La présente invention a pour objet un nouveau complexe isolé comprenant une protéine NNT-1 et en outre au moins une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRa ainsi que des anticorps dirigés spécifiquement contre ledit complexe. L'invention comprend également une composition comprenant ledit complexe comme médicament pour la prévention et/ou le traitement de maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington, pour la maintenance de la masse musculaire chez les paralysés, pour le traitement de l'obésité ou du cancer.

La famille des cytokines de type IL-6 comprend 1'IL-6, l'IL-11, le facteur d'inhibition de la leucémie LIF (pour « Leukemia Inhibitory Factor »), I'oncostatine M OSM, le facteur neurotrophique ciliaire CNTF (pour « Ciliary NeuroTrophic Factor »), la cardiotrophine-1 CT-1 ainsi que la neurotrophine-1 NNT-1 aussi dénommée BSF-3 (pour « B cell Stimulatory Factor 3 ») ou CLC (pour « Cardiotrophin-Like Cytokine ») (Taga, T. et al., Annu. Rev. Immunol. 15 : 797-819, 1997 ; Senaldi, G., et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. 96 : 11458-11463, 1999 ; Shi, Y. et al., Biochem. Biophys. Res.

Commun. 262 : 132-138, 1999). Toutes ces cytokines utilisent, comme chaîne de récepteur impliquée dans la transduction du signal, la glycoprotéine gpl30. Les cytokines LIF, OSM, CNTF, CT-1 et NNT-1 partagent une deuxième sous-unité de récepteur impliquée dans la transduction du signal à l'intérieur de la cellule, la chaîne du récepteur à LIF : LIFR (3 (Senaldi, G., et al., 1999 ; Heinrich, P. C., et al., Biochem. J., 334 : 297-314, 1998). II a été décrit que les cytokines IL-6, IL-11, CNTF et CT-1 utilisent encore une chaîne a non impliquée dans la transduction du signal qui forme un complexe à haute affinité avec gpl30 et/ou LIFR (3. Des formes solubles des chaînes a des récepteurs pour IL-6, IL-11 et CNTF peuvent agir comme agoniste sur les cytokines correspondantes ce qui implique que des complexes formés entre ces chaînes a et les cytokines peuvent stimuler toute cellule exprimant gpl30 (pour IL-6 et IL-11) ou la combinaison de gpl30 et LIFR (pour CNTF) (Davis, S., et al., Science 259 : 1736-1739, 1993). C'est pourquoi ces cytokines ont des fonctions redondantes et des effets pléiotropiques sur le système immunitaire, hématopoïétique, nerveux central et

reproductif (Taga, T. et al., Annu. Rev. Immunol. 15 : 797-819, 1997). Elles jouent aussi un rôle dans le contrôle de la fonction du foie et la résorption osseuse (Taga, T. et al., Annu. Rev. Immunol. 15 : 797-819, 1997). Des effets sur la croissance tumorale ont aussi été reportés, l'IL-6 étant un facteur impliqué dans la croissance autocrine de myélomes et l'OS (oncostatine) un facteur de croissance autocrine des sarcomes de Kaposi par ailleurs capable d'inhiber la croissance de cellules de mélanomes. Des effets sur l'angiogénèse ont aussi été décrits (Van Damme, J., et al., J. Exp. Med. 165 : 914-919, 1987 ; Nordan, R. P. et al., Science 233 : 566-569, 1986 ; Kawano, M., et al., Nature 332 : 83-85, 1988 ; Malik, N., et al., Mol. Cell. Biol. 9 : 2847-2853, 1989 ; Nair, B. C., et al., Science 255 : 1430-1432, 1992 ; Miles, S. A., et al., Science 255 : 1432-1434, 1992 ; Pepper, M. S., et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 213 : 31-67, 1996).

Le facteur de cytokine 1 dénommé CLF-1 (pour « Cytokine-Like Factor-1 ») a été identifié comme une protéine ayant une homologie avec gpl30 et les chaînes a des récepteurs pour la famille des cytokines proches de l'IL-6. Il a été proposé que CLF-1 agisse comme une chaîne a classique de cette famille ou qu'il participe à une molécule de type IL-12 (Elson, G. C., et al., J. Immunol. 161 : 1371-1379, 1998). L'IL-12 est une cytokine hétérodimérique comprenant deux chaînes polypeptidiques, p35 et p40. Les deux sous-unités de l'IL-12 sont les produits de deux gènes indépendants. Les sous- unités p35 et p40 sont homologues, respectivement, à des membres de la famille IL-6 et à des récepteurs aux cytokines. Les deux chaînes du récepteur à l'IL-12 impliquées dans la transduction du signal (IL-12R l et IL-12R (32) sont elles homologues à gpl30. Le système IL-12/IL-12R est donc proche du système cytokine de la famille IL-6/gpl30 plus LIFR .

La production de l'IL-12 est contrôlée de manière originale. Lorsqu'elle est exprimée seule, la sous-unité p35 n'est sécrétée qu'en très faible quantité. Elle n'est relâchée par les cellules qu'en présence de la sous-unité p40. La synthèse de cette chaîne est donc absolument requise pour la production de l'IL-12. A la différence de p35, p40 exprimée seule est sécrétée sous forme d'un homodimère capable de lier le récepteur et qui a un effet antagoniste (Trinchieri, G., Annu. Rev. Immunol., 13 : 251-276, 1995).

Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence la production d'homodimères de CLF-1 par des cellules transfectées par 1'ADNc correspondant. Cette

observation est compatible avec l'hypothèse que CLF-1 est impliquée dans une cytokine multimérique de type IL-12 (Elson, G. C., et al., J. Immunol. 161 : 1371-1379, 1998).

Depuis la comparaison des phénotypes des souris pour lesquelles les gènes codant pour le CNTF ou la chaîne a de son récepteur, 1'existence d'un deuxième ligand pour CNTFRa a été spéculée. Ce ligand est généralement appelé CNTF-2 et serait important pour le développement. En effet, les souris déficientes pour CNTF ne sont que peu affectées dans leur phénotype et uniquement à l'âge adulte (Masu, Y., et al., Nature 365 : 27-32, 1993). De même, il existe des populations humaines homozygotes pour des mutations inactivant CNTF qui sont totalement asymptomatiques (DeChiara, T. M., et al., Cell. 83 : 313-322, 1995). A l'opposé de ces observations sur le rôle du CNTF, les souris sans CNTFRa sont incapables de téter, meurent peu après la naissance et ont une perte dramatique dans la population de neurones moteurs (Yssel, H., et al., J. Immunol.

Methods 72 : 219-227, 1984).

On recherche aussi de nouvelles cytokines capables de se lier aux récepteurs LIFR et/ou gpl30 et ainsi capables de stimuler les cellules exprimant ces récepteurs.

Ainsi, il reste aujourd'hui un grand besoin d'isoler et d'identifier un nouveau ligand spécifique du récepteur CNTFRa, tout comme de nouveaux ligands spécifiques des récepteurs LIFR et/ou gpl30. De tels ligands seraient en effet susceptibles d'avoir un rôle important en particulier dans le développement du système nerveux central, dans la survie des neurones centraux et périphériques ainsi que dans la fonction neuromusculaire. Ceci est justement l'objet de la présente invention.

Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante que la sécrétion de la cytokine NNT-1 de la famille IL-6 est dépendante de la co-expression de CLF-1 et que NNT-1 et CLF-1 forment un complexe capable de stimuler la prolifération des cellules via un récepteur comprenant les sous-unités CNTFRa, gpl30 et LIFR .

Lors de cette mise en évidence, il a aussi été constaté de manière surprenante la formation des complexes NNT-1/sCNTFRa et NNT-1/CLF-1/sCNTFRa ; sCNTFRa désignant la chaîne a du récepteur au CNTFR sous forme soluble, agoniste pour CNTF (Davis, S., et al., Science 259 : 1736-1739, 1993).

Ces complexes peuvent agir sur toutes les cellules exprimant LIFR et gpl30, et donc avoir des effets sur l'ensemble des systèmes dont les cellules expriment LIER ? et

gpl30, tels que le système immunitaire, hématopoïétique, nerveux, reproductif ainsi que sur le foie, les os et les muscles squelettiques.

La présente invention a ainsi pour objet principal un complexe isolé comprenant une protéine NNT-1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRa.

La présente invention a ainsi notamment pour objet un complexe isolé, dénommé également CNTF2, caractérisé en ce qu'il comprend une protéine NNT-1 et une protéine CLF-1. L'invention concerne encore le complexe comprenant les protéines NNT-1 et sCNTFRa et le complexe comprenant les protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFRa.

Par « protéine », on entend désigner également les termes de peptide ou polypeptide, ces 3 termes étant utilisés indifféremment dans la présente description.

Dans la présente description, en particulier dans les revendications, sauf mention particulière, on entendra désigner par « protéine NNT-1 » la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et ses protéines dérivées telles que définies ci-après ; par « protéine CLF-1 » la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et leurs protéines dérivées telles que définies ci-après et par « protéine soluble sCNTFRa » la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7 et ses protéines dérivées telles que définies ci-après.

Par « protéine dérivée » de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, on entend désigner dans la présente description toute protéine dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2, capable de former un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7.

Parmi ces protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 2, on préfère notamment les protéines formant un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFR .

Par activité biologique du récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFRp, on entend désigner en particulier celle mesurée par des techniques standards ci-après décrites dans les exemples comme la phosphorylation en tyrosine de gpl30 et LIFR des

cellules BAF/3 et SK-N-MC exprimant les sous-unités CNTFRa, gpl30 et LIFRP ou leur prolifération cellulaire.

Parmi ces protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 2, on préfère aussi les protéines formant un complexe avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur complexe gp 130/LIFR .

