INHIBIDORES DE LA ENZIMA O ⁶ -ALQUILGUANINA-ADN-METIL- TRANSFERASA PARA EL TRATAMIENTO DEL CáNCER.

SECTOR DE LA TéCNICA

La presente invención se enmarca en el campo de Ia química médica, y más concretamente en el de compuestos inhibidores de enzimas para uso terapéutico aplicables en particular como adyuvantes del tratamiento del cáncer por quimioterapia, al disminuir los efectos negativos de dicha terapia.

ESTADO DE LA TéCNICA

El tratamiento de Ia mayor parte de los tumores se basa en una aproximación múltiple que incluye Ia resección quirúrgica y Ia radioterapia, dirigidas al tumor principal, y Ia quimioterapia, que actúa en todo el organismo para prevenir y combatir Ia aparición de tumores en otras localizaciones (metástasis). Los principales compuestos usados en quimioterapia son los agentes alquilantes (ciclofosfamida, mecloretamina), antimetabolitos (6-mercaptopurina, 5-fluoruracilo), alcaloides derivados de plantas (vinblastina, vincristina), y diversas moléculas biológicas (antibióticos antitumorales, enzimas, hormonas, etc.).

Las nitrosoureas y los compuestos relacionados (procarbazina, estreptozina, temozolomida) son similares a los agentes alquilantes y su efectividad terapéutica se atribuye, en buena parte, al potencial citotóxico de las lesiones que inducen en el ADN [1]. Los tejidos tumorales, dada Ia mayor tasa de proliferación de sus células, sintetizan más ADN, por Io que son los más afectados por estas lesiones. En particular dichos compuestos provocan metilaciones del oxigeno en posición 6 de las moléculas de guanina del ADN, originando O ⁶ -metilguanina (0 ⁶ -mG). La metilación de Ia guanina en esta posición provoca que se aparee con una timina (T) en vez de con una citosina (C), y también puede provocar entrecruzamientos G-C

por Io que Ia replicación de Ia cadena con 0 ⁶ -mG origina alteraciones en Ia nueva cadena de ADN que finalmente producen Ia inhibición tanto de Ia replicación como de Ia transcripción del ADN, conduciendo en ambos casos a muerte celular por apoptosis [1]. Sin embargo las células presentan mecanismos para reparar las lesiones de su ADN producidas en condiciones fisiológicas normales, ya sea por factores medioambientales o por metabolitos generados internamente. En particular Ia resistencia a los compuestos alquilantes de O ⁶ está mediada por Ia enzima O ⁶ -alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (Ia enzima en humanos es conocida como hAGT, del inglés "human O ⁶ - alkylguanine-DNA alkyltransferase"), que transfiere el grupo metilo de Ia 0 ⁶ -mG a un aminoácido de su centro activo (un cisteína en posición 145), restaurando así Ia guanina original [1 , 2]. La síntesis de Ia hAGT se encuentra aumentada en Ia mayoría de las células tumorales, por Io que a menudo los tumores son resistentes a Ia quimioterapia con agentes alquilantes [3, 4]. Así por ejemplo, Ia acción de Ia hAGT es Ia causa principal de Ia resistencia a quimioterapia en el glioblastoma, un tipo de tumor maligno que constituye aproximadamente el 50% de los tumores cerebrales. Se ha estudiado por tanto el uso de inhibidores de Ia hAGT como coadyuvantes para los tratamientos de quimioterapia, ya que al potenciarse el efecto de los agentes alquilantes podría reducirse su dosis terapéutica, Io que a su vez supondría una disminución de sus efectos secundarios. La O ⁶ -benzilguanina (O ⁶ -bG) y sus análogos inactivan hAGT in vitro e in vivo [2], pero aunque se ha demostrado en ensayos clínicos que Ia O ⁶ -BG mejora Ia eficacia de agentes quimio-terapéuticos [5], existen limitaciones considerables para su uso terapéutico: su toxicidad sobre Ia mielina de las células nerviosas, su escasa solubilidad en agua y su rápida degradación en el plasma celular [6]. Además, Ia hAGT tiene más afinidad por Ia 0 ⁶ -mG que por Ia O ⁶ -bG, por Io que se une preferentemente al ADN

que presente O ⁶ -mG, de modo que su actividad reparadora está más favorecida que Ia inhibición por O ⁶ -bG.

Algunos estudios recientes han mostrado que los oligodesoxirribonucleótidos que contienen O ⁶ -bG inactivan más eficazmente a Ia hAGT [7]. En concreto, se ha demostrado el potencial inhibidor in vitro de moléculas de 11 desoxirribonucleótidos que contienen O ⁶ -bG modificadas con enlaces metilfosfonato terminales para protegerlas de Ia degradación por nucleasas. Sin embargo, en modelos celulares el potencial inhibidor de Ia hAGT por estas cadenas de desoxirribonucleótidos se redujo en una escala de unas 1000 veces en comparación a Io observado in vitro, sugiriendo que Ia incorporación de estas moléculas por las células es un factor limitante de su acción terapéutica.

