Die Proteomics-Technologie eröffnet die Möglichkeit, durch Analyse von biologischen Systemen auf der Proteinebene neue biologische Targets und Marker zu identifizieren. Es ist bekannt, dass von den im Genom codierten Proteinen nur jeweils ein bestimmter Teil aller möglichen Proteine exprimiert wird, wobei beispielsweise Gewebetyp, Entwicklungsstand, Aktivierung von Rezeptoren oder zelluläre Interaktionen die Expressionsmuster und-raten beeinflussen. Um Unterschiede der Expression von Proteinen in gesundem oder krankem Gewebe festzustellen, können verschiedene vergleichende Methoden zur Analyse von Protein-Expressionsmustern herangezogen werden ( (a) S. P. Gygi et al., Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A., 2000,97, 9390 ; (b) D. R. Goodlett et al., Proteome Protein Anal., 2000,3 ; (c) S. P. Gygi et al., Curr. Opin. Biotechnol., 2000,11, 396).

Eine leistungsfähige Methode ist dabei die massenspektrometrische Detektion von Proteinen. Bei Verwendung von unterschiedlich isotopencodierten Affinitätsmarker (ICAT'E'= Isotope Coded Affinity Tags) und Tandem-Massenspektrometrie kann dieses Verfahren zur quantitativen Analyse von komplexen Proteinmischungen herangezogen werden ( (a) S. P. Gygi et al., Nature Biotechnology, 1999,17, 994 ; (b) R. H. Aebersold et al., WO 00/11208). Das Verfahren beruht darauf, dass jede von zwei oder mehr zu vergleichenden Proteinmischungen, die in verschiedenen Zellzuständen erhalten worden sind, mit einem Affinitästmarkern anderer Isotopencodierung umgesetzt wird. Die Proteinmischungen werden danach kombiniert, gegebenenfalls fraktioniert oder proteolytisch behandelt und affinitätschromatographisch gereinigt. Nach Elution der gebundenen Fragmente werden die Eluate durch Kombination von Flüssigkeitschromatographie und Massen- spektrometrie (LC-MS) analysiert. Paare bzw. Gruppen von mit sich nur in der Isotopencodierung unterscheidenden Affinitätsmarkern markierten Peptiden sind

chemisch identisch und werden in der HPLC nahezu zeitgleich eluiert, sie unterscheiden sich im Massenspektrometer jedoch um die jeweiligen Molekulargewichtsdifferenzen aufgrund unterschiedlicher Isotopenmuster der Affinitätsmarker. Relative Proteinkonzentrationen können direkt durch Messungen der Peakflächen erhalten werden. Geeignete Affinitätsmarker sind Konjugate aus Affinitätsliganden, die über Brückenglieder kovalent mit proteinreaktiven Gruppen verknüpft sind. Dabei werden in die Brückenglieder unterschiedliche Isotope eingebaut. Das Verfahren wurde anhand von Affinitätsmarkern, in denen Wasserstoff-Atome durch Deuterium-Atome ersetzt wurden ('H/2D- Isotopencodierung) beschrieben.

Die im Stand der Technik beschriebene Methode mit lH/2D-isotopencodierten Affinitätsmarkem weist verschiedene Nachteile auf, insbesondere einen Isotopeneffekt der unterschiedlich markierten, aber ansonsten identischen Peptidfragmente im LC, eine nicht ausreichende Stabilität der Affinitätsmarker im allgemeinen und speziell im LC-MS/MS und eine mangelnde Effizienz der Avidin- Monomer-basierten Affinitätschromatographie.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung verbesserter Affinitätsmarker.

Gegenstand der Erfindung sind organische Verbindungen, geeignet als Affinitätsmarker-Reagenzien zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, der Formel (I), A-L-PRG (I) in der A für einen Affinitätsliganden-Rest, PRG für eine proteinreaktive Gruppe und L für einen A und PRG kovalent verknüpfenden Linker steht,

wobei der Linker L eine säurespaltbare Gruppe S der Formel enthält, in der Y für eine optional verzweigte Abstandhaltergruppe mit einer Kettenlänge von 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 5 Nicht-Wasserstoff-Atomen und SK für die Seitenkette einer Aminosäure steht, oder deren Salze.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer oder mehrerer unterschiedlich isotopenmarkierter erfindungsgemäßer Verbindungen als Reagenz zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen, insbesondere zur Identifikation von einem oder mehreren Proteinen oder Protein-Funktionen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben und zur Bestimmung der relativen Expressions-Niveaus von einem oder mehreren Proteinen in einer oder mehreren Protein-haltigen Proben.

Die säurespaltbare Gruppe S gewährleistet als Sollbruchstelle unter Säureeinwirkung eine Spaltung des Affinitätsmarkers, um so z. B. die Freisetzung von der Affinitätssäule zu erleichtern, den am Peptid verbleibenden Rest zu verkleinern und/oder die Arbeitsabläufe insgesamt effizienter zu gestalten. Diese säurelabile Sollbruchstelle ermöglicht eine Dekomplexierung der Peptidfragmente durch eine wesentlich effizientere Streptavidin-basierte Affinitätschromatographie für Biotin- modifizierte Peptidfragmete. Vorteilhaft ist auch, dass die nach Säurespaltung an den Peptidfragmenten verbleibenden Tags ein deutlich niedrigeres Molekulargewicht

sowie eine höhere Isotopendichte aufweisen. Weiterhin wird die Handhabung der Affinitätsmarker durch bessere Löslichkeit und durch eine kristalline oder amorphe Erscheinungsart gegenüber dem Stand der Technik verbessert.

Die in der säurespaltbaren Gruppe S enthaltene Abstandhaltergruppe Y ist in ortho-, meta-oder para-Stellung zu dem Stickstoff-Atom an den Benzolring gebunden, wobei die para-Stellung bevorzugt ist. Geeignete Abstandhaltergruppen Y sind beispielsweise aus den Bausteinen NH, CH2 und/oder CO aufgebaute Ketten, in denen ein oder mehrere Wasserstoff-Atome durch gleiche oder verschiedene, optional Heteroatom-haltige Kohlenwasserstoffreste, insbesondere CI-C4-Alkylreste, substituiert sein können. Bevorzugt enthält Y mindestens eine NH-Gruppe, insbesondere an ihrem vom Benzolring abgewandten Ende. Besonders bevorzugte Abstandhaltergruppen Y sind NH, NH-CH2 und NH-CH2-CH2-NH-CO, wobei die beiden letzteren vorzugsweise mit der CH2-bzw. CO-Gruppe an den Benzolring gebunden sind.

Bei der Aminosäure-Seitenkette SK handelt es sich um die Seitenkette einer a-Aminosäure der Formel SK-CH (NH2) -COOH, die für andere SK als ein H-Atom in der D-, L-oder racemischen Form vorliegen kann. Geeignete SK sind beispielsweise die Seitenketten der 20 natürlichen Aminosäuren sowie deren D- Formen und Racemate, z. B. die Seitenketten von L-Glycin, L-Histidin, L-Valin, D- Valin, L-Prolin, L-Asparagin, L-Asparaginsäure und L-Glutaminsäure. Gegebenen- falls in SK vorhandene weitere funktionelle Gruppen, beispielsweise bei Amino- säuren wie Histidin oder Asparaginsäure, können optional frei oder mit einer Schutzgruppe geschützt vorliegen.