Par activité biologique du récepteur complexe gpl30/LIFRp, on entend désigner en particulier celle mesurée par des techniques standards ci-après décrites dans les exemples comme la prolifération des cellules BAF3 transfectées par les ADNc codant pour gpl30 et LIFR . D'autres techniques utilisables se basent sur la prolifération des cellules TF-1, la production d'IL-6 par les cellules KB ou encore la phosphorylation de STAT-3 dans les cellules HEP62.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 2, on préfère tout particulièrement les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 2 et formant un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, l'activité biologique dudit complexe étant au moins de 50 %, de préférence 60 % ou 80 % de celle mesurée pour le complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7 dans les exemples ci-après.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 2, on préfère également les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 2 et formant un complexe avec la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, ledit complexe étant capable d'inhiber l'activité biologique du complexe obtenu avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7.

En effet, de tels complexes, en tant qu'inhibiteurs compétitifs du complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et/ou avec la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, pourront être utilisés pour moduler, en particulier diminuer, l'activité biologique

du récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFRp ou du récepteur gpl30/LIFRp, en particulier la survie, la croissance ou la prolifération de cellules exprimant ledit récepteur complexe, notamment tumorales.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 2, on préfère notamment les protéines dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 2 ou avec l'un de ses fragments, et comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 2.

Ainsi, lesdites protéines dérivées de la protéine NNT-1 dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, avec la séquence SEQ ID No. 2 ou avec l'un de ses fragments, pourront ainsi comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparée à la protéine sauvage NNT- 1 de séquence SEQ ID No. 2.

Par substitution conservatrice, on entend désigner toute substitution d'acide aminé n'induisant que peu ou pas d'effet sur la charge totale, la polarité ou l'hydrophobicité de la protéine de référence, ladite substitution permettant d'accroître ou de diminuer l'activité recherchée du complexe NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa comprenant ladite protéine NNT-1 substituée. Cette activité recherchée pouvant être soit une activité agoniste ou soit antagoniste (inhibiteur compétitif) du récepteur complexe CNTFRa/gp 130/LIFR ou du récepteur gp 130/LIFR .

Par « protéine dérivée » de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, on entendra désigner dans la présente description toute protéine dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, capables de former un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2.

Parmi les protéines dérivées de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, on préfère également les protéines formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFR , activité biologique telle que précédemment définie.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, on préfère tout particulièrement les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, 1'activité biologique dudit complexe étant au moins de 50 %, de préférence 60 % ou 80 % de celle mesurée pour le complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, on préfère également les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ledit complexe étant capable d'inhiber l'activité biologique du complexe obtenu avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4. En effet, un tel complexe, en tant qu'inhibiteur compétitif du complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, pourra être utilisé pour moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRct/gpl30/LIFR , en particulier diminuer la survie, la croissance ou la prolifération de cellules exprimant ledit récepteur complexe, notamment tumorales.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, on préfère notamment les protéines dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 ou avec l'un de leurs fragments, et comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6.

Ainsi, lesdites protéines dérivées de la protéine CLF-1 dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, avec la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 ou avec l'un de leurs fragments, pourront ainsi comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparée à la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6.

Par « protéine dérivée » de la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, on entendra désigner dans la présente description toute protéine dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID

No. 7, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de séquence SEQ ID No. 7, capables de former un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2.

Parmi les protéines dérivées de séquence SEQ ID No. 7, on préfère également les protéines formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ledit complexe étant capable de moduler l'activité biologique du récepteur gpl30/LIFRp, activité biologique telle que précédemment définie.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 7, on préfère tout particulièrement les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 7 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, l'activité biologique dudit complexe étant au moins de 50 %, de préférence 60 % ou 80 % de celle mesurée pour le complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine soluble sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 7, on préfère également les protéines comprenant un desdits fragments de la séquence SEQ ID No. 7 et formant un complexe avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ledit complexe étant capable d'inhiber l'activité biologique du complexe obtenu avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7. En effet, un tel complexe, en tant qu'inhibiteur compétitif du complexe formé avec la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, pourra être utilisé pour moduler l'activité biologique du récepteur gpl30/LIFR (3, en particulier diminuer la survie, la croissance ou la prolifération de cellules exprimant ledit récepteur complexe, notamment tumorales.

Parmi les protéines dérivées de la séquence SEQ ID No. 7, on préfère notamment les protéines dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID No. 7 ou avec l'un de leurs fragments, et comprenant au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence 8, 10, 15, 20, 25, 50 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 7.

Ainsi, lesdites protéines dérivées de la protéine sCNTFRa dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, avec la séquence SEQ ID No. 7 ou

avec l'un de leurs fragments, pourront ainsi comprendre une ou plusieurs substitutions, de préférence conservatrices, délétions ou insertions, comparée à la protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7.

Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, « BLAST 2 sequences », disponible sur le site http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/; les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres « open gap penaltie » : 5, et « extension gap penaltie » : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice « BLOSUM 62 » proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.

L'invention comprend un complexe selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No. 2 ; la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6 ; et/ou une protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No. 7.

De manière générale, dans la présente description, on entend désigner par 1'expression de type complexe comprenant"A, B et/ou C"ou encore"A ; B et/ou C" (telle que dans la revendication 2) ou encore A/B et/ou C" -les complexes comprenant A et B, -les complexes comprenant A et B et C, ou -les complexes comprenant A et C.

De manière générale également, par 1'expression de type"A, et/ou B et/ou C"on entend désigner toutes les combinaisons possibles de ces trois éléments pris seuls, par deux ou trois (A, B, C, A et B, A et C, B et C, A et B et C).

De manière générale aussi, par l'expression de type couplage entre"A, et B et/ou C", on entend désigner : -le couplage entre A et B, -le couplage entre A et B et C, ou -le couplage entre A et C.

Parmi lesdits complexes NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa selon l'invention, on préfère ceux caractérisés en ce que la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 ou la protéine sCNTFRa est obtenue par synthèse chimique ou par voie recombinante.

Lesdites protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFRa peuvent être obtenues sous forme de protéines recombinantes, glycosylées ou non, par les techniques standards de recombinaison génétique en utilisant des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par des vecteurs plasmidiques ou viraux contenant des acides nucléiques codant pour lesdites protéines, ou par synthèse chimique.

Parmi lesdits complexes selon l'invention, on préfère également ceux caractérisés en ce que la protéine NNT-1 est couplée par liaison covalente à la protéine CLF-1 et/ou à la protéine sCNTFRa pour former une protéine de fusion, notamment par couplage chimique.

Dans un mode de réalisation particulier, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine NNT-1, et/ou ladite protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRa pour faciliter le couplage chimique, de préférence ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.

Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre ladite protéine NNT-1, ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRa. Le couplage covalent entre ladite protéine NNT-1, et ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRa selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N-ou C-terminale de ladite protéine NNT-1, et/ou de ladite protéine CLF-1 et/ou de ladite protéine sCNTFRa. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de ladite protéine NNT-1, et/ou de ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRa choisies à coupler.

Dans un autre mode de réalisation particulier, le complexe selon l'invention est caractérisé en ce que ladite protéine de fusion obtenue après couplage entre ladite protéine NNT-1, et ladite protéine CLF-1 et/ou ladite protéine sCNTFRa est préparée par recombinaison génétique.

La protéine de fusion peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine NNT-1, d'une séquence codant pour ladite protéine CLF-1 et/ou d'une séquence codant pour ladite protéine sCNTFRa.

Les procédés de synthèse de molécules de fusion ou hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185 : 3-187, 1990).

Parmi lesdits complexes selon l'invention, on préfère également ceux caractérisés en ce que la protéine NNT-1, CLF-1 et sCNTFRa sont des protéines naturelles exprimées par des cellules ou lignées cellulaires, notamment d'origine animale, comprenant naturellement des acides nucléiques codant pour lesdites protéines NNT-1 et/ou CLF-1 et/ou sCNTFRa, en particulier par des cellules capables de produire naturellement le complexe selon l'invention, en particulier dans le milieu de culture où elles sont cultivées.

L'invention comprend en outre un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant la mise en contact d'une protéine NNT-1 avec une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRa, de préférence dans un milieu favorisant la formation dudit complexe.

L'invention concerne aussi un vecteur ou un système de deux ou trois vecteurs de co-expression des protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa dans une cellule hôte, lesdites protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa étant capables de former un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit vecteur ou ledit système de deux ou trois vecteurs contient une séquence nucléique codant pour une protéine NNT-1, une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRa. Le vecteur ou système de deux ou trois vecteurs selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression desdites séquences dans une cellule hôte et éventuellement la sécrétion desdites séquences hors de la cellule hôte. Par « vecteur d'expression ou de co- expression », on entend aussi bien des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs d'expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus, du virus associé à

I'adénovirus (AAV), de rétrovirus, des lentivirus, et de préférence les dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de l'herpès pour 1'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour 1'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.

Selon un mode particulier de réalisation, le vecteur selon l'invention comporte des éléments de contrôle de 1'expression des protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa adaptés à la cellule hôte choisie.

L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par les vecteurs ou systèmes de deux vecteurs selon l'invention. De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant 1'expression des deux protéines recombinantes capables de former un complexe selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales ; de préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères, mais également une cellule d'insectes dans laquelle on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes de séquence nucléotidique insérée dans un vecteur ou système de deux vecteurs tel que défini ci- dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant 1'expression de la séquence nucléotidique transfectée.

L'invention concerne également une méthode de préparation d'un complexe NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un vecteur ou système de deux ou trois vecteurs selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention porte sur une méthode de préparation d'un complexe NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinant caractérisé en ce que l'on cultive des cellules transformées selon l'invention dans des conditions permettant 1'expression des protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFR

a recombinantes et que l'on récupère ledit complexe NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinant formé.

Le complexe NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinant selon l'invention est susceptible d'être obtenu selon un procédé de l'invention et selon les techniques de production de protéines recombinantes connues de l'homme du métier. La présente invention concerne donc le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinant susceptible d'être obtenu par la méthode ci-dessus présentée. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Un système efficace de production de protéine recombinante nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. II doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion des protéines traduites. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa capables de former le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinant selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.

De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.

Les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinants selon l'invention obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle. Bien entendu, lesdits complexes NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa recombinants selon l'invention peuvent être obtenus à partir de protéine NNT-1 couplée à une protéine CLF- 1 et/ou couplée à une protéine sCNTFRa par fusion génétique comme cela a été mentionné précédemment.