Así pues, los inhibidores de Ia función reparadora de ADN de Ia hAGT descritos hasta ahora no son suficientemente efectivos. Los autores de Ia presente invención aplicaron por tanto Ia metodología del diseño de fármacos basado en Ia estructura tridimensional de las dianas terapéuticas para solventar este problema técnico. Para ello analizaron Ia estructura de Ia hAGT [8] y se fundamentaron en Ia hipótesis de que Ia unión del ADN no comporta un cambio conformacional significativo en esta enzima, al igual que se ha encontrado para Ia proteína Ada (que también repara alquilaciones del ADN). Esta hipótesis encaja asimismo con el mecanismo de inversión de Ia base alquilada que se plantea para este tipo de enzimas [9]. La aplicación de esta metodología, en el punto de confluencia entre Ia

Química, Ia Biología y Ia Bioinformática ha permitido identificar dos familias de compuestos con gran afinidad por el centro activo de Ia proteína hAGT y que poseen Ia capacidad de inhibir su actividad biológica de forma relevante.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

La presente invención se relaciona con el uso de derivados de piperadinil-metil-tetrazol-quinolinona y derivados de difenil-triazolo- pirimidina como inhibidores de Ia acción reparadora del ADN realizada por

Ia enzima O ⁶ -alquilguanina-ADN-alquiltransferasa y con composiciones farmacéuticas que los contienen, para Ia preparación de medicamentos coadyuvantes de Ia terapia antitumoral basada en agentes alquilantes.

El procedimiento para identificar familias de dichos compuestos se inició con el cribado virtual de Ia base de datos de compuestos químicos (quimioteca) ZINC [10], que contiene más de dos millones de compuestos. En dicho cribado se buscaron candidatos a interaccionar con el centro activo de Ia hAGT, particularmente compuestos que encajaran en el surco hidrofóbico que presenta Ia superficie de dicho centro activo y que está definido por los aminoácidos Metionina 134, Prolina 140 y el "lazo" del centro activo (comprendido entre los aminoácidos Valina 155 y Glicina 160, inclusive). La interacción o encaje molecular ("docking") de los compuestos de Ia quimioteca en dicho surco se analizó virtualmente según el proceso esquematizado en Ia Figura 1. La estructura inicial de Ia hAGT se obtuvo de Ia base de datos PDB

(RCSB Protein Data Bank, disponible en www.rcsb.org/pdb/ [11]). De dicha base se tomó un modelo de Ia proteína, del que se descartaron las moléculas de agua y ADN que aparecían interaccionando con Ia misma. A este modelo se Ie añadieron los átomos de hidrógeno con el programa protonate del paquete AMBER [12], y se Ie asignaron cargas y radios atómicos a todos los átomos de Ia proteína utilizando el mismo paquete. A continuación, se caracterizó energéticamente el centro activo mediante Ia combinación de tres programas propios desarrollados por los inventores:

• CGRID [13], genera una malla tridimensional sobre el centro activo de Ia proteína y permite calcular tanto las interacciones electrostáticas como las de tipo van der Waals entre cada uno de los átomos de centro

activo de Ia proteína con cada uno de los átomos principales (carbono, nitrógeno, oxígeno, azufre, hidrógeno, fósforo, flúor, cloro, bromo, yodo) de las moléculas de Ia quimioteca utilizada. Los bordes de Ia malla tridimensional para Ia hAGT se situaron a un mínimo de distancia de 5 A de cualquier átomo del nucleótido metilado (tal como Ia 0 ⁶ -mG) sobre el que actuará el centro activo de Ia enzima, y el espaciado entre cada punto de Ia malla fue de 0.5 A.

• CDOCK [13], un programa de análisis del encaje molecular o docking cuya función de asignación de valores se basa en las mallas calculadas con CGRID. Se utilizaron 3 sondas (moléculas prototipo): benceno para detectar zonas hidrofóbicas, y agua y metanol para detectar zonas susceptibles de formar puentes de hidrógeno.

• GAGA [14], que comprime Ia información obtenida por CDOCK para una sonda en una serie de funciones gaussianas que actúan como puntos farmacofóricos.

La "preparación" de los compuestos de Ia quimioteca ZINC para su cribado basado en el posible encaje molecular con el centro activo de hAGT se inició con el cálculo de las coordenadas tridimensionales de todos los compuestos de esta quimioteca mediante el programa CORINA [Corina Molecular Networks, Erlangen, Alemania]. Este programa permite además generar todas las combinaciones tridimensionales de un determinado compuesto de Ia quimioteca a través de las diferentes conformaciones de sus anillos y estereoisómeros. Con las coordenadas tridimensionales se realizó un análisis conformacional de todos estas combinaciones mediante el programa ALFA, desarrollado por los autores de Ia presente invención. El análisis permitió obtener las conformaciones más estables energéticamente de cada compuesto, asignándoles a su vez radios tipo AMBER a todos sus átomos [12]. Por último, se calcularon las cargas parciales de cada átomo mediante el paquete MOPAC [15]. Este cálculo se realizó para cada una de las estructuras tridimensionales

obtenidas con el programa CORINA. Toda Ia información que se fue generando (estructuras tridimensionales de las conformaciones con sus radios y cargas) se almacenó en una base de datos relacional en MySQL [disponible en www.mysql.com]. En total se obtuvo información de 2.288.455 compuestos en formato bidimensional (SMILES, Daylight Chemical Information Systems, Inc.), que fue procesada e incluida en Ia base de datos relacional.

