Techniken zur Separation organischer Verbindungen aus wässrigen Lösungen (bzw. Prozessgemischen) sind zahl- reich bekannt. Hierzu zählen beispielsweise die Auf- trennung über Ionenaustauscherharze, Chromatographie- verfahren, Adsorption, Filtration, Evaporation, Reverse Osmose, Elektrodialyse usw. Eine Integration von derar- tigen Abtrennungsprozessen in Bioprozessen wie Fermen- tationsverfahren hat sich bisher als besonders schwie- rig erwiesen.

Insbesondere die Gewinnung von Aminosäuren hat dabei in den letzten Jahren vor allem mit Blick auf die Lebens- mittel-und Getränkeindustrie wirtschaftlich an Inte- resse zugenommen. Die Separation der gewünschten Amino- säuren aus Bioprozessgemischen erfolgt z. B. vor allem über Ionenaustauscher oder beispielsweise mittels Reak- tivextraktion. Diese Verfahren stießen jedoch bis vor kurzem bei der Aufreinigung insbesondere von Kulturbrü- hen an ihre Grenzen. Nachteilig bei einer Behandlung von Kulturflüssigkeiten über Ionenaustauscher war z. B. das Erfordernis einer extensiven Vorbehandlung des zu reinigenden Gemisches.

Es ist außerdem bekannt, dass bei der fermentativen Produktion von L-Phenylalanin im Fed-Batch-Verfahren die Produktbildung ab einer L-Phenylalanin-Konzen- tration von ca. 30 g/L inhibiert wird. Um diese Inhi- bierung zu verhindern, ist es notwendig, das L-Phenylalanin während des Prozesses abzutrennen. Ein solches Verfahren kann als sogenannte"in situ Produkt- gewinnung" (auch als"in situ Product Recovery", oder "ISPR") angedeutet werden. Die Anwendung von ISPR ist z. B. beschrieben in Publikationen von M. Gerigk et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 25 (2002) 43-52, und von D. Maass et al., Bioprocess Biosyst. Eng. (im Druck).

In WO/66253 ist ein Verfahren zur integrierten reak- tivextraktiven Abtrennung von in einem wässrigen Bio- prozessgemisch vorhandenen stickstoffhaltigen organi- schen Substanzen beschrieben, wobei man bestimmte

Extraktionsmittel, die zumindest teilweise längerketti- ge organische Verbindungen und wenigstens einen flüssi- gen Kationentauscher als Reaktivcarrier enthalten, ein- setzt und wobei die Extraktion in Hohlfaserkontaktoren über wenigstens eine poröse Membran, die entweder von dem wässrigen Gemisch oder dem Extraktionsmittel be- netzbar ist, geschieht. Die Funktion der Membran ist dabei, ein dispersionsfreies Extraktionsverfahren zu ermöglichen, so dass nur ein Stoffaustausch der stick- stoffhaltigen organischen Substanzen mittels Diffusion (maximal im Rahmen der Löslichkeit der organischen Pha- se und des Carriers) über die Membran-stabilisierte Phasengrenzfläche stattfindet. Zugleich sollte dabei der Eintrag der organischen Phase in das wässrige Bio- prozessgemisch prinzipiell vermieden werden, da dies zu einer Reduzierung der Aktivität des Biokatalysators (und/oder des Mikroorganismus) führen könnte. Beim Membranextraktionssystem findet also im Prinzip keine Vermischung der beiden Phasen (organische Extraktions- phase und wässriges Bioprozessgemisch) statt.

Bei der Wahl der Reaktivcarriersyteme gemäß WO/66253 werden trotzdem sehr hohe Erfordernisse an der Biokom- patibilität der Komponenten gestellt. Verwendet wurde bevorzugt das biokompatible Stoffsystem mit Kerosin als Lösungsmittel und Di-2-ethylhexyl-Phosphorsäure (D2EHPA) als Extraktionsmittel (Carrier). Der Carrier D2EHPA wurde dabei in einer zweiten Extraktionsstufe mit Schwefelsäure als Extraktionsmittel regeneriert.

Das L-Phenylalanin wurde in der Schwefelsäure aufkon- zentriert. Dies beschränkt die Möglichkeiten der Sys-

temwahl im allgemeinen auf Kombinationen von Kerosin und D2EHPA, bzw. mit Di-Nonyl-Naphthalen Sulfonsäure Estern (DNNSE).

Die Handhabung des membrangestützten Extraktionssystems hat sich aber in der Praxis, schon im Pilotmaßstab, als aufwendig erwiesen. Ein Scale-up bei Verwendung von Hohlfaserkontaktoren ist nur bedingt durchführbar, was z. B. durch die starke Druckabhängigkeit bedingt ist.

Sobald Druckschwankungen auftreten, können die Phasen leicht instabil werden, was zu einem Phasendurchbruch führen kann und zur Bildung von Emulsionen, wobei der Prozess beendet werden muss. Da weiterhin die Porosität der Membranen stets die maximale Austauschfläche be- stimmen, sind Stofftransport und Extraktionsleistung bei membrangestützter Reaktivextraktion ziemlich limi- tiert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur integrierten Abtrennung aus einem Biore- aktor von einer oder mehreren in einem wässrigen Bio- prozessgemisch vorhandenen organischen Substanzen, ent- haltend zumindest eine positiv geladene und/oder auf- ladbare stickstoffhaltige Gruppe mittels Reaktivextrak- tion, in wenigstens einem Schritt zur Verfügung zu stellen, das die oben genannten Nachteile nicht mehr aufweist.