Der Affinitätsligand A dient zur selektiven Anreicherung von Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie. Die Affinitätssäulen sind mit den entsprechenden komplementären Partnern zu den Affinitätsliganden versehen, welche kovalente oder nicht kovalente Bindungen mit den Affinitätsliganden eingehen. Ein Beispiel für einen geeigneten Affinitätsliganden ist Biotin oder ein Biotin-Derivat, das mit den komplementären Peptiden Avidin oder Streptavidin starke, nicht kovalente

Bindungen eingeht. Auf diese Weise können zu untersuchende Proben mit Hilfe der Affinitätschromatographie selektiv aus Probenmischungen isoliert werden. Im gleichen Sinn können beispielsweise auch Kohlenhydrat-Reste, die nicht kovalente Wechselwirkungen mit beispielsweise fixierten Lektinen eingehen können, als Affinitätsligand verwendet werden. Weiterhin kann im gleichen Sinn die Wechselwirkung von Haptenen mit Antikörpern oder die Interaktion von Übergangsmetallen mit entsprechenden Liganden als Komplexbildner genutzt werden oder andere Systeme die miteinander in Wechselwirkung treten. In noch einer weiteren Ausführungsform kann der Affinitätsligand A eine funktionelle Gruppe darstellen, die eine kovalente Fixierung des Affinitätsmarker-Reagenzes an eine polymere Matrix ermöglicht.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen steht A für den Acylrest eines Affinitätsliganden, beispielsweise Biotinyl oder ein Biotin- Derivat.

Proteinreaktive Gruppen PRG dienen der gezielten Markierung der Proteine an ausgewählten funktionellen Gruppen. PRGs haben eine spezifische Reaktivität für endständige funktionelle Gruppen der Proteine. Aminosäuren als Elemente von Proteinen, die häufig für gezielte Markierungen verwendet werden, sind beispielsweise Mercaptoaminomonocarbonsäuren wie Cystein, Diaminomono- carbonsäuren wie Lysin oder Arginin oder Monoaminodicarbonsäuren wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure. Weiterhin können proteinreaktive Gruppen auch phosphatreaktive Gruppen wie beispielsweise Metallchelate sowie aldehydreaktive und ketonreaktive Gruppen wie beispielsweise Amine mit Natriumborhydrid oder Natriumcyanoborhydrid sein. Ebenso können es Gruppen sein, die nach einer gezielten Proteinderivatisierung wie beispielsweise einer Bromcyanspaltung oder einer Elimination von Phosphatgruppen etc. mit den Umsetzungsprodukten reagieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindungen steht PRG für den Rest einer proteinreaktiven Gruppe steht, die charakterisiert ist durch

eine elektrophile Gruppe und eine geeignete Brücke, die die Anbindung der elektrophilen Gruppe an den Linker L ermöglicht oder erleichtert, vorzugsweise verbrückte Elektrophile wie -CO-[CH2] r-Cl r =1-10, -CO-CH=CH2 oder eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe, wie sie z. B. von W. H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, AcademicPress Inc. 1987, S. 30ff beschrieben und zusammengefasst wurden.

Zur Verbesserung der Löslichkeit der erfindungsgemäßen Affinitätsmarker können vorhandene saure und/oder basische funktionelle Gruppen in Form ihrer Salze, bevorzugt ihrer Hydrochloride, Trifluoracetate oder Alkalimetall-Salze, hergestellt und eingesetzt werden.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung weist die proteinreaktive Gruppe PRG löslichkeitsverbessernde funktionelle Gruppen auf.

Bevorzugte erfindungsgemäße Verbindungen sind solche der Formel (II) A-S-B1-Xl- (CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (II)

in welcher A für den Acylrest eines Affinitätsliganden steht, beispielsweise Biotinyl oder ein Biotin-Derivat, PRG für den Rest einer proteinreaktiven Gruppe steht, die charakterisiert ist durch eine elektrophile Gruppe und eine geeignete Brücke, die die Anbindung der elektrophilen Gruppe an X4 ermöglicht oder erleichtert, vorzugsweise verbrückte Elektrophile wie -CO-[CH2] r-Cl r= 1-10,<BR> <BR> -CO-CH=CH2 oder eine andere bekannte proteinreaktive Gruppe, wie sie z. B. von W. H. Scouten in Methods in Enzymology, Volume 135, edited by Klaus Mosbach, AcademicPress Inc. 1987, S. 30ff beschrieben und zusammengefasst wurden, S die erfindungsgemäße säurespaltbare Gruppe ist, XI, X2, X3 unabhängig voneinander und auch für X2 unabhängig von anderen X2 jeweils für O, S, NH, NR, CO, CO-O, O-CO, CO-S, S-CO, S-S, SO, SO2, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Si-O, O-Si, Arylen-

oder Diarylengruppen stehen, wobei auch Xl, X2, oder X3 teilweise oder vollständig nicht vorhanden sein können, X4 für O, S, NH, NR, CO-NR, NR-CO, CS-NR, NR-CS, Arylen-oder Diarylengruppen steht, besonders bevorzugt NH, NR, O oder S, m, n, p, q, r, z, s, x unabhängig voneinander jeweils für eine Zahl von 0 bis 100 stehen, wobei die Summe n + xm + p bevorzugt kleiner als 100 ist und besonders bevorzugt zwischen 5 und 30 liegt, B für eine optional vorhandene Amin-Gruppe NRR'mit der Konnektivität S-NRR'-Xl steht, die als Brücke S mit Xi verknüpft, wobei Bl zusammen mit Xl Teil eines Aminosäure-Derivats sein kann, und R, R'unabhängig voneinander jeweils für Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy oder Aryl oder beide gemeinsam mit N für einen N-Heterocyclus NRR'stehen, wobei R'zusätzlich an Xl gebunden ist und daher nicht für Wasserstoff stehen kann, wobei R und R' neben Xl weiterhin modifiziert sein können durch funktionelle Gruppen, die beispielsweise die Löslichkeit verbessern, wie z. B.

Carboxyl-oder Aminogruppen, und wobei R und R'in der Form substituiert vorliegen können, dass Bl-Xl zusammen das Derivat einer Aminosäure ergeben, und wobei die nicht an der Bindung mit S oder mit CH2 beteiligten funktionellen Gruppen beispielsweise zur verbesserten Löslichkeit beitragen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Alkoxy, Aryl, Arylen und N-Heterocyclyl, soweit nicht anders spezifiziert, die folgende Bedeutung :

Alkyl per se und"Alk"in Alkoxy stehen für einen linearen oder verzweigten Alkylrest mit in der Regel 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4, besonders bevorzugt 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, tert. -Butyl, n-Pentyl und n-Hexyl.

Alkenyl steht für einen Alkylrest mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und in der Regel 1, 2 oder 3 Doppelbindungen, beispielsweise und vorzugsweise für Ethenyl, n- Propenyl und Methylethenyl.

Alkinyl steht für einen Alkylrest mit mindestens 2 Kohlenstoffatomen und in der Regel 1, 2 oder 3 Dreifachbindungen, beispielsweise und vorzugsweise für Ethinyl und Propinyl.

Alkoxy steht beispielhaft und vorzugsweise für Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, tert. -Butoxy, n-Pentoxy und n-Hexoxy.

Aryl steht für einen mono-bis tricyclischen aromatischen, carbocyclischen Rest mit in der Regel 6 bis 14 Kohlenstoffatomen, beispielhaft und vorzugsweise für Phenyl, Naphthyl und Phenanthrenyl. Arylen steht für einen bivalenten Arylrest, beispielhaft und vorzugsweise für Phenylen, Naphthylen und Phenanthrenylen.

N-Heterocyclyl steht für einen mono-oder polycyclischen, vorzugsweise mono-oder bicyclischen, nicht-aromatischen heterocyclischen Rest mit in der Regel 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8 Ringatomen und mindestens einem N-Heteroatom und insgesamt bis zu 3, vorzugsweise bis zu 2 Heteroatomen und/oder Heterogruppen aus der Reihe N, O, S, SO, SO2. Die N-Heterocyclyl-Reste können gesättigt oder teilweise ungesättigt sein. Bevorzugt sind 5-bis 8-gliedrige, monocyclische gesättigte N-Heterocyclylreste mit insgesamt bis zu zwei Heteroatomen aus der Reihe O, N und S, wie beispielhaft und vorzugsweise Pyrrolidin-2-yl, Pyrrolidin-3-yl, Pyrrolinyl, Piperidinyl, Morpholinyl und Perhydroazepinyl, insbesondere Pyrrolidin-2-yl und Piperidin-4-yl.