Las posiciones más probables de estos compuestos en su encaje con el centro activo se obtuvieron después de Ia utilización de dos programas de filtros. El programa DOCK [16] se utilizó para asignar a cada geometría centro activo - compuesto un valor (ZScore) en función de los contactos entre ambas moléculas. Se seleccionaron aquellos compuestos que presentaban geometrías con valores de ZScore iguales o superiores a 5 para ser analizados exhaustivamente con el programa CDOCK [17]. De los 976 millones de conformaciones de los compuestos de ZINC se seleccionaron 4.787 para su cribado exhaustivo con CDOCK. Todos los resultados obtenidos, tanto del filtrado inicial como del filtrado exhaustivo se almacenaron en Ia base de datos relacional. Para Ia identificación final de compuestos con potencial inhibidor de Ia hAGT se llevó a cabo una actualización de los valores energéticos de los resultados obtenidos con CDOCK incorporando una componente coulómbica más refinada y los términos necesarios para Ia desolvatación del centro activo y del compuesto (puesto que ambas moléculas inicialmente se encuentran en solución en Ia célula, deben dejar de reaccionar con el solvente en las regiones en las que interaccionan entre sí). La actualización se llevó a cabo mediante Ia resolución de Ia ecuación de Poisson implementada en el paquete DelPhi (http://wiki.c2b2. columbia.edu/honiglab_public/index.php/Software). También se añadió Ia componente no polar, calculada como un valor proporcional al área de superficie accesible al solvente (S>4S>4) [18]. Así

pues, fue posible realizar una reclasificación de los resultados en función de Ia suma de las energías de van der Waals, coulómbica, desolvatación del centro activo y del compuesto potencialmente inhibidor y componente no polar. A partir de esta nueva clasificación se inspeccionaron visualmente los resultados de los compuestos que presentaban los 100 mejores resultados y se seleccionaron 21 compuestos dentro de dicho grupo que mostraban Ia mayor afinidad frente al centro activo de Ia hAGT.

Dichos compuestos demostraron capacidad inhibidora de Ia hAGT in vitro e in vivo, resultando en el último caso en una mayor eficacia de los agentes alquilantes para controlar Ia proliferación celular (Ejemplo 2). Los compuestos identificados pueden agruparse en dos grupos según su estructura química: compuestos con Ia fórmula I (derivados de piperadinil- metil-tetrazol-quinolinona) y compuestos con Ia fórmula Il (deridados de difenil-triazolo-pirimidina), en adelante "compuestos de Ia invención". Así, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto capaz de inhibir Ia acción de Ia O ⁶ -alquilguanina-ADN- alquiltransferasa caracterizado porque es un derivado de piperadinil-metil- tetrazol-quinolona con Ia fórmula general (en adelante fórmula I):

en Ia que:

- X es un átomo de carbono (C) o nitrógeno (N), indistintamente;

- R ¹ , R ² , R ³ y R ⁴ son iguales o diferentes y están independientemente seleccionados del grupo constituido por: hidrógeno, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquilmetil, cicloalquiletil, aminocarbonilalquil, alquiloxi lineal, alquiloxi ramificado, furilmetil, imidazolilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, R ⁷ , metil-R ⁷ , etil-R ⁷ , propil-R ⁷ , metoxi-R ⁷ , etoxi-R ⁷ , propoxi- R ⁷ , donde R ⁷ es un arilo en el que cada una de sus cinco posiciones restantes está sustituida por un grupo independientemente seleccionado entre hidrógeno, flúor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi (alquilóxido de 1 a 4 átomos de C), alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino.

En una realización particular de Ia presente invención X es nitrógeno, R ¹ es 2,5-dimetilfenil, R ² es hidrógeno, R ³ es metoxi y R ⁴ es fenil-metil, originando Ia 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1 -piperazinil][1 -(fenilmetil)-i H-tetrazol- 5-il]metil]-6-metoxi-2(1/-/)-quinolinona (en adelante, compuesto Ia o Pibetina, según denominación dada por los inventores), con Ia fórmula:

En otra realización particular de Ia presente invención, X es carbono, R ¹ es fenil-metil, R ² es metil, R ³ es hidrógeno y R ⁴ es fenil-metil, originando Ia 3-[(4-bencil-1-piperadinil)-(1-bencil-1H-5-tetrazolil)]metil -7-metil- 2(1/-/)quinolinona (en adelante compuesto Ib), con Ia fórmula:

Un segundo aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de un compuesto capaz de inhibir Ia acción de Ia O ⁶ -alquilguanina-ADN- alquiltransferasa caracterizado porque es un derivado de difenil-triazolo- pirimidina con Ia fórmula general (en adelante, fórmula II):

en Ia que cada uno de los grupos R y R está independientemente seleccionado del grupo constituido por: hidrógeno, alquilo lineal, alquilo ramificado, cicloalquilmetil, cicloalquiletil, aminocarbonilalquil, alquiloxi lineal, alquiloxi ramificado, furilmetil, imidazolilmetil, imidazoliletil, imidazolilpropil, R ⁸ , metil-R ⁸ , etil-R ⁸ , propil-R ⁸ , metoxi-R ⁸ , etoxi-R ⁸ , propoxi- R ⁸ , donde R ⁸ es un arilo en el que cada una de sus cinco posiciones restantes está sustituida por un grupo independientemente seleccionado

entre hidrógeno, flúor, cloro, bromo, trifluorometilo, hidroxi, alcoxi (alquilóxido de 1 a 4 átomos de C), alquilcarbonil, alquilamino, y sulfonilamino.