Les complexes NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa selon l'invention qui peuvent être formés à partir de protéines NNT-1 et/ou CLF-1 et/ou sCNTFRa obtenues par synthèse chimique et peuvent ainsi comporter des acides aminés non naturels, sont également compris dans l'invention.

Les procédés de purification des protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFRa recombinantes ou naturelles, ou des complexes NNT-1/CLF-I et/ou sCNTFRa selon l'invention sont connus de l'homme du métier. Les protéines NNT-1, CLF-1 et sCNTFR a ou le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa selon l'invention, notamment recombinantes, peuvent être purifiées à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono-ou polyclonaux spécifiques, etc.. Une variante préférée consiste à produire une protéine recombinante fusionnée à une protéine « porteuse » (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.

Les cellules caractérisées en ce qu'elles contiennent un vecteur ou système de deux vecteurs selon l'invention font également partie de la présente invention, notamment les cellules procaryotes ou eucaryotes, de préférence les cellules de mammifère.

De préférence, 1'invention comprend un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) culture d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine NNT-1 et une séquence d'ADN codant pour la protéine CLF-1 et/ou une séquence d'ADN codant pour une protéine sCNTFRa dans un milieu de culture approprié à ladite cellule ; b) récupération dudit complexe formé à partir du milieu de culture et/ou de lysat desdites cellules cultivées.

De préférence, ladite cellule à l'étape a) est une cellule transformée selon 1'invention.

De préférence également, ladite cellule à l'étape a) est une cellule exprimant naturellement une protéine NNT-1, une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRa, c'est-à-dire une cellule comprenant naturellement une séquence nucléique codant pour une protéine NNT-1 et une séquence nucléique codant pour une protéine CLF-1 et/ou une séquence nucléique codant pour une protéine sCNTFRa.

Parmi les cellules exprimant naturellement une protéine NNT-1 et une protéine CLF-1 et/ou une protéine sCNTFRa, on préfère en particulier les cellules issues d'une lignée cellulaire, notamment animale, telles que celles décrites ci-après dans les exemples, ces exemples n'étant pas limitatifs.

Dans un mode de réalisation préféré, la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRa sont sécrétées à l'extérieur de ladite cellule cultivée et le complexe formé est directement prélevé à partir dudit milieu de culture, obtenu à l'étape a).

L'invention comprend également un complexe selon l'invention, caractérisé en ce que ledit complexe est obtenu par un procédé comprenant les étapes suivantes : a) culture d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine NNT-1, d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine CLF-1 et/ou d'une cellule contenant une séquence d'ADN codant pour la protéine sCNTFRa dans un milieu de culture approprié pour chacune desdites cellules ; b) mise en contact des protéines NNT-1 et des protéines CLF-1 et/ou des protéines sCNTFRa contenues dans leur milieu de culture respectif et/ou dans leur lysat cellulaire respectif ; c) récupération dudit complexe formé à l'étape b).

De préférence, lesdites cellules à l'étape a) sont des cellules transformées selon l'invention.

Dans un mode de réalisation préféré, les cellules utilisées à l'étape a) avant transformation sont de même type et sont cultivées après transformation dans un même milieu de culture, la mise en contact des protéines NNT-1 et des protéines CLF-1 et/ou des protéines sCNTFRa contenues alors dans le milieu de culture commun et/ou dans le lysat cellulaire global se faisant naturellement.

De manière préférée, la protéine NNT-1, la protéine CLF-1 et/ou la protéine sCNTFRa sont sécrétées à l'extérieur desdites cellules cultivées et le complexe formé est directement prélevé à partir dudit milieu de culture obtenu à l'étape a).

De manière générale, les procédés de préparation des complexes selon l'invention ci-avant décrits, ou décrits dans les exemples ci-après, font également partie de la présente invention, ainsi que les complexes NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa obtenus ou susceptibles d'être obtenus par ces procédés.

Un mode de réalisation de l'invention concerne un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention capable de fixer le récepteur CNTFRa.

Un mode de réalisation de l'invention concerne aussi un complexe NNT-1/s CNTFRa selon l'invention capable de fixer le récepteur LIFR .

Sous un autre aspect, la présente invention comprend un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments, caractérisé en ce qu'il est dirigé spécifiquement contre un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention. Elle comprend aussi des anticorps monoclonaux, polyclonaux, ou un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa ou un complexe NNT-1/sCNTFRa selon l'invention.

De préférence, I'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments dirigé spécifiquement contre un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant du complexe NNT-I/CLF-1 selon l'invention responsable de l'interaction spécifique du complexe NNT-l/CLF-1 avec le récepteur complexe CNTFRa/gp 130/LIFR .

De préférence, 1'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments dirigé spécifiquement contre un complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa ou un complexe NNT-1/sCNTFRa selon l'invention, est caractérisé en ce qu'il est capable de se fixer spécifiquement sur un épitope ou déterminant du complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa ou NNT-1/sCNTFRa selon l'invention responsable de l'interaction spécifique du complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa ou NNT-1/sCNTFRa avec le récepteur complexe gpl30/LIFR .

Les déterminants épitopiques consistent habituellement en des groupes de molécules présentant des surfaces chimiquement actives telles que des acides aminés ou des chaînes latérales de sucres et ayant une structure tridimensionnelle spécifique et/ou une charge spécifique caractéristique.

De manière plus préférée, 1'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, dirigé spécifiquement contre un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention sera capable de reconnaître spécifiquement (ou avec une plus grande affinité) le complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6 sans toutefois reconnaître (ou avec une affinité significativement inférieure) la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6 prises séparément.

De manière plus préférée, I'anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, dirigé spécifiquement contre un complexe NNT-1/CLF-1/sCNTFRa ou un complexe NNT'-1/sCNTFRa selon l'invention sera capable de reconnaître spécifiquement (ou avec une plus grande affinité) le complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa ou le complexe NNT-1/sCNTFRa selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6 et de la protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7 sans toutefois reconnaître (ou avec une affinité significativement inférieure) la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6 et la protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7 prises séparément.

Les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFR selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFR. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975 (Nature, 256 : 495-497, 1975).

Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFR selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne

d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le complexe NNT-l/CLF-I et/ou sCNTFR ayant servi d'antigène.

L'invention a ainsi de préférence pour objet des anticorps mono-ou polyclonaux ou leurs fragments, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et de la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou SEQ ID No. 6.

L'invention a aussi de préférence pour objet des anticorps mono-ou polyclonaux ou leurs fragments, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le complexe NNT-1/sCNTFRa selon l'invention constitué de la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2 et de la protéine sCNTFRa de séquence SEQ ID No. 7.

Les anticorps de l'invention, ou leurs fragments pourront également être marqués par un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.

Un tel anticorps pourrait non seulement être utile pour étudier et ainsi mieux connaître le rôle joué par les complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, en particulier dans la régulation des gènes mais également serait utile au regard des résultats présentés par les inventeurs dans la présente invention, pour d'autres applications comme les applications thérapeutiques ou diagnostics.

Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou l'un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT-1/CLF-1 selon l'invention seraient notamment utiles pour le ciblage de composés capables de moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRot/gpl 30/LIFR , ou du complexe NNT-l/CLF-1.

Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou l'un de leurs fragments, dirigés spécifiquement contre un complexe NNT-1/sCNTFRa selon l'invention seraient notamment utiles pour le ciblage de composés capables de moduler l'activité biologique du récepteur complexe gpl30/LIFRp, ou du complexe NNT-1/sCNTFRa.

Les fragments d'anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention comprennent tout fragment dudit anticorps monoclonal capable de se fixer sur l'épitope du complexe NNT-l/CLF-1 et/ou CNTFRa sur lequel se fixe l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ledit fragment est issu. Des exemples de tels fragments incluent en particulier des anticorps monoclonaux simple chaîne ou des fragments monovalents Fab ou Fab'et des fragments divalents tels que F (ab') 2, qui possèdent la même spécificité de

fixation que l'anticorps monoclonal ou polyclonal dont ils sont issus. Un fragment selon l'invention pourra également être un fragment Fv simple chaîne produit par des méthodes connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Skerra et al. (Science, 240 : 1038-1041, 1988) et King et al. (Biochemical J., 290 : 723-729, 1991).

Selon la présente invention, des fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention peuvent être obtenus à partir des anticorps monoclonaux ou polyclonaux tels que décrits précédemment par des méthodes telles que la digestion par des enzymes, comme la pepsine ou la papaïne et/ou par clivage des ponts disulfures par réduction chimique. D'une autre manière, les fragments d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux compris dans la présente invention peuvent être synthétisés par des synthétiseurs automatiques de peptides tels que ceux fournis par la société Applied Biosystems, etc., ou peuvent être préparés manuellement en utilisant des techniques connues de l'homme de l'art et telles que décrites par exemple par Geysen et al. (J.

Immunol. Methods, 102 : 259-274, 1978).

En général, pour la préparation d'anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments, on pourra se référer aux techniques qui sont en particulier décrites dans le manuel « Antibodies » (Harlow et al., Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications pp. 726, 1988) ou à la technique de préparation à partir d'hybridomes décrite par Kohler et Milstein en 1975.

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention pourront par exemple être purifiés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été immobilisé le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa ou l'un de ses fragments comportant l'épitope reconnu spécifiquement par lesdits anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention.

L'invention comprend en outre un anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les anticorps humanisés, chimériques ou anti-idiotypes.

Les anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art (Carter et al., PNAS 89 : 4285-4289, 1992 ; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10 : 1-142, 1992).

De tels anticorps monoclonaux humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes thérapeutiques.

Les anticorps monoclonaux ou leurs fragments de type chimérique selon l'invention peuvent être réalisés en utilisant les techniques de recombinaison génétique.

L'invention comprend également un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, caractérisé en ce qu'il est marqué.

Les anticorps monoclonaux ou polyclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.