Gelöst wird diese Aufgabe dadurch, dass zur Reaktivex- traktion mindestens eine Flüssig-Flüssig-Zentrifuge

verwendet wird und dass die organischen Substanzen aus dem Extraktionsmittel in eine wässrige Phase rückextra- hiert werden.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Abbildung einer Flüssig-Flüssig-Zentrifuge. Leichte (organische) und schwere (wässrige) Phase werden separat in die Zentri- fuge eingeführt und mit Hilfe eines Rotors intensiv in einem Mischbereich vermischt, wonach Trennung leichter und schwerer Phase in einem Trennbereich geschieht.

Leichte und schwere Phase werden separat abgeführt, d. h. die schwere Phase fließt an der Rotorwand über die äußere Wehrscheibe (die eine vom System abhängige Größe hat) ab ; die leichte Phase fließt innen über ein festes Wehr ab. Wehrscheiben, wie man sie in Flüssig-Flüssig- Zentrifugen verwenden kann, sind-im allgemeinen ver- stellbare oder in der Größe des zentralen Lochs wählba- re-Metallscheiben, die ein Loch in der Mitte haben, über dessen Größe der Abfluss der schweren Phase gere- gelt werden kann.

In Abbildung l ist : 1 einerseits Zufuhr des Bioprozessgemisches, anderer- seits des Extraktionsmittels 2 Mischbereich bzw. Extraktionsbereich 3 Trennbereich 4 Abfuhr der schweren Phase über die äußere Wehr- scheibe (7) 5 Abfuhr der leichten Phase über ein festes Wehr (8) 6 Rotationszylinder 7 die äußere Wehrscheibe 8 ein festes Wehr

9 Antriebswelle.

Die oben erwähnten Nachteile aus dem Stand der Technik werden bei der erfindungsgemäßen Ausführung des Verfah- rens gemäss Anspruch 1 überwunden, wobei die Unteran- sprüche 2 bis 14 das Verfahren weiter verbessern. Es hat sich erwiesen, dass beim Verfahren gemäss der Er- findung sowohl eine wesentlich höhere Leistung (verbes- serter Stofftransport) als auch eine verbesserte Hand- habung des Prozesses erreicht wird. Außerdem hat sich gezeigt, dass auf limitiertem Ausmaß erzielte Ergebnis- se einfach auf einen größeren, z. B. auf 300 L Ebene, Maßstab übertragbar sind. Bevorzugt werden aber nur die Lösungsmittel, die beim Schütteln mit wässriger Phase in einem Schüttelkolben keine starken Emulsionen for- men, da sonst die Wirkung der Flüssig-Flüssig- Zentrifuge (n) beeinträchtigt würde.

Im Sinne dieser Erfindung wird mit mindestens eine Flüssig-Flüssig-Zentrifuge"gemeint, dass man für die weitere Aufarbeitung des Bioprozessgemisches nicht not- wendigerweise weitere Flüssig-Flüssig-Zentrifugen zu verwenden hat. So kann z. B. der erste Extraktions- schritt (die"Hinextraktion") in zwei (oder sogar meh- rere) parallel geschalteten Flüssig-Flüssig-Zentrifugen ausgeführt werden. Dies kann kontinuierlich oder semi- kontinuierlich geschehen. Auch kann, wie später in die- ser Beschreibung besprochen, die Rückextraktion mit ei- ner oder mehreren Flüssig-Flüssig-Zentrifuge (n) ausge- führt werden. So könnte man eine zweite Flüssig- Flüssig-Zentrifuge (oder weitere Flüssig-Flüssig- Zentrifugen in parallel) nachschalten (zur Rückextrak-

tion) so bald sich-nach bestimmter Zeit-in der ers- ten Flüssig-Flüssig-Zentrifuge eine gute Beladung der organischen Phase eingestellt hat. Die Rückextraktion kann aber auch mit anderen Techniken durchgeführt wer- den, z. B. membrangestützt wie in WO/66253.

Erfindungsgemäß werden, bei der Hinextraktion, Extrak- tionsgut (d. h. das Bioprozessgemisch, z. B. eine Fer- mentationsbrühe, bzw. das Extraktionsmittel, z. B.

D2EHPA in Kerosin) in die Zentrifuge (siehe Abbildung 1) zugeführt (l). An der Außenseite des Rotors findet die Mischung der beiden Phasen, d. h. die Extraktion statt (2). Im Innenraum werden die Phasen im Zentrifu- galfeld separiert (3) + (6). Die schwere Phase verlässt die Zentrifuge außen (4), die leichte Phase innen (5).

Die optimale Trennung der beiden Phasen kann z. B. über die Größe der gewählten Wehrscheibe (n) (7) + (8) ge- währleistet werden.