Die nicht-isotopenmarkierten Verbindungen stellen bereits eine Isotopencodierung dar. Zur weiteren Isotopencodierung werden die erfindungsgemäßen Verbindungen vorzugsweise mit mindestens einem Kohlenstoff-Atom des Isotops 13C, insbesondere vier bis 15 13C-Atomen, isotopenmarkiert. Der mit lH/2D-Affmitätsmarkern beobachtete nachteilige Isotopeneffekt in der LC wird durch die l2C/l3C- Isotopenkodierung deutlich verringert. Alternativ oder zusätzlich können zur Markierung auch die Isotope 2D, 15N, 170, 1$0 und/oder 34S eingesetzt werden.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden 13C-markierte Verbindungen zusätzlich mit mindestens einem Stickstoff-Atom des Isotops 15N, vorzugsweise ein bis drei 15N-Atomen, insbesondere einem 15N-Atom, isotopenmarkiert.

Die Isotopenmarkierungen werden üblicherweise in L und/oder PRG vorgenommen, insbesondere in L und bei Verbindungen der Formel (II) in CH2-Gruppen, B und/oder Xl.

Die säurespaltbare Gruppe S ist bevorzugt am PRG-terminalen Ende des Linker L angeordnet und die Abstandhaltergruppe Y direkt an die proteinreaktive Gruppe PRG gebunden, beispielsweise in Form von Verbindungen der Formel (II).

Der Grad der Säurespaltbarkeit der säurespaltbaren Gruppe S hängt von der Struktur des jeweiligen Linker L ab und kann moduliert und somit den Erfordernissen der jeweiligen Verwendung der Verbindungen angepasst werden. Wird beispielsweise Säurespaltbarkeit unter milden Bedingungen angestrebt, so haben sich als besonders günstig Verbindungen der Formel (II) erwiesen, in der Bl für eine Amin-Gruppe NRR'steht, in der auch R ungleich Wasserstoff ist, in der insbesondere R und R' beide für Alkyl oder gemeinsam mit N für N-Heterocyclyl stehen, beispielsweise und vorzugsweise die Amin-Gruppen N (CH3) CH2, Pyrrolidin-2-yl und Piperidin-4-yl.

Solche milden Bedingungen sind beispielsweise in verdünnter Trifluoressigsäure gegeben, z. B. bei Verdünnung auf einen Gehalt von weniger als 50 Vol.-%,

insbesondere weniger als 20 Vol. -%, in einem Gemisch von Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis von 1 zu 1.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise hergestellt werden indem eine Gruppe H-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (III) mit V = H oder OH, bevorzugt H, zunächst mit einem an der N-terminalen Aminogruppe geschützten Aminosäurederivat nach in der Peptidchemie gängigen Kupplungsmethoden umgesetzt wird zu einem Konjugat SG-NH-CH (SK)-CO-B1-X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-V (IV) mit SG einer in der Peptidchemie gängigen Schutzgruppe, bevorzugt Boc und mit SK dem Rest einer Aminosäureseitenkette in der D-oder L-Konfiguration oder in der racemischen Form.

Anschließend kann (IV) mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe einer proteinreaktiven Gruppe der Formel U-PRG (V) mit U einer Gruppe, die die Verknüpfung von PRG mit X4 ermöglicht, indem sie zum Beispiel zusammen mit dem Rest V in (IV) zu einer Abgangsgruppe wird, umgesetzt werden. Beispiele für solche Gruppen sind aktivierte Ester wie z. B. N- Hydroxysuccinimid-ester oder Chloride oder Gruppen, aus denen während der Kupplung eine Abgangsgruppe generiert werden kann.

In einem weiteren Schritt wird dann die Aminoschutzgruppe SG abgelöst, wobei ein Konjugat der Formel (VI) erhalten wird H2N-CH (SK)-CO-B1-Xl- (CH2)"- [X'- (CH2)..] x-X'- (CH2) p-X"-PRG (VI) Parallel dazu wird der Affinitätsligand A-OH oder eine aktivierte Form desselben, beispielsweise ein aktivierter Ester oder ein Säurechlorid, unter geeigneten Kupplungsbedingungen mit einer Verbindung die optional auch eine Schutzgruppe tragen kann, zur Verbindung umgesetzt. Die Verbindung (VIII) wird dann ggf. nach vorheriger Abspaltung einer optional eingeführten Schutzgruppe mit aktivierten Kohlensäurederivaten wie Thiophosgen oder Thiocarbonylbisimidazol in ein entsprechendes Isothiocyanat überführt und anschließend mit (VI) zum Thioharnstoff (IX) gekuppelt.

Im letzten Schritt können gegebenenfalls noch vorhandene Schutzgruppen optional abgespalten werden, um so Konjugate der Formel (II) zu erhalten.

A-S-B (CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (II)

In einer bevorzugten Ausführungsform des Herstellungsverfahrens umfasst (IV) eine Verbindung der Formel Boc-NH-CH (SK)-CO-NH- (CH2) 3-0- (CH2) 2-0- (CH2) 2-0- (CH2) 3-NH2 (X) das mit einer Verbindung der Formeln (XI a-c) reagiert U-CO- [CHZ] T Cl r =. 1-10 (XI b) U-CO-CH=CH2 (XI c) und nach Ablösung der Boc-Schutzgruppe in Gegenwart von Ethyldiisopropylamm oder einer anderen geeigneten Base mit einem aus Verbindung (VIII) generierten Isothiocyanat, beispielsweise dem Isothiocyanat zu den Zielverbindungen der Formel (II) umgesetzt wird.

In allen Reaktionschritten können reversibel abspaltbare Schutzgruppen, wie sei in der Peptidchemie üblich sind, eingesetzt werden. Eine Schutzgruppe SG kann erhalten bleiben oder gleichzeitig mit der Boc-Schutzgruppe oder in einem separaten Schritt abgelöst werden. Geeignete Schutzgruppen sind beispielsweise die mit Trifluoressigsäure spaltbare Boc-Schutzgruppe oder die mit Piperidin oder

Morpholin spaltbare Fmoc-Schutzgruppe. Weitere geeignete Schutzgruppen und die entsprechenden Methoden zur Einführung und Abspaltung wurden z. B. beschrieben in (a) Jakubke/Jeschkeit : Aminosäuren, Peptide, Proteine ; Verlag Chemie 1982 oder (b) Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Vierte Auflage ; Band 15.1 und 15.2, herausgegeben von E. Wünsch.

Optional können die erfindungsgemäßen Affinitätsmarker auch in umgekehrter Reihenfolge aufgebaut werden, wobei zunächst in ein Derivat der Formel SG-NH-CH (SK)-Co-Bi-XI-(CH2) n-[X2-(CH2) m] x-X3-(CH2) p-X4-V (IV) eine geeignete weitere Schutzgruppe SG', vorzugsweise die Fmoc-Schutzgruppe, nach Standardmethoden ((a) Jakubke/Jeschkeit : Aminosäuren, Peptide, Proteine ; Verlag Chemie 1982 ; (b) Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, Georg Thieme Verlag Stuttgart, Vierte Auflage ; Band 15.1 und 15.2, herausgegeben von E.

Wünsch) eingeführt wird, wobei SG-NH-CH (SK)-CO-B (CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-SG' (XIII) entsteht.

Im nächsten Schritt wird die N-terminale Schutzgruppe SG abgelöst und das erhaltene Derivat (XIII) dann mit dem aus (VIII) generierten Isothiocyanat wie beispielsweise (XII) umgesetzt zu Verbindungen der Formel A-S-B1-Xl- (CHZ) n- [XZ- (CHZ) m] X X3- (CH2) p-X4-SG' (XIV).

