本发明涉及检测 DNA样品中预定位点的突变的试剂盒、 引物组合、 方法及应用。

背景技术

在特定位点形成突变是分子生物学实验中常用 的研究手段， 可以有助于分析特定位点的 点突变对于基因功能的作用。 通常而言， 在构建了目标突变体后， 如何对该位点是否正确发 生了突变， 是本领域技术人员所面临的问题。

然而， 目前分子生物学领域中， 对于特定位点突变的检测仍有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问 题之一。 为此， 本发明的一个目的在于提 出一种能够有效检测 DNA样品中预定位点的突变的方法。

根据本发明的第一方面， 本发明提出了一种检测 DNA样品中预定位点的突变的方法。 根据本发明的实施例， 该方法包括以下步骤： 使用扩增引物对所述 DNA样品进行 PCR扩增 反应， 以便获得扩增产物， 所述扩增产物包含所述预定位点； 使用延伸引物以及 dd TP, 以 所述扩增产物为模板， 进行寡核苷酸延伸反应， 以便获得在所述延伸引物的 3'端连接一个碱 基的延伸产物， 其中， 所述延伸引物的 3'端紧邻所述预定位点； 对所述延伸产物进行分子量 检测， 以便获得所述延伸产物的分子量； 以及基于所述延伸产物的分子量， 确定所述预定位 点的突变类型。 由于延伸反应是以包含预定位点的扩增产物为 模板， 并且进行延伸反应的延 伸引物的 3'端紧邻所述预定位点，并且在进行延伸反应� ��使用 ddNTP作为原料，因而可以保 证延伸反应可以仅延伸一个碱基， 即对应预定的位点， 基于各个不同碱基的分子量存在较为 显著的区别， 因而， 通过对延伸产物的分子量进行检测， 可以通过所获得的延伸产物的分子 量， 来确定在预定位点是否发生了突变， 以及所发生突变的类型。 由此， 可以广泛应用于分 子生物领域， 例如检测是否成功构建了相应的突变体。

根据本发明的实施例， 上述检测 DNA样品中预定位点的突变的方法还可以具有下 列附 加技术特征：

根据本发明的一个实施例， 所述 DNA样品为人全基因组 DNA。 由此， 可以有效地对人 类中的基因突变进行检测。

根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突 变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4 基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变。 由此， 可以有效地检测与耳聋相关的基因突变。

根据本发明的一个实施例，所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、

299_300delAT和 235delC的至少一种，所述 GJB3基因的突变为选自位点 5380T和 547G>A 的 ^少一种， 所述 SLC26A4基因的突变为选自 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一 种， 以及所述 mtDNA的突变为选自 1494 T和 1555A>G的至少一种。 由此， 可以有效地 检测遗传性耳聋相关的基因突变。

根据本发明的一个实施例，所述扩增弓 I物包括第一弓 I物和第二弓 I物，其中，针对所述 GJB2 基因的 35ddG突变，所述第一引物为如 SEQ ID NO: 1所示，所述第二引物为如 SEQ ID NO: 2所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 33所示； 针对所述 GJB2基因的 167delT突变， 所 述第一引物为如 SEQ ID NO: 3所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 4所示， 所述延伸引 物为如 SEQ ID NO: 34所示； 针对所述 GJB2基因的 176-191dell6突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 5所示，所述第二引物为如 SEQ ID NO: 6所示，所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 35所示；针对所述 GJB2基因的 299_300delAT突变，所述第一弓 I物为如 SEQ ID NO: 7所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 8戶; f示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 36所示； 针对所述 GJB2基因的 235delC突变，所述第一弓 I物为如 SEQ ID NO: 9所示，所述第二弓 |物为如 SEQ ID NO: 10所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 37所示； 针对所述 GJB3基因的 538C>T 突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 11所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 12所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 38所示； 针对所述 GJB3基因的 547G>A突变， 所述第一引 物为如 SEQ ID NO: 13所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 14所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 39所示； 针对所述 SLC26A4基因的 2810T突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 15所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 16所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 40 所示； 针对所述 SLC26A4基因的 589G>A突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 17所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 18所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 41所示； 针对所 述 SLC26A4基因的 919-2A>G突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 19所示， 所述第二引 物为如 SEQ ID NO: 20所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 42所示； 针对所述 SLC26A4 基因的 1174A>T突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 21所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 22所示，所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 43所示；针对所述 SLC26A4基因的 1226G>A 突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 21所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 22所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 44所示； 针对所述 SLC26A4基因的 12290T突变， 所述第 一引物为如 SEQ ID NO: 21所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 22所示， 所述延伸引物 为如 SEQ ID NO: 45所示； 针对所述 SLC26A4基因的 1975G>C突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 25所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 26所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 47所示； 针对所述 SLC26A4基因的 2027T>A突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 25所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 26所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 48所示； 针对所述 SLC26A4基因的 21620T突变， 所述第一弓 I物为如 SEQ ID NO: 27所示， 所述第 二弓 I物为如 SEQ ID NO: 28所示，所述延伸弓 I物为如 SEQ ID NO: 49所示；针对所述 SLC26A4 基因的 2168A>G突变， 所述第一弓 I物为如 SEQ ID NO: 27所示， 所述第二弓 |物为如 SEQ ID NO: 28所示，所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 50所示；针对所述 SLC26A4基因的 IVS15+5G>A 突变， 所述第一引物为如 SEQ ID NO: 23所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 24所示， 所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 46所示； 针对所述 mtDNA基因的 14940T突变， 所述第 一引物为如 SEQ ID NO: 29所示， 所述第二引物为如 SEQ ID NO: 30所示， 所述延伸引物 为如 SEQ ID NO: 51所示； 以及针对所述 mtDNA基因的 1555 A>G突变， 所述第一引物为 如 SEQ ID NO: 31所示，所述第二引物为如 SEQ ID NO: 32所示，所述延伸引物为如 SEQ ID NO: 52所示。

为方便表述， 将上述引物组合分别总结与下表 1和 2中。

表 1 : 针对上述 20个耳聋基因突变位点的扩增引物。

序列编号 * 引物序列 5' 3'** 引物说明

SEQ ID NO: l AGATCTTTCCAATGCTGGTG

用于扩增位点 35delG的扩增引物

SEQ ID NO:2 AGAGTAGAAGATGGATTGGG

SEQ ID NO:3 AAAGGAGGTGTGGGGAGATG 用于扩增位点 167delT的扩增引物

SEQ ID NO:4 GATCGTAGCACACGTTCTTG

SEQ ID N0 5 AGGCCGACTTTGTCTGCAAC 用于扩增位点 176 191dell6的扩增引

SEQ ID NO:6 TGGGAGATGGGGAAGTAGTG 物

SEQ ID NO:7 CTTCGATGCGGACCTTCTG 用于扩增位点 299 300delAT的扩增引

SEQ ID NO:8 CTCCTAGTGGCCATGCACG 物

SEQ ID NO:9 TGGCGTGGACACGAAGATCA

用于扩增位点 235delC的扩增引物

SEQ ID NO: 10 ACTTCCCCATCTCCCACATC

SEQ ID NO: 11 CCAACATCGTGGACTGCTAC 用于扩增位点 5380T的扩增引物 SEQ ID NO: 12 CCACCATGAAGTAGGTGAAG

SEQ ID NO: 13 CCACCATGAAGTAGGTGAAG

用于扩增位点 547G>A的扩增引物

SEQ ID NO: 14 CAACATCGTGGACTGCTACA

SEQ ID NO: 15 TAGTGACGTCATTTCGGGAG

用于扩增位点 281C>T的扩增引物

SEQ ID NO: 16 ACCAGAACTCTCAATCTGCC

SEQ ID NO: 17 CTTGTAAGTTCATTACCTG

用于扩增位点 589G>A的扩增引物

SEQ ID NO: 18 TAGAGATACAGCTAGAGTCC

SEQ ID NO: 19 CCAGGTTGGCTCCATATGAA

用于扩增位点 919-2A>G的扩增引物

SEQ ID NO:20 CCAATGGAGTTTTTAACATC

SEQ ID NO:21 CCAGTCTCTTCCTTAGGAAT 用于扩增位点 1174A>T、 1226G>A和

SEQ ID NO:22 GTTCCTACCTGTGTCTTTCC 1229C>T的扩增引物

SEQ ID NO:23 AGAAAACAAATTTCTAGGG 用于扩增位点 IVS15+5G>A的扩增引

SEQ ID NO:24 TTCTATGGCAATGTCGATGG 物

SEQ ID NO:25 CAGAAAACCAGAACCTTACC 用于扩增位点 1975G>C禾 P 2027T>A

SEQ ID NO:26 ACGTTCCCAAAGTGCCAATC 的扩增引物

SEQ ID NO:27 GACAACATTAGAAAGGACAC 用于扩增位点 2162C>T和 2168A>G

SEQ ID NO:28 GATTTCACTTGGTTCTGTAG 的扩增引物

SEQ ID NO:29 TACGATAGCCCTTATGAAAC

用于扩增位点 14940T的扩增引物

SEQ ID NO:30 GGGGTTTTAGTTAAATGTCC

SEQ ID NO:31 AGCTCAGAGCGGTCAAGTTA

用于扩增位点 1555A>G的扩增引物

SEQ ID NO:32 CTAAAACCCCTACGCATTTA

*： 对于每 一水

物） 的第一引物 （有时也称为上游引物）和第二引物 （有时也称为下游引物）。

**:根据本发明的一个实施例， 在扩增引物的第一引物和第二引物 5'端还可以都具有 10 个碱基 acgttggatg (SEQ ID NO: 53 ) 的标签序列， 发明人发现， 通过采用上述标签序列， 可 以使得上述第一引物和第二引物的分子量不在 质谱的检测范围内， 由此， 能够进一步提高检 测的精确度和效率。