En otra realización particular de Ia presente invención R ⁵ es fenilmetoxi y R ⁶ es etil, originando el compuesto denominado 7-[4 -(benciloxi)fenil]-5- (4-etilfenil)-4,5,6,7-tetrahidro-[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pirimidina (en adelante, compuesto lia), con Ia fórmula:

En una cuarta realización particular de Ia presente invención R ⁵ es fenilmetoxi y R ⁶ es etoxi, originando el compuesto denominado 7-[4- (benciloxi)fenil]-5-(4-etoxifenil)-4,5,6,7-tetrahidro-[1 ,2,4]triazolo[1 ,5- a]pirimidina (en adelante, compuesto Mb) con Ia fórmula:

Los modelos tridimensionales de unión entre los compuestos de Ia invención descritos en las realizaciones particulares (compuestos Ia - o Pibetina- , Ib, Ma y Mb) con el centro activo de Ia hAGT se muestran en las Figuras 6, 7, 8 y 9. El análisis de los efectos de dichos compuestos sobre Ia hAGT demostró que los mismos son capaces de inhibir competitivamente Ia actividad reparadora de esta enzima en presencia de su sustrato natural, Ia cadena de ADN metilada.

Asimismo, según se muestra en el Ejemplo 2, el tratamiento de cultivos de células derivadas de carcinomas con dichos compuestos potenció Ia acción terapéutica de Ia carmustina (1 ,3-Bis(2-cloroetil)1-nitrosourea), un agente alquilante empleado frecuentemente para combatir el mieloma múltiple, tumores del cerebro, enfermedad de Hodgkin's, y linfomas no Hodgkin's, mostrando el potencial terapéutico del uso de los compuestos de Ia invención como co-adyuvantes de agentes quimio-terapéuticos en el tratamiento de tumores.

Un tercer aspecto de Ia presente invención incluye el uso de isómeros o mezclas de isómeros de los compuestos de Ia invención, incluyendo los isómeros de los compuestos Ia, Ib, Ma y Mb descritos en Ia presente

invención, como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. Dichos isómeros comprenden:

- isómeros en disposición Z o E definidos por Ia posición de los sustituyentes respecto a los enlaces múltiples que presentan los compuestos,

- isómeros ópticos o enantiómeros, originados por Ia presencia de centros quirales (átomos unidos a cuatro sustituyentes diferentes) que provocan Ia diferenciación entre enantiómeros respecto a su actividad óptica (rotación de Ia luz polarizada al pasar a través de una solución del enantiómero),

- diastereoisómeros, isómeros con al menos dos centros quirales, estando los sustituyentes de uno de dichos centros dispuestos igual en ambos diastereoisómeros y los sustituyentes de al menos otro de los centros dispuestos de forma distinta entre ambos.

Un cuarto aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de profármacos de los compuestos de Ia invención como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. El término "profármaco", tal como aquí se utiliza comprende cualquier compuesto derivado de las fórmulas I ó Il tal y como se definen en Ia presente invención (por ejemplo, esteres, carbamatos, amidas etc.), que, cuando se administra a un individuo, es capaz de proporcionarle, directa o indirectamente, uno o varios de los compuestos de Ia invención.

En una realización preferente de Ia presente invención, dicho profármaco es un compuesto que, en comparación con los compuestos de Ia invención aumenta su biodisponibilidad cuando se administra a un individuo, o que potencia Ia liberación de los compuestos de Ia invención en un compartimiento biológico (por ejemplo, en el cerebro o el tejido particular afectado por el tumor o Ia metástasis). La preparación de dicho profármaco puede llevarse a cabo mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en Ia materia, que pueden encontrarse por

ejemplo en "Textbook of Drug Design and Discovery" (Krogsgaard-Larsen P, Liljefors T y Madsen U; editorial Taylor and Francis, 2002, 3 ^a Edición).

Un quinto aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de las formas cristalinas de los compuestos de Ia invención en estado libre o como solvatos, como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. El término "solvato", tal como aquí se utiliza, incluye tanto solvatos que puedan ser utilizados en Ia composición de un medicamento, como solvatos útiles en Ia preparación de dicho medicamento. Los solvatos pueden obtenerse por métodos convencionales de solvatación bien conocidos por los técnicos en Ia materia.

Un sexto aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de Ia invención como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos. Las sales de los compuestos de Ia invención que no sean farmacéuticamente aceptables pueden ser útiles asimismo en Ia preparación de fármacos, por Io que todas las sales de los compuestos de Ia invención, sean o no farmacéuticamente aceptables están incluidas en el ámbito de Ia presente invención.

Un séptimo aspecto de Ia presente invención se refiere al uso como coadyuvantes de agentes quimio-terapéuticos, de compuestos de Ia invención que contengan uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, compuestos con una de las fórmulas I ó Il en las que uno o varios átomos de hidrogeno han sido sustituidos por átomos de deuterio o de tritio, uno o varios átomos de de carbono han sido sustituidos por átomos de ¹³ C o ¹⁴ C o uno o varios átomos de nitrógeno han sido sustituidos por ¹⁵ N.