Auch durch eine Veränderung des Volumenstroms kann die Verweilzeit in der Zentrifuge, d. h. die Kontaktzeit der Phasen, variiert werden. Außerdem wird durch Verände- rung der Drehzahl die Phasengrenzfläche beeinflusst, wie auch die Stärke des Zentrifugalfeldes die Trennung der wässrigen und organischen Phasen verändern kann.

Der erfindungsgemäße Prozess lässt sich durch Variation von Drehzahl und/oder Volumenströmen einfach regeln.

Beide sind einfache Optimierungsparameter, die frei ge- wählt werden können.

Darüber hinaus können auch bauart-bedingte Veränderun- gen an den Zentrifugen, Rotoren usw. angebracht werden

zur weiteren Optimierung des Prozesses. Zum Beispiel hat man bei den Rotoren die Wahl aus sogenannten"Low- Shear"oder"High-Shear"Rotoren. Auch können, bauart- bedingt, andere Separatoren, wie z. B. Tellerseparato- ren, mit gegeneinander drehenden Tellern oder mit sta- tischen Tellern, eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das zu der (ersten) Flüssig-Flüssig-Zentrifuge geleite- te Bioprozessgemisch zellfrei gemacht bevor es in diese Zentrifuge geleitet wird. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das zu der (ersten) Flüssig-Flüssig-Zentrifuge geleitete Bioprozessgemisch außerdem auch proteinfrei gemacht. Dabei entsteht eine zellfreie und biokatalysatorfreie Bioprozesslösung. Be- vorzugt als wässriges Bioprozessgemisch ist ein Fermen- tationsgemisch. Die Fermentationen können, je nach Art der Reaktion, aerob oder anaerob ablaufen und als Batch-, semi-kontinuierlicher oder kontinuierlicher Prozess betrieben werden.

Das erfindungsgemäße Prinzip der Flüssig-Flüssig- Zentrifugation kann sowohl bei der Hinextraktion (aus dem im Bioreaktor vorhandenem Medium) als auch bei der Rückextraktion, wobei die zu gewinnenden Substanzen wieder in eine wässrige Phase aufgenommen werden, vor- zugsweise in aufkonzentrierter Form, angewendet werden.

Insbesondere wird ein Verfahren verwendet, bei dem der ersten Flüssig-Flüssig-Zentrifuge ein weiterer Extrak- tionsschritt nachgeschaltet ist, wo die extrahierte Substanz aus dem ersten Extraktionsschritt in eine

wässrige Phase rückextrahiert wird. Es wird bevorzugt, dass der weitere Extraktionsschritt auch in einer Flüs- sig-Flüssig-Zentrifuge statt findet.

Bei der Rückextraktion in einer Flüssig-Flüssig- Zentrifuge werden die in der Hinextraktion beladene or- ganische Phase (Extraktionsmittel, z. B. D2EHPA in Ke- rosin, mit darin aufgenommene extrahierten Substanzen) einerseits, und die, z. B. mit Schwefelsäure auf nie- drigen pH gebrachte, wässrige Phase andererseits sepa- rat in eine Flüssig-Flüssig-Zentrifuge für die Zurück- extraktion zugeführt. Zur Illustration sei hier wieder auf Abbildung 1 hingewiesen. Die Zufuhr der organischen Phase und der wässrigen Phase geschieht bei (l). An der Außenseite des Rotors findet wiederum die Vermischung von beiden Phasen, d. h. die Rückextraktion, statt (2).

Auch bei der Rückextraktion werden die Phasen aufgrund der Zentrifugalkraft im Innenraum separiert (3) + (6), wonach die schwere Phase die Zentrifuge außen verlässt (4), und die leichte Phase innen (5). Die optimale Trennung der beiden Phasen wird auch bei der Rückex- traktion z. B. über die Größe der gewählten Wehrschei- be (n), (7) + (8), gewährleistet. Die Rückextraktion kann-wie oben schon erwähnt-aber auch mit anderen Techniken durchgeführt werden.

Im erfindungsgemäßen Prozess entspricht die Extrakti- onsleistung in der ersten Flüssig-Flüssig-Zentrifuge vorzugsweise wenigstens der Produktionsrate im Biopro- zess. Mit Extraktionsleistung in einem Extraktions- schritt (oder sogar in einem ganzen Prozess, wenn man den totalen Prozess der integrierten Abtrennung als

einen Extraktionsprozess andeutet) ist die extraktive Abtrennung einer Komponente pro Stunde in dem Extrakti- onsschritt (oder in dem ganzen Prozess) -aus dem Bio- prozessgemisch-gemeint. Die insgesamt abgeführte Men- ge kann in Mol angegeben werden. Mit Produktionsrate wird die pro Stunde in dem Bioprozess biokatalytisch produzierte Menge jener Komponente (in Mol) verstanden, die in dem Extraktionsschritt (oder in dem ganzen Pro- zess) extraktiv aus dem Bioprozessgemisch abgeführt werden kann.

Als Extraktionsmittel zur integrierten Extraktion von organischen Substanzen, die zumindest eine positiv ge- ladene und/oder aufladbare stickstoffhaltige Gruppe enthalten, aus einem Bioprozessgemisch werden vorzugs- weise die gleichen Extraktionsmittel eingesetzt wie in WO/66253. Das heißt, es wird zur Extraktion in der ers- ten Flüssig-Flüssig-Zentrifuge bevorzugt ein Extrakti- onsmittel eingesetzt, das zumindest teilweise länger- kettige organische Verbindungen und wenigstens einen flüssigen Kationentauscher enthält. Die zumindest teil- weise längerkettigen organischen Verbindungen haben bei den erfindungsgemäßen Verfahren die Funktion eines Lö- sungsmittels. Der flüssige Kationentauscher hat die Funktion eines Carriers.