表 2: 针对上述 20个耳聋基因突变位点的延伸引物。

序列编号 引物序列 引物说明

SEQ ID NO:33 TTTGTTCACACCCCC 位点 35delG的延伸引物

SEQ ID NO:34 gggcCTTTGTCTGCAACACCC 位点 167delT的延伸引物

SEQ ID NO:35 ctccGCAACACCCTGCAGCCAG 位点 176_191dell6的延伸引物

SEQ ID NO:36 gcTGAACTTCCTCTTCTTCTC 位点 299_300delAT的延伸引物

SEQ ID NO:37 ggATCCTGCTATGGGCC 位点 235delC的延伸引物

SEQ ID NO:38 ccctaGTGGACTGCTACATTGCC 位点 538 T的延伸引物

SEQ ID NO:39 ctgcAGTAGGTGAAGATTTTCTTCT 位点 547G>A的延伸引物

SEQ ID NO:40 GTCATTTCGGGAGTTAGTA 位点 2810T的延伸引物

SEQ ID NO:41 CTTGTAAGTTCATTACCTGTATAATTC 位点 589G>A的延伸引物

SEQ ID NO:42 GCAGTAGCAATTATCGTC 位点 919-2A>G的延伸引物

SEQ ID NO:43 GCCTTTGGGATCAGC 位点 1174A>T的延伸引物

SEQ ID NO:44 CACCACTGCTCTTTCCC 位点 1226G>A的延伸引物

SEQ ID NO:45 ttCCACCACTGCTCTTTCCCCCA 位点 12290T的延伸引物

SEQ ID NO:46 AAAACAAATTTCTAGGGATAAAATA 位点 IVS15+5G>A的延伸引物

SEQ ID NO:47 CTCCACAGTCAAGCA 位点 1975G>C的延伸引物

SEQ ID NO:48 AGAACCTTACCACCCGC 位点 2027T>A的延伸引物 SEQ ID NO:49 CAGAGTATAGCATCAAGGACC 位点 2162C>T的延伸引物

SEQ ID NO:50 TCTGTAGATAGAGTATAGCATCA 位点 2168A>G的延伸引物

SEQ ID NO:51 CGTACACACCGCCCGTCAC 位点 14940T的延伸引物

SEQ ID NO:52 ACTTACCATGTTACGACTTG 位点 1555A>G的延伸引物

如表 1和表 2所示，扩增弓 I物的长度为大约 30个碱基，延伸引物的长度为 17-28个碱基。 另外， 发明人发现， 基于前述引物组合， 不同位点的延伸引物与延伸产物、 延伸产物与延伸 产物间的分子量差异不小于 30D。 本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引 物组合， 能 够非常有效地检测所列出的突变类型， 并且适于同时检测多个位点的多种突变类型， 根据本 发明的实施例， 可以同时对上述 20种突变类型进行精确快速地检测。

根据本发明的一个实施例， 在进行所述寡核苷酸延伸反应之前， 进一步包括： 使用碱性 磷酸酶对所述扩增产物进行处理的步骤。 由此， 通过碱性磷酸酶对扩增产物进行处理， 可以 除去扩增产物中残存的 dNTP， 从而可以提高后续延伸反应的效率， 进而能够实现高效地检 测 DNA样品中预定位点的突变。

根据本发明的一个实施例，通过 MALDI-TOF质谱检测对所述延伸产物进行分子量检 测。 由此， 能够精确、 高效地对延伸产物进行分子量检测， 发明人惊奇地发现通过 MALDI-TOF 质谱检测甚至可以实现对 DNA样品中杂合突变或纯合突变的检测。

根据本发明的一个实施例， 在对所述延伸产物进行 MALDI-TOF质谱检测之前， 进一步 包括对所述延伸产物进行纯化的步骤。 由此， 可以进一步提高 MALDI-TOF质谱检测的精确 度， 从而提高检测 DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。

根据本发明的具体示例， 利用阴离子树脂对所述延伸产物进行纯化。 由此， 能够更进一 步提高 MALDI-TOF质谱检测的精确度， 从而提高检测 DNA样品中预定位点的突变的效率 和精确度。

根据本发明的第二方面， 本发明提出了一种用于检测 DNA样品中预定位点的突变的系 统。 根据本发明的实施例， 该用于检测 DNA样品中预定位点的突变的系统包括： DNA样品 扩增装置， 所述 DNA样品扩增装置， 用于对所述 DNA样品进行 PCR扩增， 以便获得扩增 产物， 所述扩增产物包含所述预定位点； 扩增产物延伸装置， 所述扩增产物延伸装置与所述 DNA样品扩增装置相连， 以便从所述 DNA样品扩增装置接收扩增产物， 并且对所述扩增产 物进行寡核苷酸延伸反应，以便获得在所述延 伸引物的 3'端连接一个碱基的延伸产物，其中， 所述延伸引物的 3'端紧邻所述预定位点； 分子量检测装置， 所述分子量检测装置与所述扩增 产物延伸装置相连， 以便确定所述延伸产物的分子量； 以及突变分析装置， 所述突变分析装 置基于所述延伸产物的分子量， 确定所述预定位点的突变类型。 利用该系统， 能够有效地实 施根据本发明实施例的检测 DNA样品中预定位点的突变的方法，从而有效地 确定 DNA样品 中预定位点的突变。

根据本发明的实施例， 上述检测 DNA样品中预定位点的突变的系统还可以具有下 列附 加技术特征：

根据本发明的一个实施例， 所述 DNA样品扩增装置内设置有扩增引物对， 所述扩增产 物延伸装置内设置有延伸引物。 由此， 便于 DNA样品扩增装置和扩增产物延伸装置分别对 DNA样品进行扩增， 和进行寡核苷酸延伸反应。

根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突 变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4 基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变， 所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT禾 P 235delC 的至少一种， 所述 GJB3 基因的突变为选自位点 5380T禾 P 547G>A的至少一种， 所述 SLC26A4基因的突变为选自 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所述 mtDNA的突变为选自 14940T和 1555A>G的至少一 种， 所述扩增引物包括第一引物和第二引物， 其中， 针对这些突变， 可以采用表 1和表 2中 所列出的引物组合 （前面已有详细描述， 在此不再赘述）。 本发明的发明人¾奇地发现通过 使用上述的弓 I物组合， 能够非常有效地检测所列出的突变类型。

根据本发明的一个实施例， 进一步包括： 扩增产物净化装置， 所述扩增产物净化装置分 别与所述 DNA样品扩增装置和所述扩增产物延伸装置相连 ， 以便对所述扩增产物进行净化 处理， 并将经过净化的扩增产物输入至所述扩增产物 延伸装置。 由此， 可以除去扩增产物中 残存的 dNTP，从而可以提高后续延伸反应的效率，进� �能够实现高效地检测 DNA样品中预 定位点的突变。

根据本发明的一个实施例， 所述分子量检测装置为 MALDI-TOF质谱装置。

根据本发明的一个实施例， 进一步包括延伸产物纯化装置， 其中， 所述延伸产物纯化装 置分别与所述扩增产物延伸装置和所述 MALDI-TOF质谱装置相连， 以便对所述延伸产物进 行纯化处理， 并将经过纯化的延伸产物输入至所述 MALDI-TOF质谱装置。

根据本发明的一个实施例， 所述延伸产物纯化装置为阴离子树脂。

根据本发明的第三方面， 本发明提出了一种用于确定 DNA样品中预定位点的突变的试 剂盒。根据本发明的实施例， 该试剂盒包括： 扩增引物对， 所述扩增引物对适于对所述 DNA 样品进行 PCR扩增反应， 以便获得扩增产物， 所述扩增产物包含所述预定位点； 以及延伸引 物， 所述延伸产物适于利用 dd TP, 以所述扩增产物为模板， 进行寡核苷酸延伸反应， 以便 获得在所述延伸引物的 3'端连接一个碱基的延伸产物， 其中， 所述延伸引物的 3'端紧邻所述 预定位点。 利用该试剂盒， 所制备的延伸产物， 可以有效地用于确定 DNA样品中预定位点 的突变， 从而实施根据本发明实施例的确定 DNA样品中预定位点的突变的方法。

