GAMMA (γ).

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevos compuestos ciclopéptidos RGD beta- lactámicos así como a sus sales farmacéuticamente aceptables, a procedimientos para su preparación, a composiciones farmacéuticas que los contienen y a su uso para la preparación de medicamentos en terapéutica humana y/o veterinaria. También se refiere a materiales resultantes de su inmovilización sobre proteínas, polímeros, fases estacionarias de cromatografía o compuestos fluorescentes y al empleo de dichos materiales para la manufactura de sistemas de análisis o diagnóstico, sistemas de separación o rellenos cromatográficos para la detección de integrinas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las características de adhesión e interacción de los diferentes tipos celulares con otras células o componentes de la matriz extracelular son esenciales para la función celular. Las integrinas son unas glicoproteinas receptores de la membrana celular de tipo αβ heterodímero que juegan un papel imporante en estos procesos. Así, la integiϊna αvβ3 es un receptor de células endoteliales que es dependiente de

RGD y que se expresa de forma preferente en vasos sanguíneos en proceso de angiogénesis. Se ha demostrado que juega un papel importante en neovascularización y que sus antagonistas detienen la formación de nuevos vasos sanguíneos sin afectar a los preexistentes (Brooks PC et al. Science 1994 264(5158): 569-571 "Requirement of vascular integrin avβ3for angiogénesis").

Varias integrinas reconocen la secuencia hidrofílica de aminoácidos RGD Arg-Gly- Asp (Ruoslahti E, Pierschbacher M, CeIl 1986 44:517-518 " Arg-Gly-Asp: A versatile cell recogñition sigñal") rEMK ^' secüencϊú se encuentra en proteínas adhesivas como fibronectina, vitronectina, fibrinógeno, factor de von Willebrand y colágenos. Procesos como la

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agregación de plaquetas, la migración de células tumorales, la metástasis, la angiogénesis y la adhesión de osteoclastos en la matriz ósea dependen de la interacción entre receptores como las integrinas y proteinas de la matriz extracelular como las que se acaban de mencionar (Tissue Res. 305, 285-295 (2001)). Los anticuerpos, péptidos o peptidomiméticos capaces de interferir selectivamente en los mecanismos de adhesión celular controlados por una o varias de dichas integrinas y, más particularmente por las integrinas (Xvβ ₃ , son por lo tanto agentes antiangiogénicos de aplicación en terapia antitumoral, como se índica, por ejemplo, en Science, 264, 569-571 (1994), CeIl, 79, 1157-1164 (1994), Science, 270, 1500-1502 (1995) ó J Mea Chem., 43, 22-26 (2000). También son de utilidad en el tratamiento de la restenosis posterior a la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA), la artritis reumatoide o la osteoporosis.

Entre ellos, los péptidos sintéticos que contiene la secuencia RGD podrían competir con las proteinas en la unión a los receptores (integrinas). Se ha visto que la conformación de la secuencia RGD juega un papel crítico en la especificidad de la unión al receptor. La presencia de conformaciones bloqueadas de giros γ y/o β en ciclopéptidos o pseudopéptidos equivalentes puede ser determinada en disolución mediante técnicas de RMN como se indica, por ejemplo, en Quart. Rev. Biophys. 31, 142-237 (1998), y métodos para el bloqueo conformacional de diferentes combinaciones de giros γ y/o β se han utilizado para incrementar la potencia y selectividad de los pseudociclopéptidos RGD en el reconocimiento de integrinas de las familias αvβ ₃ , ocπβ _3> «vβs y ot ₅ βi como se muestra, por ejemplo, en J. Biol. Chem. 269, 20233-20238 (1994).