En un octavo aspecto, Ia presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas con una cantidad terapéuticamente efectiva de uno o más compuestos de Ia invención, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, tanto presentes en forma esencialmente pura como en mezcla con agentes auxiliares, aditivos o portadores farmacéuticamente aceptables y, eventualmente, otros agentes terapéuticos. Los agentes auxiliares, aditivos o portadores deben ser compatibles con los demás componentes de Ia composición y no causar perjuicios a sus receptores. Las composiciones farmacéuticas incluyen aquéllas que son adecuadas para administración oral, rectal, nasal, tópica (incluidas Ia bucal, sublingual y epicutánea), o parenteral (incluidas Ia subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Los métodos para Ia preparación de dichas composiciones así como los agentes auxiliares, aditivos o portadores (diluyentes, solventes, disgregantes, emulgentes, absorbentes, antioxidantes, lubricantes, colorantes, edulcorantes, humectantes, etc) son bien conocidos en Ia técnica de Ia farmacia, y ejemplos de ambos pueden encontrarse en "Textbook of Drug Design and Discovery" (Krogsgaard- Larsen P, Liljefors T y Madsen U; editorial Taylor and Francis, 2002, 3 ^a Edición). Los compuestos de Ia invención, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, así como las composiciones farmacéuticas que los contienen pueden ser utilizados junto con otros fármacos para proporcionar terapia de combinación, ya sea formando parte de Ia misma composición farmacéutica o como composiciones separadas, administradas simultánea o no simultáneamente.

En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de uno o más compuestos de Ia invención, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, capaz de desarrollar en el receptor el efecto terapéutico mediado por Ia inhibición de Ia actividad reparadora de ADN de Ia hAGT. Dicha cantidad o

dosis vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos y sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, así como por Ia composición farmacéutica que los contengan, Ia vía y frecuencia de administración, y Ia edad y condición del sujeto individual al que se Ie administra.

Una realización particular de Ia presente invención Io constituye el uso de un compuesto de Ia invención de fórmula I ó II, sus isómeros, profármacos, solvatos o sales, o sus mezclas, en Ia elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer, incluyendo, pero no limitado, al tratamiento de carcinomas incluyendo los de próstata, mama, pulmón, páncreas, colorrectal, gástrico, esofágico, laríngeo, tiroideo, hepático, de vejiga urinaria, renal, uterino, y de cérvix, cualquier tipo de sarcomas incluyendo osteosarcomas, sarcomas de partes blandas y angiosarcomas, cualquier tipo de tumor hematopoyético incluyendo leucemias y linfomas, cualquier tipo de tumor del sistema nervioso incluyendo neuroblastomas, glioblastomas y astrocitomas, cualquier cáncer dermatológico incluyendo melanomas, carcinomas de células básales y carcinomas de células escamosas. En una realización preferente de Ia presente invención, dicho uso se lleva a cabo en combinación con otros tratamientos antitumorales, sean éstos mediante Ia administración de medicamentos, sustancias radiactivas, radioterapia, quimioterapia, cirugía o cualquier procedimiento médico.

DESCRIPCIóN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS

Figura 1. Metodologías para Ia identificación de pequeñas moléculas inhibidoras de Ia actividad de Ia enzima O ⁶ -alquilguanina- ADN-metil-transferasa. El proceso se inició por dos vías paralelas, consistentes en el análisis virtual, mediante medios informáticos, de Ia

estructura tridimensional, conformaciones más estables energéticamente y distribución de cargas, radios y cargas de los átomos que se encuentran en Ia superficie de las moléculas de una quimioteca de compuestos (ZINC) y del centro activo de Ia enzima. Los datos resultantes de dicho análisis para los más de tres millones de compuestos de Ia quimioteca se almacenaron en una base de datos (BBDD) relacional en entorno MySQL. Las posiciones más probables de los compuestos en su encaje con el centro activo de Ia enzima se obtuvieron asignando a cada par geométrico centro activo - compuesto un valor (ZScore) en función de los contactos entre ambas moléculas, calculado mediante un programa informático (DOCK). Las parejas geométricas con valores de ZScore superiores a 5 se re-analizaron con el programa CDOCK, diseñado específicamente por los autores de Ia invención. Posteriormente se llevo a cabo una reclasificación de los resultados en función de Ia suma de las energías de van der Waals, componente coulómbica, desolvataciones del centro activo y del compuesto potencialmente inhibidor (pérdida de interacción con moléculas del disolvente para que puedan interaccionar entre sí) y componente no polar. A partir de esta nueva clasificación se inspeccionaron visualmente los resultados y se seleccionaron 21 compuestos que mostraban Ia mayor probabilidad de interacción estable con el centro activo de Ia hAGT.

Figura 2. Fórmulas generales de los compuestos de Ia invención.

Se muestran las fórmulas generales de los compuestos de Ia invención (fórmulas I y II).

