Sector Técnico

La presente invención está relacionada con el área industrial, más específicamente con los cultivos de microalgas de interés en la industria acuicultura e industria alimentaria.

Estado del Arte

Dentro de los llamados químicos finos producidos por microalgas, el pigmento carotenoide rojo astaxantina (ATX) posee una alta demanda gracias a sus importantes características. Se utiliza ATX sintética como pigmento en acuicultura e industria alimentaria, para lograr el color anaranjado o rojizo en salmones y truchas mantenidas en cautiverio, las que solo pueden obtenerlo desde su alimentación (Liu, 2010). Además, es indispensable para el desarrollo normal y reproducción de salmónidos, acelerando la madurez sexual e incrementando la fertilización, maduración de los huevos y defensa frente a estrés oxidativo (Nakano y cois.1995). Sin embargo, estas características beneficiosas son menores en la ATX sintética comparado con la ATX natural. La ATX natural posee 500 veces más capacidad antioxidante que el o-tocoferol (vitamina E), mostrando la capacidad de absorción de radicales libres (ORAC) más alta de todos los carotenoides (Nguyen, 2013), despertando gran interés para su uso como suplemento o ingrediente funcional en la alimentación humana. Adicionalmente el pigmento natural posee aplicaciones en la industria farmacéutica y nutracéutica (Lorenz y Cysewsky, 2000), en el caso del consumo humano, ha demostrado capacidad para la prevención de enfermedades degenerativas (Iwamoto y cois. 2000; Guerin y cois. 2003), prevención del cáncer (McCarty, 2012), mejoramiento de la respuesta inmune (Kobayashi y cois. 1997; Lorenz y Cysewsky, 2000; Lignell y Bottiger, 2001), prevención de enfermedades oculares (Cort y cois. 2008), cuidado de la piel (Lorenz, 2002; Tominaga y cois. 2012), agente antiinflamatorio (Speranza y cois. 2012), e inhibición del colesterol LDL (Choi y cois. 2011). Estas sobresalientes cualidades hacen que la ATX natural sea considerada el "rey de los carotenoides", con un renovado interés para el consumo humano (Nguyen, 2013). Esta gran variedad de efectos benéficos ha permitido el ingreso de la astaxantina microalgal al mercado de productos nutracéuticos, con una enorme variedad de productos con propiedades antioxidantes que se comercializan en tiendas de alimentos naturales (McCoy, 1999) y en diversas cadenas de farmacias. En general, la evidencia acumulada ha demostrado que la ATX de la microalga H. /acustrís conocida antiguamente como H. piuviaiis (Nakada & Ota, 2016; Guiry, 2018), es beneficiosa para la salud humana por la prevención de diversas enfermedades

Sus excepcionales características han creado un importante mercado para su producción, que se estima alcanzó los US$ 200 millones el 2015 (Frost y Sullivan 2008) manteniendo un significativo crecimiento año a año. Incluso cuando la mayor parte del pigmento que se utiliza en la industria de la acuicultura es de origen sintético, el mercado para consumo humano está en activo crecimiento y se estima que alcanzó los US$ 60 millones el 2008 (Frost y Sullivan 2008), principalmente en forma de encapsulados o en formulación de cosméticos, bebidas y alimentos funcionales.