根据本发明的实施例， 上述用于确定 DNA样品中预定位点的突变的试剂盒还可以具有 下列附加技术特征：

根据本发明的一个实施例，所述预定位点的突 变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4 基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变， 所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT禾 P 235delC 的至少一种， 所述 GJB3 基因的突变为选自位点 5380T禾 P 547G>A的至少一种， 所述 SLC26A4基因的突变为选自 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所述 mtDNA的突变为选自 14940T和 1555A>G的至少一 种，所述扩增引物包括第一引物和第二引物， 所述扩增弓 I物包括第一引物和第二引物，其中， 针对这些突变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合 （前面已有详细描述， 在此不再赘 述)。 本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引 物组合， 能够非常有效地检测所列出的 突变类型。

根据本发明的第四方面， 本发明提出了一种诊断遗传性耳聋的方法。 根据本发明的实施 例， 包括以下步骤： 提取怀疑患有遗传性耳聋的受试者的 DNA样品； 根据前述确定 DNA样 品中预定位点的突变的方法， 对所述 DNA样品中预定位点的突变进行分析； 以及基于所述 DNA样品中存在所述预定位点的突变， 确定所述受试者患有遗传性耳聋， 其中， 所述预定位 点的突变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变， 所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT和 235delC的 至少一种，所述 GJB3基因的突变为选自位点 538 T和 547G>A的室少一种，所述 SLC26A4 基因的突变为选自 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A、 2162C>T、 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所述 mtDNA的突变为选 自 1494 T和 1555A>G的至少一种。 由此， 根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋的方法， 能够有效地诊断受试者是否属于遗传性耳聋， 并且能够辅助确认耳聋的病因， 进而能够针对 病因采用相应的治疗和辅助措施。

根据本发明的实施例， 上述诊断遗传性耳聋的方法还可以具有下列附 加技术特征： 根据本发明的一个实施例， 所述扩增引物包括第一引物和第二引物， 其中， 针对前述突 变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合（前面已有详细描述， 在此不再赘述)。 本发 明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组 合， 能够非常有效地检测所列出的突变类型， 从而可以高效地确定受试者是否患有遗传性耳 聋。

根据本发明的第五方面， 本发明提出了一种产前诊断遗传性耳聋的方法 。 根据本发明的 实施例， 该产前诊断遗传性耳聋的方法包括以下步骤： 分离胎儿 DNA样品； 根据前述确定 DNA样品中预定位点的突变的方法， 对所述胎儿 DNA样品中预定位点的突变进行分析； 以 及基于所述胎儿 DNA样品中存在所述预定位点的突变， 推测所述胎儿患有遗传性耳聋， 其 中， 所述预定位点的突变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4基因以及 mtDNA的至少 一种基因的突变，所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176- 191 del 16 299 3 OOdel AT 和 235delC的至少一种， 所述 GJB3基因的突变为选自位点 538 T和 547G>A的 少一种， 所述 SLC26A4基因的突变为选自 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所 述 mtDNA的突变为选自 1494 T和 1555A>G的至少一种。 由此， 根据本发明实施例的诊 断遗传性耳聋的方法， 能够辅助推测胎儿患有遗传性耳聋， 并且能够辅助确认耳聋的病因， 进而能够针对病因采用相应的治疗和辅助措施 。

根据本发明的一个实施例， 所述扩增引物包括第一引物和第二引物， 其中， 针对前述突 变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合（前面已有详细描述， 在此不再赘述)。 本发 明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组 合， 能够非常有效地检测所列出的突变类型， 从而可以推测胎 J L是否患有遗传性耳聋。

根据本发明的一个实施例， 所述胎儿 DNA是从孕妇的绒毛膜、 羊水或脐带血中提取的。 由此， 可以在孕早期即能够推测胎儿是否患有遗传性 耳聋， 并且不会由于直接从胎儿组织提 取样本而造成胎儿流产等事故。

根据本发明的第六方面， 本发明提出了一种预测电子耳蜗效果的方法。 根据本发明的实 施例， 该预测电子耳蜗效果的方法包括以下步骤： 提取耳聋患者的 DNA样品； 根据前述确 定 DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述 DNA样品中预定位点的突变进行分析；基于 所述 DNA样品中存在所述预定位点的突变， 确定所述耳聋患者患有遗传性耳聋； 基于所述 耳聋患者患有遗传性耳聋， 预测电子耳蜗对于所述耳聋患者有效， 其中， 所述预定位点的突 变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变， 所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT和 235delC的至少 一种， 所述 GJB3基因的突变为选自位点 5380T和 547G>A 至少一种， 所述 SLC26A4基 因的突变为选自 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A、 2162C>T、 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所述 mtDNA的突变为选 自 1494 T和 1555A>G的至少一种。 由此， 可以通过确定耳聋患者的病因， 来确定是否可 以采用电子耳蜗来辅助耳聋患者获得听力。

根据本发明的实施例， 上述预测电子耳蜗效果的方法可以具有下列附 加技术特征： 根据本发明的一个实施例， 所述扩增引物包括第一引物和第二引物， 其中， 针对前述突 变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合（前面已有详细描述， 在此不再赘述)。 本发 明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物组 合， 能够非常有效地检测所列出的突变类型， 从而可以高效地推测胎儿是否患有遗传性耳聋 。

根据本发明的第七方面， 本发明提出了一种试剂盒， 其特征在于， 包括： 扩增引物对， 所述扩增引物对适于对 DNA样品进行 PCR扩增反应， 以便获得扩增产物， 所述扩增产物包 含所述预定位点； 以及延伸引物， 所述延伸产物适于利用 ddNTP, 以所述扩增产物为模板， 进行寡核苷酸延伸反应， 以便获得在所述延伸引物的 3'端连接一个碱基的延伸产物， 其中， 所述延伸引物的 3'端紧邻所述预定位点，所述预定位点的突变� ��选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变， 所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT和 235delC的至少一种， 所述 GJB3基因的突变为选 自位点 5380T和 547G>A 至少一种，所述 SLC26A4基因的突变为选自 281C>T、589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所述 mtDNA的突变为选自 14940T和 1555A>G的至少一 种， 所述扩增引物包括第一引物和第二引物， 其中， 针对前述突变， 可以采用表 1和表 2中 所列出的引物组合 （前面已有详细描述， 在此不再赘述）。 本发明的发明人¾奇地发现通过 使用上述的引物组合制备的延伸产物， 能够非常有效地用于检测所列出的突变类型， 从而可 以高效地确定遗传性耳聋。

根据本发明的一个实施例， 所述试剂盒可以用于选自诊断遗传性耳聋、 产前诊断遗传性 耳聋、 以及预测电子耳蜗效果的至少一种。 由此， 利用该试剂盒， 可以有效地实施前述的根 据本发明实施例的诊断遗传性耳聋、 产前诊断遗传性耳聋、 以及预测电子耳蜗效果的方法。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部 分给出，部分将从下面的描述中变得明显， 或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施� �的描述中将变得明显和 容易理解， 其中：

图 1是根据本发明一个实施例的检测 DNA样品中预定位点的突变的方法的流程示意图 ； 图 2是本发明一个实施例的用于检测 DNA样品中预定位点的突变的系统的示意图； 图 3-14是根据本发明实施例的检测遗传性耳聋相� �基因突变的质谱检验结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终相同或 类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同 或类似功能的元件。 下面通过参考附图描述的 实施例是示例性的， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。

在本发明中使用的术语 "第一 "和"第二"仅用于描述目的， 而不能理解为指示或暗示相对 重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量 。 由此， 限定有 "第一"、 "第二"的特征可以明 示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。 进一步地， 在本发明的描述中， 除非另有说明， "多个"的含义是两个或多于两个。

本发明是基于发明人的下列发现而完成的： 对于已知位点的基因突变， 因其突变类型是 已知的， 因而通过检测包含该已知位点的一段特定长度 的寡核苷酸序列的分子量， 可以基于 该分子量的数值判断出在该位点是否存在突变 ， 并且通过计算， 可以获知该突变的类型。

检测 DNA样品中预定位点的突变的方法

根据本发明的第一方面， 本发明提出了一种检测 DNA样品中预定位点的突变的方法。 在本文中所使用的术语"预定位点"是指 DNA样品突变分析的目标位点， 通常指的是已经对 该位点的突变类型进行充分研究， 其功能已经明了的位点。在本文中， 所使用的术语 "突变"， 指的是与野生型 DNA序列有区别的情况， 其可以包括插入、 置换、 缺失一个或者多个碱基， 既可以是点突变， 也可以一段序列的整体改变。