Als längerkettige organische Verbindungen werden vor- zugsweise solche Verbindungen eingesetzt, die nur schwer mit Wasser mischbar oder nur schwer in Wasser lösbar sind und bei Temperaturen zwischen 10 und 60 °C, vorzugsweise zwischen 20 und 40 °C flüssig sind. Denk- bar sind hier verzweigte, unverzweigte, gesättigte, un-

gesättigte oder teilweise aromatische organische Ver- bindungen. Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare längerkettige organische Verbindungen sind Alkane, Al- kene oder Fettsäureester oder Gemische aus mehreren dieser Verbindungen. Insbesondere werden dabei als län- gerkettige organischen Verbindungen Alkane, Alkene oder Fettsäureester mit 6 bis 20 C-Atomen, vorzugsweise mit 12 bis 18 C-Atomen eingesetzt.

Als Alkane sind beispielsweise Hexan, Cyclohexan, De- can, Ethyl-Decan, Dodecan oder Gemische davon einsetz- bar. Besonders bevorzugt ist Kerosin. Als Alkene sind z. B. Hexen, Nonen, Decen, Dodecen oder Gemische davon einsetzbar. Als Fettsäureester sind insbesondere Al- kylstearate mit Alkylgruppen mit mehr als 2 C-Atomen einsetzbar. Beispiele für Fettsäureester sind Ethylstearat, Butylstearat, Isopropylstearat, Ethyl- Palmitat oder Butyl-Linoleat. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Kerosin oder Butylstearat. Zwei oder mehr der genannten organischen Verbindungen können auch in Form von Gemischen zum Einsatz kommen.

Als flüssigen Kationentauscher werden insbesondere Es- ter aus anorganischen Säuren und organischen Resten, die vorzugsweise verzweigt sind, eingesetzt. Zu den an- organischen Säuren zählen vorzugsweise Phosphorsäure, phosphorige Säure, Schwefelsäure und schweflige Säure.

Mehr spezifisch werden als flüssiger Kationentauscher bevorzugt Ester aus Phosphorsäure, phosphoriger Säure, Schwefelsäure oder schwefliger Säure eingesetzt. Ganz besonders bevorzugt sind Ester aus Phosphorsäure. Die erfindungsgemäß verwendeten organischen Reste sind vor-

zugsweise verzweigte und/oder unverzweigte Alkyl-oder Alkenyl-Gruppen mit wenigstens 4 C-Atomen, vorzugsweise 4 bis 20 C-Atomen. Zu den bevorzugten flüssigen Kat- ionentauschern zählen Di-2-Ethyl-Hexyl-Phosphorsäure- Ester, Mono-2-Ethyl-Hexyl-Phosphorsäure-Ester, Di- Nonyl-Naphthalen-Sulfonsäure-Ester oder Gemische hier- von. Am meisten bevorzugt als flüssigen Kationentau- scher sind Di-2-Ethyl-Hexyl-Phosphorsäure-Ester, Mono- 2-Ethyl-Hexyl-Phosphorsäure-Ester, Di-Nonyl-Naphthalen- Sulfonsäure-Ester oder Gemische hiervon. Erfindungsge- mäß am meisten bevorzugt ist das Gemisch aus Di-2- Ethyl-Hexyl-Phosphorsäure-Ester und Mono-2-Ethyl-Hexyl- Phosphorsäure-Ester.

In der ersten Flüssig-Flüssig-Zentrifuge beträgt die Menge an flüssigem Kationentauscher, bezogen auf die Menge an längerkettigen organischen Verbindungen im allgemeinen 2 bis 25 Gew. %, vorzugsweise 5 bis 20 Gew. %, besonders bevorzugt 8 bis 15 Gew. %.

Zu den extrahierbaren Substanzen zählen beispielsweise L-Aminosäuren, aber auch D-Aminosäuren können erfin- dungsgemäß in einem integrierten Verfahren abgetrennt werden. Grundsätzlich sind sowohl natürliche als auch nicht natürliche Aminosäuren extrahierbar. Denkbar sind alle D-und L-Formen essentieller Aminosäuren. Beispie- le für extrahierbare Aminosäuren sind L-Phenylalanin, D-Phenylalanin, L-Tryptophan, D-Tryptophan, L-Tyrosin, D-Tyrosin, D-p-Hydroxy-Phenylglycin, D-Phenylglycin, Di-Hydroxy-Phenylalanin. Auch können aromatische ß-Aminosäuren abgetrennt werden, wie z. B. ß-Phenyl- alanin oder ß-Tyrosin. Weiterhin sind mit dem erfin-

dungsgemäßen Verfahren Lactame extrahierbar. Hierzu zählen u. a. auch ß-Lactame, z. B. Caprolactam.