Nach Ablösung der Schutzgruppe SG', beispielsweise der Fmoc-Schutzgruppe mit Piperidin, wird im letzten Schritt die Kupplung mit dem Derivat einer proteinreaktiven Gruppe oder der aktivierten Vorstufe einer proteinreaktiven Gruppe U-PRG (V)

vorgenommen und das Konjugat A-S-B1-SX1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-(CH2)p-X4-PRG (II) erhalten.

Die Reaktionen können bei verschiedenen Druck-und Temperaturverhältnissen durchgeführt werden, üblicherweise bei 0,5 bis 2 bar, bevorzugt unter Normaldruck, d. h. bei etwa 1 bar, und-30 bis +100 °C, vorzugsweise-10 bis + 80 °C, insbesondere 0 bis 30 °C. Die Durchführung erfolgt in geeigneten Lösungsmitteln wie Dimethylformamid (DMF), Tetrahydrofuran (THF), Dichlormethan, Chloro- form, Cl-C4-Alkoholen, Acetonitril, Dioxan, Wasser oder in Gemischen der genannten Lösungsmittel. In der Regel sind Reaktionen in DMF, Dichlormethan, THF, Dioxan/Wasser oder THF/Dichlormethan bei Raumtemperatur (RT), d. h. etwa 20 °C, oder unter Eiskühlung und Normaldruck bevorzugt.

Beispiele Verwendete Abkürzungen : Boc-tert-Butoxycarbonyl DIEA-Diisopropylethylamin (Hünig's base) DMAP-Dimethylaminopyridin DMF-Dimethylformamid DMSO-Dimethylsulfoxid EDCI-N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl-carbodiimid, x HC1 EI-Elektronenstoß-Ionisation ESI-Elektrospray-Ionisation Fmoc-Fluorenyl-9-methoxycarbonyl<BR> HOBT-1-Hydroxy-lH-benzotriazol HPLC-High-performance liquid chromatography MALDI-Matrix-unterstützte Laserdesorption-Ionisation MS-Massenspektroskopie MTBE-Methyl tert-butyl ether RP-Reverse phase RT-Raumtemperatur TCEP-Triscarboxyethylphosphin TFA-Trifluoressigsäure THF-Tetrahydrofuran TLC-Thin layer chromatography (v/v)-Konzentrationsangabe in Volumen pro Volumen (w/v)-Konzentrationsangabe in Masse pro Volumen wässr.-wässriger Die Angabe der Zusammensetzung von Lösungsmittel-und Elutionsmittelgemischen erfolgt, soweit nicht ausdrücklich anders angegeben, durch jeweils von"/"getrennte Angabe der Komponenten und nachgestellt der relativen Volumenteile. So bedeutet

z. B."Acetonitril/Wasser 10/1"ein Gemisch von Acetonitril und Wasser im Volumenverhältnis von 10 zu 1.

Bevorzugt verwendete Elutionsmittel (Bezugnahme durch Angabe von 1) etc.) : l) AcetonitriVWasser 10/1 2) Acetonitril/Wasser 20/1 3) Dichlormethan/Methanol 97,5/2, 5 4) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/1/0, 1 5) Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2 6) Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1, 5 7) Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/2/0,2 Zur nachfolgend beschriebenen Herstellung beispielhafter Affinitätsmarker wurden zunächst die Biotin-Derivate der Edukt-Serie 1 und die Zwischenprodukte der Edukt- Serie 2 hergestellt. Diese Edukte wurden anschließend zu den entsprechenden Affinitätsmarker umgesetzt.

Edukt-Serie 1 : Biotin-Derivate E. 1. 1 1 g (4,09 mmol) Biotin, 500 mg (4,09 mmol) 4-Aminobenzylamin sowie 830 mg (6,14 mmol) 1-Hydroxy-1H-benzotriazol, 942 mg (4,91 mmol) N- (3-Dimethyl- aminopropyl) -N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid und 1587 mg Ethyl-diisopropyl- amin wurden in 40 ml DMF zusammengegeben. Es wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand aufgereinigt durch Flash-

Chromatographie an Kieselgel (Elutionsgemisch : Dichlormethan/Methanol/wässr.

Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacüo abgedampft. Der Rückstand wurde mit Diethylether verrührt und abgesaugt. Es wurden 1097 mg (77 %) des Zwischenproduktes erhalten [TLC : Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5 : Rf = 0, 58] [ESI-MS : m/e = 349 (M+H) +].

600 mg (1,72 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 40 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 298 mg (2,58 mmol) Thiophosgen und 890 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das Zielprodukt E. 1.1 wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.

Ausbeute : 616 mg (92 %) [TLC : Rf= 0, 56 5)] [ESI-MS : m/e = 391 (M+H) +].

E. 1.2 Mono-Fmoc-geschütztes p-Phenylen-diamin wurde nach Standard-Methoden, wie sie z. B. in Houben Weyl ; Methoden der Organischen Chemie ; Vierte Auflage ; Band XV Teil 1 und 2 ; Georg Thieme Verlag Stuttgart 1974, oder in Hans-Dieter Jakubke and Hans Jeschkeit : Aminosäuren, Peptide, Proteine ; Verlag Chemie, Weinheim 1982 beschrieben sind, hergestellt.

200 mg (0,82 mmol) Biotin wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 974 mg (8,2 mmol) Thionylchlorid versetzt. Nach l h Rühren wurde eingeengt und zweimal mit Dichlormethan nachdestilliert.

Das entstandene Säurechlorid (0,81 mmol) wurde in 30 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 387 mg (4,9 mmol) Pyridin sowie mit 242 mg (0,55 mmol)

von Mono-Fmoc-geschütztem p-Phenylen-diamin versetzt. Es wurde 2 Tage bei RT gerührt und das ausgefallene Produkt abfiltriert. Erhalten wurden 300 mg (99 %) des Intermediats, das ohne weitere Aufreinigung in den nächsten Reaktionsschritt eingesetzt wurde [TLC : Rf= 0,5 1)].

Das Rohprodukt wurde in 5 ml DMF aufgenommen und mit 500 1ll Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch 7)).

Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in vacuo getrocknet. Erhalten wurden 69 mg (39 %) des entschützten Intermediats.

65 mg (0,19 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 10 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 33 mg (0, 29 mmol) Thiophosgen und 100 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 10 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das Zielprodukt E. 1. 2 wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.

Ausbeute : 65 mg (89 %) [TLC : Rf= 0,43 1)] [ESI-MS : m/e = 377 (M+H) +].

E. 1.3 500 mg (3,65 mmol) 4-Amino-benzoesäure wurden in 20 ml DMF aufgenommen und mit 872 mg (2,73 mmol) vom Hydrochlorid des Mono-Fmoc-geschützten Ethylendiamins sowie mit 739 mg (5,47 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und mit 839 mg (4,38 mmol) N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid versetzt. Es wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, eingeengt und der Rückstand in 200 ml Dichlormethan aufgenommen. Es wurde dreimal mit 200 ml Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde

eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel : Acetonitril). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Erhalten wurden 639 mg (59 %) des Zwischenproduktes [TLC : Rf= 0, 68 2)] 400 mg (1 mmol) des Intermediats wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 500 p1 Piperidin versetzt. Nach 15 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch : Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand in vacuo getrocknet. Erhalten wurden 147 mg (82 %) des entschützten Intermediats [TLC : Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0,2 : Rf= 0,18].

191 mg (0,78 mmol) Biotin wurden in 10 ml DMF aufgenommen und mit 158 mg (1,17 mmol) 1-Hydroxy-lH-benzotriazol und 180 mg (0,94 mmol) N- (3-Dimethyl- aminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid versetzt. Es wurde 10 min bei RT gerührt und dann 303 mg Ethyl-diisopropylamin sowie 140 mg (0,78 mmol) des entschützten Intermediats zugesetzt. Dann wurde nochmals 6 h bei RT gerührt, eingeengt und das Rohprodukt aus Dichlormethan mit Diethylether ausgefällt. Der Rückstand wurde abgetrennt und durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsgemisch : Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Es wurden 222 mg (70 %) des Zwischenproduktes erhalten [TLC : Dichlormethan/Methanol/wässr. Ammoniak (17 %) 15/4/0,5 : Rf = 0, 47].