Es sabido que ciertos miméticos de ciclopentapéptidos RGD que presentan en disolución un giro γ y un giro β entre los residuos de Arg-Gly-Asp inhiben de modo moderado la integrína ocvβ _3. Para llevar a cabo la estabilización simultánea de un giro γ y un giro β entre los residuos Arg-Gly-Asp de ciclopentapéptidos RGD se han empleado α- amino-γ-lactamas, α-amino-δ-lactamas, α-amino-ε-lactamas, prolinas, prolinas espirolactámicas, y biciclos lactámicos tales como los descritos en J. Am. Chem. Soc. 118, 7881-7891 (1996), Org. Lett. 3, 1001-1004 (2001) ó EP-683 173. La presencia de los giros Y y β en estos compuestos- se determina -mediante la formación - de -dos. jpuentes_jie_ hidrógeno; el primero entre NH(Asp) y C=O(ATg), correspondiente al giro γ y el segundo

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

entre NH(Arg) y C=O(Asp), correspondiente al giro β. También se han estabilizado simultáneamente los mismos tipos de giros γ y β entre los residuos de Arg-Gly-Asp en ciclopentapéptidos RGD sin incorporar lactamas u otros agentes cíclicos mediante la modificación de la configuración (D) ó (L) de algunos de los aminoácidos contenidos en el ciclo, véase EP-O 606 881.

Por otra parte, es conocido que el ciclopentapéptido RGD ciclo(Arg-Gly-Asp-(D)Phe- N(Me)VaI), conteniendo simultáneamente un D-aminoácido y un resto N-alquilado, presenta únicamente giros γ- débiles en disolución acuosa, tal y como se establece en J, Med. Chem. 42, 3033-3040 (1999). Dicho compuesto, que no posee un giro β- en su conformación en medio acuoso, posee una mayor afinidad por la integrina αvβ ₃ que sus análogos conteniendo giros γ y β. La modificación de ciclopéptidos RGD u otros elementos estructurales para bloquear un giro γ, preferentemente sin formar giros β-, parece ser un requisito deseable para incrementar la actividad inhibidora de dichos compuestos frente a la integrina αvβ ₃ - A la vista de lo anterior es evidente que aún persiste la necesidad de encontrar inhibidores de integrina que sean selectivos y que tengan buena actividad. Son especialmente deseables compuestos que presenten giros γ, que sean estables y con buenas propiedades farmacológicas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Hemos encontrado que pseudopéptidos cíclicos conteniendo la secuencia RGD y un residuo beta lactama alfa aminado presentan una conformación con giros γ y buenas propiedades de inhibición de integrinas. Además, hemos encontrado que en función de uno de los sustituyentes se puede modular la conformación y mantener o eliminar el giro β. Los compuestos de la invención se caracterizan por ser conformacionalmente restringidos con independencia de los sustituyentes, conteniendo al menos un giro γ estable en agua.

Así, en un aspecto la invención se dirige a un compuesto de fórmula (I): c/c/o[Arg-Gly-Asp-(beta-Lactam)]

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

(D conteniendo al menos un giro γ donde (beta-Lactam)- es un fragmento de 3-amino-l-(2- carbonilmetil)-azetidinona de fórmula (II)

(H)

donde R ¹ , R ² , R ³ , R ⁴ , R ⁵ y R ⁶ se seleccionan independientemente del grupo formado por hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, arilalquilo sustituido o no sustituido, heterocicliío sustituido o no sustituido, heterociclilalquilo sustituido o no sustituido, -COR ₇ , -C(O)OR ₇ , -C(O)NR ₇ R ₈ -C=NR ₇ , -CN, -OR ₇ , -OC(O)R ₇ , -S(O) ₄ -R ₇ , - NR ₇ R ₈ , -NR ₇ C(O)R ₉ , -NO ₂ , -N=CR ₇ R ₈ o halógeno; donde dos de ellos pueden estar unidos para formar un sustituyente cíclico; t es 1, 2 ó 3,

R ₇ y R ₈ se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, cicloalquilo sustituido o no sustituido, alquenilo sustituido o no sustituido, arilo sustituido o no sustituido, heterocicliío sustituido o no sustituido, alcoxilo sustituido o no sustituido, ariloxilo sustituido o no sustituido, halógeno; sus enantiómeros, diastereoisómeros o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende un compuesto tal como se define más arriba, sus enantiómeros, diastereoisómeros o mezclas de los mismos.