Figura 3. Fórmulas de realizaciones específicas de compuestos de Ia invención. Se muestran las fórmulas químicas de cuatro compuestos que constituyen realizaciones específicas de Ia invención: dos compuestos que tienen Ia fórmula general I y dos compuestos que tienen Ia fórmula general II. Compuesto Ia, 3-[[4-(2,5-dimetilfenil)-1 -piperazinil][1 -(fenilmetil)- 1H-tetrazol-5-il]metil]-6-metoxi-2(1/-/)-quinolinona (denominado Pibetina

por los inventores); compuesto Ib, 3-[(4-bencil-1 -piperadinil)-(1 -bencil-1 H- 5-tetrazolil)]metil-7-metil-2(1/-/)quinolinona compuesto Ma, (benciloxi)fenil]- 5-(4-etilfenil)-4,5,6,7-tetrahidro-[1 ,2,4]triazolo[1 ,5-a]pirimidina; y compuesto llb,7-[4-(benciloxi)fenil]-5-(4-etoxifenil)-4,5,6,7-tetrahid ro-[1 ,2,4]triazolo[1 ,5- a]pirimidina.

Figura 4. Modelos estructurales del encaje molecular entre compuestos de Ia invención y el centro activo de Ia enzima hAGT. Las ilustraciones muestran representaciones de Ia superficie de hAGT, junto a modelos de varillas de compuestos Ia, Ib, Ma y Mb de Ia invención, ilustrando el encaje óptimo entre el centro activo de Ia hAGT y dichos compuestos según resultados obtenidos mediante el programa CDOCK.

Figura 5. Inhibición por los compuestos Ia, Ib, Ma y Mb de Ia actividad reparadora de ADN de Ia enzima hAGT in vitro. La actividad remanente de Ia hAGT tras pre-incubarse con distintas concentraciones en el intervalo de 0 a 100 μM de los compuestos de Ia invención se representa como el porcentaje de dicha actividad durante Ia posterior incubación de Ia mezcla utilizando [ ³ H]-metil-ADN como sustrato, respecto a Ia actividad medida en el control positivo. Como control negativo de Ia reacción se utilizó proteína hAGT muíante (C145S, representado por un círculo, O), y como control positivo se sustituyeron los compuestos por Ia misma concentración del disolvente utilizado para su disolución, el DMSO (representado por un cuadrado negro, "). La figura superior muestra Ia actividad remanente de Ia hAGT frente a las distintas concentraciones del compuesto Ia (rombo negro, ^) y Ib (rombo gris, ^). La figura inferior muestra Ia actividad remanente de Ia hAGT frente a las distintas concentraciones del compuesto Ma (triángulo negro, A ) y Mb (triángulo gris, ^ ).

Figura 6. Inhibición por los compuestos Ia, Ma y Mb de Ia actividad reparadora de ADN de Ia enzima hAGT in vivo. Se muestra el efecto de distintos compuestos de Ia invención en concentraciones en el intervalo de 0 a 100 μM sobre Ia formación de colonias de células tumorales de adenocarcinoma colorectal humano sin tratar con el agente quimioterapeútico carmustina (columnas en negro) o tratadas con una concentración de 40 μM de dicho agente (columnas en gris). El número de colonias se representa como porcentaje de las mismas respecto al número observado en el control negativo: células incubadas con el medio utilizado para disolver los distintos compuestos de Ia invención (concentración = 0 μM) y no tratadas con carmustina (columnas en negro en el extremo izquierdo de todas las gráficas).

EJEMPLOS DE MODOS DE REALIZACIóN DE LA INVENCIóN

Ejemplo 1. Inhibición de Ia actividad reparadora de ADN de Ia hAGT in vitro por los compuestos Ia, Ib, Ma y Mb.

El análisis computacional descrito en Ia presente invención permitió identificar dos compuestos particulares para cada una de las fórmulas generales I y Il (compuestos Ia y Ib, y Ma y Mb, respectivamente) que encajaban con buena afinidad en el centro activo de Ia enzima hAGT

(veáse Ia Figura 4) y por tanto podían interferir competitivamente con Ia interacción entre dicha enzima y su sustrato, el ADN metilado. Para demostrarlo experimentalmente, se analizó Ia capacidad de dichos compuestos de inhibir Ia actividad reparadora de ADN de Ia enzima hAGT mediante un ensayo in vitro utilizando hAGT sintetizada en cultivos de E. coli recombinantes. Como control negativo en dicho ensayos se utilizó hAGT de un muíante, el hAGT-δC177-C145S (en adelante, hAGT-C145S) donde Ia cisteína 145 responsable de Ia actividad reparadora de esta

enzima es sustituida por una serina, provocando Ia pérdida de su actividad.