200 mg (0,54 mmol) dieses Zwischenproduktes wurden in 15 ml Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und mit 94 mg (0, 81 mmol) Thiophosgen und 210 mg Ethyl-diisopropylamin versetzt. Es wurde 15 min bei Raumtemperatur gerührt und eingeengt. Das Zielprodukt wurde aus Dichlormethan/Methanol mit Diethylether ausgefällt.

Ausbeute : 230 mg (95 %) [TLC : Acetonitril/Wasser/Eisessig 5/1/0, 2 : Rf= 0,44] [ESI-MS : m/e = 448 (M+H) +].

Edukt-Serie 2 E. 2.1 Zu einer Lösung von 4,7, 10-Trioxa-1, 13-tridecandiamin (1 g, 4,54 mmol) in 30 ml Dichlormethan wurden 913,2 mg (4,54 mmol) Boc-Glycin-N-carboxy-anhydrid sowie 100 mg 4-Dimethylaminopyridin gegeben und 16 h bei RT gerührt. Der Ansatz wurde dann bei vermindertem Druck eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und mit wenig Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde dann über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie gereinigt (Eluent : Dichlormethan/Methanol/wässr.

Ammoniak (17 %) 15/3/0,3). Die entsprechenden Fraktionen wurden gesammelt, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 333 mg (20 %) eines Öls [TLC : Rf= 0,26 5)].

E. 2. 2 Zu einer Lösung von 4,7, 10-Trioxa-1, 13-tridecandiamin (195 mg, 0, 88 mmol) in 20 ml Dichlormethan wurden 400 mg (0,88 mmol) Bis-tert-butoxycarbonyl-histidin- N-hydroxysuccinimidester gegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Flash- Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel : Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 17 % 15/3/0, 3) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das

Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Erhalten wurden 165 mg (34 %) eines Öls [TLC : Rf= 0, 31 5)].

E. 2.3

500 mg (2,3 mmol) Boc-D-Valin sowie 467 mg (3,45 mmol) 1-Hydroxy-1H- benzotriazol und 530 mg (2,76 mmol) N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 25 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurden 507 mg (2,3 mmol) 4,7, 10-Trioxa-1, 13- tridecandiamin hinzugegeben und der Ansatz über Nacht bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase eingeengt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 7)).

Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Erhalten wurden 220 mg (23 %) eines Öls [TLC : Rf = 0, 29 5)].

E. 2.4

Zu der Lösung von 4,7, 10-Trioxa-1, 13-tridecandiamin (20,0 g ; 90,8 mmol) in 2-Pro- panol (2000 ml) wurde bei-10 °C eine Lösung von Chlorameisensäure- (9-

fluorenylmethyl)-ester (23,5 g ; 90, 8 mmol) in Tetrahydrofuran (500 ml) langsam zugetropft. Nach 2 h wurde der Ansatz bei vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (1000 ml) aufgenommen und zweimal mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung (je 250 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Der Rückstand war weitgehend einheitlich und frei von dem Ausgangsprodukt 4,7, 10-Trioxa-1, 13-tridecandiamin. Die Ausbeute an Rohprodukt betrug 36,5 g (91 %) in Form eines Sirup [TLC : Dichlor- methan/Methanol 5/1 : Rf= 0,27] [ESI-MS : m/z 443,4 (M+H) +].

E. 2. 5 378 mg (2,2 mmol) Boc-Glycin sowie 364 mg (2,7 mmol) 1-Hydroxy-1H-benzo- triazol und 413 mg (2,16 mmol) N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid Hydrochlorid wurden in 30 ml DMF zusammengegeben und 30 min bei RT gerührt.

Anschließend wurden 1000 mg (1,8 mmol) der Verbindung E. 2.4 hinzugegeben und der Ansatz 2 h bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase eingeengt und der Rückstand durch Flash- Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 2)), Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen und mit Wasser ausgeschüttelt.

Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt.

Erhalten wurden 797 mg (76 %) eines Öls [TLC : Rf= 0, 64 1)].

E. 2.6 Aus den 790 mg (1,35 mmol) der Verbindung E. 2.5 wurde die Boc-Schutzgruppe nach Standardbedingungen mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgelöst (800 mg, 98 %).

790 mg (1,32 mmol) des entschützten Intermediats wurden in 30 ml DMF aufgenommen und mit 514 mg (1,32 mmol) der Verbindung E. l. 1 sowie mit 511 mg N, N-Diisopropylethylamin vesetzt und 16 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft, der Rückstand mit 30 ml Wasser verrührt und der verbleibende Feststoff abfiltriert. Er wurde in Dichlormethan/Methanol aufgenommen und an- schließend mit Diethylether die Zielverbindung ausgefällt. Erhalten wurden nach Filtration und Trocknung 1077 mg (93 %) [TLC : Rf= 0,4 4)].

1070 mg (1,22 mmol) dieses Intermediats wurden in 25 ml DMF aufgenommen und mit 1 ml Piperidin versetzt. Nach 45 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan digeriert. Anschließend wurde abfiltriert und der Filterrückstand in einer Mischung aus 10 ml Dichlormethan und 10 ml Methanol suspendiert. Nach Zugabe von 100 ml Diethylether fiel das Produkt vollständig aus und wurde abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 805 mg (99 %) des Zielproduktes E. 2.6 [TLC : Acetonitril/Wasser/Eisessig 10/3/1,5 Rf= 0,4].

E. 2.7

Diethylenglycol (3,18 g ; 30 mmol) wurde zu einer Lösung aus wässrigem Kalium- hydroxid (40 % ; 120 mg) und 1,4-Dioxan (3,75 ml) getropft. Die Lösung wurde unter Eiskühlung tropfenweise mit Acrylsäurenitril-1, 2, 3-(l3C) 3 (3,36 g ; 60 mmol) versetzt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wurde 16 h nachgerührt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan (30 ml) verdünnt und zweimal mit gesättigter Kochsalz- lösung gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde säulenchromatographisch gereinigt (Eluent : Dichlormethan/Me- thanol 50/1). Ausbeute : 6,21 g (95 %), Konsistenz : Sirup [TLC : Dichlormethan/Methanol 10/1 : Rf= 0,71 ; MS (ESI) : m/z 241,1 (M+Na) +, 219,1 (M+H) +].

E. 2.8 Die Lösung der Verbindung E. 2.7 (5,0 g ; 22,9 mmol) in Methanol (115 ml) und konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (68 ml) wurde mit Raney-Nickel (2,5 g) versetzt und 5 h bei 100 °C und 100 bar mit Wasserstoff hydriert. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde der Katalysator abgesaugt. Das Filtrat wurde eingeengt.

Der Rückstand wurde dreimal in Ethanol aufgenommen und eingeengt. Ausbeute : 3,84 g (74 %), Konsistenz : Sirup [TLC : Dichlormethan/Methanol/Ammoniak 4/3/l : Rf = 0,27] [MS (ESI) : m/z 227,3 (M+H) + ; 13 C-NMP, (100,6 MHz, CDC13) : 8 = 69,48, 69,10 (13CH2-0), 39,13, 38,77 (13CH2-NH2), 32,74, 32,38, 32,36, 32,01 (13CH2- 13CH2-13CH2)].

E. 2.9 Zu der Lösung der Verbindung E. 2. 8 (1,0 g ; 4,42 mmol) in 2-Propanol (50 ml) wurde bei-10 °C eine Lösung von Chlorameisensäure- (9-fluorenylmethyl)-ester (1,14 g ; 4,42 mmol) in Tetrahydrofuran (20 ml) gegeben. Es wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt und 16 h gerührt. Die Mischung wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Dichlormethan (50 ml) aufgenommen, zweimal mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und eingeengt. Der Rückstand ist weitgehend einheitlich und wurde ohne weitere Aufreinigung in der Folgestuie eingesetzt. Ausbeute : 1,76 g (89 %), Konsistenz : Sirup [TLC : Dichlormethan/Me- thanol 5/1 : Rf 0, 27] [MS (ESI) : m/z 449,4 (M+H)+].