Les anticorps monoclonaux marqués selon l'invention ou leurs fragments incluent par exemple des anticorps dits immunoconjugués qui peuvent être conjugués par exemple avec des enzymes telles que la péroxydase, la phosphatase alkaline, la P-D- galactosidase, la glucose oxydase, la glucose amylase, I'anhydrase carbonique, I'acétyl- cholinestérase, le lysozyme, la malate déhydrogénase ou la glucose-6 phosphate déhydrogénase ou par une molécule comme la biotine, la digoxigénine ou la 5-bromo- désoxyuridine. Des marqueurs fluorescents peuvent être également conjugués aux anticorps monoclonaux ou leurs fragments de l'invention et incluent notamment la fluorescéine et ses dérivés, le fluorochrome, la rhodamine et ses dérivés, la GFP (GFP pour « Green Fluorescent Protein »), le dansyl, l'umbelliférone etc.. Dans de tels conjugués, les anticorps monoclonaux de l'invention ou leurs fragments peuvent être préparés par des méthodes connues de l'homme de l'art. Ils peuvent être couplés aux enzymes ou aux marqueurs fluorescents directement ou par l'intermédiaire d'un groupe espaceur ou d'un groupe de liaisons tel qu'un polyaldéhyde, comme le glutaraldéhydeque, 1'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 1'acide diéthylènetriaminepentaacétique (DPTA), ou en présence d'agents de couplage tels que le périodate etc.. Les conjugués comportant des marqueurs de type fluorescéine peuvent être préparés par réaction avec un isothiocyanate.

D'autres conjugués peuvent inclure également des marqueurs chimioluminescents tels que le luminol et les dioxétanes ou des marqueurs bioluminescents tels que la luciférase et la luciférine.

Parmi les marqueurs pouvant être fixés sur l'anticorps monoclonal ou un de ses fragments selon l'invention, on préfère également les marqueurs radioactifs tels que 14c, "Cl,"Co,"Co,"Cr,'"Eu,"Fe,'H,'"I,'"I,"P,"S,"SEetTc qui peuvent être détectés par des moyens connus tels que le compteur gamma ou à scintillations, par autoradiographie, etc..

Sous un autre aspect, 1'invention a pour objet l'utilisation d'un complexe NNT- 1/CLF-l selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1/CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFR , notamment la transduction de signal induite par la phosphorylation de la tyrosine de gp l 3 0 et LIFR .

Par modulation de l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFRp, on entend désigner aussi bien l'induction ou l'accroissement que son inhibition, en particulier lorsque le complexe formé entre les protéines NNT-1 et CLF-1 ou lesdits anticorps anti-NNT-l/CLF-1 agissent en tant qu'inhibiteur compétitif ou antagoniste.

De préférence, ledit complexe NNT-l/CLF-1 est le complexe formé entre la protéine NNT-1 de séquence SEQ ID No. 2, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No. 2, et la protéine CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, ou une protéine dont la séquence présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID No. 4 ou No. 6, et le médicament est destiné à induire ou à accroître l'activité biologique du récepteur complexe CNTFRa/gp l 3 0/LIFR .

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1/CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à augmenter ou à diminuer la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation de cellules exprimant le récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFR .

L'invention a en particulier pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1/CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à

augmenter la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation des neurones centraux, périphériques et ceux impliqués dans la fonction neuro-musculaire, en particulier destiné au traitement d'anomalie de développement du cerveau foetal.

L'invention a de préférence également pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention ou d'un anticorps anti-NNT-1/CLF-1 monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention, pour la préparation d'un médicament destiné à diminuer la survie, la croissance, la prolifération ou la différenciation de cellules tumorales exprimant le récepteur complexe CNTFRa/gpl30/LIFR ou un récepteur capable de fixer spécifiquement le complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention.

L'invention comprend encore l'utilisation d'un complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFR a ou NNT-1/sCNTFRa selon l'invention ou d'anticorps anti- (NNT-l/CLF-1/sCNTFRa ou NNT-1/sCNTFRa) pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité biologique du récepteur gpl30/LIFR , notamment la transduction de signal induite par la phosphorylation de la tyrosine de gpl30 et LIFR .

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un complexe NNT-1/CLF- 1/sCNTFRa ou NNT-1/sCNTFRa ou d'anticorps anti- (NNT-l/CLF-l/sCNTFRa ou NNT-1/sCNTFRa) selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné à moduler l'activité du récepteur gpl30/LIFR des cellules exprimant ledit récepteur gpl30/LIFR , telles que les cellules impliquées dans le système immunitaire, le système hématopoïétique, le système nerveux, le système reproductif, le foie, les os ou le muscle squelettique.

L'invention concerne encore l'utilisation d'un complexe NNT-l/CLF-1 selon l'invention pour faciliter la prolifération et/ou inhiber la différentiation des cellules souches et plus particulièrement des cellules souches embryonnaires. En effet, il est connu que la cytokine LIF permet la prolifération des cellules souches et inhibent leur différentiation.

Sous un autre aspect, 1'invention comprend un complexe selon l'invention, ou un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention en tant que médicament.

L'invention comprend également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants : -un complexe selon l'invention ; -un anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments selon l'invention ; -un vecteur ou système de vecteurs, ou une cellule transformée selon l'invention ; et -une cellule capable d'exprimer naturellement une protéine NNT-1 et une protéine CLF- 1 et/ou une protéine sCNTFRa.

De telles compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur ou système de vecteurs selon l'invention, pourront en particulier être utilisées pour le transfert d'acide nucléique codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa dans une cellule donnée in vivo dans le cadre d'un traitement d'une maladie neurodégénérative par thérapie génique. Cette nouvelle technologie dont le champ d'application est vaste, permet d'envisager le traitement de maladies neurodégénératives pour lesquelles les alternatives thérapeutiques classiques sont peu efficaces voire inexistantes et concernent aussi bien les maladies génétiques qu'acquises. L'approche la plus pratiquée consiste à utiliser un véhicule viral pour introduire l'acide nucléique thérapeutique dans la cellule à traiter et, en particulier, rétroviral et adénoviral. En effet, les virus ont développé des mécanismes sophistiqués pour traverser les membranes cellulaires, échapper à la dégradation au niveau des lysosomes et faire pénétrer leur génome dans les noyaux afin d'assurer 1'expression du gène thérapeutique.

De plus en plus de méthodes de transfert de gènes font appel à des vecteurs non viraux. D'autres méthodes de transfert de gènes peuvent être employées comme par exemple la délivrance de l'acide nucléique thérapeutique au moyen de vecteurs synthétiques, tels que les lipides cationiques qui interagissent spontanément avec l'acide nucléique pour former des complexes chargés positivement capables de fusionner avec les membranes cellulaires anioniques et faire pénétrer l'acide nucléique qu'ils transportent (voir par exemple Behr, Bioconjugate Chemistry, 5 : 382, 1994). Enfin, une approche encore plus simple peut également être envisagée par administration directe d'ADN nu codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa, notamment dans le cadre des maladies touchant les muscles par injection intramusculaire. Ces méthodes non virales mettent généralement en oeuvre un vecteur ou système de vecteurs plasmidiques selon

1'invention portant les gènes thérapeutiques codant pour les deux protéines NNT-1 et CLF-1 et/ou sCNTFRa, et les éléments nécessaires à son expression.

De telles compositions pharmaceutiques comprenant un vecteur ou système de vecteurs, selon l'invention pourront également être utilisées pour le transfert d'acide nucléique codant pour les protéines NNT-1, CLF-1 et/ou sCNTFRa, dans une cellule donnée ex vivo dans le cadre d'un traitement de maladie neurodégénérative, en particulier pour la réparation ou la régénération de neurones ou tissu neuronal, qui seront ensuite implantés ou réimplantés dans le patient à traiter (xénogreffe ou allogreffe).

L'invention concerne en outre une composition pharmaceutique selon l'invention pour la prévention ou le traitement de maladies neurodégénératives, notamment la sclérose latérale amyotrophique, la maladie de Parkinson ou la maladie de Huntington, pour le traitement d'anomalie de développement du cerveau foetal, pour la régénération du tissu nerveux ou du muscle squelettique ou pour la maintenance de la masse musculaire chez les paralysés ou encore pour le traitement du cancer ou de l'obésité.

En effet, parmi les applications potentielles du complexe NNT-1/CLF-1 en tant qu'activateur spécifique du récepteur CNTF, on peut citer également son utilisation dans la préparation de médicament destiné au traitement de l'obésité et de ses maladies associées comme l'hyperglycémie comme décrit en particulier dans les demandes de brevets WO 98/22128, WO 98/32458 et WO 99/08701. II a été démontré que des souris rendues obèses maigrissaient suite à un traitement avec la protéine CNTF. Un dérivé du CNTF, I'axokine, a également permis d'obtenir des résultats similaires et confirme ainsi l'utilité du complexe NNT-l/CLF-1 dans le traitement de l'obésité.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour améliorer la fertilité, et notamment pour éviter les endométrioses et/ou faciliter l'implantation des blastocystes.

Elles peuvent encore être mises en oeuvre pour faciliter l'hématopoïèse et particulièrement dans le traitement de la thrombocytopénie. Dans ce cas, les compositions selon l'invention comprennent en outre du GM-CSF. II a été constaté que le nombre de plaquettes produites était augmenté en présence de LIF.

Enfin, les compositions selon l'invention peuvent être utilisées pour le traitement des rétinites et plus particulièrement des rétinites pigmentaires.

Sous un autre aspect, 1'invention a pour objet une composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention de pathologie liée à une expression anormale du complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de ses fragments, selon l'invention ; et b) un excipient pharmaceutiquement acceptable.

De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention, est caractérisée en ce que ladite pathologie est choisie parmi les cancers.

L'invention a également pour objet l'utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement du cancer.