Ferner können erfindungsgemäß auch Peptide, insbesonde- re aber Di-oder Oligopeptide extrahiert werden. Hierzu zählt beispielsweise L-Aspartyl-L-Phenylalanin als Vor- läufermolekül für die Herstellung von Aspartam. Extra- hierbar sind auch Aminoalkohole, z. B. lS, 2R-cis- (-)- Aminoindanol, und (Amino) Cyclitolen. Die erfindungsge- mäße Extraktion ist außerdem anwendbar für die Gewin- nung von Aminen oder Amiden.

Das Bioprozessgemisch enthält vorzugsweise organische Substanzen ausgewählt aus der Gruppe aliphatischer und/oder aromatischer Aminosäuren und/oder Lactame, de- ren Salze, Derivate oder Di-oder Oligopeptide oder Ge- mische dieser Verbindungen, welche erfindungsgemäß aus dem Bioprozessgemisch extrahiert werden.

Das Extraktionsmittel kann erfindungsgemäß neben den genannten Verbindungen auch weitere Substanzen enthal- ten. Hierzu zählen auch nach dem Stand der Technik be- kannte Extraktionsmittel.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur integrierten Abtren- nung aus einem Bioreaktor von einer oder mehreren in einem wässrigen Bioprozessgemisch vorhandenen organi- schen Substanzen enthaltend zumindest eine positiv ge- ladene und/oder aufladbare stickstoffhaltige Gruppe mittels Reaktivextraktion in wenigstens einem Schritt wird vorzugsweise kontinuierlich betrieben. In dieser

bevorzugten kontinuierlichen Ausführungsform wird (a) wässriges Bioprozessgemisch kontinuierlich aus dem Bioreaktor entnommen, und (b) mit einem Extraktionsmittel in eine Flüssig- Flüssig-Zentrifuge geführt, und (c) dort mittels eines Extraktionsmittels extrahiert, wobei eine organische Phase bekommen wird, die die aus dem Bioprozessgemisch zu extrahierende Substanz enthält, und (d) das erhaltene wässrige Retentat in den Bioreaktor zurückgeführt.

In Schritt (a) kann statt des wässrigen Bioprozessgemi- sches selbstverständlich auch jedes andere in einem (Bio) -Reaktor entstehende Reaktionsgemisch verwendet werden, in dem organische Substanzen mit zumindest ei- ner positiv geladenen und/oder aufladbaren stickstoff- haltigen Gruppe enthalten sind. Beispiele solcher Sub- stanzen sind oben bereits angedeutet.

Ein sehr bevorzugtes Einsatzgebiet des erfindungsge- mäßen Verfahrens ist die Extraktion aus Fermentations- lösungen, Abwässern und/oder wässrigen Gemischen chemi- scher Synthese-und/oder Degradationsprozesse. Insbe- sondere lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren in Fermentationsprozesse integrieren. Die Fermentations- prozesse können aerob oder anaerob ablaufen und als batch-, semi-kontinuierliche oder kontinuierliche Pro- zesse betrieben werden.

Die organischen Substanzen werden dabei erfindungsgemäß bevorzugt aus dem Extraktionsmittel in eine wässrige

Phase rückextrahiert. Insbesondere wird dazu, in einem weiteren Verfahrensschritt (e) die organische Phase aus (c) in einem geschlossenen Kreislauf mit einer wässri- gen Akzeptorphase in Kontakt gebracht und rück- extrahiert.

Als wässrige Akzeptorphase kommen generell zur Entla- dung der Carrier alle geeigneten Protonendonatoren in Frage, z. B. H+ aus Schwefelsäure. In Schritt (e) kann statt Schwefelsäure selbstverständlich auch jede andere starke Säure verwendet werden. Beispiele sind ferner Ammoniumsulphat, Salzsäure und Phosphorsäure.

Bevorzugt findet der Kontakt mit der wässrigen Akzep- torphase in einer Flüssig-Flüssig-Zentrifuge statt, und die dabei erhaltene abgereicherte organische Phase wird kontinuierlich oder semi-kontinuierlich in die Zentri- fuge aus Schritt (b) zurückgeführt.

Mit noch mehr Vorzug wird das wässrige Bioprozessge- misch in Stufe (a) in einem weiteren Schritt [al] über einen Bypass mit Ultrafiltrationsmodul (Trennwert unge- fähr 500 kDa) unter Rückführung des Zellmaterials in den Bioreaktor, zellfrei gemacht. Es wird ein zellfrei- es Permeat erhalten, das zu Schritt (b) geführt wird.

In einem weiteren bevorzugten Vorgang [a2] wird das zellfreie Permeat über eine Membrankassette im Nano- Bereich (Trennwert ungefähr 10 kDa bis 50 kDa)], pro- teinfrei gemacht, unter Rückführung des proteinhaltigen Teils des zellfreien Permeats in den Bioreaktor, wobei das erhaltene zellfreie und proteinfreie Permeat mit

dem Extraktionsmittel zu Schritt (b) in die erste Flüs- sig-Flüssig-Zentrifuge geführt wird.

Die besten Ausbeuten des erfindungsgemäßen Prozesses werden bekommen, wenn man in den Stufen (d) und (e) ei- ne vollständige Rückführung des wässrigen Retentats in den Bioreaktor durchführt. Insgesamt findet dann eine vollständige Rückführung des wässrigen Retentats in den Bioreaktor statt.