La invención también se refiere a un procedimiento para la obtención de un compuesto tal como se definió más arriba, qué comprende: a) la ciclación de los siguientes pseudopéptidos protegidos en los restos de Arg y Asp:

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

H-Arg-Gly-Asp~(beta-Lactam)-OH

H-Gly-Asp-(beta-Lactam)-Arg-OH H-Asp-(beta-Lactam)-Arg-Gly-OH H-(beta-Lactam)-Arg-Gly-Asp-OH donde (beta-Lactam)- es un fragmento de 3-amino-l-(2-carbonilmetil)-azetidin-2-ona de fórmula (II) tai como está definido; b) opcionalmente la eliminación de los grupos protectores.

La invención también cubre los intermedios necesarios para este procedimiento y que presenta los elementos estructurales de los compuestos tal como están definidos más arriba, es decir pseudopéptidos de fórmula:

H-Arg-Gly-Asp-(beta-Lactam)-OH H-Gly-Asp-(beta-Lactam)-Arg-OH H-Asp-(beta-Lactam)-Arg-Gly-OH H-(beta-Lactam)-Arg-Gly-Asp-OH donde (beta-Lactam)- es el fragmento de 3-amino-l-(2-carbonilmetíl)-azetidin-2-ona de fórmula (II) tal como se definió y donde Asp y Arg están opcionalmente protegidos con grupos protectores.

En otro aspecto la invención se refiere al empleo de un compuesto tal como se define más arriba en la manufactura de un medicamento. De forma preferente el medicamento es para el tratamiento o prevención de una enfermedad mediada por la sobreexpresión de integrinas del tipo αvβ3, Oíπβ3, otyβs y «sβi en humanos y animales, tal como cáncer, metástasis de tumores sólidos cancerosos, trombosis, restenosis posterior a la angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA), artritis reumatoide o la osteoporosis. En un aspecto adicional la invención se refiere a un sistema para la purificación de integrinas o bien un sistema de diagnóstico o análisis que comprende un pseudopéptido tal como está definido más arriba.

Los compuestos de la invención se pueden inmovilizar sobre un soporte para constituir un material que es otro aspecto de la invención. El soporte puede ser entre otros

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

un polímero, una proteína, un compuesto fluorescente o una fase estacionaria de cromatografía.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL CONTENIDO DE LAS FIGURAS: La Figura 1 muestra el espectro ¹ H-RMN (500MHz) (WATERGATE) del Compuesto A (1OmM) registrado en H ₂ CVD ₂ O 90/10 a 300K

La Figura 2 muestra el espectro TOCSY(500MHz) (WATERGATE) del Compuesto A (1OmM) registrado en H ₂ GVD ₂ O 90/10 a 300K

La Figura 3 muestra el espectro ROESY del Compuesto A (1OmM) determinados en H ₂ O/D ₂ O 90/10 a 300K y con un tiempo de mezcla de 200ms.

La Figura 4 muestra (arriba) la deriva térmica de los protones amídicos del Compuesto A (1OmM) medida en H ₂ O/D ₂ O 90/10 entre 300K y 325K a intervalos de 5K y (abajo) los coeficientes térmicos (ppb/K) de los protones amídicos del Compuesto A.

La Figura 5 muestra la estructura tridimensional del Compuesto A en disolución de H ₂ O/D ₂ O 90/10 a 300K determinada mediante Dinámica Molecular con distancias interprotónicas restringidas a partir de los datos de RMN (ROESY).

La Figura 6 muestra el espectro ^! H-RMN (500MHz) (WATERGATE) del Compuesto B (5mM) registrado en H ₂ CVD ₂ O 90/10 a 300K

La Figura 7 muestra el espectro TOCSY(500MHz) (WATERGATE) del Compuesto B (5mM) registrado en H ₂ O/D ₂ O 90/10 a 300K

La Figura 8 muestra el espectro ROESY del Compuesto B (5mM) determinados en H ₂ CVD ₂ O 90/10 a 300K y con un tiempo de mezcla de 400ms.

La Figura 9 muestra (arriba) la deriva térmica de los protones amídicos del Compuesto B (5mM) medida en H ₂ CVD ₂ O 90/10 entre 300K y 325K a intervalos de 5K y (abajo) los coeficientes de temperatura (ppb/K) de los protones amídicos del Compuesto B.