La quantité de composés comprise dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention et nécessaire pour une thérapie efficace dépendra de différents facteurs tels que le mode d'administration, la partie du corps ciblée, l'état physiologique du patient, de l'administration d'autres médicaments, des éventuels effets secondaires, etc.. Le dosage pour de telles préventions ou traitements thérapeutiques devra être réalisé de manière à optimiser sa sécurité et son efficacité. En général, des modèles animaux peuvent être utilisés pour déterminer les quantités efficaces des composés entrant dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention pour le traitement ou la prévention des pathologies particulières. Ces méthodes sont en particulier discutées dans les ouvrages tels que Gilman et al. (The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th Ed. Pergamon Press, 1990) et Remington's Pharmaceutical Sciences (17th ed., 1990) pour des méthodes d'administration telles que les méthodes par voie orale, intraveineuse, intrapéritonale, intramusculaire ou transdermique. Les excipients pharmaceutiquement acceptables incluent notamment l'eau, les solutions salines, les tampons ou tout autre composé décrit par exemple dans l'Index de Merck.

Entre également dans le cadre de l'invention, une trousse ou nécessaire de diagnostic comprenant un anticorps selon l'invention, notamment pour le dosage (dont la détection) ou l'identification de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, dans un échantillon biologique, de préférence in vitro.

En particulier, une trousse de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend les éléments suivants :

-un anticorps polyclonal, monoclonal ou un de leurs fragments selon l'invention, le cas échéant marqué ; -le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique ; -le cas échéant, un réactif permettant la détection des complexes antigène- anticorps produits par la réaction immunologique, ce réactif pouvant également porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas où ledit anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments n'est pas marqué.

L'invention comprend également un procédé pour la détection et/ou le dosage de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) avec un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention (dans des conditions permettant une réaction immunologique entre lesdits anticorps et lesdits complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa) ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps éventuellement formé.

L'invention comprend en outre l'utilisation d'un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments pour le diagnostic, en particulier in vitro de pathologie liée à 1'expression anormale de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, notamment pour le diagnostic de cancer.

Par ailleurs, les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention, peuvent également être utilisés pour l'identification ou la localisation, notamment tissulaire ou cellulaire, et/ou le dosage de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, ladite utilisation étant comprise dans l'invention.

Les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention constituent également un moyen d'analyse de 1'expression de complexes NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, dans des échantillons biologiques (fluides ou sur des coupes de tissus spécifiques), par exemple par immunofluorescence, par marquage enzymatique, radioactif ou à l'or. Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa,

dans les tissus ou prélèvements biologiques, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de 1'expression de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, mais également pour le suivi de l'évolution de méthodes de prévention ou de traitement de pathologie nécessitant ladite détection ou ledit dosage.

Plus généralement, les anticorps monoclonaux, polyclonaux ou leurs fragments selon l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où 1'expression de complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative.

De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide biologique, tel que le sérum, le sang total, des cellules, un échantillon de tissu ou des biopsies d'origine humaine.

Toute procédure ou test classique peut être mise en oeuvre pour réaliser une telle détection et/ou dosage. Ledit test peut être un test par compétition ou par sandwich, ou tout test connu de l'homme de l'art dépendant de la formation d'un complexe immun anticorps-antigène. Suivant les applications selon l'invention, 1'anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments peut être immobilisé ou marqué. Cette immobilisation peut être réalisée sur de nombreux supports connus de l'homme de l'art.

Ces supports peuvent notamment inclure le verre, le polystyrène, le polypropylène, le polyéthylène, le dextran, le nylon, ou des celluloses naturelles ou modifiées. Ces supports peuvent être soit solubles ou insolubles.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par immunofluorescence, ou radio- immunologique (RIA) ou équivalent.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet une méthode pour évaluer l'affinité d'un composé à tester pour le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) la mise en contact d'un échantillon contenant ledit complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, avec i) un anticorps monoclonal, polyclonal ou un de leurs fragments selon l'invention ; et ii) ledit composé à tester ; et

b) la mesure de la quantité dudit anticorps monoclonal, polyclonal ou l'un de leurs fragments, ladite quantité étant inversement proportionnelle à la quantité de composés à tester fixés sur ledit complexe NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa.

Les anticorps monoclonaux, polyclonaux selon l'invention ou leurs fragments peuvent être utilisés également dans des méthodes in vitro pour la sélection de composés susceptibles de se fixer au complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa, avec l'affinité recherchée. Ainsi, la présente invention comprend également des méthodes de sélection par compétition de composés pharmaceutiques dans lesquelles les anticorps monoclonaux ou polyclonaux de l'invention ou leurs fragments entrent en compétition avec le composé à tester susceptible de se fixer au complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa. Ainsi, ces composés, identifiés par la méthode selon l'invention pourront être utilisés pour occuper ces sites de fixation sur le complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFR a, et agir en tant qu'agent modulateur ou antagoniste de l'activité biologique des complexes NNT-1/CLF-1 et/ou sCNTFRa.

Sous un dernier aspect, la présente invention comprend également : le peptide CLF-1 (variant d'épissage) de séquence SEQ ID No. 4 ainsi que tout peptide dérivé dont la séquence comprend un fragment d'au moins 5, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ou 45 acides aminés consécutifs du fragment compris entre les positions aa 405 et aa 445 de la séquence SEQ ID No. 4.

De préférence, de tels peptides dérivés du variant d'épissage CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 selon l'invention sont capables de former un complexe NNT-l/CLF-1 et/ou sCNTFRa selon l'invention, et/ou pourront être obtenus par recombinaison génétique ou par synthèse chimique.

L'invention comprend aussi les acides nucléiques codant pour le peptide CLF-1 de séquence SEQ ID No. 4 ou l'un de ses peptides dérivés selon l'invention, les vecteurs comprenant de tels acides nucléiques ainsi que les cellules hôtes transformées à l'aide desdits vecteurs ou acides nucléiques.

L'invention comprend en outre un anticorps capable de reconnaître spécifiquement le domaine aa 405-aa 445, ou l'un de ses fragments, du peptide de séquence SEQ ID No. 4.

L'invention comprend également toute méthode, mettant en oeuvre un tel peptide de séquence SEQ ID No. 4, ou l'un de ses dérivés, une séquence nucléique codant pour de tels peptides, ou ledit corps.

L'utilisation de peptides de séquence SEQ ID No. 4 ou l'un de ses peptides dérivés selon l'invention dans toute application connue de l'art antérieur pour le peptide CLF-1 de séquence SEQ ID No. 6 est également comprise dans la présente invention.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci- apres.

Légende des figures : Figures 1A et 1B. Formation d'un complexe sécrété entre NNT-1 et CLF-1 1A Partie du haut : 1'expression de NNT-1 a été détectée par « Western blot » dans le lysat des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les protéines indiquées.

Partie du bas : les complexes NNT-l/CLF-1 ont été isolés des milieux de culture des mêmes cellules par immunoprécipitation avec un anticorps monoclonal anti-C-myc et la présence de NNT-1 révélée par Western blot avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc couplé à la peroxydase 1B Partie du haut : 1'expression de NNT-1 a été détectée par « Western blot » dans le lysat des cellules transfectées avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc couplé à la péroxydase.

Partie du milieu : les protéines de fusion contenant une région Fc sécrétée dans le surnageant des cellules transfectées ont été révélées par immunoaffinité sur protéine G- Sepharose et « Western blot » avec un anticorps dirigé contre les IgG humaines couplé à la péroxydase.

Partie du bas : la présence de NNT-1 dans les mêmes milieux de cultures a été analysée par immunoafnnité sur protéine G-Sepharose et « Western blot » avec un anticorps monoclonal anti-C-myc couplé à la péroxydase.

Figure 2. L'hétérocomplexe NNT-1/CLF-1 induit la prolifération des cellules BAF 3 transfectées avec gpl30/LIFR et CNTFRa.

Les cellules BAF contrôles ou les transfectants stables exprimant les récepteurs indiqués dans la figure ont été cultivés en présence de dilutions de milieu de cultures de cellules COS transfectées avec les ADNc codant pour CLF-1 NNT-1 (dénommé CLC), CLF-1 et NNT-1 ou les contrôles relevants. L'incorporation de [3H] thymidine exprimée en CPM a été faite en triplicate. L'axe des x représente la concentration de milieu de culture exprimée sous forme de dilution en série au tiers.

Figure 3. Le complexe NNT-1/CLF-1 induit la phosphorylation en tyrosine de gpl30etLIFR (3.

Les cellules ont été incubées pour une durée de 20 min. avec l'hétérocomplexe NNT-1/CLF-1 (dilution 1 : 7), une préparation purifiée des cellules transfectées avec un plasmide contrôle (indiqué « mock » dans la figure ; dilution 1 : 7) ou du CNTF (50 ng/ml). Après lyse des cellules et immunoprécipitation avec un anticorps anti-LIFR , les protéines ont été séparées par SDS-PAGE, transférées sur une membrane PVDF et les protéines phosphorylées en tyrosine révélées à l'aide d'un anticorps monoclonal anti- phosphotyrosine.

Partie gauche : cellules BAF transfectées avec les ADNc codant pour CNTFa /gp 13 0/LIFR/3.

Partie droite : cellules SK-N-MC.

Figures 4A et 4B. Expression de 1'ARNm codant pour NNT-1 et CLF-1 dans les lignées cellulaires de tumeur de cerveau.

L'ARN total a été isolé des cellules indiquées et analysé par RT-PCR à l'aide d'amorces spécifiques pour NNT-1, CLF-1 ou-actin (contrôle).

Figures 5A, 5B, 5C et 5D. Formation d'un complexe sécrété entre NNT-1 et sCNTFR.

Figure SA : L'expression de NNT-1 a été détectée par Western blot dans le lysat des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les protéines indiquées.

Figure 5B : L'expression de CNTFR a été détectée par Western blot dans le lysat des cellules transfectées avec les ADNc codant pour les protéines indiquées.

Figure 5C : La présence de NNT-1 dans les milieux de culture des mêmes cellules a été détectée par immunoprécipitation avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc suivi d'un Western blot de la fraction purifiée avec l'anticorps monoclonal anti-protéine C.

Figure 5D : Les complexes NNT-1/CNTFR on été isolés des milieux de culture des mêmes cellules par immunoprécipitation avec un anticorps monoclonal anti-CNTFR et la présence de NNT-1 révélée par Western blot avec l'anticorps monoclonal anti-protéine C.

SN : surnageant ; IP : immunoprécipitation ; WB : Western blot.