E. 2.10 In 15 g (68 mmol) 4,7, 10-Trioxa-1, 13-tridecandiamin wurde nach Standardbedingun- gen mit Di-tert-butyldicarbonat in Dichlormethan die Boc-Schutzgruppe eingeführt [TLC : Rf= 0, 34 5)].

E. 2.11

372 mg (2 mmol) Maleimidobuttersäure sowie 316 mg (2,34 mmol) 1-Hydroxy-1H- benzotriazol und 359 mg (1,87 mmol) N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodi- imid Hydrochlorid wurden in 25 ml DMF zusammengegeben und 1 h bei RT gerührt.

Anschließend wurden 500 mg (1,56 mmol) der Verbindung E. 2. 10 und 403 mg Ethyldiisopropylamin hinzugegeben und der Ansatz weitere 16 h bei RT gerührt.

Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und viermal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Petrolether gefällt. Der Überstand wurde abdekantiert und der verbleibende ölige Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 577 mg (76 %) des gewünschten Produktes [TLC : Rf= 0,48 4)].

570 mg (1,17 mmol) dieses Intermediats wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenom- men und mit 1 ml TFA versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. Nach Filtration und Trocknung wurden 90 mg (85 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz erhalten [TLC : Rf= 0,2 5)].

E. 2.12 Herstellung in Analogie zu Beispiel E. 2.10 und E. 2.11 ausgehend von Beispiel E. 2. 8 [TLC : Rf= 0, 1 5)].

E. 2.13 Herstellung in Analogie zu Beispiel E. 2.10 und E. 2.11 ausgehend von Beispiel E. 2.8 [TLC : Rf=0, 2j.

E. 2.14 Zu einer Lösung von 200 mg (0,4 mmol) der Verbindung E. 2.11 in 15 ml Dimethylformamid wurden 125 mg (0,4 mmol) Tert-butoxycarbonyl-prolin-N- hydroxysuccinimidester sowie 155 mg Ethyldiisopropylamin gegeben und 30 min bei RT gerührt. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel : Acetonitril/ Wasser 20/1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft und der Rückstand getrocknet. Anschließend wurde nach Standardbedingungen die Boc-Schutzgruppe abgelöst.

Ausbeute : 75 % über 2 Stufen [TLC : Rf= 0,22 5)].

E. 2.15 Herstellung analog zu E. 2.14. Ausbeute : 54 % über 2 Stufen [TLC : Rf= 0,23 5)].

E. 2.16 Herstellung in Analogie zu Beispiel E. 2.14 ausgehend von E. 2.13.

Ausbeute : 55 % über 2 Stufen [TLC : Rf= 0, 1 5)].

E. 2.17 Herstellung durch Verknüpfung von Boc-Sarkosin mit Verbindung E. 2.11 in Gegenwart von EDCI/HOBT und anschließende Boc-Abspaltung nach Standardbedingungen.

Ausbeute : 56 % über 2 Stufen [TLC : Rf= 0, 14 5)].

E. 2. 18 Herstellung in Analogie zu Beispiel E. 2.17 ausgehend von Beispiel E. 2.12.

Ausbeute : 71 % über 2 Stufen [TLC : Rf= 0, 1 5)].

E. 2.19 Herstellung durch Verknüpfung von Boc-Piperidin-4-carbonsäure mit Verbindung E. 2. 11 in Gegenwart von EDCI/HOBT und anschließende Boc-Abspaltung nach Standardbedingungen.

E. 2.20 Herstellung in Analogie zu Beispiel E. 2.19 ausgehend von Beispiel E. 2.12.

Ausbeute : 51 % über 2 Stufen [TLC : Rf = 0, 08 5)].

Beispiele für säurespaltbare Affinitätsmarker Beispiel 1 : Herstellungsverfahren (Variante A) 45 mg (265 pmol) Maleimidopropionsäure sowie 54 mg (0,397 mmol) 1-Hydroxy- 1H-benzotriazol und 61 mg (0,318 mmol) N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 10 ml DMF zusammengegeben und 2 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 100 mg (0,265 mmol) der Verbindung E. 2.1 und 103mg Ethyldiisopropylamin hinzugegeben und der Ansatz weitere 2h bei RT gerührt. Dann wurde eingeengt, der Rückstand in Dichlormethan aufgenommen und viermal mit Wasser ausgeschüttelt. Anschließend wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet, eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Petrolether gefällt. Der Überstand wurde abdekantiert und der verbleibende ölige Rückstand im Hochvakuum getrocknet. Erhalten wurden 103 mg (74 %) des gewünschten Produktes [TLC : Rf= 0, 48 4)].

100 mg (189 µmol) dieses Intermediats wurden in 10 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 1 ml TFA versetzt. Nach 30 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt.

Nach Filtration und Trocknung wurden 90 mg (85 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz erhalten [TLC : Rf= 0,58 6)], 88 mg (158 gmol) des entschützten Intermediats und 62 mg (158 gaol) des Isothiocyanats E. 1. 1 aus der Edukt-Serie 1 wurden in 10 ml DMF gelöst, mit 83 ul Ethyldiisopropylamin versetzt und dann 3 h bei RT gerührt. Es wurde eingeengt, der Rückstand mit Wasser verrührt und abgesaugt. Der Rückstand wurde abgetrenntm, dann in 4 ml Dichlormethan/Methanol 1/1 und in 2 ml DMF aufgenommen und mit Diethylether gefällt. Der Niederschlag wurde abgesaugt und nach Trocknung im

Hochvakuum wurden 110 mg (85 %) der Zielverbindung erhalten [TLC : Rf = 0, 5 5)] [ESI-MS : m/e = 819 (M+H) +].

Beispiel 2 : Herstellungsverfahren (Variante B) 790 mg (1,35 mmol) der Verbindung E. 2.5 wurden in 40 ml Dichlormethan aufgenommen und mit 8 ml TFA versetzt. Nach 1 h Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand aus Dichlormethan mit Diethylether gefällt. der Überstand wurde abdekantiert und das harzige Produkt im Hochvakuum getrocknet.

Erhalten wurden 800 mg (99 %) des gewünschten Produkts als Trifluoressigsäuresalz [TLC : Rf= 0, 3 5)].

790 mg (1,32 mmol) des entschützten Intermediats wurden in 30 ml DMF vorgelegt und mit 515 mg (1,32 mmol) des Isothiocyanats E. l. l aus der Edukt-Serie 1 sowie mit 690 al Ethyldiisopropylamin versetzt und dann über Nacht bei RT gerührt. Es wurde eingeengt, der Rückstand mit 10 ml Wasser verrührt und abgesaugt. Der Rückstand wurde abgetrennt und dann in Dichlormethan/Methanol suspendiert. Es wurden noch 50 ml Diethylether zugesetzt und der Niederschlag erneut abfiltriert.

Nach Filtration und Trocknung wurden 1077 mg (93 %) der gewünschten Verbindung erhalten [TLC : Rf= 0,4 4)].