参考图 1，根据本发明的实施例，检测 DNA样品中预定位点的突变的方法包括以下步骤 : S100: 使用扩增弓 I物对 DNA样品进行 PCR扩增反应， 以便获得扩增产物， 扩增产物包 含预定位点。 根据本发明的实施例， 可以采用的 DNA样品的来源， 不受特别限制。 根据本 发明的一个示例， 可以采用的 DNA样品为人全基因组 DNA。 根据本发明的一个实施例， 可 以采用含有待测位点的 DNA片段的 DNA样品进行检测， 这样可以提高检测的效率和精度。 例如， 可以首先提取生物样本中的全基因组 DNA， 然后通过常规的分离方法， 获得含有特定 位点的 DNA片段。

根据本发明的实施例，可以通过本发明的方法 进行研究的预定位点的突变不受特别限制。 根据本发明一些实施例， 可以通过本发明的方法， 进行检测的预定位点的突变是为选自人类 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变。 本发明的发明 人惊奇地发现， 借助本发明实施例的方法， 可以有效地对上述基因中的突变位点进行检测 。 根据本发明的一个具体示例， 可以进行检测的突变位点以及常见的突变类型 为下表 3中所列 出的任意一种：

需要说明的是， 这些突变位点的表示方法均为本领域技术人员 已知的表达方式。 鉴于突 变位点既可以发生在 cDNA序列上，也有可能发生在内含子上。为此� �发明人提供突变说明， 以对突变的精确位点进行描述。 其中， 说明规则为：

1 )在位点前面加字母以区分所参考序列的类型� �

① " c "表示参考 cDNA的序列， 如： c.235delC, 表示 cDNA序列的第 25个碱基 C缺失

② " m. "表示参考线粒体的序列， 如： m.l494C>T, 表示线粒体 DNA序列第 1494个碱基 C被置换为丁。

2) 以内含子开始： 外显子序号 +该位点在内含子的位置如： IVS15+5G>A， 表示在 SLC26A4基因第 15个外显子的下游的第 5个碱基 G置换为 A。

3 ) c.l76-191dell6表示缺失 176位至 191位的 16个碱基。

4) c.299_300delAT表示缺失 299位至 300位的 2个碱基 （ΑΓ碱基）。

关于人类 ΪΪ生型的上述基因， 可以通过 NCBI索取号获得。 人类野生型 GJB2的 NCBI 索取号为 NG_008358.1、 GJB3的 NCBI索取号为 NG_008309.1、 SLC26A4的 NCBI索取号 为 NG_008489.1、 mtDNA (线粒体 DNA) 的 NCBI索¾号为 NC_012920。

为方便理解， 下面对 GJB2、 GJB3 SLC26A4、 mtDNA (线 体 DNA)进行简要介绍。 GJB2基因： 该基因定位于常染色体 13qll-12区域， DNA全长 4804__bp， 含 2个外显子， 编码区为 678 bp,编码由 266个氨基酸残基组成的缝隙连接蛋白 Connexin 26，属于 β-2蛋白， 是钾离子循环通路的一部分。 GJB2基因突变为遗传性耳聋最常见的病因， GJB2基因突变导 致的耳聋为语前、 双侧、 对称性耳聋， 听力损失程度变异较大， 可由轻度到极重度， 但多数 为重度或极重度耳聋。 在中国人群中， 常见 GJB2 基因突变类型主要有 235ddC、 299 300delAT、 176 191dell6等， 可占 GJB2基因突变人群的 80%以上。关于该基因的详细 描述， 可以参见 Dai P, Yu F, Han B, et al. GJB2 mutation spectrum in 2,063 Chinese patients with nonsyndromic hearing imp∑drment[J]. J Transl Med, 2009, 7:26, 在此通过参照并入本文。

GJB3基因:该基因定位在 1ρ33-ρ35， 有 2个外显子， 编码含有 270个氨基酸的缝隙连接 蛋白 C ₀ nn _eX in 31。 GJB3基因突变可引起常染色体显性或隐性遗传� �非综合征性耳聋， 被认 为与高频听力下降有关。 关于该基因的详细描述， 可以参见¾& JH, Liu CY， Tang BS， et al . Mutations in the gene encoding gap junction protein beta-3 associated with autosomal dominant hearing impairment. Nat ewet, 1998,20 :370-373 , 在此通过参照并入本文。

SLC26A4基因： 也被称为 PDS基因， 该基因定位于常染色体 7q31区域， 含 21个外显 子， 编码 1个由 780个氨基酸残基组成的多次跨膜蛋白 Pendrin, 属于离子转运体家族， 主要 与碘 /氯离子转运有关。 临床上表现为先天性或后天性耳聋， 耳聋发生或加重与外伤、感冒有 关。 PDS基因突变种类较多， 但 919— 2A>G、 2168A>G、 1226G>A、 1975G>C、 1229C>T、 1174A>T、 1687_1692insA、 IVS15+5G>A、 2027T>A 589G>A与 281C>T突变体频率高达 82.51%。 关于 基因的详细描述， 可以参见袁永一,王国建,黄德亮，等. 大前庭水管相关 SLC26A4基因热点突变区域筛查方案探讨. ^" 学 2010, 8(3) :292-295 , 在此通过 参照并入本文。

线粒体 DNA基因： 线粒体基因突变与氨基糖甙类抗生素（AmAn)引� ��的药物性耳聋有 关， 线粒体基因突变会导致线粒体的缺陷， 影响到与听力直接相关的耳蜗毛细胞线粒体的 产 能不足， 从而导致耳蜗与前庭细胞损伤或死亡。 线粒体 DNA基因突变为母系遗传， 常在成 年早期发生， 表现为双侧对称性、 以高频听力下降为主、 程度不等的感音神经性耳聋。 线粒 体基因突变的主要位点有 1555A>G与 1494C>T。

关于上述基因突变类型的详细描述， 可以见相关的研究文献， 为方便描述特列表如下， 通过参考将所列举的文献并入本文。

基因 突变 参考文献 在野生型基因全 长序列中的对应 位点

GJB2 35delG Mahdieh N, Rabbani B. Statistical study of 35delG突变位点

35delG mutation of GJB2 gene A 对 应 meta-analysis of carrier frequency. Int J NG 008358 中 Audiol.2009;48(6):363-70. 所^全长序列中

167delT Al-Achkar W, Moassass F, Al-Halabi B, et 的第 3429位

al.Mutations of the Connexin 26 gene in

families with non-syndromic hearing loss. Mol 167delT 突变位 Med Report. 2011 Mar-Apr;4(2):331-5. 点 对 应

176-191dell6、 Chen Y, Tudi M, Lu HL, et al. Common gene NG 008358 中 235delC 与 mutations study in Uyghur population with 所^全长序列中 299_300delAT deafness in Kashgar region of Xinjiang. 的第 3561位

Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za

Zhi. 2011 Mar;46(3):205-8. 176_191dell6突 变 Ϊ立 点 对应 NG 008358 中 所^全长序列中 的第 3570-3585 位

235delC 突变位 点 对 应 NG 008358 中 所 全长序列中 的第 3639位

299_300delAT突 变 Ϊ立 点 对应 NG 008358 中 所^全长序列中 的第 3693-3694 位

GJB3 538C>T Chen Y， Tudi M, Sun J, et al. Genetic 5380T 突变位

Mutations in Non-syndromic Deafness Patients 点 对 应 of Uyghur and Han Chinese Ethnicities in NG 008309 所 Xinjiang, China: A Comparative Study. J 示 长序列中的 Transl Med. 2011 Sep 14;9(1): 154. 第 4111位；

547G>A Xia JH, Liu CY, Tang BS, et al. Mutations in

the gene encoding gap junction protein beta-3 547G>A突变位 associated with autosomal dominant hearing 点 对 应 impairment. Nat Genet. 1998 Dec;20(4):370-3. NG 008309 所 示 长序列中的 第 4121位

SLC26A4 281C>T Wu CC, Lu YC, Chen PJ, et al. Phenotypic 2810T 突变位

Analyses and Mutation Screening of the 点 对 应 SLC26A4 and FOXI1 Genes in 101 NG 008489 所 Taiwanese Families with Bilateral 示 长序列中的 Nonsyndromic Enlarged Vestibular Aqueduct 第 2778位； (DFNB4) or Pendred Syndrome. Audiol

Neurotol 2010;15:57-66. 589G>A突变位

589G>A Wang QJ, Zhao YL, Rao SQ, et al. A distinct 点 对 应 spectrum of SLC26A4 mutations in patients NG 008489 所 with enlarged vestibular aqueduct in China. 示 长序列中的 Clin Genet. 2007 Sep;72(3):245-54. 第 13703位；

Xiao Mei Ouyang, Denise Yan, Hui Jun Yuan, 919-2A>G 突变 et al. The genetic bases for non-syndromic 位 点 对 应 hearing loss among ChineseGenetics of NG 008489 所 hearing loss in the Chinese population. Journal 示 ^长序列中的 of Human Genetics 54, 131-140. (在该文献中， 第 22819位； 采用以氨基酸命名的方式： P.G197R)

1174A>T突变位

2027T>A Park HJ, Shaukat S, Liu XZ, et al. Origins and 点 对 应 frequencies of SLC26A4 (PDS) mutations in NG 008489 所 east and south Asians: global implications for 示 长序列中的 the epidemiology of deafness. J Med Genet. 第 29514位； 2003 Apr;40(4):242-8.

