit einer 10-4 molaren Lösung (Endkonzentration) der obigen Verbindung war eine vollständige Hemmung der Phenoloxidase-Reaktion in humanen Melanocyten zu beobachten.

C) Aufhellung melaninbedingter Hyperpigmentierungen 4 freiwilligen Probanden mit melaninbedingter Hyperpigmentierung wurde eine 0,1 % (w/w) Verteilung der obigen Verbindung in Unguenta emulsificans topisch verabreicht. Nach vierwöchiger Behandlung war eine deutliche Aufhellung der Hyperpigmentierungen zu beobachten.

Die erfindungsgemäßen Phenoloxidase-Inhibitoren können zur Herstellung von Medikamenten mit ausgeprägter Wirkung gegen melaninbedingte Hyperpigmentierungen verwendet werden. Die aufhellende Wirkung zielt gleichermaßen sowohl auf angeborene bzw. genetische bedingte als auch auf erworbene Hyperpigmentierungen.

Die Wirkung beruht auf einer kompetitiven Hemmung der Phenoloxidase, wodurch die enzymatische Oxydation von Tyrosin zu Dihydroxyphenylalanin (Dopa) und die Weiterreaktion über das Dopachinon zum Dopachrom unterbunden wird. Die wirksame Konzentration beträgt etwa 10-'bis 10-'M. Die inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Inhibitoren erstreckt auch auf weitere metabolische Prozesse in Melanocyten sowie auf die Hemmung des Pigmenttransports von Melanocyten in Keratocyten. Die erfindungsgemäßen Phenoloxidase-Inhibitoren lassen sich daher auch zur Herstellung von Medikamenten verwenden, welche zur Behandlung von benignen, semimalignen und malignen Veränderungen der Melanocyten, insbesondere auch zur Beeinflussung von deren Wachstum zur Anwendung kommen.

Die erfindungsgemäßen Phenoloxidase-Inhibitoren können in einer Salbe verteilt topisch verabreicht werden. Es sind jedoch auch andere Zusammensetzungen, Formulierungen und Grundlagen möglich. Insbesondere können sie zusammen mit im Stand der Technik bekannten Wirkstoffen, wie z. B. Stabilisatoren, Antioxidantien (z. B. Tocopherol), Lichtschutzmitteln, Glucocorticosteroiden, Vitamin-A-Säure und deren Derivaten in beliebiger Kombination und verschiedenen Mengenverhältnissen zueinander eingesetzt werden.