La Figura 10 muestra la estructura tridimensional del Compuesto B en disolución de H ₂ CVD ₂ O 90/10 a 300K determinada mediante Dinámica Molecular con distancias interprotónicas restringidas a partir de los datos de RMN (ROESY).

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

La Figura 11 muestran las curvas de inhibición de adhesión sobre vitronectina de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC) sobreexpresadas en integrina αvβ ₃ mediante la adición de los Compuestos A y B. Las curvas corresponden al promedio de tres determinaciones y las barras de error indican la desviación standard de las medidas para cada valor.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En la presente descripción, los términos siguientes tienen el significado indicado:

"Alquilo" se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada, lineal o ramificada, que consiste en átomos de carbono e hidrógeno, sin contener insaturación, que tiene de uno a doce átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo, etc.

Los radicales alquilo pueden estar sustituidos opcionalmente por uno o más sustituyentes tales como arilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, animo, nitro, mercapto, alquiltio, etc. Si se sustituye por arilo se obtiene un radical "Aralquilo", tal como bencilo y fenetilo.

"Arilo" se refiere a radicales de anillo único y múltiples anillos, que incluyen radicales de múltiples anillos que contienen grupos arilo separados y/o condensados. Los grupos arilo típicos contienen desde 1 hasta 3 anillos separados o condensados y desde 6 hasta aproximadamente 18 átomos de carbono de anillo, tales como un radical fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antracilo. El radical arilo puede estar opcionalmente sustituido por uno o más sustituyentes, tal como hidroxilo, mercapto, halógeno, alquilo, fenilo, alcoxilo, haloalquilo, nitro, ciano, dialquilamino, aminoalquilo, acilo, alcoxicarbonilo, etc. "Alquenilo" se refiere a un radical alquilo que tienen al menos 2 átomos de C y que tiene uno o más enlaces insaturados.

"Cicloalquilo" se refiere a un radical estable monocíclico o bicíclico de 3 a 10 miembros, que está saturado o parcialmente saturado, y que sólo consiste en átomos de carbono e hidrógeno, tal como ciclohexilo o adamantilo. A menos que se establezca específicamente lo contrario en la memoria descriptiva, el término "cicloalquilo" se refiere a que incluye radicales cicloalquilo que están opcionalmente sustituidos por uno o más

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

sustituyentes tales como alquilo, halógeno, hidroxilo, amino, ciano, nitro, alcoxilo, carboxilo, alcoxicarbonilo, etc.

"Heterociclilo" se refiere a un radical estable de anillo de 3 a 15 miembros que consiste en átomos de carbono y desde uno hasta cinco heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, preferentemente un anillo de 4 a 8 miembros con uno o más heteroátomos y, con mayor preferencia, un anillo de 5 ó 6 miembros con uno o más heteroátomos. Puede ser aromático o no. Para el objeto de esta invención, el heterociclo puede ser un sistema de anillo monocíclico, bicíclico o tricíclico, que puede incluir sistemas de anillos condensados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el radical heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede ser opcionalmente cuaternario; y el radical heterociclilo puede estar parcial o completamente saturado o ser aromático. Ejemplos de tales heterociclos incluyen, pero no se limitan a, azepinas, bencimidazol, benzotiazol, furano, isotiazol, imidazol, indol, piperidina, piperazina, purina, quinolina, tiadiazol, tetrahidrofurano, cumarina, morfolina; pirrol, pirazol, oxazol, isoxazol, triazol, imidazol, etc.

"Alcoxilo" se refiere a un grupo de fórmula -ORa en el que Ra es un radical alquilo según se definió anteriormente, por ejemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, etc.

"Amino" se refiere a un grupo de fórmula -NH ₂ , -NHRa o -NRaRb, opcionalmente cuaternizado, en el que Ra y Rb son radicales alquilo según se definió anteriormente y seleccionados independientemente, por ejemplo metilamino, etilmetilamino, metilpropilamino, etc.

"Halógeno" o "halo" se refiere a bromo, cloro, yodo o flúor.