919-2A>G Wu CC, Hung CC, Lin SY, et "/.Newborn 1226G>A 突变 genetic screening for hearing impairment: a 位 点 对 应 preliminary study at a tertiary center. PLoS NG 008489 所 One. 2011;6(7):e22314. 示 ^长序列中的

Dai P, Yuan Y Huang D, Zhu X, et al. 第 29566位； Molecular Etiology of Hearing Impairment in

Inner Mongolia mutations in SLC26A4 gene 12290T突变位 Λ Λ Λ and relevant phenotype analysis. J Transl Med. 点 对 应

2008 Nov 30;6:74. NG 008489 所

1226G>A Fugazzola L, Cirello V, Dossena S, et al. High 示全长序列中的 phenotypic intrafamilial variability in patients 第 29569位； with Pendred syndrome and a novel

duplication in the SLC26A4 gene: clinical IVS 15+5G>A突 characterization and functional studies of the 变位 点 对应 mutated SLC26A4 protein. Eur J Endocrinol. NG 008489 所 2007 Sep;157(3):331-8. 示 ^长序列中的

2162C>T Fugazzola L, Mannavola D, Cerutti N, et al. 第 39546位；

Molecular Analysis of the Pendred's Syndrome

Gene and Magnetic Resonance Imaging 1975G>C突变 Studies of the Inner Ear Are Essential for the 位点对应 Diagnosis of True Pendred's Syndrome. J Clin NG 008489所 Endocrinol Metab. 2000 Jul;85(7):2469-75. 示 长序列中的

2168A>G Li H, Li HB, Mao J, Liu MJ, et al. Genetic 第 41364位； screening of mutation hot-spots for

nonsyndromic hearing loss in southern Jiangsu 2027T>A突变位 province with SNaPshot. Zhonghua Yi Xue Yi 点 对 应 Chuan Xue Za Zhi. 2011 Aug;28(4):383-6. NG 008489 所

IVS15+5G>A Iwasaki S, Tsukamoto K, Usami S, et al. 示 ^长序列中的

Association of SLC26A4 mutations with 第 41416位； clinical features and thyroid function in deaf

infants with enlarged vestibular aqueduct. J 21620T突变位 Hum Genet. 2006;51(9):805-10. 点 对 应

NG 008489 所 示 长序列中的 第 49492位；

2168A>G 突变 位 点 对 应 NG 008489 所 示 ^长序列中的 第 49498位； mtDNA 1494C>T Zhao H, Li R, Wang Q, Yan Q, Deng JH, et 1494C>T突变位

(线粒体 α/.Maternally inherited 点 对 应 DNA) aminoglycoside-induced and nonsyndromic NC 012920所示 deafness is associated with the novel C1494T 全 ^序列中的第 mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene 1494位； in a large Chinese family. Am J Hum Genet. 2004 Jan;74(l): 139-52. 1555A>G突变

1555A>G Prezant TR, Agapian TV, Bohlman MC, et al. 位点对应

Mitochondrial ribosomal RNA mutation NC 012920所示 associated with both antibiotic-induced and 全 ^序列中的第 non-syndromic deafness. Nat Genet. 1993 1555位；

Jul;4(3):289-94.

由此， 利用根据本发明实施例的方法， 可以有效地检测耳聋相关的基因突变， 并且进而 能够有效地预测受试者罹患遗传性耳聋， 例如可以辅助诊断患者耳聋的发病原因， 从而可以 针对性地采用相应的治疗方案。

本领域技术人员能够理解的是， 可以采用任何 PCR方法 DNA样品进行扩增， 只要所得 到的扩增产物中包含预定位点即可。 根据本发明的具体示例， 为了诊断前面表 3中所列出的 突变类型， 可以采用表 1中所列出的引物对分别作为扩增引物的第一� �物和第二引物。 本发 明的发明人惊奇地发现通过使用上述的扩增引 物， 能够有效地实现对预定位点的扩增， 并且 在后续能够有效地提高检测突变类型的效率和 精确性， 从而可以高效地确定受试者是否患有 遗传性耳聋。 根据本发明的一个实施例， 在表 1中所示出的第一引物和第二引物 5'端还可以 都具有 10个碱基 acgttggatg ( SEQ ID NO: 53 ) 的标签序列， 发明人发现， 通过采用上述标 签序列， 可以使得上述第一引物和第二引物的分子量不 在后续质谱的检测范围内， 由此， 能 够进一步提高检测的精确度和效率。

S200: 在获得包含预定位点的扩增产物之后， 可以使用延伸引物以及 ddNTP, 以所获得 的扩增产物为模板， 进行寡核苷酸延伸反应， 以便获得在所述延伸引物的 3'端连接一个碱基 的延伸产物。 根据本发明的实施例， 延伸引物的 3'端紧邻预定位点。 由此， 所获得的延伸产 物的 3'末端所对应的碱基包含有预定位点的突变信� ��， 在后续可以通过分子量的分析， 确定 该位点是否具有突变事件， 并且可以确定该突变事件的类型。 本领域技术人员可以理解， 可 以通过任何已知的 PCR方法对扩增产物进行上述寡核苷酸延伸反应 。根据本发明的一个实施 例， 可以采用表 2中所列出的弓 I物作为延伸引物进行上述寡核苷酸延伸反应� � 本发明的发明 人惊奇地发现通过使用表 1和表 2中所列出的弓 I物组合， 能够非常有效地检测所列出的突变 类型。

根据本发明的一个实施例， 在进行所述寡核苷酸延伸反应之前， 可以进一步包括使用碱 性磷酸酶对所获得的扩增产物进行处理的步骤 。由此，通过碱性磷酸酶对扩增产物进行处理 ， 可以除去扩增产物中残存的 dNTP， 从而可以提高后续延伸反应的效率， 进而能够实现高效 地检测 DNA样品中预定位点的突变。

S300: 在获得上述延伸产物之后， 可以对延伸产物进行分子量检测， 以便获得延伸产物 的分子量。 根据本发明的实施例， 可以采用任何已知的方法对延伸产物进行分子 量检测。 根 据本发明的一个实施例， 通过 MALDI-TOF 质谱 （基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)检测对所述延伸 产物进行分子量检测。 MALDI-TOF质谱是近年来发展起来的一种新型的软 电离生物质谱， 主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离 子源 (MALDI)和飞行时间质量分析器（TOF)。 MALDI 的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶 薄膜， 基质从激光中吸收能量传递给 生物分子， 而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物 分子得到质子， 而使生物分子电离 的过程。 TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管 道， 根据到达检测器的飞行时间不 同而被检测， 即测定离子的质荷比 （M/Z) 与离子的飞行时间成正比， 实现对离子的检测。

由此， 能够精确、 高效地对延伸产物进行分子量检测。 发明人惊奇地发现， 通过 MALDI-TOF质谱检测甚至可以实现对 DNA样品中杂合突变或纯合突变的检测。根据本 发明 的一个实施例， 在对延伸产物进行 MALDI-TOF质谱检测之前， 进一步包括对所述延伸产物 进行纯化的步骤。 由此， 可以进一步提高 MALDI-TOF质谱检测的精确度， 从而提高检测 DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。根 据本发明的具体实例，利用阴离子树脂对所 述延伸产物进行纯化。 由此， 能够更进一步提高 MALDI-TOF质谱检测的精确度， 从而提高 检测 DNA样品中预定位点的突变的效率和精确度。

S400: 最后， 基于所检测获得的延伸产物分子量， 确定所述预定位点的突变类型。 由于 延伸反应是以包含预定位点的扩增产物为模板 ， 并且进行延伸反应的延伸引物的 3'端紧邻所 述预定位点，并且在进行延伸反应时使用 dd TP作为原料， 因而可以保证延伸反应可以仅延 伸一个碱基， 即对应预定的位点， 基于各个不同碱基的分子量存在较为显著的区 别， 因而， 通过对延伸产物的分子量进行检测， 可以通过所获得的延伸产物的分子量， 来确定在预定位 点是否发生了突变， 以及所发生突变的类型。 需要说明的是， 这里的分析可以是通过将延伸 产物的分子量与标准参照进行比较来获得。 这里使用的术语 "标准参照"可以是预先对具有已 知突变的样品进行平行试验获得的分子量数值 。

与现有技术相比， 根据本发明实施例的方法至少具有下列优点之 一：

( 1 ) 使用的试剂耗材相对简单且稳定， 不需要荧光染料、 特殊的酶等价格昂贵的试剂；

(2) 反应可以在微量体系中进行， 减少了样品和各种消耗品的使用；

(3 ) 由于质谱技术直接检测 DNA的分子量（质荷比）且直接确定碱基的类型 （即， 不 需要经过任何形式的信号转换)， 因此， 理论上只要有一个拷贝的突变片段例如单核苷 酸多 态性 （SNP)被扩增即可识别， 从而杜绝了假阳性发生的可能；