De forma natural el hongo Xanthophyiiomyces dendrorhous y las microalgas verdes Chioreiia zofingiensis y Haematococcus iacustrís (ex H. piuviaiis; Nakada & Ota, 2016; Guiry, 2018), son los únicos organismos con potencialidad para competir con la ATX sintética (Tinoi y cois. 2006). H. iacustrís (ex H. piuviaiis) es el organismo más productivo, acumulando grandes cantidades de astaxantina al enquistarse, alcanzando hasOta un 4% del compuesto en base a peso seco en condiciones de laboratorio (Ambati y cois. 2014; Boussiba, 2000). No obstante, se requieren 56 kg de biomasa para obtener un kilo de pigmento a un valor de US$12.000. Pese a que la producción de ATX derivada de esta microalga es más costosa comparada con la artificial y de levaduras, es la de mejor calidad en cuanto a su índice de capacidad antioxidante ORAC, y tiene aprobación FDA para uso en consumo humano (Nguyen, 2013). Adicionalmente la ATX natural está asociada a otros compuestos que estabilizan el pigmento, evitando su oxidación e incrementando su duración en almacenamiento (Holtin y cois. 2009; Nguyen, 2013), sin embargo, la ATX natural representa solo un 30% de la producción actual (Frost y Sullivan 2008), existiendo una baja productividad en los cultivos y procesos inductivos de acumulación de ATX (Lorenz & Cysewski, 2000), los cuales son tradicionalmente de tipo autotróficos, necesitando grandes extensiones de terreno, mucho tiempo y elevados costos de producción (Nguyen, 2013), lo que indica una clara necesidad de nuevas fuentes naturales de ATX y por sobre todo, de nuevas formas de cultivar y particularmente, de inducir la acumulación de ATX con mayores productividades, que permitan una producción comercial sustentadle para cubrir su creciente mercado. Incluso, debe considerarse que los costos de producción no están demasiado alejados de la ATX sintética, por lo que mejoras en el proceso de inducción de ATX podrían hacer económicamente más viable la producción de ATX natural en un futuro próximo (L¡ y col., 2011).

La producción de ATX a partir de microorganismos ha sido un tema de intensa investigación en los últimos años (Chen et al, 1997; Ip & Chen, 2005), en comparación con otros microorganismos productores, las microalgas verdes, tales como H. /acustrísy C. zofíngiensis, tienen la capacidad de acumular grandes cantidades de ATX (Rise et al, 1994; Boussiba et al, 1999, Borowitzka, 1999; Curtain, 2000). En la actualidad la producción de ATX natural se realiza mayoritariamente, a través del cultivo e inducción de H. /acustrís bajo condiciones autotróficas, es decir, utilizando nutrientes inorgánicos, luz y CO2 como fuente de carbono (carbono inorgánico), requiriendo grandes extensiones de terreno, prolongados tiempos (21 a 27 días) para su cultivo e inducción de acumulación de ATX y elevados costos en operación. En este escenario, los existentes cultivos y procesos de inducción de acumulación de ATX autotróficos de H. lucustrís no satisfacen la demanda mundial de ATX natural, considerando que las condiciones actuales de cultivo e inducción de ATX presentan bajas productividades de 0,18 g ATX nr ³ d ^-1 con un 1,8% (porcentaje en masa de ATX respecto a la biomasa seca) promedio anual en un amplio terreno de 4000 m ² para raceways de cultivo y 25000 m ² para raceways de inducción autotróficas (Datos Planta industrial de Pigmentos Naturales S.A.).

Las cepas silvestres de la microalga logran una producción máxima reportada en bibliografía de 4% en condiciones ideales de laboratorio en bajos volúmenes de cultivo. Sin embargo, los contenidos obtenidos en procesos de mayor escala a nivel industrial raramente superan el 2%. Para mejorar la productividad se ha utilizado mutagénesis al azar, logrando incrementos entre 2,5 - 2,6% (Chen y cois, 2003; Gomez y cois. 2013), pero con problemas de reversión, baja biomasa y acumulación de otros compuestos no deseados (An y cois. 1989). La generación de transgénicos puede ser exitosa (Liu, 2010; Teng, 2002; Steinbrenner y Sandmann, 2006; Kathiresan y cois. 2009) pero no está permitido su uso a nivel nacional ni en alimentación humana, enfatizando la necesidad de fuentes naturales (Nguyen, 2013).

Con estos antecedentes expuestos, es altamente necesario desarrollar un nuevo bioproceso de acumulación de astaxantina vía inducción mixo o heterotrófica en H. lacustris como una herramienta validada, con un gran potencial económico para obtener incrementos significativos de astaxantina, libre de las restricciones sanitarias, geográficas o climáticas.

REFERENCIAS

• Borowitzka, MA. (1999) Commercial production of microalgae: ponds, tanks, tubes and fermenters. J Biotechnol 70:313-21.

• Boussiba, S., Bing, W., Yuan, J. P., Zarka, A. y Chen, F. (1999). Changes in pigments profile in the green alga Haeamtococcus pluvialis exposed to environmental stresses. Biotechnology Letters, 21(7), 601-604.