1070 mg (1,22 mmol) dieses Intermediats wurden in 25 ml DMF aufgenommen und mit 1 ml Piperidin versetzt. Nach 45 min Rühren bei Raumtemperatur wurde eingeengt und der Rückstand mit Dichlormethan digeriert. Anschließend wurde abfiltriert und der Filterrückstand in einer Mischung aus 10 ml Dichlormethan und 10 ml Methanol suspendiert. Nach Zugabe von 100 ml Diethylether fiel das Produkt vollständig aus und wurde abfiltriert und getrocknet. Erhalten wurden 805 mg (99 %) des %) des entschützten Intermediats E. 2.6 [TLC : Rf = 0, 4 6)],

9,5 mg (45 p. mol) Maleimidocapronsäure sowie 9,1 mg (0,067 mmol) 1-Hydroxy- 1H-benzotriazol und 10,3 mg (0,054 mmol) N- (3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethyl- carbodiimid Hydrochlorid wurden in 15 ml DMF zusammengegeben und 1,5 h bei RT gerührt. Anschließend wurden 30 mg (0,265 mmol) des in der Vorstufe entschützten Intermediats (Verbindung E. 2.6) sowie 24 p1 N, N-Diisopropyl- ethylamin zugegeben, und die Lösung dann über Nacht bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand in 3 ml Dichlormethan/ Methanol 1/1 aufgenommen und anschließend mit 15 ml Diethylether versetzt. Das ausgefällte Rohprodukt wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel : Acetonitril/Wasser 10/1) gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt, das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und lyophilisiert. Erhalten wurden 6 mg (16 %) des Zielproduktes [TLC : Rf = 0, 2 1)] [ESI-MS : m/e = 861 (M+H) +].

Folgende Beispiele wurden, soweit nicht anders angegeben, in analoger Weise zu Beispiel 1 (Variante A) oder Beispiel 2 (Variante B) hergestellt. Die jeweilige Variante ist nachfolgend entweder genannt oder beschrieben.

Beispiel 3 Edukte : E. 2.2, E. 1.1 ; Variante A Ausbeute: 11 % über 3 Stufen Rf = 0,65 6) [ESI-MS: m/e = 899 (M+H)+] Die Verbindung ist glatt wasserlöslich.

Beispiel 4

Edukte : E. 2.3, E. l. l ; Variante A Ausbeute: 23 % über 3 Stufen Rf = 0,675) [ESI-MS: m/e = 861 (M+H)+] Beispiel 5

50 mg (75 umol) der Verbindung E. 2.6 wurden in Dichlormethan suspendiert und unter Argon portionsweise mit 18 µ (225 µmol) Acrylsäurechlorid sowie 12 Ill Pyridin versetzt. Die Mischung wurde dann über 2 Tage bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 1)). Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dioxan/Wasser 1/1 gelöst und lyophilisiert. Erhalten wurden 12mg (22 %) des Zielproduktes [TLC : Rf= 0, 14 1)] [ESI-MS : m/e = 722 (M+H) +].

Beispiel 6

50 mg (75 umol) der Verbindung E. 2.6 wurden in 20 ml Dichlormethan suspendiert und unter Argon mit 24 Ill (300 umol) Chloracetylchlorid sowie 12 p1 Pyridin versetzt. Die Mischung wurde dann über 2 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand mit 5 ml Dichlormethan behandelt. Der verbleibende Feststoff wurde abgetrennt und durch Flash-Chromatographie an Kieselgel gereinigt (Elutionsmittel 1)) Die entsprechenden Fraktionen wurden vereinigt und das Lösungsmittel in vacuo abgedampft. Der Rückstand wurde in Dichlormethan/Methanol aufgenommen und das Zielprodukt mit Diethylether ausgefällt. Erhalten wurden 12 mg (22 %) des Zielproduktes [TLC : Rf = 0, 21 [ESI-MS : m/e = 744 (M+H) +].

Beispiel 7 : Herstellungsverfahren (Variante C) Die Verbindung E. 2.11 wurde wie in Beispiel E. 2.5 beschrieben mit Boc-Glycin umgesetzt. Ausbeute : 61 % [TLC : Rf= 0, 52 4)] Anschließend wurde die Boc-Schutzruppe mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan abgelöst. Ausbeute : 98 % [TLC : Rf= 0, 2 2')] Dieses entschützte Intermediat und 62 mg (158 u. mol) des Isothiocyanats E. 1. 1 aus der Edukt-Serie 1 wurden dann wie in Beispiel 1 beschrieben miteinander zur Reaktion gebracht, um das Zielprodukt zu erhalten. [TLC : Rf= 0, 4 5)]

Beispiel 8 Edukte : E. 2. 11 ; Boc-Glycin ; E. 1. 2 Variante C [TLC : Rf = 0, 5)] Beispiel 9 Edukte : E. 2. 11 ; Bis-Boc-Histidin ; E. 1. 1 Variante C [TLC : Rf= 0, 35 6)] Beispiel 10 Edukte : E. 2. 11 ; Bis-Boc-Histidin ; E. 1. 2 Variante C [TLC : Rf = 0,35 6)]

Beispiel 11 Edukte : E. 2.11 ; Boc-Glutaminsäure-8-tert. butylester ; E. l. l Variante C [TLC : Rf = 0,5 5)] Beispiel 12 Edukte : E. 2. 11 ; Boc-Glutaminsäure-8-tert. butylester ; E. 1. 2 Variante C [TLC : Rf = 0,7 6)] Beispiel 13 Edukte : E. 2. 11 ; Boc-Glutaminsäure-8-tert. butylester ; E. 1. 1 Variante C und anschließende Überführung in das Natriumsalz mit 1 Äquivalent wässriger Natriumhydroxidlösung.

Ausbeute : 38 % über 4 Stufen [TLC : Rf = 0,4 5)] [ESI-MS : m/e = 905 (M+H) +].

Beispiel 14

Edukte : E. 2. 11 ; Boc-Glutaminsäure-8-tert. butylester ; E. 1. 2 Variante C und anschließende Überführung in das Natriumsalz mit 1 Äquivalent wässriger Natriumhydroxidlösung.

Ausbeute : 52 % über 4 Stufen [TLC : Rf= 0, 5 5)] [ESI-MS : m/e = 891 (M+H) +].

Beispiel 15

Edukte : E. 2.17 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid ; E. 1.2 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde.

Ausbeute : 55 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 45 5)] [ESI-MS : m/e = 890 (M+H) +].

Beispiel 16 Edukte : E. 2.18 ; Boc-Glycin ; E. 1.2 Variante C Ausbeute : 37 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 4 5)] [ESI-MS : m/e = 896 (M+H) +].

Beispiel 17 Edukte : E. 2.14 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid ; E. 1. 2 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde.

Ausbeute : 47 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 45 5)] [ESI-MS : m/e = 916 (M+H) +].

Beispiel 18

Edukte : E. 2.19 ; Boc-Glycin ; E. 1. 2 Variante C Ausbeute : 47 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 5 5)] [ESI-MS : m/e = 930 (M+H) +].

Beispiel 19 Edukte : E. 2.20 ; Boc-Glycin ; E. 1. 2 Variante C Ausbeute : 32 % über 3 Stufen [TLC : Rf = 0, 5 5)] [ESI-MS : m/e = 936 (M+H) +].

Beispiel 20 Edukte : E. 2.17 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid ; E. 1. 1 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde.

Ausbeute : 55 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 46 5)] [ESI-MS : m/e = 904 (M+H) +].

Beispiel 21 Edukte : E. 2.17 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid ; E. 1. 3 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde.

Ausbeute : 38 % über 3 Stufen [TLC : Rf = 0, 4 5)] [ESI-MS : m/e = 961 (M+H) +].

Beispiel 22 Edukte : E. 2.17 ; Boc-Glutaminsäure-#-tert. butylester ; E. 1.2 Variante C Ausbeute : 19 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 46 5)] [ESI-MS : m/e = 962 (M+H) +].

Beispiel 23

Edukte : E. 2.14 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid ; E. 1. 1 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde.

Ausbeute : 47 % über 3 Stufen [TLC : Rf= 0, 44 5)] [ESI-MS : m/e = 930 (M+H)+].

Beispiel 24 Edukte : E. 2.13 ; Boc-Glycin ; E. 1. 1 Variante C Ausbeute : 42 % über 3 Stufen [TLC : Rf = 0, 57 5)] [ESI-MS : m/e = 867 (M+H) +].

Beispiel 25 Edukte : E. 2.15 ; Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid ; E. 1. 1 Variante C, wobei anstelle der Aktivierung über EDCI/HOBT als aktivierter Aminosäurebaustein Boc-Glycin-N-carbonsäureanhydrid eingesetzt wurde.