Síntesis y purificación de hAGT y hAGT-C145S. Se transformaron células de E. coli con vectores derivados de los plásmidos pet21 y pet28, incluyendo en el primer caso una secuencia de Ia hAGT (plásmido pet21- hAGT) y en el segundo Ia secuencia muíante (originando el vector pet28- hAGT-δC177-C145S). Se seleccionaron las bacterias transformadas mediante crecimiento en medio LB-agar con ampicilina (100 μg/ml) para seleccionar las colonias bacterianas conteniendo el vector pet21-hAGT o con kanamicina (50 μg/ml) para seleccionar aquellas conteniendo el vector pet28-hAGT- T-δC177-C145S. Se transfirieron colonias individuales a 0,6 litros de medio LB, conteniendo el antibiótico correspondiente a las mismas concentraciones antes indicadas y se incubaron en agitación a 37 ^° C durante 16 h. A continuación se realizaron diluciones de 150 ml_ de dicho cultivo en 1 ,5 litros de LB conteniendo el antibiótico correspondiente, pero a una concentración dos veces menor que Ia inicial. Estas diluciones de los cultivos se incubaron de nuevo en agitación a 37 ^° C hasta que alcanzaron Ia fase de crecimiento exponencial (D.O.βoo nm ~ 0,6), momento en que Ia temperatura se redujo a 3O C. Cuando se estabilizó esta temperatura para todo el cultivo se Ie añadió 1 mM de isopropil α-D- tiogalactopiranósido (Calbiochem A) para inducir Ia expresión de Ia hATG. Tras 4 horas de incubación se centrifugaron los cultivos durante 15 min, resuspendiendo los sedimentos en una solución tampón de 50 mM Tris pH=8,0 y 20% sacarosa. Estas resuspensiones se congelaron por inmersión en nitrógeno líquido y se conservaron a -80 ^° C hasta Ia purificación de Ia hAGT.

Para dicha purificación se descongelaron las resuspensiones celulares y se les añadió solución tampón para Ia lisis celular: 350 mM cloruro de sodio; 20 mM Imidazol; 0,2% IGEPAL; 1 μl β-mercaptoetanol, 20% sacarosa, y 50 mM Tris pH=8,0. La rotura celular se llevó a cabo en un sonicador Fisher Bioblock Scientific 75042, tras Io que las disoluciones se

centrifugaron a 185844 g durante 45 min. El sobrenadante se filtró a través de filtros de acetato de celulosa con poros de 45 μM de diámetro (Sarstedt) y se aplicó el filtrado a una columna HiTrap™ FF (Amersham Biosciences). La proteína unida específicamente a dicha columna a través de Ia cola de histidinas fue eluída mediante el flujo de una solución tampón de Imidazol en gradiente de 10 mM a 500 mM, y 350 mM NaCI, 20 mM Tris pH=8,0 y 1 mM β-mercaptoetanol. Las fracciones proteicas obtenidas se concentraron mediante centrifugación con dispositivos Amicon Ultra-15 (Millipore) y se purificaron mediante cromatografía de tamiz molecular en una columna Superdex 75 16/60 (Amersham Biosciences), utilizando como solución tampón 150 mM NaCI, 10 mM ditiotreitol (DTT) y 0,1 mM etilen- diamino-tetra-acetato (EDTA). Las fracciones correspondientes a Ia proteína eluída de esta columna se volvieron a concentrar mediante dispositivos Amicon Ultra-15 y se llevaron a una concentración de 2 mg/ml en el mismo tampón en presencia de 40% de glicerol, para su conservación a -2O ⁰ C hasta su posterior utilización.

Preparación del ADN metilado. Se metilo ADN de timo de ternera (Sigma) con [ ³ H]-metilnitrosourea (Amersham Biosciences) siguiendo el protocolo descrito en [19]. Se resuspendió 1 mg de ADN en 1 mi de solución tampón de 10 mM cacodilato sódico pH=7,0 durante 24 horas a 4 ^° C y a continuación se Ie añadieron 7 μl de [ ³ H]-metilnitrosourea, incubándose Ia mezcla a 37 ^° C durante 2 h. Finalizada Ia reacción de metilación, el ADN metilado se precipitó con acetato sódico y etanol. El precipitado obtenido, conteniendo el [ ³ H]-metil-ADN se lavó de forma exhaustiva con etanol y se resuspendió finalmente en solución tampón 50 mM Tris pH=7,8, 1 mM DTT y 5 mM EDTA, conservándose a -20 ^° C hasta su uso en los ensayos de actividad.

Ensayo de Ia actividad de Ia hAGT in vitro. La actividad reparadora del ADN de Ia hAGT y su inhibición por los compuestos de Ia invención se determinó siguiendo básicamente el método descrito en [20]. Brevemente, Ia enzima hAGT se preincubó durante 30 min a 37 ^° C con diferentes

concentraciones de los compuestos Ia, Ib (Asinex), Ma ó Mb (Chemdiv, Inc.) (0, 25, 50, 75 o 100 μM) disueltos en dimetilsufóxido (DMSO), usando como medio de reacción una solución tampón 50 mM Tris pH=7,8, 1 mM DTT y 5 mM EDTA. Tras esta pre-incubación se inició Ia reacción mediante Ia adición del substrato, [ ³ H]-metil-ADN, y se incubó a 37 ⁰ C durante 90 minutos. El volumen final de las reacciones fue de 200 μl, siendo las concentraciones finales de Ia hAGT y del [ ³ H]-metil-ADN 0.5 μM y 50 μM, respectivamente. Todas las reacciones se detuvieron por Ia adición de 400 μl de una solución acuosa de ácido tricloroacético (TCA, Sigma) al 13%. El [ ³ H]-metil-ADN restante, no reparado por Ia acción de Ia hAGT se hidrolizó calentando Ia mezcla de reacción hasta alcanzar 90 ^° C durante 30 min. La hAGT se precipitó por centrifugación a 1610O g durante 10 minutos y se lavaron los precipitados resultantes con una solución acuosa de TCA al 5%. Tras dichos lavados se resuspendieron en 200 μl de solución tampón 0.2 M de Tris pH=8,0. La radioactividad correspondiente al grupo ³ H-metil incorporado a Ia hAGT durante Ia reacción enzimática de reparación del ADN se midió con un contador de centelleo líquido (Wallac 1414), utilizando el cóctel de centelleo Optiphase HiSafe 3 (Perkin Elmer). Esta actividad remanente de Ia hAGT tras Ia preincubación con los compuestos de Ia invención se calculó en relación a los controles positivos, en los que Ia enzima se preincubó sólo con el disolvente DMSO (con ningún compuesto inhibidor). Como control negativo se usaron ensayos con Ia enzima hAGT-C145S, muíante sin actividad. Todos los ensayos se efectuaron por duplicado, y en cada uno de ellos las diferentes concentraciones de los compuestos se realizaron por cuadriplicado. Los resultados se expresan mediante el porcentaje de actividad remanente de hAGT en relación a Ia determinada para los controles positivos (en los que no hay inhibición de Ia actividad reparadora de dicha enzima). Los resultados de este ensayo se ilustran en Ia Figura 5, donde se puede observar que los compuestos Ia, Ib, Ma y Mb inhiben Ia actividad