• Boussiba, S. (2000) Carotenogenesis in the green alga Haematococcus pluvialis: Cellular physiology and stress response. Physiol Plant 108: 111-117.

• Chen, Y., Li, D., Lu, W., Xing, J., Hui, B. y Han, Y. (2003). Screening and characterization of astaxanthin-hyperproducing mutants of Haematococcus pluvialis. Biotechnology letters, 25(7), 527-529.

• Choi, H. D., Youn, Y. K. y Shin, W. G. (2011). Positive effects of astaxanthin on lipid profiles and oxidative stress in overweight subjects. Plant foods for human nutrition, 66(4), 363- 369.

• Cort, A., Ozturk, N., Yargicoglu, P., Yucel, I., Unal, M., Ciftcioglu, A., ... y Aslan, M. (2008). Suppressive Effect of Astaxanthin on Retinal Injury Induced by Ocular Hypertension. Free Radical Biology and Medicine, 45, S80-S81.

• Curtain, C. (2000) The growth of Australia's algal beta-carotene industry. Australas Biotechnol 10: 19-23.

• Ip, P. F., y Chen, F. (2005b). Production of astaxanthin by the green microalga Chlorella zofingiensis in the dark. Process Biochemistry, 40(2), 733-738.

• Li, J., Zhu, D., Niu, J., Shen, S. y Wang, G. (2011). An economic assessment of astaxanthin production by large scale cultivation of Haematococcus pluvialis. Biotechnology Advances, 29 (6), pp. 568-574.

• Liu, J. (2010) Genetic engineering of Chlorella zofingiensis for enhanced astaxanthin biosynthesis and assessment of the algal oil for biodiesel production. Doctoral thesis, University of Hong Kong. http://hdl.handle.net/10722/131813

• McCarty, M. F. (2012) Minimizing the cancer-promotional activity of cox-2 as a central strategy in cancer prevention. Medical Hypotheses 78(1): 45-57.

• Nakada, T., y Ota, S. (2016). What is the correct name for the type of Haematococcus Flot. (Volvocales, Chlorophyceae)?. Taxon, 65(2), 343-348.

• Nguyen, K. (2013) Astaxanthin: A Comparative Case of Synthetic VS. Natural Production. Chemical and Biomolecular Engineering Publications and Other Works. Http://trace.tennessee.edu/utk_chembiopubs/94. Official Journal of the European Communities L106, DIRECTIVE 2001/18/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 12 March 2001, on the deliberate release into the environment of genetically modified organisms and repealing Council Directive 90/220/EEC. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Estresores seleccionados para inducir la producción de ATX en cepas de H. lacustrís.

Figura 2: Gráfica tridimensional de la superficie de respuesta para la productividad de la inducción de ATX por vía mixotrófica en la cepa 024.

Figura 3: Cromatogramas de ATX en cultivos de cepa P3 con inducción autotrófica. Señales: Izquierda corresponde a muestra sin hidrol ¡zar; derecha corresponde a muestra hidrolizada.

Figura 4. Cromatogramas de ATX en cultivos de cepa P3 con inducción mixotrófica. Señales: izquierda corresponde a muestra hidrolizada y derecha corresponde a muestra sin hidrolizada.

Figura 5. Cromatogramas de ATX en cultivos de cepa 024 con inducción autotrófica. Señales: Izquierda corresponde a muestra hidrolizada y derecha corresponde a muestra sin hidrolizar.

Figura 6. Cromatogramas de ATX en cultivos de cepa 024 con inducción mixotrófica. Señales: izquierda corresponde a muestra hidrolizada y derecha corresponde a muestra sin hidrolizar.

Figura 7: Estándar de ATX sintética 10 pg/mL junto a muestra de cepa 024 tratamiento NaCI.

Figura 8: Determinación estereoisómeros en ATX de cepa P3 con inducción autotrófica

Figura 9: Determinación estereoisómeros en ATX de cepa P3 con inducción mixotrófica

Figura 10: Determinación estereoisómeros en ATX de cepa 024 con inducción mixotrófica

Figura 11: Ensayos de capacidad antioxidante (%) de ATX proveniente de la cepa 024 (izquierda) y P3 (derecha).