(4)质谱技术还有自动化、 高通量检测等特点， 因此， 质谱技术与多引物延伸技术结合 使用， 可以在一个反应体系中同时检测多个耳聋突变 位点， 结合 DNA 自动提取设备、 多重 PCR引物设计软件及数据分析软件， 大大减轻工作量， 提高检测通量， 并降低检测费用； ( 5 ) 与基因序列测定相比具有操作简便、 结果准确、 通量高、 价格低廉的优点。

用于检测 DNA样品中预定位点的突变的系统

根据本发明的第二方面， 本发明提出了一种用于检测 DNA样品中预定位点的突变的系 统。 参考图 2， 根据本发明的实施例， 该用于检测 DNA样品中预定位点的突变的系统 1000 包括： DNA样品扩增装置 100、 扩增产物延伸装置 200、 分子量检测装置 300以及突变分析 装置 400。

根据本发明的实施例， DNA样品扩增装置 100用于对 DNA样品进行 PCR扩增， 以便获 得包含预定位点的扩增产物。根据本发明的一 个实施例， DNA样品扩增装置 100内设置有扩 增弓 I物对， 所述扩增产物延伸装置内设置有延伸引物。 由此， 便于 DNA样品扩增装置和扩 增产物延伸装置分别对 DNA样品进行扩增， 和进行寡核苷酸延伸反应。 如前所述， 根据本 发明的实施例， DNA样品扩增装置 100不受特别限制， 其可以是任何适于对 DNA样品进行 扩增的装置。 根据本发明的一个实施例， 可以采用已知的 PCR装置作为 DNA样品扩增装置 100。 另外， 根据本发明的实施例， 可以在 DNA样品扩增装置 100中预先设置扩增引物对， 由此可以方便进行操作。 本领域技术人员可以根据所要进行分析的位点 来确定可以采用的扩 增引物序列。根据本发明的一个实施例，所述 预定位点的突变为选自 GJB2基因、 GJB3基因、 SLC26A4基因以及 mtDNA的至少一种基因的突变， 所述 GJB2基因的突变为选自 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT和 235delC的至少一种， 所述 GJB3基因的突变为选 自位点 5380T和 547G>A 至少一种，所述 SLC26A4基因的突变为选自 281C>T、589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G和 IVS15+5G>A的至少一种， 以及所述 mtDNA的突变为选自 14940T和 1555A>G的至少一 种。 关于这些突变， 在前面已经进行了详细描述， 在此不再赘述。 针对这些突变， 可以采用 表 1和表 2中所列出的引物组合（前面已有详细描述， 在此不再赘述） 作为扩增弓 I物对。 本 发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引物 组合， 能够非常有效地检测所列出的突变类 型。 需要说明的是， 在本发明中所使用的术语"相连"应做广义理解� �� 其可以是直接相连， 也 可以是通过媒介间接相连， 只要可以实现功能上的衔接即可。

根据本发明的实施例， 扩增产物延伸装置 300与 DNA样品扩增装置 100相连， 以便从

DNA样品扩增装置 100接收扩增产物，并且对扩增产物进行寡核苷 酸延伸反应， 以便获得在 所述延伸引物的 3'端连接一个碱基的延伸产物， 其中， 延伸引物的 3'端紧邻所述预定位点。 根据本发明的一个实施例， 可以进一步包括扩增产物净化装置 （图中未示出）， 扩增产物净 化装置可以分别与 DNA样品扩增装置 100和扩增产物延伸装置 200相连， 以便对扩增产物 进行净化处理， 并将经过净化的扩增产物输入至扩增产物延伸 装置 200。 由此， 可以除去扩 增产物中残存的 d TP， 从而可以提高后续延伸反应的效率， 进而能够实现高效地检测 DNA 样品中预定位点的突变。

根据本发明的实施例， 分子量检测装置 300可以与扩增产物延伸装置 200相连， 以便确 定所述延伸产物的分子量。 根据本发明的一个实施例， 所述分子量检测装置为 MALDI-TOF 质谱装置。 由此， 能够精确、 高效地对延伸产物进行分子量检测， 发明人惊奇地发现通过 MALDI-TOF质谱检测甚至可以实现对样品中杂合突 变或纯合突变的检测。 根据本发明的一 个实施例， 进一步包括延伸产物纯化装置 （图中未示出）。 延伸产物纯化装置可以分别与扩 增产物延伸装置 200和 MALDI-TOF质谱装置 300相连， 以便对延伸产物进行纯化处理， 并 将经过纯化的延伸产物输入至所述 MALDI-TOF 质谱装置。 由此， 可以进一步提高 MALDI-TOF质谱检测的精确度， 从而提高检测 DNA样品中预定位点的突变的效率和精确 度。 根据本发明的一个实施例， 所述延伸产物纯化装置为阴离子树脂。 由此， 能够更进一步 提高 MALDI-TOF质谱检测的精确度， 从而提高检测 DNA样品中预定位点的突变的效率和 精确度。

根据本发明的实施例， 突变分析装置 400可以与分子量检测装置 300相连， 基于所得到 的延伸产物的分子量， 确定所述预定位点的突变类型。 根据本发明的实施例， 突变分析装置 400可以与存有标准参照， 通过将延伸产物的分子量与标准参照进行比较 可以得出是否存在 突变以及突变类型的结论。 这里使用的术语"标准参照"可以是预先对具有� ��知突变的样品进 行平行试验获得的分子量数值。 另外， 根据本发明的实施例， 突变分析装置 400还可以适于 进行各种统计检验分析， 以便实现更精确更准确地分析。

由此， 利用根据本发明实施例的系统， 能够有效地实施根据本发明实施例的检测 DNA 样品中预定位点的突变的方法， 从而有效地确定 DNA样品中预定位点的突变。 需要说明的 是， 上面所提到的各个装置的功能可以在相同的容 器内完成， 只要能够实现上述功能即可。

应用

根据本发明的实施例， 确定 DNA样品中预定位点的突变的方法可以应用于多 种与基因 突变相关的检测。 例如， 可以有效地对实验室中构建的突变体的突变类 型进行检测。

根据本发明的实施例， 还可以将上述方法应用于诊断遗传性耳聋的方 法、 产前诊断遗传 性耳聋的方法、 产前诊断遗传性耳聋的方法。

具体地， 根据本发明的一个方面， 本发明提出了一种诊断遗传性耳聋的方法。 根据本发 明的实施例， 诊断遗传性耳聋的方法包括以下步骤： 提取怀疑患有遗传性耳聋的受试者的 DNA样品； 根据前述确定 DNA样品中预定位点的突变的方法， 对所述 DNA样品中预定位 点的突变进行分析； 以及基于 DNA样品中存在所述预定位点的突变， 确定所述受试者患有 遗传性耳聋， 其中， 所述预定位点的突变为表 3中所列出的突变的至少一种。 由此， 根据本 发明实施例的诊断遗传性耳聋的方法， 能够有效地诊断受试者是否属于遗传性耳聋， 并且能 够辅助确认耳聋的病因， 进而能够针对病因采用相应的治疗和辅助措施 。 根据本发明的实施 例， 可以采用的 DNA样品的类型并不受特别限制， 可以采用受试者的全基因组 DNA， 也可 以采用来自于包含特定基因的 DNA片段， 这里所说的特定基因指的是耳聋相关基因。 根据 本发明的实施例， 针对表 3中所列出的突变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合 （前 面已有详细描述， 在此不再赘述)。 本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引 物组合， 能够非常有效地检测所列出的突变类型， 从而可以高效地确定受试者是否患有遗传性耳 聋。 关于各步骤的细节， 可以参见前面的相关描述， 在此不再赘述。

进一步， 本发明提出了一种产前诊断遗传性耳聋的方法 。 根据本发明的实施例， 该产前 诊断遗传性耳聋的方法包括以下步骤：分离胎 儿 DNA样品；根据前述确定 DNA样品中预定 位点的突变的方法， 对所述胎儿 DNA样品中预定位点的突变进行分析； 以及基于所述胎儿 DNA样品中存在所述预定位点的突变， 确定所述胎儿患有遗传性耳聋， 其中， 所述预定位点 的突变为表 3中所列出的突变的至少一种。 由此， 根据本发明实施例的诊断遗传性耳聋的方 法， 能够辅助推测胎儿患有遗传性耳聋， 并且能够辅助确认耳聋的病因， 进而能够针对病因 采用相应的治疗和辅助措施。 针对表 3中所列出的突变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引 物组合 （前面已有详细描述， 在此不再赘述)。 本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的 引物组合，能够非常有效地检测所列出的突变 类型，从而可以推测胎儿是否患有遗传性耳聋 。 根据本发明的实施例， 可以采用的 DNA样品的类型并不受特别限制， 可以采用胎儿的全基 因组 DNA， 也可以采用来自于胎儿的包含特定基因的 DNA片段， 这里所说的特定基因指的 是耳聋相关基因。 根据本发明的实施例， 胎儿基因组 DNA的来源不受特别限制。 根据本发 明的一个实施例， 胎儿全基因组 DNA是从孕妇的绒毛膜、 羊水或脐带血中提取的。 由此， 可以在孕早期就能够有效推测胎儿是否患有遗 传性耳聋。 另外， 根据本发明的一个实施例， 也可以通过从孕妇的外周血中分离来自于胎儿 的游离核酸， 作为进行耳聋相关检测的 DNA 样品。