Es ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, dass die Rückextraktion unter gleichzeiti- ger Aufkonzentrierung der organischen Substanzen er- folgt. Am meisten bevorzugt erfolgt das erfindungsge- mäße Verfahren kontinuierlich und simultan zu einer in dem Bioreaktor ablaufenden Reaktion, wobei die Extrak- tionsleistung des gesamten Prozesses mindestens der Produktionsrate im Bioreaktor gleicht. Es wird vorzugs- weise aus Fermentationslösungen extrahiert.

Das erfindungsgemäße Verfahren für eine integrierte Ab- trennung von Substanzen aus einem Bioprozessgemisch kann aber im Prinzip auch verwendet werden für eine in- tegrierte Abtrennung von Substanzen aus anderen Prozes- sen als biokatalytischen Prozessen. In dem Fall spricht man, statt vom Bioreaktor (oder Fermentationsreaktor, oder Fermenter), besser von einem Behälter, in dem eine Reaktion abläuft, aus der man kontinuierlich eine Sub- stanz abtrennen möchte. Im allgemeinen wird ein derar- tiger Behälter jedoch meistens als Bioreaktor bezeich- net werden.

Gegenüber der Arbeit mit Hohlfaserkontaktoren sind Handhabung und Scale-up bei Verwendung von Flüssig- Flüssig-Zentrifugen vereinfacht. Nach dem Anfahren läuft das System stabil, selbst wenn zeitweise keine Zufuhr von leichter oder schwerer Phase stattfindet.

Phaseninstabilität aufgrund von Druckunterschieden ist somit kein Problem. Die Phasengrenzfläche und damit der Stofftransfer sind in diesem System ebenfalls erhöht.

Eine solche integrierte Verwendung von Flüssig-Flüssig- Zentrifugen in einem Fermentationsprozess während der Fermentation ist neu. Flüssig-Flüssig-Zentrifugen sind zwar schon seit langem bekannt und kommerziell zu kau- fen, z. B. bei der CINC Deutschland GmbH, Brakel, Deutschland. CINC Deutschland ist eine Tochtergesell- schaft von Costner Industries Nevada Corporation, USA.

Es sei bemerkt, dass Likidis und Schügerl (Biotech. & Bioeng., Vol. 30, Seite 1032-1040,1987 ; DE-A-3729338) Flüssig-Flüssig-Zentrifugen zwar mit Erfolg eingesetzt haben, bei der Aufarbeitung von Bioprozessgemischen nach Beendung der Fermentation, insbesondere zur Gewin- nung von Penizillin, doch wurden dabei immer toxische Extraktionsmittel eingesetzt und die verwendeten Bioka- talysatoren kamen nie in Kontakt mit den bei der Ex- traktion verwendeten Extraktionsmitteln. Außerdem wur- den die von Likidis und Schügerl extrahierten Substan- zen immer durch Reaktion mit einer Carboxylgruppe aus dem Medium abgetrennt. Es gibt in genannten Publikatio- nen keinen Hinweis, dass man Flüssig-Flüssig-Zentri- fugen auch in einer integrierten Verfahrensweise bei Fermentationsprozessen verwenden könnte. Extraktionen

über verschiedene flüssige Membranen (Flüssig-Emulsion- Membrane) sind bei Thien, M. P., et al. (Biotechnol Bi- oeng. 1998,32 : 604-615) beschrieben, können jedoch nicht unter Bedingungen mit hohem shear-stress" ; wie bei Verwendung von Zentrifugen, eingesetzt werden.

Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass beim erfindungsgemäßen Verfahren zur in Fermentations- prozessen integrierten Reaktivextraktion unter Verwen- dung mindestens einer Flüssig-Flüssig-Zentrifuge, sehr hohe Ausbeuten an extrahierten Substanzen möglich sind.

So hat es sich als möglich erwiesen in der Akzeptorpha- se L-Phenylalanin in Konzentrationen im Bereich von bis zu ungefähr 80 g/1 zu gewinnen, und wahrscheinlich wer- den sogar noch höhere Konzentrationen ermöglicht.

Im Prinzip ermöglicht die jetzige Erfindung also auch das Arbeiten mit geringeren Mengen an Carrier als zuvor im Stand der Technik üblich war.

Im folgenden wird mit Hilfe der Abbildung 2 die Anwen- dung des erfindungsgemäßen Verfahrens anhand eines in- tegrierten Fermentationsprozesses, z. B. zur Produktion von L-Phenylalanin, näher erläutert : Abbildung 2 zeigt einen Bioreaktor (3) in dem eine fer- mentative Produktion von L-Phenylalanin erfolgt. An diesen Bioreaktor (Fermenter) ist ein Bypass mit Ultra- filtrationsmodul (UF I ; 500 kDa) angeschlossen (5), durch den die Fermentationsbrühe während des Prozesses gepumpt wird, um zellfreies Permeat zu gewinnen. Das zellfreie Permeat wird dabei in ein Vorratsgefäß ge-