Ausbeute : 37 % über 3 Stufen [TLC : Rf = 0, 5 5)] [ESI-MS : m/e = 958 (M+H )+].

Proteinanalvtische Untersuchungen Kupplung der Affinitätsmarker an SDS-7 und Beschreibung des Arbeitsablaufs an Hand von Beispiel 2 Als Probe wurde eine Mischung von sieben Proteinen verwendet, die auch Verwendung als Größenstandard in der Gelelektrophorese findet (SDS-7-Marker, Sigma-Aldrich GmbH, Taufkirchen).

24 zig der Proteinmischung wurden in 5 µl Puffer 1 gelöst und mit 135 ul Puffer 3 verdünnt. Durch Erhitzen auf 100 °C für 3 Minuten wurden die Proteine denaturiert. Zur Reduktion der vorhandenen Cysteine wurde 3 gl Reduktionslösung zugegeben und der Ansatz 10 Minuten bei 100 °C inkubiert. Zur Umsetzung der freien Cysteine mit dem Affinitätsmarker wurde dann 5 u. l Derivatisicrungslösung zugesetzt und für 90 Minuten bei 37 °C inkubiert.

Nach der Derivatisierung wurden 3 ill Trypsinlösung zugesetzt. Die Spaltung der Proteine erfolgt über Nacht (ca. 17 Stunden) bei 37 °C.

Puffer 1 : 50 mM Tris-HCl, pH 8,3 ; 5 mM EDTA ; 0,5 % (w/v) SDS Puffer 2 : 10 mM NH4Acetat, pH 7 Puffer 3 : 50 mM Tris-HCl, pH 8, 3 ; 5 mM EDTA Reduktionslösung : 50 mM TCEP in Puffer 2 Derivatisierungslösung : 30 vLg/, ul Affinitätsmarker in DMSO Trypsinlösung : 1 mg/ml Trypsin (Promega GmbH, Mannheim) in Puffer 3 Affinitätsreinigung derivatisierter Peptide Die Affinitätssäulen (Monomeric Avidin, Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn) mit einem Säulenvolumen von 200 gel wurden vor der Aufreinigung frisch hergestellt und durch folgende Waschschritte vorbereitet :

- Zwei Säulenvolumina 2xPBS - Vier Säulenvolumina 30 % (v/v) Acetonitril/0,4 % (v/v) Trifluoressigsäure - Sieben Säulenvolumina 2xPBS - Vier Säulenvolumina 2 mM Biotin in 2xPBS - Sechs Säulenvolumina 100 mM Glycin, pH 2,8 - Sechs Säulenvolumina 2xPBS 30 Ill Probe wurden vor dem Auftragen mit 30 Ill 2xPBS verdünnt und dann auf die Säule aufgetragen. Danach wurden zum Entfernen der nicht-biotinylierten Peptide folgende Waschschritte durchgeführt : - Sechs Säulenvolumina 2xPBS - Sechs Säulenvolumina PBS - Sechs Säulenvolumina 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat/20 % (v/v) Methanol - Ein Säulenvolumen 0,3 % (v/v) Ameisensäure Die Probe wurde mit folgenden Schritten eluiert : - Drei Säulenvolumina 0,3 % (v/v) Ameisensäure - Drei Säulenvolumina 30 % (v/v) Acetonitril/0,4 % (v/v) Trifluoressigsäure Das Eluat wurde bis zur Trockenheit eingedampft und erst kurz vor der Analyse mit Massenspektrometrie wieder gelöst.

PBS : Stammlösung lOx, GibcoBRL, Cat. No. 14200-067 Massenspektrometrische Analyse Zur Analyse der Peptide wurde ein Ionenfallen-Massenspektrometer (LCQdeka, ThermoFinnigan, San Jose) eingesetzt, das direkt mit einer Hochdruckflüssig- keitschromatographie verbunden ist (LC-MS). Als Trennsäule wurde eine Reversed-

Phase-Säule (C, 8-Phase) benutzt. Die Peptide wurden in Eluent A (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure) gelöst und injiziert. Sie wurden mit einem Gradienten von Eluent B (0,025 % (v/v) Trifluoressigsäure/84 % (v/v) Acetonitril) eluiert. Die eluierenden Peptide wurden durch die Akquisitions-Software des Gerätes automatisch erkannt und für eine Identifizierung fragmentiert. Damit konnte die Identität der Peptide eindeutig bestimmt wurden.

Fig. 1 zeigt ein Beispiel für ein Fragmentspektrum eines Peptides aus dieser Analyse. Das beobachtete Muster identifiziert das Peptid eindeutig als das Peptid mit der Sequenz FLDDDLTDDIMCVK aus Lactalbumin, das Bestandteil der Probe war. Die Masse des Peptides und seine Fragmentierung bestätigen, dass der Affinitätsmarker in der erwarteten Weise durch Säure gespalten wurde.

Insgesamt wurden in einer Analyse 18 unterschiedliche Peptide aus der Probe identifiziert, die alle in der gleichen Weise die erwartete Masse des Adduktes mit säuregespaltenem Rest des Affinitätsmarkers trugen. Es wurde kein einziges Cystein- haltiges Peptid identifiziert, das einen noch vollständigen Rest des Affinitätsmarkers trug. Fig. 2 zeigt als Beispiel die Peptide, die aus Rindertrypsin identifiziert wurden.

In Fig. 3 wird anhand der Beispiele 15 und 16 gezeigt, dass die isotopenmarkierten Affinitätsmarker sich in ihren chromatographischen und massenspektrometrischen Eigenschaften unabhängig vom Markierungsgrad identisch verhalten. In Fig. 3 a) sind exemplarisch die Ionenspuren der leichten und der schweren Variante des markierten Peptids LFTFHADICTLPDTEKD aus Rinderalbumin gezeigt. Ein Retentionszeitunterschied ist nicht zu erkennen. In Fig. 3 b) und c) sind die Fragmentspektren der doppelt geladenen Peptidionen gezeigt. Beide sind identisch bis auf die Verschiebung der Cystein-haltigen Fragmente um 6 Da aufgrund der Iosotopenmarkierung.

Die gleichen Ergebnisse erhält man auch für andere Affinitätsmarker und Peptide, wie Fig. 4 für die Beispiele 18 und 19 belegt. Es handelt sich um das Peptid APILSDSSCK aus Rindertrypsin. Auch hier ist eine exakte Koelution auf der

Chromatographie und identisches Verhalten bei der Fragmentierung im Massenspektrometer zu beobachten.

Fig. 1 : Fragmentspektrum eines mit der Verbindung aus Beispiel 2 derivatisierten Peptides nach Isolierung über Avidin, d. h. mit säuregespaltenem Affinitätsmarker.

Fig. 2 : Sequenzabdeckung von Rindertrypsin, die bei Benutzung der Verbindung aus Beispiel 2 erreicht wurde.

Fig. 3 : MS-Analyse einer Proteinmischung nach Derivatisierung mit den Beispielen 15 und 16 in einem einzigen Ansatz. Anhand der Ionenchromatogramme (Fig. 3 a)) sieht man, dass die beiden Varianten exakt zur gleichen Zeit eluieren und gleich intensiv auftreten. Die Fragmentspektren der leichten (Fig. 3 c)) und schweren (Fig.

3 c)) Variante des markierten Peptids LFTFHADICTLPDTEK sind bis auf die erwarteten Verschiebungen von 6 Da identisch.

Fig. 4 : MS-Analyse einer Proteinmischung nach Derivatisierung mit den Beispielen 18 und 19 in einem einzigen Ansatz. Anhand der Ionenchromatogramme (Fig. 4 a)) sieht man, dass die beiden Varianten exakt zur gleichen Zeit eluieren und gleich intensiv auftreten. Die Fragmentspektren der leichten (Fig. 4 b)) und schweren (Fig. 4 c)) Variante des markierten Peptids APILSDSSCK sind bis auf die erwarteten Verschiebungen von 6 Da identisch.