根据本发明的又一方面， 本发明还提供了一种预测电子耳蜗效果的方法 。 根据本发明的 实施例， 该预测电子耳蜗效果的方法包括以下步骤： 提取耳聋患者的 DNA样品； 根据前述 确定 DNA样品中预定位点的突变的方法，对所述 DNA样品中预定位点的突变进行分析；基 于所述 DNA样品中存在所述预定位点的突变， 确定所述耳聋患者患有遗传性耳聋； 基于所 述耳聋患者患有遗传性耳聋， 预测电子耳蜗对于所述耳聋患者有效， 其中， 所述预定位点的 突变为表 3中所列出的突变的至少一种。 由此， 可以通过确定耳聋患者的病因， 来确定是否 可以采用电子耳蜗来辅助耳聋患者获得听力。 针对表 3中所列出的突变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合（前面已有详细描述， 在此不再赘述)。本发明的发明人惊奇地发现� � 过使用上述的引物组合， 能够非常有效地检测所列出的突变类型， 从而可以预测耳聋患者是 否具有残余的螺旋神经节， 以便在没有对疾病进行治疗的前提下， 采用电子耳蜗绕过受损的 毛细胞直接利用电流剌激听神经从而重建听觉 。 根据本发明的实施例， 可以采用的 DNA样 品的类型并不受特别限制，可以采用胎儿的全 基因组 DNA，也可以采用来自于胎儿的包含特 定基因的 DNA片段， 这里所说的特定基因指的是耳聋相关基因。

试剂盒

本发明还提出了一种试剂盒， 其特征在于， 包括： 扩增引物对以及延伸引物。 根据本发 明的实施例， 扩增引物对适于对 DNA进行 PCR扩增反应， 以便获得包含预定位点的扩增产 物， 延伸产物适于利用 ddNTP, 以所得到的扩增产物为模板， 进行寡核苷酸延伸反应， 以便 获得在所述延伸引物的 3'端连接一个碱基的延伸产物， 其中， 延伸引物的 3'端紧邻所述预定 位点， 所述预定位点的突变为表 3中所列出的突变的至少一种。 针对表 3中所列出的突变， 可以采用表 1和表 2中所列出的引物组合 （前面已有详细描述， 在此不再赘述） 分别作为扩 增引物对和延伸引物。 本发明的发明人惊奇地发现通过使用上述的引 物组合制备的延伸产 物， 能够非常有效地用于检测所列出的突变类型， 从而可以高效地确定遗传性耳聋。 根据 本发明的一个实施例，利用该试剂盒，可以有 效地实施前述的根据本发明实施例的检测 DNA 样品中预定位点的突变、 诊断遗传性耳聋、 产前诊断遗传性耳聋、 以及预测电子耳蜗效果的 方法。 根据本发明的实施例， 本发明还提出了一组可以用于上述试剂盒的引 物组合。 利用该 引物组合， 可以有效地检测 DNA样品中预定位点的突变、 诊断遗传性耳聋、 产前诊断遗传 性耳聋、 以及预测电子耳蜗效果的方法。

下面根据具体的实施例对本发明进行说明。 需要说明的是， 这些实施例仅仅是为了说明 本发明， 而不应以任何方式解释为对本发明的限制。 另外， 除非特别说明， 在下面的实施例 中所涉及的方法为常规方法， 所涉及的材料和制剂也为市售可得的。

实施例 1

① 引物设计 根据所选择的待检测和 /或分型的耳聋基因突变位点 20个，包括 4个基因，分别是： GJB2 基因 (包含位点 35delG、 167delT、 176-191dell6、 299_300delAT与 235delC)、 GJB3基因 （包 含位点 538C>T 与 547G>A)、 SLC26A4基因 (包含位点 281C>T、 589G>A、 919-2A>G 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G与 IVS15+5G>A) 与 mtDNA的 1494C>T与 1555A>G。

根据突变位点的位置和基因型设计扩增弓 I物对和一条延伸引物， 其中扩增弓 I物的长度在 30个碱基左右，其扩增引物在 5'端具有 10个碱基 acgttggatg的标签序列； 延伸引物的长度为 17-28个碱基， 允许 5'端有 1-5个碱基与模板不完全配对， 并且 3'末端碱基与突变位点 3'端相 邻碱基完全匹配。 另外， 不同位点的延伸引物与延伸产物、 延伸产物与延伸产物间的分子量 差异不小于 30D。本发明设计的针对上述 20个耳聋基因突变位点的扩增引物参见表 1 (在第 一序列和第二序列的 5'端均带有标签序列 acgttggatg), 延伸引物参见表 2。

② DNA提取

收集正常人血液样本和临床收集的 8份临床血液样品 （命名为临床样本 1-8)， 使用全血 基因组 DNA提取试剂盒提取 DNAoDNA溶于水中作为模板 DNA,浓度统一调整为 50ng/^。

③ PCR扩增

通过 PCR扩增， 获得靶序列 PCR扩增产物。 PCR扩增反应体系参见表 4。 其中， 所有 试剂购买自美国 Sequenom公司， PCR仪为 GeneAmp® PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module o

表 4

PCR反应条件为 94°C， 2分钟； 94 °C变性 20秒， 56°C退火 30秒， 72°C延伸 1分钟， 共

性对照是已知序列的正常的人类基因组 DNA， 阴性对照是无菌双蒸水。

④ SAP处理

通过 SAP酶 （虾碱性磷酸酶） 处理， 除去步骤③获得的扩增产物中含有的 dNTP, 以确 保延伸反应时只延伸一个碱基。 SAP酶反应体系见下表 5。 所有试剂购买自美国 Sequenom 公司， PCR仪为 GeneAmp® PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module。

表 5

其中， SAP酶及 SAP酶缓冲液来自 iPLEX® Gold Reagent Kit 384。 SAP酶反应条件为 37°C温育 40分钟， 以去除 PCR扩增反应中剩余的 dNTP; 85°C温育 5分钟， 以使 SAP酶失活。

⑤延伸反应

以④中获得的 PCR扩增产物为模板， 通过延伸反应， 在延伸引物的 3'端连接一个碱基， 从而得到延伸产物。延伸反应所使用的原料是 经过质量修饰的 ddNTP, 它既保证了延伸反应 只连接一个碱基， 又能使整个系统的分辨率提高。 延伸反应体系见表 6。 所有试剂购买自美 国 Sequenom公司， PCR仪为 GeneAmp® PCR System 9700 Dual 384-Well Sample Block Module

表 6

其中， iPLEX酶、 iPLEX ddNTP混合物及 iPLEX缓冲液来自 iPLEX® Gold Reagent Kit

384。

*其中延伸引物混合物按照各引物的分子量大� �进行线性关系调整（即，根据每种延伸引 物的分子量计算每种引物的使用量)， 以达到最优的延伸反应， 获得最优的质谱峰图。

延伸反应条件为 94 °C， 30秒； 94 °C变性 5秒， 52 °C退火 5秒， 80°C延伸 5秒， 共扩增 40个循环， 且在每个循环中退火和延伸进行 5个小循环； 最终 72°C延伸 3分钟。

⑥树脂纯化

采用树脂（型号 08040， 购买自美国 Sequenom公司）纯化步骤⑤获得的延伸产物。在� �� 伸产物中加入 6 mg树脂， 18.00微升水， 垂直摇匀 40 min。 经过本步反应后， 树脂将与反应 体系中的阳离子充分结合， 从而使反应体系脱盐。反应完成后的纯化产物 可在 4°C保存数天， 也可在 -20°C保存数周。 所得的纯化产物在 4000 rpm离心 5分钟后， 取上清直接用于质谱检

⑦质谱检测

通过点样仪（型号 MassARRAYNanodispenser RSlOOO, 购买自美国 Sequenom公司）把 经步骤⑥化后的延伸产物转移到 384孔 spectroCHIP lI芯片上，芯片基质与产物共结晶，该芯 片在 Sequenom MALDI-TOF质谱仪 （型号 MassARRAY Analyzer Compact, 购买自美国 Sequenom公司） 上进行质谱检测， 从而确定待检测突变位点的基因型。

质谱检测结果显示于图 3-8中，

图 3显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:36对测试样本位点 299_300ddAT进行检测的结果。 从图 3-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 6545.3处检测到¾， 所述峰经分析确认为野 生型 ΑΓ (样本来源于正常人）， 结果与实际一致。 从图 3-2可知， MALDI-TOF质谱检测在 分子量 6545.3和 6561.3处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合缺 失突变（样本来源于临床样 本 1 )，结果与实际一致。从图 3-3可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 6561.3处检测到峰， 所述峰经分析确认为纯合缺失突变（样本来源 于临床样本 2)， 结果与实际一致。