Las referencias a grupos sustituidos en los compuestos de la presente invención se refieren al resto especificado que puede estar sustituido en una o más posiciones disponibles por uno o más grupos adecuados, por ejemplo, halógeno tal como flúor, cloro, bromo y yodo; ciano; hidroxilo; nitro; azido; alcanoílo tal como un grupo alcanoüo C 1-6 tal como acilo y similares; carboxamido; grupos alquilo incluyendo aquellos grupos que tienen de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono y, más preferiblemente, 1-3 átomos de carbono; grupos alquenilo y alquinilo incluyendo grupos que tienen- uno o más enlaces insaturados y desde-2-hasta- aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 2 hasta aproximadamente 6 átomos de

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carbono; grupos alcoxilo que tienen desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; ariloxilo tal como fenoxilo; grupos alquiltio que incluyen aquellos restos que tienen uno o más enlaces tioéter y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfinilo incluyendo aquellos restos que tienen uno o más enlaces sulfinilo y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; grupos alquilsulfonilo incluyendo aquellos restos que tienen uno o más enlaces sulfonilo y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; grupos aminoalquilo tales como grupos que tienen uno o más átomos de N y desde 1 hasta aproximadamente 12 átomos de carbono o desde 1 hasta aproximadamente 6 átomos de carbono; arilo carbocíclico que tiene 6 o más átomos de carbono, particularmente fenilo o nañilo y aralquilo tal como bencilo. A menos que se indique lo contrario, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo y cada sustitución es independiente de la otra.

Es conocido que la introducción de α-amino-β-lactamas α-alquiladas según la fórmula (II) en péptidos abiertos del tipo A]-(beta-Lactam)-A ₂ , donde Ai y A ₂ representan dos aminoácidos, provoca la estabilización de un giro β- de tipo II ó II' entre el NH dador del resto A ₂ y C=O aceptor del resto Ai, tal y como se describe en Angew. Chem. Int. Ed. 38, 3056-3058 (1999), J Org. Chem. 66, 6333-6338 (2001), ó J. Am. Chem. Soc. 125, 16243-16260 (2003).

Sorprendentemente, hemos encontrado que la introducción de α-amino-β-lactamas en pseudopéptidos RGD forma un giro γ- cuya posición es dependiente de la configuración (R) ó (S) del estereocentro Ca del anillo de azetidin-2-ona contenido dentro del fragmento (beta-Lactam), pero independiente de los sustituyentes R ² , R ³ , R ⁴ y R ⁵ . Así, se ha establecido que cuando la configuración en el estereocentro Ca del anillo de β-lactama es (S) y R ⁶ es H se induce un giro γ- inverso entre el N-H dador del fragmento (beta-Lactam) definido según la fórmula (II) y el C=O (GIy), que actúa como aceptor, y que cuando la configuración de dicho estereocentro es (R) y R ⁶ es H se induce un giro γ- con puente de hidrógeno entre el N-H(Asp) y el C=O(Arg). Cuando R ⁶ es diferente de H se forma un giro gamma con puente de hidrógeno entre NH(Asp) y C=O(Arg), tanto cuando la

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

configuración es (S) como cuando es (R). En todo caso el giro γ siempre está presente en los compuestos de la invención y no hay tendencia a formar giros β. Y lo que es más importante, se ha comprobado que los compuestos de la invención tal como están definidos más arriba inhiben de forma selectiva y eficaz las integrinas del tipo αγβ ₃ , ttπβ ₃ , ocyβs y α ₅ βi, independientemente del tipo de giro γ presente.