Figure 6. L'hétérocomplexe NNT-1/sCNTFR induit la prolifération des cellules BAF 3 transfectées avec gpl30 et LIEFRO.

Les cellules BAF 3 transfectées d'une façon stable avec les récepteurs gpl30 et LIFR ont été cultivées en présence de dilutions de milieu de cultures de cellules COS transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1, sCNTFR, NNT-1 et CLF-1 ou NNT-1 et sCNTFR. La protéine LIF recombinante a été utilisée comme contrôle positif de la prolifération cellulaire. L'incorporation de [3H] thymidine exprimée en CPM a été faite en triplicate. L'axe des abscisses représente la concentration de milieu de culture exprimée sous forme de dilution en série au tiers.

EXEMPLE 1 Matériels et Méthodes Cultures cellulaires Les lignées de singe COS I, de neuroblastome humain SK-N-MC, de gliome humain U373 MG et myéloïde de souris BAF/3 ont été obtenues de zu American Type Culture Collection » (ATCC, Rockville, MD) et maintenues selon les spécifications. Les lignées de gliomes LN 215, LN 229 et LN 415 ont été généreusement données par le Dr.

P-Y Dietrich (Hôpital Cantonal Universitaire de Genève, Genève, Suisse) et cultivées dans du milieu DMEM additionné de 10 % de sérum de veau foetal (SVF). Pour les purifications de protéines, les cellules COS I ont été cultivées dans du milieu de Yssel {Yssel, De Vries, et al. 1984 ID : 378} après transfection. Les cytokines recombinantes et les récepteurs solubles ont été obtenus de R & D systems (Abingdon, Oxon, UK).

Clonage de 1'ADNc codant pour NNT-1 Une EST (« Expressed Sequence Tag ») codant pour NNT-1 (GenBank, No. d'accession AI752561) a été identifiée par recherche bio-informatique TBLASTN en utilisant la séquence en acide aminé connu de NNT-1 dans la requête de recherche.

L'ADNc codant pour NNT-1 a ensuite été amplifié par PCR ancrée sur de l'hADNc de ganglion lymphatique (Race-Ready human lymph node cDNA ; Clontech, Palo Alto, CA) à l'aide de l'amorce AP-1 (du kit d'amplification Marathon de Clonetech) et de l'amorce spécifique pour NNT-1 5'-AAGGGGGAGCGAAGAGGAGAAGG-3' (SEQ ID No. 8) (35 cycles de PCR, 94°C, 30 » ; 60°C, 30 » ; 72°C, 1 »). L'ADNc amplifié a été clone dans le vecteur pGEM-Teasy (Promega Corp., Madison, WI) et séquence. Pour produire un dérivé de NNT-1 contenant l'épitope C-myc EQKLISEEDL (SEQ ID No. 9) (NNT- lmyc) I'ADNc de NNT-1 a été amplifié de l'insert du vecteur pGEM-Teasy à l'aide des amorces 5'-CGCGGATCCGCCATGGACCTCCGAGC-3' (SEQ ID No. 10) et 5'- <BR> <BR> <BR> <BR> GCGGAATTCAGAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCGAAGCCATGAGC CCCCAG-3' (SEQ ID No. 11) (10 cycles de PCR, 94°C, 30 » ; 60°C, 30 » ; 72°C, 45 »).

L'ADNc codant pour NNT-lmyc a été clone dans le vecteur d'expression pCDNA3 (Invitrogen, Leek, Hollande) à l'aide des enzymes de restriction Bam HI et Eco RI et vérifié par séquençage.

Clonage d'un nouveau variant d'épissage de CLF-1 et production d'ADNc chimérique codant pour une protéine de fusion CLF-1-Fc Par criblage bio-informatique utilisant BLASTN sur la banque de donnée EST au NCBI (http// : www. ncbi. nlm. nih/BLAST), nous avons identifié un EST codant pour un nouveau variant d'épissage de CLF-1 (GenBank, accession No. AI406406) contenant 293 nucléotides additionnels par rapport à la séquence publiée de CLF-1 en raison de l'utilisation d'une séquence acceptrice d'épissage pour l'exon 9 dans la séquence du gène en amont de celle publiée pour CLF-1. L'ADNc codant pour ce variant d'épissage (SEQ ID No. 3) a été amplifié de 1'ADNc de poumon foetal humain (Clonetech) à l'aide des amorces 5'-CGCGAATTCCCATGCCCGCCGGCCGCCG-3' (SEQ ID No. 12) et 5'- CGCGAATTCTAACTAGGGTGAGTATGTTC-3' (SEQ ID No. 13) (30 cycles de PCR, 94°C, 30 » ; 60°C, 30 » ; 72°C, 2 »). L'ADNc amplifié a été clone dans le site de restriction Eco RI du vecteur pCDNA3 (Invitrogen). La séquence en acide aminé de la protéine codée par cet ADNc ne diverge qu'à l'extrémité C-terminale de la séquence originale de CLF-1. Pour produire un ADNc codant pour une protéine de fusion CLF-1- Fc, la région codante de CLF-1 a été amplifiée par PCR, clonée en phase avec un fragment d'ADNc codant pour la région Fc de l'IgGl humaine et séquencée.

Production d'un ADNc chimérique codant pour une protéine de fusion CNTFRa- Fc L'ADNc codant pour une forme soluble de la chaîne a du récepteur au CNTF a été amplifié à l'aide des amorces 5'-CCGCTCGAGGCCCAGAGACACAGTCCACA-3' (SEQ ID No. 14) et 5'-CCGCTCGAGGTCACAGATCTTCGTGGT-3' (SEQ ID No.

15), clone en phase avec un fragment d'ADNc codant pour la partie Fc de l'IgGl humaine et séquence.

Transfection transitoire Les cellules COS I ont été mises en culture à raison de 1 x 105 cellules/puits dans des boîtes de culture à 6 puits de 35mm2 et transfectées le lendemain avec du Fugene 6 (Roche Diagnostics, Meylan, France) selon les instructions du fabricant. Pour les co- transfections, les complexes plasmides/Fugene 6aM ont été générés et ajoutés aux cellules indépendamment.

Immunoprécipitation du complexe CLF-lFc/NNT-lmyc et analyse par « Western blot » Les cellules COS I ont été lycées 72 heures après transfection dans du tampon RIPA (50 mM Tris-HCI pH 7. 5, 150 mM NaCI, 1 % Nonidet P40, 0, 5 % déoxycholate de sodium, 0, 1 % SDS). Les lysats cellulaires ont été passés à travers des aiguilles de seringues de 0, 8 mm et les débris cellulaires éliminés par centrifugation. Les lysats ont ensuite été mélangés 1 : 1 avec du tampon échantillon Tris-Glycine-SDS (Novex, San Diego, CA) contenant 750 mM de (3-mercaptoethanol et chauffés à 95°C pour 5'. En parallèle, les milieux de cultures ont été centrifugés séquentiellement à 3000 puis 13000 RPM dans une microcentrifugeuse pour éliminer les débris cellulaires. Les milieux ont été incubés une heure avec 25 pI de protéine G-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suède) à 4°C. Après élimination de la protéine G-Sepharose, de l'anticorps monoclonal anti-C- myc (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) a été ajouté (concentration finale 10 llg/ml) pour 2 heures à 4°C. 50 u1 de protéine G-Sepharose ont ensuite été ajoutés et l'incubation poursuivie pour une heure. La protéine G-Sepharose a été lavée trois fois avec du PBS, reprise dans 100 ul de tampon échantillon tris-Glycine-SDS contenant 375 mM de (3-mercaptoéthanol et chauffée à 95°C pour 5'. Pour l'immunoprécipitation des protéines de fusion Fc, la même procédure a été suivie, excepté que la première

incubation a été effectuée avec de la Sépharose couplée à de l'albumine sérique humaine et l'addition d'anticorps anti-C-myc omise. Les protéines ont été analysées par SDS- PAGE sur un gel polyacrylamide 12 % et électrotransférées sur une membrane PVDF (Millipore Corp., Bedford, MA). Les membranes ont été bloquées dans du tampon TBS additionné de 0, 15 % Tween-20 et 5 % de lait en poudre (tampon de blocage). Les protéines comprenant l'épitope C-myc on été détectées par incubation avec un anticorps anti-C-myc couplé à la péroxydase (Roche Diagnostics) dilué 1 : 1000 dans du tampon de blocage. Les protéines de fusion contenant une région Fc ont été révélées à l'aide d'un anti-IgG humain couplé à la péroxydase (dilution 1 : 2000 dans du tampon de blocage ; Amersham France SA). La péroxydase a été révélée par chimiluminescence (ECL ; Amersham France S. A.) en suivant les instructions du fabricant.

Purification du CLF-1-Fc et du complexe NNT-lmyc/CLF-1-Fc Les milieux de cultures des cellules transfectées avec les ADNc codant pour CLF-l-Fc ou NNT-1-myc et CLF-l-Fc ont été récoltés 3 jours après transfection. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation, les milieux de cultures concentrés 10 x à l'aide de concentrateurs Centricon-30 (Millipore corp.) puis pré-incubes avec 25 Ill/ml de Sépharose couplée à l'albumine humaine. Les complexes CLF-1-Fc/NNT-1- myc ont été purifiés par affinité en incubant les milieux de cultures concentrés avec des billes magnétiques anti-IgG de souris (3 x 108 oc-mouse IgG Dynabeads M-450 ; Dynal A. S., Olso, Norvège) préincubées avec l'anticorps monoclonal anti-C-myc. Les complexes ont été élues des billes par l'addition de peptide C-myc (concentration finale 100 Ag/ml ; Roche Diagnostics) pour 16 h à 4°C. L'excès de peptides a été éliminé par dilution et successive sur une colonne Microcon-30 (Millipore Corp.). La présence de CLF-l-Fc et NNT-1-myc dans le complexe purifié par immunoaffinité a été vérifiée par « Western blot », comme décrit dans la section précédente (Pierce, Rockford, IL).