Figura 12: Ensayos de capacidad antioxidante de ATX proveniente de la cepa 024 (izquierda) y P3 (derecha).

Figura 13: Concentración de ATX y biomasa obtenida de la cepa 024 durante el proceso de inducción.

Figura 14: Productividad de la inducción mixotrófica optimizada de ATX en FBR 3 L, 5 experiencias. Figura 15: Productividad de la inducción mixotrófica optimizada de ATX en FBR de 200 L, 3 experiencias.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Se presenta un nuevo bioproceso integrado no autotrófico de acumulación de astaxantina (ATX), vía inducción mixotrófica en Haematococcus lacustrís para la industria nutracéutica.

Durante el desarrollo de esta tecnología se utilizaron diferentes estresores los que fueron seleccionados según su capacidad de inducción de ATX. Se utilizaron diferentes fuentes de carbono: acetato, glicerol y acetato-glicerol; irradiancia y temperatura.

El bioproceso comprende al menos las siguientes etapas: a) Fase de crecimiento de cultivo autotrófico en condiciones estándar: se prepara un cultivo autotrófico en condiciones estándar en un periodo de 10-20 días en bioreactores entre 5 y 800 L a 23°C, con burbujeo constante y a una intensidad lumínica de 50 pE m ^-2 s ^-1 ; b) Fase de Inducción de acumulación de ATX: En un fotobioreactor se somete el cultivo a las siguientes condiciones: Fuente de carbono mezcla de acetato de sodio-glicerol a 10-50 mM; temperatura de 25-28°C; irradiancia a 500-700 pE m“ ² s ^-1 ; pH entre 7 - 8; agitación a 100 - 250 rpm; duración 6 a 12 días; c) Fase de cosecha y secado de biomasa, bajo condiciones estándar; y d) Fase de extracción de ATX, bajo condiciones estándar.

El bioproceso integrado permite una mayor acumulación del pigmento carotenoide ATX en al menos dos cepas de H. lacustrís, que representan cepas industriales y cepas poliploides. Dado que no existieron diferencias significativas entre ambas cepas estudiadas bajo estas condiciones óptimas de inducción, podemos indicar que este proceso puede servir para cualquier cepa de H. lacustrís. En estas condiciones para la cepa industrial se obtuvieron productividades de ATX 3,27 g nr ³ d ¹ y para la cepa poliploide se obtienen productividades de ATX 2,61 g nr ³ d’ ¹ . Lo que significa incrementar entre 15 y 18 veces más la productividad de ATX en comparación a la obtenida por la industria bajo condiciones tradicionales en la industria del norte de Chile 0,18g nr ³ d' ¹ .

Otra de las características competitivas del bioproceso es la disminución del tiempo de inducción, logrando obtener altas productividades entre 6-12 días de inducción, mientras que, con el método tradicional del proceso industrial, la inducción se logra en períodos entre 15-45 días.

El fotobioreactor utilizado puede tener una capacidad desde los 250ml hasta 200L, sin tener que modificar las condiciones de operación y sin afectar la calidad de la ATX obtenida.

Este bioproceso puede ser implementado sin limitaciones, sanitarias, estacionales, climáticas o geográficas. Las ventajas y potencialidades competitivas del bioproceso no autotrófico desarrollado son:

- Mayor productividad de ATX debido a la optimización de dos factores: i) incremento en la producción de ATX y ¡i) menor tiempo de proceso de inducción.

- Menor costo de operación debido a: i) reducción del consumo de agua, ¡i) reducción de costos energéticos y iii) menor mano de obra.

- Aplicable a cualquier zona geográfica por la utilización de sistemas cerrados.

- Menor costo de inversión, dado el menor requerimiento de terreno para su implementación.

- No depende de la variabilidad estacional.

- Mayor control de las variables críticas del proceso (por ejemplo, temperatura).

- Disminuye la contaminación de la producción por el uso de sistemas cerrados.

En la caracterización química e isomérica de la molécula de ATX obtenida en este bioproceso con respecto a la inducción autotrófica, no se encontraron diferencias en los perfiles de carotenoides ni en la composición isomérica de la molécula de ATX.