reparadora del ADN metilado catalizada por Ia hAGT, siendo mayor Ia eficacia inhibidora para los compuestos de fórmula Il que para los de fórmula I, y dentro de éstos, siendo mayor Ia eficacia inhibidora del compuesto Ib que Ia del Ia (compárense las IC50, concentración de compuesto necesaria para reducir al 50% Ia actividad reparadora de ADN de Ia hAGT).

Ejemplo 2. Optimización del efecto antitumoral de Ia carmustina (agente alquilante) mediante inhibición por los compuestos Ia, Ma y Mb de Ia actividad hAGT in vivo.

Dado que Ia acción de Ia hAGT es Ia base de uno de los mecanismos de supervivencia de las células frente a Ia lesión en su ADN provocada por su metilación, puede concluirse que Ia inhibición de dicha enzima debe provocar una mayor sensibilidad por parte de las células a compuestos que, como los agentes alquilantes usados en quimioterapia, inducen dichas lesiones. Este es un efecto positivo desde el punto de vista terapéutico puesto que optimiza Ia acción antitumoral de dichos agentes. Los autores de Ia presente invención demostraron este efecto en cultivos de células tumorales proveniente de adenocarcinoma colorectal humano (código ATCC: HTB 38) tratadas con carmustina. En particular se empleó el ensayo de formación de colonias, previamente utilizado en el estudio de agentes adyuvantes de quimioterapia en células tumorales [21].

Ensayo de formación de colonias. Se sembraron 15000 células en cada uno de los 6 pocilios de placas de cultivo (Falcon) utilizando como medio el RPMI 1640 (Genycell) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Biowhittaker). Tras una incubación durante 48 horas a 37 ^° C se reemplazó el medio y se añadió al nuevo medio diferentes concentraciones de los compuestos Ia, Ma y Mb (0, 5, 10, 50 y 100 μM). Tras una pre-incubación durante 6 horas con los compuestos de Ia invención, se añadió a los cultivos carmustina (1 ,3-Bis(2-cloroetil)1- nitrosourea, también conocido como BCNU, Sigma) disuelta en una

solución 1 :1 de tampón fosfato salino pH=7,6 y etanol para llegar a una concentración final de 40 μM en el medio de cultivo. Asimismo se efectuaron controles positivos para cada uno de los cultivos con las diferentes concentraciones de compuestos de Ia invención en los que se añadía únicamente Ia solución 1 :1 de tampón fosfato salino pH=7,6 y etanol sin contener carmustina. Se incubaron todos los cultivos 2 horas y se reemplazó el medio de cultivo por medio RPMI suplementado con suero fetal bovino y que contenía las respectivas concentraciones de los compuestos de Ia invención. Tras un periodo de incubación de 16 horas se lavaron las células y se resembraron 2000 células por pocilio en nuevas placas de cultivo, creciéndose los cultivos durante 12 días a 37 ^° C.

La eficacia de Ia hAGT para inhibir el crecimiento celular se determinó mediante el recuento de las colonias formadas usando tinción con violeta de cresilo (cristal violeta, Merck). Tras una incubación en Ia solución de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente se lavaron las colonias varias veces con agua destilada y desionizada (MiIIiQ) y se dejaron secar a temperatura ambiente. Finalmente, se resuspendieron con una solución acuosa de ácido acético al 10% y se midió Ia absorbancia de las resuspensiones a 590 nm. El número de colonias se representó como porcentaje de las mismas respecto al valor observado en el control negativo: células pre-incubadas e incubadas sólo con el medio utilizado para disolver los distintos compuestos de Ia invención (concentración = 0 μM) y no tratadas con carmustina (columnas en negro en el extremo izquierdo de todas las gráficas). Los resultados de este ensayo se ilustran en Ia Figura 6. Se observó que los compuestos ensayados potenciaban el efecto inhibidor de Ia proliferación celular o formación de colonias mediado por Ia carmustina. El compuesto Ia reforzó el efecto de Ia carmustina a concentraciones iguales o superiores a 10 μM de dicho compuesto, mientras que los compuestos Ma y Mb requirieron concentraciones iguales o superiores a 50 μM para mostrar un refuerzo de Ia acción de Ia carmustina.

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