Analyse de la phosphorylation en tyrosine Les cellules SN-N-MC ont été incubées dans du milieu de culture sans sérum pour 16 h, stimulées 10 minutes à 37°C en présence des échantillons à tester puis lycées dans du tampon 10 mM Tris-HCI pH 7. 6, 5 mM EDTA, 50 mM NaCI, 30 mM pyruvate de sodium, 50 mM fluorure de sodium, 1 mM orthovanadate de sodium, 1 % Brij 96 contenant des inhibiteurs de protéases (1 pg/ml pepstatine A, 2 g/ml leupeptine,

5 ug/ml aprotinine, 1 mM phénylméthylsulphonyl fluorure ; Sigma Chemical Corp.). Les lysats ont été agités durant 60 min à 4°C et les fractions insolubles éliminées par centrifugation à 12 000 x g pour 30 min. Après avoir été ajustés pour le contenu en protéines, les lysats ont été incubés pour 16 h en présence d'anticorps spécifiques dirigés contre LIFR (10 pg Ab/ml, SC-659 ; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Les complexes antigènes-anticorps ont été isolés par chromatographie d'affinité sur protéine A-Sepharose (Pharmacia), lavés dans du tampon de lyse et élues dans du tampon échantillon Tris-Glycine-SDS contenant 375 mM (3-mercaptoethanol, analysés par SDS- PAGE et transférés sur une membrane PVDF. Après blocage, la membrane a été incubée successivement avec un anticorps monoclonal anti-phosphotyrosine (4G10, 1 ug/ml ; UBI, Lake Placid, NY) et un anticorps polyclonal de chèvre anti-souris couplé à la péroxydase (dilué 1 : 4000 ; Biosource, Camarillo, CA). L'anticorps lié à la membrane a été révélé par chimiluminescence.

Prolifération des cellules BAF/3 Les cellules BAF/3 sont négatives pour 1'expression de nombreux récepteurs des cytokines et peuvent être transfectées pour exprimer de manière stable des combinaisons variées de récepteurs pour les cytokines de la famille IL-6. Dans cette étude, les cellules BAF/3 transfectées exprimant les combinaisons suivantes de récepteurs ont été utilisées : gpl30, gpl30 + LIFR , gpl30 + OSMR P (chaîne P du récepteur OSM), gpl30 + IL- 6Ra, gpl30 + LIFR + IL-6Ra, gpl30 + LIFR + CNTFRa. Les cellules parentales ou transfectées ont été mises en culture en triplicata à raison de 104 cellules/puits dans 100 u1 milieu de culture additionné de 10 % de SVF et de dilution sérielle des échantillons à tester. Après une incubation de 72 heures à 37°C, 0, 5 uCi de [6-3H]- thymidine (74 GBq/mmol ; Amersham France S. A.) a été ajouté à chaque puits pour une durée de 4 heures. L'incorporation a été mesurée à l'aide d'un compteur P.

Détection des ARNm codants pour CLF-1 et NNT-1 par RT-PCR L'ARN a été isolé à l'aide de TRIzol (Life Technologies, Paisley, UK). L'ADNc a été synthétisé avec de la transcriptase reverse SuperScript II en utilisant 5 g d'ARN comme substrat et des hexamères comme amorce (Life Technologies). Un cinquantième de 1'ADNc a ensuite été amplifié par PCR à l'aide, respectivement, des amorces 5'- TGGCTCCTGCCTCTATGTTG-3' (SEQ ID No. 16) et 5'-

CCACTCGGTAGCGGATCTGG-3' (SEQ ID No. 17) pour CLF-1, et 5'-CTCAATCG CACAGGGGAC-3' (SEQ ID No. 18) et 5'-AAGGGGGAGCGAAGAGGAGAAGG-3' (SEQ ID No. 8) pour NNT-1. Le produit de PCR a été analysé par électrophorèse sur gel agarose.

EXEMPLE 2 : NNT-1 n'est sécrété qu'en présence de CLF-1 La cytokine NNT-1 contient un peptide signal (Senaldi et al., 1999 ; Shi et al., 1999). Un dérivé de cette cytokine (NNT-1-myc) a été exprimé comprenant un épitope reconnu par un anticorps anti-C-myc dans la lignée fibroblastique de rein de singe COS.

Bien que la production de la protéine recombinante soit clairement détectable dans ces cellules (cf. figure 1A), la sécrétion de NNT-1 dans le milieu de culture n'a pas été observée (cf. figures 1A et 1B et résultats non présentés). Pour tester si la co-expression d'une seconde chaîne était requise pour la sécrétion de NNT-1, comme décrit pour l'IL- 12, 1'ADNc codant pour NNT-1-myc a été transfecté seul ou co-transfecté avec celui codant pour CLF-1 dans les cellules COS. Le milieu de culture a été analysé pour la présence de NNT-1-myc par immunoprécipitation et « Western blot ». La cytokine NNT-1 n'a été observée que dans les surnageants des cellules co-transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1 et CLF-1 (cf. figure 1A). Ces résultats indiquent que le relargage de NNT-1 par les cellules est dépendant de la co-expression de CLF-1.

EXEMPLE 3 : NNT-1 forme un complexe avec une protéine de fusion CLF-1 Fc II a été ensuite testé si NNT-1 et CLF-1 étaient relâchés sous forme d'un hétérocomplexe. Le vecteur d'expression codant pour NNT-1-myc a été co-transfecté avec des ADNc codant pour des protéines de fusion CLF-1-Fc ou sCNTFRa-Fc.

Comme contrôle, des transfections avec les ADNc pour NNT-1-myc, CLF-1-Fc, sCNTFRa-Fc ou le vecteur d'expression vide ont été effectuées en parallèle. Les protéines complexées avec les protéines de fusion Fc ont été immunoprécipitées et NNT- lmyc révélé par « Western blotting » avec un anticorps anti-myc. NNT-1 n'a été détecté que dans les milieux de culture des cellules co-transfectées avec NNT-1-myc et CLF-1- Fc, montrant clairement la formation d'un complexe sécrété hétérodimérique entre ces deux protéines (cf. figure 1B).

EXEMPLE 4 : Le complexe NNT-1/CLF-1 induit la prolifération des cellules BAF/3 transfectées avec les ADNc codant pour CNTFRo/gpl30/LIFRp

Pour identifier les composants du récepteur pour NNT/CLF-1, la capacité du complexe à induire la prolifération de cellules BAF/3 transfectées avec différentes combinaisons des ADNc codant pour IL-6Ra, CNTFRa, gpl30 et LIFR a été étudiée.

Le milieu de culture des cellules COS co-transfectées avec NNT-1/CLF-1 ou NNT- 1/CLF-1-Fc a été testé à des concentrations variées sur les transfectants BAF/3. Le milieu de culture de cellules COS transfectées avec NNT-1 ou CLF-1 seul a été utilisé comme contrôle. Une prolifération n'a été observée que sur les cellules BAF/3 co- transfectées avec la combinaison des ADNc codant pour CNTFRa, gpl30 et LIFR .

Aucune incorporation de [3H]-thymidine n'a été observée dans les cellules transfectées avec gpl30 ou gpl30 et LIFR (figure 2). Ces résultats montrent que le complexe NNT- l/CLF-1 est biologiquement actif et soulignent l'importance de la chaîne a du récepteur au CNTF dans la formation d'un récepteur fonctionnel pour cette cytokine hétéromérique.

EXEMPLE 5 : Le complexe NNT-l/CLF-1 induit la phosphorylation en tyrosine de gpl30 et LIFR dans les cellules SK-N-MC et les BAF/3 transfectées Pour examiner la capacité du complexe NNT-1/CLF-1 à induire les signaux intracellulaires, ledit complexe a été purifié du milieu de culture de cellules COS co- transfectées avec les deux ADNc par immunoaffinité et sa capacité à induire la phosphorylation en tyrosine de gpl30, LIFR a été testée dans des transfectants BAF/3 et des cellules de neuroblastome SK-N-MC. L'exposition au complexe NNT-1/CLF-I des cellules BAF/3 transfectées par la combinaison des ADNc codant pour CNTFRa, gpl30 et LIFR a induit la phosphorylation de LIFR (cf. figure 3). Aucune phosphorylation n'a été observée avec le contrôle représenté par les protéines purifiées par immunoaffinité de cellules COS transfectées avec un vecteur d'expression vide (cf figure 3). D'une manière similaire, l'induction de la phosphorylation de gpl30 et LIFR a été observée sur les cellules de neuroblastome SK-N-MC qui sont connues pour exprimer CNTFRa, gpl30 et LIFR (cf. figure 3) à l'hétérocomplexe a été suivie de la phosphorylation en tyrosine de gpl30, démontrant que le complexe est biologiquement actif. Ces résultats sont en accord avec les observations que les préparations de NNT-1 recombinant produit dans des bactéries peuvent induire la phosphorylation en tyrosine de gpl30, LIFR et STAT 3.

EXEMPLE 6 : Profils d'expression des ARNm codant pour CLF-1 et NNT-1 Les sous-unités CNTFRa, gpl30 et LIFRR formant le récepteur au complexe NNT-1/CLF-1 sont connues pour être exprimées par plusieurs lignées cellulaires dérivées de tumeur du cerveau. La coexpression de CLF-1 et NNT-1 par ces cellules se traduirait par la production de l'hétérocomplexe et une activité autocrine sur leur prolifération.

L'expression des ARNm codant pour CLF-1 et NNT-1 a donc été étudiée par transcriptase reverse-PCR (RT-PCR) dans des lignées cellulaires dérivées de tumeurs du cerveau. Comme montré dans les figures 4A et 4B, 1'expression de l'ARNm codant pour NNT-1 a été observée dans les cellules du neuroblastome SK-N-MC et du glioblastome U373. De manière similaire, CLF-1 est détectable par RT-PCR dans les cellules SK-N- MC et dans plusieurs lignées de glioblastome.

Ces exemples montrent que NNT-1 forme un complexe stable avec CLF-1. La formation de cet hétérocomplexe est indispensable pour le relargage de NNT-1 dans le milieu de culture des cellules et représente la première démonstration d'un tel mécanisme de contrôle de la production dans la famille des cytokines homologue à l'IL-6. Ce mode de contrôle est proche de celui décrit pour l'hétérodimère IL-12 (cf. figures 1A et 1B) (Trinchieri, G., Annu. Rev. Immunol. 13 : 251-276, 1995). II est ainsi fort probable que bien qu'active à haute concentration après production dans les bactéries, NNT-1 n'est normalement sécrétée et donc fonctionnellement active que sous forme d'un complexe avec CLF-1.