En una variante de la invención el sustituyente R ¹ no es H. En ese caso se ha visto que las α-amino-β-lactamas α-alquiladas según la fórmula (II) en pseudociclopentapéptidos RGD de fórmula (I) no forma un giro β dentro del ciclo, como cabría esperar. En este caso el sustituyente R ¹ es preferentemente un grupo alquilo, lineal, ramificado ó cíclico, conteniendo de 1 a 16 átomos de carbono, preferentemente de 1 a 6 átomos de carbono, o bien un grupo alquilidenaromático definido por la fórmula — (CH ₂ ) _n Ar donde n es 1, 2, 3 ó 4 y Ar es un grupo aromático o heteroaromático. El grupo aromático o heteroaromático es preferiblemente fenilo, 1- ó 2-naftilo, 1-, 2- ó 9-antranilo, 2-, 3- ó 4-difenilo, 2-, 3-, ó 4-piridilo, 2- ó 3-furilo, 2-ó 3-tienilo, 1-, 2- ó 3-ρirrolilo, 1-, 2-, 3-, 4- ó 5-imidazolilo, 1-, 3-, 4- ó 5-pirazolilo, 2-, 4- ó 5- oxazolilo, 3-, 4- ó 5- isoxazolilo, 2-, 4- ó 5-tiazolilo, 3-, 4- ó 5- isotiazolilo. Estos grupos pueden estar sustituidos (mono-, di- tri-, tetra- o penta- sustituido) por ejemplo y de manera independiente, por grupos metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, tere-butilo, CF ₃ , F, OMe, NMe ₂ , NH ₂ . En una variante preferida R ¹ es -CH ₂ Ph. En otra variante R ¹ es un grupo alquilpolifluorado definido por la fórmula -

(CH ₂ ) _m Rf donde m es 0,1, 2, 3 ó 4 y Rf es CF ₃ , C ₂ F ₅ , n-C ₃ F ₇ , n-C ₄ F ₉ , n-C ₅ F _π , n-C ₆ F ₁₃ ó C ₆ F ₅ ; o bien un grupo alquilo funcionalizado definido por la fórmula -(CH ₂ ) _P X donde p es 1, 2, 3 ó 4 y X es OH, NH ₂ , SH ó CO ₂ H.

En otra variante de la invención R ² es H o bien un grupo alquilo, lineal o ramificado conteniendo de 1 a 15 átomos de carbono; preferentemente H, CH ₃ , C ₂ H ₅ o bien un grupo alquilo C1-C4 funcionalizado. En otra variante R es un grupo alquilidenaromático definido por la fórmula -(CH ₂ ) _n Ar donde n es 1, 2, 3 ó 4 y Ar es un grupo aromático o heteroaromático.

En otra variante de la invención R ³ se selecciona entre H, metilo, etilo, alilo, bencilo o fenilo.

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En otra variante de la invención R ⁴ se selecciona preferentemente entre H, metilo, etilo, iso-propilo, iso-butilo, bencilo, alilo, 4-hidroxibencilo, hidroximetilo, 1-hidroxietilo, carboximetilo, carboxietilo, aminocarbonilmetilo, aminocarboniletilo, 4-aminobutilo, 3- guanidilpropilo, tiometilo, 2-(metiltio)etilo, 3-indolilmetilo. Alternativamente puede ser un grupo alquilo, lineal o ramificado conteniendo de 5 a 15 átomos ó un grupo alquilo C1-C4 funcionalizado.

En otra variante de la invención R ⁵ se selecciona preferentemente entre H, grupo metilo, etilo, alilo, bencilo o fenilo.

En algunos compuesto se prefiere que R ⁴ y R ⁵ formen juntos un grupo -(CH ₂ ) _n - formando un ciclo donde n es 2, 3 ó 4.

En otra variante preferida R ⁶ es H.

Alternativamente, R ¹ y R ⁶ forman un grupo -(CH ₂ ) _n — formando un ciclo donde n' es 3, 4 ó 5.

Algunos compuestos típicos de la invención viene recogidos en los ejemplos, véase ejemplos 7 y 8 (compuestos A y B).

La invención incluye los ciclopéptidos definidos según la fórmula (I), conteniendo todas las formas enantiómeras ó diastereómeras de fragmentos -(beta-Lactam)- definidos según la fórmula (II).

En la fórmula (I) Arg representa el aminoácido Arginina o un derivado del mismo, GIy representa el aminoácido Glicina o un derivado del mismo y Asp representa el ácido aspártico o un derivado del mismo. La configuración de los aminoácidos de la secuencia RGD es (L). Estos aminoácidos pueden presentar grupos protectores.