La cepa poliploide (P3) no vio afectada su composición de carotenoides, ya sea por su tratamiento de poliploidización como por los tratamientos inductivos no autotróficos.

La cepa industrial (024) tampoco se vio afectada por los tratamientos inductivos no autotróficos en lo referente al perfil de carotenoides como en la composición isomérica de la molécula de ATX (3S,3'S), El efecto que se pudo comprobar es el aumento de la concentración de ATX para ambas cepas en los tratamientos de inducción no autotrófica, especialmente del tipo mixotrófico.

En los ensayos de capacidad antioxidante (CA), se logró comprobar que esta propiedad es relativamente afectada por la concentración de ATX en cada ensayo. No obstante, la naturaleza diferente de cada ensayo antioxidante no siempre demuestra que existe una relación directamente proporcional entre la concentración de ATX con la capacidad antioxidante (CA).

En todos los ensayos antioxidantes realizados, a partir de los tratamientos de inducción mixotrófica, existió un aumento de la CA con respecto a la inducción autotrófica (NaCI), aunque el ensayo de CA por DPPH claramente indico que no existen diferencias significativas entre los tratamientos de inducción. Sin embargo, en el resto de los ensayos hubo un efecto importante en el aumento de la capacidad antioxidante de la molécula de ATX en las inducciones mixotróficas.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Evaluación de estresores que inducen la acumulación de astaxantina por vía mixotrófica.

Se evaluaron los estresores en dos cepas de H. lacustrís, la primera cepa denominada 024, corresponde a la cepa industrial de la empresa Astax Chile SpA, y la cepa P3 corresponde a un poliploide del laboratorio GIBMAR UdeC. La cepa P3 se encuentra depositada en el Banco Español de Algas (BEA) bajo el código de acceso BEA IDA 0064B, el deposito fue realizado con fecha 21 de noviembre de 2017.

Los 4 estresores evaluados fueron:

• fuentes de carbono: acetato de sodio, glicerol y mezcla de ellos, en rango de concentración entre 5-100 mM;

• temperatura a un rango entre 25-30°C;

• irradiancia a un rango entre 400 y 700 pE m ^-2 s ^-1 ; y

• radiación UV-C a un rango entre 10-100 mJcnr ² .

Después de la inducción, se mantuvieron en un shaker JSOS-500, JSR con una agitación de 120 rpm a 25, 30 y 35°C entre 6 y 12 días. Para la evaluación de cada estresor se utilizaron cultivos crecidos en botellones entre 2- 5 L que fueron mantenidos por 10 días a 23°C, con burbujeo constante y a una intensidad lumínica de 50 pmol m ^-2 s ^-1 . Tras esta fase de crecimiento, se procedió con los tratamientos de inducción de acumulación. Estos se llevaron a cabo en matraces erlenmayer de 250 mL que fueron inoculados con 100 mL de cultivo y, posteriormente, cada uno de ellos fueron sometidos a diferentes tratamientos para inducir el enquistamiento de las cepas de H. lacustrís (024 y P3 . El control se dejó sin ningún estresor, y se mantuvo en las mismas condiciones que los tratamientos restantes. Adicionalmente NaCI fue utilizado como un control industrial (en la industria se diluye el cultivo y durante 4 días consecutivos se le añade NaCI para inducir el enquistamiento), para simular estas condiciones se añadieron 0,25 gL ¹ los 4 primeros días hasta obtener 1 gL ¹ de NaCI en los 100 mL del cultivo. Los estresores fueron analizados en las cepas 024 y P3 dos veces de forma independiente, incluyendo 3 réplicas para cada uno.

En cada caso se determinó la productividad de ATX de los estresores evaluados. En la Tabla 1 se presentan las mejores condiciones seleccionadas.

Tabla 1: Condiciones seleccionadas para la optimización.