pumpt. Von dort wird das zellfreie Permeat im Kreis durch eine zweite Ultrafiltrationseinheit (UF II ; 10 kDa) gefördert (6), um die im Permeat anwesenden Pro- teine abzutrennen. Das so erhaltene zell-und protein- freie Permeat wird in eine erste Flüssig-Flüssig- Zentrifuge (1) gepumpt zur Extraktion des L-Phenyl- alanins mit dem Extraktionsmittel, z. B. D2EHPA in Ke- rosin. Nach Extraktion und Phasentrennung wird das Raf- finat in den Fermenter zurückgeführt. Die organische Phase (z. B. D2EHPA in Kerosin) wird im Kreis geführt (4), und in der zweiten Flüssig-Flüssig-Zentrifuge (2) findet die Rückextraktion mit z. B. Schwefelsäure statt. Das L-Phenylalanin wird dabei in der wässrigen Phase aufkonzentriert. Extraktionsmittel und/oder Pro- tonendonator können über (7) zugeführt werden (bzw. wird das beladene Extraktionsmittel mit aufkonzentrier- ter extrahierten Substanz zur Gewinnung der Substanz abgeführt).

In Abbildung 2 ist, anders formuliert : 1 eine erste Flüssig-Flüssig-Zentrifuge mit Zufuhr des zell-und proteinfreien Bioprozessgemisches, und des Extraktionsmittels, bzw. Abfuhr des abge- reicherten Bioprozessgemisches, und des beladenen Extraktionsmittels, 2 eine zweite Flüssig-Flüssig-Zentrifuge mit Zufuhr des beladenen Extraktionsmittels und Dosierung vom Protonendonator aus (7), bzw. Abfuhr des weiter zu beladenden Extraktionsmittels zu (1), bzw. des be- ladenen Extraktionsmittels zur Gewinnung von der aufkonzentrierten Substanz, 3 Bioreaktor,

4 Kreislauf der organischen Phase, 5 Ultrafiltrationsmodul (UF I ; Trennwert ungefähr 500 kDa), 6 Ultrafiltrationseinheit (UF II ; 10 kDa ; Nano- Bereich, Trennwert ungefähr 10 kDa), 7 Zu-und Abfuhr Extraktionsmittel und/oder Protonen- donator, M Antrieb.

Die Erfindung wird jetzt anhand eines Beispiels und ei- niger Vergleichsbeispiele näher erläutert.

Im vorliegenden Beispiel wurde dabei in einer Aufstel- lung gemäss Abbildung 2, mit einem Bioreaktor mit 10 L Fermentationsvolumen (batch), und einem Bypass-Volumen von ungefähr 1.2 L gearbeitet. Ultrafiltrationsmodul I (Schleicher und Schüll GmbH, Dassel, Deutschland ; ein Hohlfaserfiltrationsmodul) hatte einen Trennwert von 500 kDa. Ultrafiltrationsmodul II (ebenfalls Schleicher und Schüll GmbH, Dassel, Deutschland) hatte einen Trennwert von 10 kDa, und bestand aus fünf Kassettenmo- dulen. Als Extraktionsmittel für die Hinextraktion wur- de D2EHPA (Merck) in Kerosin (Fluka) verwendet.

Beispiel I (fermentative L-Phenylalaninbereitung) In dem Bioreaktor (Fermenter) wurde eine Fermentation mit integrierter Extraktion durchgeführt. Die Fermenta- tion wurde im Batch-Verfahren gestartet. Während der Wachstumsphase der Zellen (eines L-Phenylalanin produ-

zierenden tyrosinauxotrophen E. coli Stammes) wurde, nach ca. 6 Stunden, die Produktion induziert und der Ammoniak-, Glucose-und Tyrosin-Feed gestartet. Die Wachstumsphase wurde nach insgesamt ca. 14 Stunden durch Tyrosinlimitierung der E. coli beendet. Nach ins- gesamt ungefähr 22 Stunden waren im Medium etwa 15 g/L L-Phenylalanin, das heisst eine signifikante L-Phenyl- alaninkonzentration, vorhanden bei guter Bildungsrate.

Zu diesem Zeitpunkt wurde der Prozess zur Gewinnung von zell-und proteinfreiem Permeat und anschließend die Extraktion gestartet.

Die für den Fed-Batch-Fermentationsprozess und die in- tegrierte Reaktivextraktion verwendeten Extraktionspa- rameter der Flüssig-Flüssig-Zentrifugen waren wie folgt : Erste Flüssig-Flüssig-Zentrifuge : - Schwere Phase : Fermentationsbrühe mit L-Phenylalanin, Volumenstrom : 2.4 L/h - Leichte Phase : 10 %-ige Lösung von D2EHPA in Kerosin, Volumenstrom : 3.36 L/h Zweite Flüssig-Flüssig-Zentrifuge - Schwere Phase : 1 M Schwefelsäure, Volumen- strom : 1.5 L/h - Leichte Phase : 10 %-ige Lösung von D2EHPA in Kerosin, Volumenstrom : 3.36 L/h Die Extraktion erfolgte für ca. 18 Stunden, d. h. bis Prozessstunde 40, wo der Prozess abgebrochen wurde. Das

Extraktionssystem erwies sich bei Zufuhr von protein- freiem Medium stabil. Ein negativer Effekt der Extrak- tion, beispielsweise durch den Eintrag von Kerosin oder D2EHPA, auf den Fermentationsprozess konnte nicht fest- gestellt werden.