图 4显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:40对测试样本位点 2810T进行检测的结果。从图 4-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 6121处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生型 C (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 4-2可知， MALDI-TOF质谱检测 在分子量 6121与 6200.9处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合 CT (样本来源于临床样本 3 )， 结果与实际一致。

图 5显示了使用延伸引物 SEQ ID N0:41对测试样本位点 1229 T进行检测的结果。 从 图 5-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 7053.6处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生 型 C (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 5-2可知， MALDI-TOF质谱 检测在分子量 7053.6与 7133.5处检测到峰， 所述峰经分析确认为杂合 CT (样本来源于临床 样本 4)， 结果与实际一致。

图 6显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:46对测试样本位点 IVS15+5G>A进行检测的结果。 从图 6-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 7961.3处检测到峰， 所述峰经分析确认为野 生型 G (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 6-2可知， MALDI-TOF质 谱检测在分子量 7961.3与 8041.2处检测到峰， 所述峰经分析确认为杂合 GA (样本来源于临 床样本 5)， 结果与实际一致。

图 7显示了使用延伸弓 I物 SEQ ID NO:50对测试样本位点 2168A>G进行检测的结果。从 图 7-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 7413.7处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生 型 A (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 7-2可知， MALDI-TOF质谱 检测在分子量 7333.8与 7413.7处检测到峰， 所述峰经分析确认为杂合 AG (样本来源于临床 样本 6)， 结果与实际一致。

图 8显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:51对测试样本位点 1494 T进行检测的结果。 从 图 8-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 5925.9处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生 型 C (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 8-2可知， MALDI-TOF质谱 检测在分子量 6005.8处检测到峰，所述峰经分析确认为突变纯 合 T (样本来源于临床样本 7)， 结果与实际一致。

实施例 2

①引物设计

根据所选择的待检测和 /或分型的耳聋基因突变位点 14个， 分布于 3个基因中， 分别是: GJB2基因 (包含位点 299_300delAT与 235delC)、 SLC26A4基因 (包含位点 281C>T、 919-2 A>G、 1174A>T、 1226G>A 1229C>T 1975G>C、 2027T>A 2162C>T 2168A>G与 IVS15+5G>A) 与 mtDNA的 1494 T与 1555A>G。 本发明设计的针对上述 14个耳聋基因突变位点的扩增 弓 I物选自实施例 1设计的扩增引物 （参见表 7)。 本发明设计的针对上述 14个耳聋基因突变 位点的延伸引物选自实施例 1设计的延伸引物 （参见表 8)。

表 7: 针对上述 14个耳聋基因突变位点的 3广增引物。

引物序列 5 引物说明

acgttggatgCTTCGATGCGGACCTTCTG

用于扩增位点 299 300delAT的扩增引物 acgttggatgCTCCTAGTGGCCATGCACG

acgttggatgTGGCGTGGACACGAAGATCA

用于扩增位点 235delC的扩增引物 acgttggatgACTTCCCCATCTCCCACATC

acgttggatgTAGTGACGTCATTTCGGGAG

用于扩增位点 2810T的扩增引物 acgttggatgACCAGAACTCTCAATCTGCC

acgttggatgCCAGGTTGGCTCCATATGAA

用于扩增位点 919-2A>G的扩增引物 acgttggatgCCAATGGAGTTTTTAACATC

acgttggatgCCAGTCTCTTCCTTAGGAAT 用于扩增位点 1174A>T、 1226G>A禾口 acgttggatgGTTCCTACCTGTGTCTTTCC 1229C>T的扩增引物

acgttggatgAGAAAACAAATTTCTAGGG

用于扩增位点 IVS15+5G>A的扩增引物 acgttggatgTTCTATGGCAATGTCGATGG

acgttggatgCAGAAAACCAGAACCTTACC 用于扩增位点 1975G>C和 2027T>A的扩 acgttggatgACGTTCCCAAAGTGCCAATC 增引物 acgttggatgGACAACATTAGAAAGGACAC 用于扩增位点 2162C>T和 2168A>G的扩 acgttggatgGATTTCACTTGGTTCTGTAG 增引物

acgttggatgTACGATAGCCCTTATGAAAC

用于扩增位点 14940T的扩增引物 acgttggatgGGGGTTTTAGTTAAATGTCC

acgttggatgAGCTCAGAGCGGTCAAGTTA

用于扩增位点 1555A>G的扩增引物 acgttggatgCTAAAACCCCTACGCATTTA

表 8: 针对上述 14个耳聋基因突变位点的延伸引物。

后续实验步骤 （即： DNA提取、 PCR扩增、 SAP处理、 延伸反应、 树脂纯化和质谱检 测） 与实施例 1 相同， 不同的是使用的模板是已知位点 235delC、 1226G>A、 2027T>A与 1555A>G出现突变的人类基因组 DNA (正常人样品和临床样本 8-11 )。

质谱检测结果显示于图 9-12中。

图 9显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:37对测试样本位点 235ddC进行检测的结果。从图 9-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 5449.6处检测到峰，所述峰经分析确认为野生型 C (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 9-2可知， MALDI-TOF质谱检测 在分子量 5449.6与 5529.5处检测到峰，所述峰经分析确认为杂合缺 失突变（样本来源于临床 样本 8)， 结果与实际一致。

图 10显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:44对测试样本位点 1226G>A进行检测的结果。 从图 10-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 5304.5处检测到峰，所述峰经分析确认为野 生型 G (样本来源同图 3-1 的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 10-2可知， MALDI-TOF 质谱检测在分子量 5288.5与 5304.5处检测到峰， 所述峰经分析确认为杂合 GA (样本来源于 临床样本 9)， 结果与实际一致。

图 11显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:48对测试样本位点 2027T>A进行检测的结果。从 图 11-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 5355.5处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生 型 G (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。从图 11-2可知， MALDI-TOF质谱 检测在分子量 5355.5与 5411.4处检测到峰， 所述峰经分析确认为杂合 GA (样本来源于临床 样本 10)， 结果与实际一致。

图 12显示了使用延伸引物 SEQ ID NO:52对测试样本位点 1555A>G进行检测的结果。 从图 12-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 6394.1处检测到峰，所述峰经分析确认为野 生型 A (样本来源同图 3-1 的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 12-2可知， MALDI-TOF 质谱检测在分子量 6314.2处检测到峰， 所述峰经分析确认为突变纯合 G (样本来源于临床样 本 11的样本来源)， 结果与实际一致。

实施例 3

①引物设计

根据所选择的待检测和 /或分型的耳聋基因突变位点 4个， 分布于 3个基因中， 分别是： GJB2基因 (包含位点 235delC；)、 SLC26A4基因 (包含位点 919-2A>G)与 mtDNA的 14940T 与 1555A>G。 本发明设计的针对上述 4个耳聋基因突变位点的扩增引物参见表 9， 延伸引物 参见表 10。

表 9: 针对上述 4个耳聋基因突变位点的扩增引物。

表 10: 针对上述 4个耳聋基因突变位点的延伸引物。

后续实验步骤 （即： DNA提取、 PCR扩增、 SAP处理、 延伸反应、 树脂纯化和质谱检 测）与实施例 1相同，不同的是使用的模板是已知位点 919-2A>G与 1555A>G出现突变的人 类基因组 DNA (正常人样品和临床样本 12-13 )。

质谱检测结果显示于图 13-14中。

图 13为使用延伸引物 SEQ ID NO:42对测试样本位点 919-2A>G进行检测的结果。 从图 13-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 5825.7处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生型 A (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 13-2可知， MALDI-TOF质谱检 测在分子量 5745.8与 5825.7处检测到峰， 所述峰经分析确认为杂合 AG, 结果与实际一致。 从图 13-3可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 5745.8处检测到峰，所述峰经分析确认突变 纯合 G (样本来源于临床样本 13 )， 结果与实际一致。

图 14为使用延伸引物 SEQ ID NO:52对测试样本位点 1555A>G进行检测的结果。 从图

14-1可知， MALDI-TOF质谱检测在分子量 6394.1处检测到峰， 所述峰经分析确认为野生型 A (样本来源同图 3-1的样本来源）， 结果与实际一致。 从图 14-2可知， MALDI-TOF质谱检 测在分子量 6314.2处检测到峰，所述峰经分析确认为突变纯 合 G (样本来源于临床样本 13)， 结果与实际一致。 在本说明书的描述中， 参考术语"一个实施例"、 "一些实施例"、 "示例"、 "具体示例"、 或"一些示例"等的描述意指结合该实施例或示� ��描述的具体特征、 结构、 材料 或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示 例中。 在本说明书中， 对上述术语的示意性表 述不一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或者特点可以在 任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方 式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例， 本领域的普通技术人员可以理解： 在不脱离本 发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例 进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本发明的 范围由权利要求及其等同物限定。