L'hétérocomplexe NNT-l/CLF-1 est capable d'induire la phosphorylation en tyrosine de gpl30, et LIFR (3 (cf. figure 2) ainsi que la prolifération des cellules BAF/3 via CNTFRa, gpl30 et LIFR (cf. figure 3). Si l'on considère NNT-1 comme une cytokine conventionnelle et CLF-1 comme une chaîne a soluble, le complexe NNT-1- récepteur comprend deux chaînes a (CLF-1 et CNTFRa). Une telle organisation est sans précédent dans cette famille. Comme son nom l'indique, CNTFRa a été identifiée à l'origine comme un récepteur pour le CNTF (Ip, N. Y. et al., Annu. Rev. Neurosci.

19 : 491-515, 1996), une cytokine permettant la survie des neurones moteur, induisant la différentiation et la prolifération de certaines lignées neuronales et ayant des fonctions neuromusculaires (Alexander, W. S., et al., Curr. Biol. 9 : 605-608, 1999). Agissant sur le même récepteur, le complexe NNT-l/CLF-1 a très probablement les mêmes propriétés.

Les ARNm codant pour NNT-1 et CLF-1 sont exprimés par un relativement grand nombre de tissus (Senaldi, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 : 11458-11463, 1999 ; Shi, Y., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 262 : 132-138, 1999 et Elson, G. C., et al., J. Immunol. 161 : 1371-1379, 1998). L'expression de CNTFRa semble par contre être restreinte au tissu nerveux en développement ou adulte et au muscle squelettique. Les effets du complexe NNT-1/CLF-1 vont donc être limités par la distribution restreinte d'une des chaînes du récepteur, CNTFRa. L'expression de l'ARNm codant pour CLF-1 mRNA a été détectée par hybridation in situ dans le cerveau en développement, le mésenchyme craniofacial (Takahashi, R., et al., Nat.

Genet. 7 : 79-84, 1994) et par Northern blot dans les muscles squelettiques (Elson, G. C., et al., J. Immunol. 161 : 1371-1379, 1998). Bien que 1'expression de l'ARNm de NNT-1 dans les muscles squelettiques adultes ou le cerveau foetal n'ait pas encore été reportée, ces observations suggèrent fortement un rôle potentiel pour l'hétérocomplexe NNT- 1/CLF-1 dans le cerveau en développement, spécialement dans la survie et la différentiation neuronale ainsi que dans la fonction neuromusculaire.

Les souris déficientes pour le gène codant pour CNTF, bien que présentant une dégénération neuronale ont un phénotype peu affecté observable que tardivement chez les adultes (Masu, Y., et al., Nature, 365 : 27-32, 1993). II a aussi été observé que 2, 5 % de la population japonaise est homozygote pour une mutation inactivant le gène du CNTF sans qu'aucun effet puisse être détecté même chez les sujets âgés (DeChiara, T. M., et al., Cell., 83 : 313-322, 1995). Contrastant fortement avec ces observations, les souris déficientes pour CNTFRa ne tètent pas, meurent rapidement après la naissance et montrent une perte dramatique dans la population de neurones moteurs (Yssel, H., et al., J. Immunol. Methods 72 : 219-227, 1984). Ces observations indiquent 1'existence d'un autre ligand non identifié de CNTFRa important au cours du développement, communément appelé CNTF-2. II est clair que CNTF-2 correspond très certainement à l'hétérocomplexe NNT-1/CLF-1. Cette hypothèse est supportée par les observations sur les souris dans lesquelles le gène codant pour CLF-1 a été inactivé : ces souris ont un phénotype superposable à celui observé chez les souris déficientes pour CNTFRa (Takahashi, R., et al., Nat. Genet. 7 : 79-84, 1994).

CNTFRa, gpl30 et LIFRR sont connues pour être exprimées par de nombreuses lignées de neuroblastomes. Une forte expression des ARNm codant pour CLF-1 et NNT- 1 a pu être observée dans les lignées de neuroblastomes et de glioblastomes. Sachant que l'induction d'un signal via gpl30 et LIFT) 3 peut induire la prolifération cellulaire, il est fortement probable que le complexe NNT-l/CLF-1 est impliqué comme facteur de croissance dans ces types de tumeurs cérébrales. De plus, comme les ARNm pour CLF-1 et NNT-1 sont détectables dans le muscle, NNT-l/CLF-1 devrait également être impliqué dans la croissance de certaines tumeurs dérivées du muscle comme des myosarcomes. Nous avons observé par cytométrie en flux que des lignées dérivées de myosarcomes expriment CNTFRa (résultats non présentés).

Le complexe NNT-l/CLF-1, ligand du récepteur CNTFRa, est capable ainsi de former un complexe ternaire avec la forme soluble de CNTFRa qui a été identifiée dans le fluide cérébro-spinal et les muscles squelettiques après dommage (Davis, S., et al., Science, 259 : 1736-1739, 1993). Un tel complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa formé dans le fluide cérébro-spinal aurait certaines « actions à distance » dans le système nerveux central, rendant des cellules normalement insensibles, sensibles à l'effet de NNT-1/CLF- 1. Un complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa agirait ainsi sur toute cellule exprimant gpl30 et LIFR . La formation d'un complexe NNT-1/CLF-l/sCNTFRa dans le muscle squelettique et une diffusion dans la circulation permettrait une action systématique.

Comme déjà mentionné, CLF-1 et NNT-1 ont une distribution tissulaire large et il apparaît donc probable que l'activité de CLF-l/NNT-1 est limitée par 1'expression restreinte de CNTFRa. Contrairement aux autres membres de la famille IL-6, des effets de CNTF sur l'hématopoïèse n'ont pas été reportés. Toutefois, l'addition de CNTFRa soluble ou la transfection de 1'ADNc codant du CNTFRa dans les cellules précurseurs hématopoïétiques les rend sensibles au CNTF (Davis, S., et al., Science, 259 : 1736-1739, 1993 ; Ip, N. Y., et al., Neuron 10 : 89-102, 1993). Ces observations indiquent que bien que des formes solubles du récepteur rendent ces cellules sensibles au CNTF, le CNTFRa n'est pas normalement exprimé par les précurseurs hématopoïétiques. Toutefois, les souris dans lesquelles le gène codant pour CLF-1 a été inactivé ont un nombre réduit de précurseurs hématopoïétiques ce qui suggère un rôle de

cette protéine dans la régulation de l'hématopoïèse (Takahashi, R., et al., Nat. Genet.

7 : 79-84, 1994). II est probable qu'un complexe entre NNT-1, CLF-1 et CNTFRa est responsable de cet effet, bien qu'une réduction de l'hématopoïèse dans les souris déficientes pour CNTFRa n'ait pas été reportée.

EXEMPLE 7 : NNT-1 est aussi sécrété en présence de CNTFR et les deux protéines forment un complexe sécrété hétérodimérique.

Il a été testé si la co-expression de CNTFR avec un dérivé de NNT-1 (NNT- lmyc/pc) résulte dans la sécrétion de NNT-lmyc/pc. L'ADNc codant pour NNT-1- myc/pc a été transfecté seul ou co-transfecté avec celui codant soit pour CLF-1, soit pour la forme transmembranaire de CNTFR (tmCNTFR), soit pour un dérivé soluble (sCNTFR) dans les cellules COS. La présence de NNT-1-myc/pc dans le milieu de culture a été analysé par immunoprécipitation et « Western blot ». La cytokine NNT-1 n'a été observée que dans les surnageants des cellules co-transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1 et soit CLF-1 soit les deux formes de CNTFR (cf. figure 5C). Ces résultats indiquent que le relargage de NNT-1 par les cellules est réalisé après la co- expression de sCNTFR ou la forme membranaire de CNTFR. Il a été ensuite testé si NNT-1 et CNTFR étaient relâchés sous forme d'un hétérocomplexe. Les milieux de culture des cellules transfectées seulement avec NNT-lmyc/pc ou co-transfectées avec NNT-lmyc/pc et sCNTFR ou tmCNTFR ont été immunoprécipités avec des anticorps monoclonaux anti-CNTFR. La présence de NNT-lmyc/pc dans les fractions purifiées en résultant a été analysée par Western blot. NNT-1 n'a été observée que dans les fractions purifiées des surnageants des cellules co-transfectées avec les ADNc codant pour NNT-1 et sCNTFR ou tmCNTFR (cf. figure 5D). Ces résultats démontrent que NNT-1 et sCNTFR forment un complexe sécrété, et que tmCNTFR peut probablement être clivé et ainsi donné naissance à une forme relarguée de CNTFR qui va générer le complexe NNT-1/CNTFRs.

EXEMPLE 8 : Le complexe NNT-1/CNTFR induit la prolifération des cellules BAF/3 transfectées avec les ADNc codant pour gpl30 et LIFR .

Le milieu de culture des cellules COS co-transfectées avec NNT-1/sCNTFR a été testé à des concentrations variées sur les BAF/3 transfectées avec des ADNc codant pour gpl30 et LIFRP. Le milieu de culture de cellules COS transfectées avec NNT-1 ou

sCNTFR seul ou co-transfectées avec NNT-1 et CLF-1 a été utilisé comme contrôle tout comme un milieu de culture contenant la protéine LIF recombinante purifiée (rLIF). Ce contrôle a été ajouté du fait que le récepteur complexe fonctionnel de LIF comprend gpl30 et LIFR . Une prolifération n'a été observée qu'avec le milieu de culture des cellules COS co-transfectées avec NNT-1 et sCNTFR et avec rLIF (figure 6). Ces résultats montrent que le complexe NNT-1/sCNTFR est biologiquement actif sur des cellules exprimant uniquement gpl30 et LIFR et démontrent que l'activité de cette cytokine héterodimérique est indépendante de la protéine CNTFR membranaire.