Die L-Phenylalanin-Konzentration im Bioreaktor nahm in diesem Beispiel I zu bis die Reaktivextraktion gestar- tet wurde, und blieb weiter während der integrierten Extraktion bei ungefähr 12-15 g/L konstant. Die L-Phe- nylalanin-Konzentration am Ausgang der ersten Zentrifu- ge nach der Extraktion lag stets bei ungefähr 7 g/L.

Der L-Phenylalaningehalt in der Schwefelsäure stieg zwischen Stunde 22 und 40 fast linear von Null bis auf ungefähr 59 g/L an, das heißt nach 18 Stunden Extrak- tionsdauer. Eine starke Aufkonzentrierung der L-Phenyl- alanin-Konzentration konnte also erreicht werden.

Die in diesem Beispiel theoretisch erreichte L-Phenyl- alanin-Konzentration kann berechnet werden, in dem man die L-Phenylalanin-Konzentrationen im Bioreaktor und in der wässrigen Schwefelsäure, bezogen auf das tatsächli- che Fermentationsvolumen, addiert. Damit wäre in diesem Beispiel eine theoretische Endkonzentration an L-Phe- nylalanin von 52 g/L erreicht.

Vergleichsbeispiel A Bei einer vergleichsweise wie in Beispiel I durchge- führten Fermentation mit im übrigem gleichen Fermenta- tionsbedingungen (Menge und Aktivität der E. coli Zel-

len, usw. ), aber ohne integrierte Extraktion, das heißt es wurde nur ein Bioreaktor und keine Extraktionsappa- ratur verwendet, lag die theoretische Endkonzentration an L-Phenylalanin bei 31 g/L.

Vergleichsbeispiel B Bei einer weiteren vergleichsweise durchgeführten Fer- mentation mit im übrigem gleichen Fermentationsbedin- gungen (Menge und Aktivität der E. coli Zellen, usw.), aber mit integrierter Extraktion über Hohlfaserkontak- toren mit Membranen gemäss WO/66253 lag die theoreti- sche Endkonzentration an L-Phenylalanin bei ungefähr 30 g/L.

Beim erfindungsgemäßen integrierten Verfahren mit Flüs- sig-Flüssig-Zentrifugen, konnte also eine weitaus höhe- re Endkonzentration an L-Phenylalanin erreicht werden als in den Vergleichsbeispielen.

Beim erfindungsgemäßen integrierten Verfahren mit Flüs- sig-Flüssig-Zentrifugen hat es sich außerdem als mög- lich erwiesen, die L-Phenylalanin-Produktion über einen längeren Zeitraum, von mindestens 50 Stunden Fermenta- tionsdauer aufrecht zu erhalten, ohne dass im Bioreak- tor eine Inhibierung auftritt.

Die Produktbildungsrate an L-Phenylalanin liegt bis zum Ende der 50-Stundenperiode klar oberhalb 0.03 g/ (g*h).

Dagegen sinkt die vergleichbare Produktbildungsrate bei

einer Standardfermentation ohne integrierte Abtrennung von L-Phenylalanin über Flüssig-Flüssig-Zentrifugen bis auf Null bei einer Prozessdauer von 36 Stunden, und bei einer Standardfermentation mit integrierter Abtrennung von L-Phenylalanin über membrangestützte Extraktion ge- mäss WO/66253 bis auf 0.02 g/ (g*h) bei einer Prozess- dauer von 36 Stunden.

In Beispiel I gemäß dem erfindungsgemäßen Prozess der integrierten Produktabtrennung über Flüssig-Flüssig- Zentrifugen stieg die Produkt-Bildungsrate mit der Fer- mentationsdauer an und erreichte ein Maximum kurz nach dem Start der Extraktion des L-Phenylalanins. Ungefähr gleichzeitig erreichte auch die Extraktionsrate ein Ma- ximum. Die Extraktionsrate blieb im weiteren Verlauf bis zur Abschaltung der Extraktion auf einem Niveau zwischen 1,1 g/ (L*h) und 1,7 g/ (L*h). Die volumetrische Produktbildung verhielt sich vergleichbar und nahm nach Abschaltung der Fermentation nur leicht ab. Durch die annähernd gleich großen Produktions-und Extraktionsra- ten wurde eine starke L-Phenylalanin-Akkumulation im Bioreaktor überraschenderweise weitgehend unterdrückt.

Im wesentlichen blieb die Konzentration an L-Phenyl- alanin im Bioreaktor im Bereich von 12 bis 15 g/L kon- stant.

Die integrale Produkt-Substrat-Ausbeute in Beispiel I wurde berechnet als 24 % am Ende der Fermentation. Das heißt, es wurde eine Verbesserung um 6,5 % gefunden im Vergleich zu einer Fermentation ohne Reaktivextraktion mit Flüssig-Flüssig-Zentrifugen (mit einer Ausbeute von

17,5 %). Bei membrangestützter Reaktivextraktion wurde dahingegen nur eine Verbesserung um 5 % gefunden im Vergleich zu einer Fermentation ohne membrangestützte Reaktivextraktion mit einer Ausbeute von 15,3 %.