Productividad de ATX Productividad de ATX Estresor seleccionado (gnr ³ d ^_1 ) cepa 024 (gnr ³ d ^-1 ) cepa P3

Irradiancia: rango entre 2,31 ± 0,09 1,35 ± 0,28

500- 700 pE rrr ² s ¹

Temperatura: rango entre

25-28°C con Acetato de 2,3 ± 0,16 1,09 ± 0,03 sodio

Rango entre 10-50 mM de

1,9 ± 0,16 2,07 ± 0,18 acetato de sodio y glicerol

Mezcla de glicerol con 1,78 ± 0,06 1,69 ± 0,3

Acetato de sodio

Se seleccionaron 4 estresores de la figura 1 para ambas cepas, obteniendo una productividad de ATX hasta 13 veces más que el promedio anual de la industria en el norte de Chile (0,18 gnr ³ d ¹ ), estos estresores fueron utilizados para la etapa de optimización. Es importante destacar que en ambas cepas coincide que las mayores productividades se obtienen con los mismos estresores. Ejemplo 2: Bioproceso de inducción de astaxantina mixotrófico optimizado.

Se realizó la optimización de los parámetros de inducción mixotróficos seleccionados en el Ejemplo 1, los que generaron una mayor acumulación del pigmento carotenoide ATX en las dos cepas de H. lacustrís. Los estresores seleccionados para evaluar en este proceso de optimización fueron: fuente de carbono acetato, fuente de carbono acetato- glicerol, i rradiancia y temperatura.

Estas condiciones fueron evaluadas mediante proceso de optimización multivariable para lo cual se organizaron en 6 bloques experimentales triplicados (n = 3 réplicas por 6 tratamientos; N=18).

Para evaluar la interacción entre los factores y optimizar el bioproceso, se utilizó el método de diseño de experimentos factorial con 3 factores y tres niveles. Los factores seleccionados corresponden a la concentración de acetato de sodio añadido al cultivo, la temperatura del reactor en donde se mantienen los cultivos entre 6 y 12 días y la ¡rradiancia del mismo. La respuesta evaluada fue la productividad de la inducción de ATX para cada una de las cepas. Veintiún experimentos se llevaron a cabo en cada caso. En total se obtuvieron 4 superficies de respuestas, evaluando la concentración de acetato de sodio, la mezcla de acetato de sodio con glicerol, para cada cepa (024 y P3).

Las superficies de respuesta fueron evaluadas mediante el análisis de varianza (ANOVA) utilizando el software de análisis de datos MODDE 12.1 (Umetrics, Umea, Sweden) para ajustar los datos experimentales a la ecuación polinómica de segundo orden mediante una técnica de regresión lineal.

Se utilizaron cultivos crecidos en botellones de 5 L que fueron mantenidos por 10 días a 23°C, con burbujeo constante y a una intensidad lumínica de 50 pE m ^-2 s ^-1 . Tras esta fase de crecimiento se procedió con los tratamientos de inducción de acumulación. Se evaluaron los 6 bloques con 3 réplicas en matraces erlenmayer de 250 mL inoculados con 100 mL de cultivo los que fueron sometidos a las condiciones establecidas para inducir el enquistamiento de las cepas de H. lacustrís (024 y P3). Además, se añadió un control industrial, diluyendo el cultivo y añadiendo NaCI durante 4 días consecutivos, para inducir el enquistamiento. Para simular estas condiciones se añadieron 0,25 gL ¹ los 4 primeros días hasta obtener 1 gL ¹ de NaCI en los 100 mL del cultivo.

Se tomaron muestras de todos los tratamientos en cada bloque entre el día 6 y 12 de cultivo con la finalidad de determinar la densidad celular, peso seco y cantidad de ATX. A modo de ejemplo, se muestra en la figura 2 el modelo optimizado para aumentar la productividad de ATX en la cepa 024 con el estresor acetato de sodio. Los valores de temperatura e irradiancia son óptimos a 27,5 °C y 637 pE m“ ² s ^-1 a una concentración de 50 mM (Tabla 2), siendo esta última el factor más significativo del modelo, puesto que un aumento en la concentración de acetato de sodio podría incrementar los valores de productividad de ATX de 2,29 gnr ³ d’ ¹ .

Tabla 2: Estresores seleccionados optimizados para aumentar la productividad de ATX, mediante una inducción mixotrófica optimizada

Estresor Valor optimizado

Acetato adaptado (mM) 50 ± 0,12

Temperatura (°C) 27,5 ± 0,12

Irradiancia pEnr ² s ¹ 637 ± 0,10

Ejemplo 3: Cepas de H. lacustris validada en base a la ATX producida

Mediante técnicas analíticas y funcionales que permiten determinar la calidad de la ATX producida (composición isomérica y capacidad antioxidante) por vía mixotrófica, se validó la cepa industrial y la cepa poliploide para el mejor proceso de inducción en comparación con la ATX de la cepa base obtenida por inducción autotrófica.

Se utilizaron cultivos crecidos en botellones de 2- 5 L que fueron mantenidos por 10 días a 23°C, con burbujeo constante y a una intensidad lumínica de 50 pE m“ ² s ^-1 . Tras esta fase de crecimiento se procedió con los tratamientos de inducción de acumulación. Se evaluaron los rangos de las condiciones optimizadas descritas en la Tabla 3, para inducir el enquistamiento de las cepas de H. lacustris (024 y P3), cada una con 4 réplicas en matraces Erlenmeyer de 250 mL inoculados con 100 mL de cultivo. Además, se añadió un control industrial de inducción descrito anteriormente.

Se tomaron muestras de todos los tratamientos entre el día 6 y 12 de cultivo con la finalidad de determinar peso seco y cantidad de ATX. Tabla 3: Estresores optimizados.

Estresor optimizado Ejemplo 3 Rango de valores

Irradiancia 500-700 pE m-2s-l

Temperatura 25-28 °C

Acetato de sodio 10-50 mM

Glicerol con Acetato de sodio Mezcla

Se cuantificó ATX libre por medio de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), por medio de la hidrólisis enzimática de los ásteres de carotenoides y se identificaron los estereoisómeros correspondientes.

Cuantifícación de estereoisómeros de ATX por cromatografía líquida de alto eficiencia HPLC.

Los estándares de ATX preparados fueron filtrados e inyectados por triplicado. Estos estándares corresponden a concentraciones de 0,75; 1,5; 3,0; 4,5; 6,0; y 7,5 pg/mL de ATX. El equipo de HPLC fue acondicionado para poder determinar la señal correspondiente a la ATX libre a un tiempo de retención de 7,92 min.

Las condiciones del análisis fueron determinadas a temperatura ambiente, con un flujo de 1 mL/min y utilizando una columna (Luna 3pm Sílice) en fase normal en condiciones ¡socráticas de hexano/acetona 82: 18 v/v con detección de 474 nm. Se inyectaron alícuotas de 20 pl con tiempo de corrida total de 15 min. En cuanto a la evaluación de algunos parámetros de validación, el método resulto lineal en los rangos de concentraciones evaluados y tanto el límite de detección como el de cuantifícación estuvieron muy por debajo del primer punto de la curva de calibrado. Lo cual refleja la capacidad del método para determinar concentraciones de ATX en concentraciones bajas.

Hidrólisis enzimática de los ásteres de carotenoides:

En las figuras 3-6 se observa la ATX libre junto a la muestra sin hidrol ¡zar para para la inducción autotrófica y mixotrófoca en la cepa P3 y 024 de H. lacustrís. Es importante destacar que independiente de la cepa y del tratamiento a los cuales fueron sometidas las muestras, los resultados indican que no hay una variación en el perfil de carotenoides entre las muestras analizadas y sólo se observa un incremento de ATX como del resto de los pigmentos detectados, indicando una inducción de toda la ruta metabólica de ATX en H. lacustrís. Estereoisómeros de la astaxantina producida en los cultivos (D3 V 024) de H. ¡acustrís.

En la figura 7, se puede observar el perfil de estereoisómeros de astaxantina sintética la cual comprende a los tres isómeros ópticos que tiene esta molécula en una proporción 1:2: 1 (3S,3'S):(3S,3R):(3R,3'R).

Esta conformación de isómeros nos permite diferenciar la molécula de astaxantina sintética de la natural, en este caso de H. lacustrís la cual corresponde a su totalidad al isómero (3S,3'S).

En las figuras 7 a 10, se puede observar y confirmar que el proceso de poliploidización, así como los tratamientos de inducción mixotróficas no afectan la composición isomérica de la molécula de ATX, manteniendo la estructura (3S,3'S), lo cual valida la obtención ATX para su utilización como nutraceútico en humanos.

Por diferentes ensayos se determinó la relación del porcentaje de capacidad antioxidante (CA) de la ATX producida por inducción mixotrófica, con respecto a CA de ATX obtenida de cepa base por inducción autotrófica.

• Resonancia paramagnética de espín (EPR)

• 2,2-difenil-l-picrylhydrazyl (DPPH)

• Ácido 2,2'-azino-bis-(3-etillbenzotiazolin-6-sulfonico) (ABTS)

• Actividad reductora del hierro férrico/poder antioxidante (FRAP)

• Capacidad de absorción de radicales de oxígeno (ORAC).

En los ensayos de capacidad antioxidante (CA), se logró comprobar que esta propiedad es relativamente afectada por la concentración de ATX en cada ensayo. No obstante, la naturaleza diferente de cada ensayo antioxidante no siempre demuestra que existe una relación directamente proporcional entre la concentración de ATX con la capacidad antioxidante (CA), figuras 11 y 12.

En todos los ensayos realizados, hubo un aumento de la CA con respecto a la inducción autotrófica (NaCI), aunque el ensayo de CA por DPPH claramente indico que no existen diferencias significativas entre los tratamientos de inducción mixotrófica. Sin embargo, en el resto de los ensayos demostró un efecto importante en el aumento de la capacidad antioxidante de la molécula de ATX en las inducciones mixotrófica (acetato y mezcla de acetato de sodio y glicerol). La CA fue determinada por diferentes métodos antioxidantes, puesto que definen diferentes mecanismos de reacción, tales como la transferencia de átomos de hidrógeno (como es en el caso del ensayo ORAC), transferencia de electrones (como el FRAP), mezcla entre los mecanismos de transferencia de átomos de hidrógeno y transferencia de electrones (como el DPPH y el ABST) o de manera inversa por capacidad proxidante (EPR).

Ejemplo 4: Bioproceso inductivo mixotrófico optimizado para obtención de ATX a escala de laboratorio (3L) y a escala piloto (200L).

Se validó el bioproceso inductivo en condiciones de laboratorio en biorreactores Infers agitados de 3 y 200L.

Se utilizaron cultivos crecidos en botellones de 5 y 20 L que fueron mantenidos por 10 días a 23°C, con burbujeo constante y a una intensidad lumínica de 50 pE m ^-2 s ^-1 . Tras esta fase de crecimiento se procedió con el tratamiento de inducción de acumulación de ATX, bajo las condiciones descritas en la tabla 4. Posteriormente se llevó a cabo la inducción, tanto en un fotobiorreactor de 3L como en biorreactores agitados de 200 L.

Tabla 4: Parámetros de inducción utilizados en el proceso de inducción de ATX en 3 y 200L.

Condición Rango

Inductor de

Mezcla de acetato de sodio y glicerol enquistamiento

Temperatura 25-28°C

Irradiancia 500-700 pE nr ² s ¹ pH 7,6

Agitación 100-250 rpm

Para evaluar la replicabilidad del método, en el caso del fotobiorreactor de 3L se llevaron a cabo cinco experiencias independientes bajo las mismas condiciones operacionales (réplicas). En la figura 13 se muestran los resultados de la concentración final de ATX expresada en % p/p de muestras de la biomasa cosechada al final de cada experiencia y liofilizada. Además, se indican la concentración final de biomasa producida en g L ^-1 . Con las 5 experiencias de inducción mixotrófica, se determinó que el promedio de las productividades obtenidas fue de 3,27 g nr ³ d ^-1 , lo cual es equivalente a 18,2 veces la productividad promedio anual de la industria (0,18 g nr ³ d ^-1 ).

En la figura 14, se pueden observar las 5 experiencias realizadas en el fotobiorreactor de 3L y en la figura 15 se indica la productividad del bioproceso de inducción mixotrófica en 3 experiencias en biorreactores agitados de 200L, En este caso, se obtuvieron productividades de ATX de 2,68 g nr ³ d ¹ lo cual es equivalente a 15 veces la productividad promedio anual de la industria (0,18 g nr ³ d ^-1 ).