Entre los compuestos de la invención también se incluyen pseudopéptidos de formula (I) donde los grupos aminoácido están derivatizados parcial o totalmente. Por derivatizado se incluyen también los profármacos, es decir, engloba también aquellos derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención. Tales derivados serán evidentes para el experto en la técnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molécula y sin limitación, los siguientes derivados de los compuestos: esteres, esteres de aminoácido, esteres de fosfato, ésteres.de.sulfqnato de sales metálicas, carbamatos y amidas.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Los derivados o profármacos particularmente favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando tales compuestos se administran a un paciente (por ejemplo, permitiendo que se administre un compuesto por vía oral para que se absorba más fácilmente en la sangre) o que potencian la administración del compuesto original a un compartimento biológico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfático) en relación con la especie original.

También están incluidos entre los compuestos de la invención aquellos donde uno o más grupos amino se encuentra protegidos con un grupo protector, siendo éstos grupos que son apropiados para proteger (bloquear) un grupo amino ante reacciones químicas, pero son fácilmente eliminables después que la reacción química se haya efectuado en otro punto de la molécula. Se utilizan preferentemente BOC, ALLOC, FMOC, CBZ, metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, bencilo, PBF, acetilo ó benzoílo.

Las abreviaturas de los grupos protectores mostrados anteriormente se definen como: ALLOC -terc-Aliloxicarbonilo.

Bn -Benciio

BOC -terc-Butoxicarbonilo.

CBZ -Benciloxicarbonilo.

FMOC -9-Fluorenilmetoxycarbonilo. PBF -2,2,4,6,7-Pentametildihidrobenzofurano-5-sulfonilo.

Además es posible emplear grupos funcionales en la cadena lateral de determinados restos aminoácidos o restos aminoácidos derivatizados, para la inmovilización de los ciclopéptidos de la invención sobre diferentes materiales, tales como polímeros o proteínas, fases estacionarias de cromatografía o compuestos fluorescentes. También se pueden inmovilizar introduciendo grupos funcionales sobre los sustituyentes R ¹ , R ² ó R ⁴ . Ello permite el empleo de los compuestos de la invención en sistemas de análisis o diagnóstico por su capacidad de enlace a las integrinas. También se pueden aplicar en sistemas de separación o de detección de integrinas.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

A menos que se indique lo contrario, los compuestos de la invención también incluyen compuestos que difieren sólo en la presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos, por ejemplo como marcadores con fines de diagnóstico. Por ejemplo, los compuestos tal como se definen más arriba, a excepción de la sustitución de un hidrógeno por un deuterio o por tritio, o la sustitución de un carbono por un carbono enriquecido en ¹³ C o ¹⁴ C o un nitrógeno enriquecido en ^!5 N, están dentro del alcance de esta invención.

Los compuestos de fórmula (I) definidos anteriormente pueden obtenerse mediante procedimientos sintéticos disponibles. Así en un aspecto de la invención también se dirige a un procedimiento para la obtención de los compuestos de fórmula (I),o de sus derivados por ejemplo protegidos en los restos de Arg y Asp con grupos protectores, mediante ciclación de los siguientes segmentos peptídicos protegidos en los restos de Arg y Asp:

H-Arg-Gly-Asp-(beta-Lactam)-OH

H-Gly-Asρ-(beta-Lactam)-Arg-OH H-Asp-(beta-Lactam)-Arg-Gly-OH

H-(beta-Lactam)-Arg-Gly-Asρ-OH

Dichas ciclaciones pueden llevarse a cabo empleando reactivos conocidos de síntesis peptídica recogidos, por ejemplo, en Houben Weyl Methods ofOrganic Chemistry, VoI. E 22 b, pp.461-542 (2003), y los grupos protectores pueden ser eliminados en un estadio posterior de la síntesis mediante métodos conocidos en el estado de la técnica.

El fragmento (beta _^ Lactam) definido según Ia fórmula (II) es de preparación conocida (ver por ejemplo Angew. Chem. Int. Ed. 38, 3056-3058 (1999), J. Org. Chem. 66, 6333-6338 (2001), ó J. Am. Chem. Soc. 125, 16243-16260 (2003).) y se incorpora en los segmentos anteriores empleando los compuestos de fórmula:

X-(beta-Lactam)-Y

siendo los grupos X y Y para cada caso y de manera independiente:

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

X: H, C ₆ H ₅ -SO ₂ -, 4-NO ₂ C ₆ H ₄ -SO ₂ -, 2-NO ₂ C ₆ H ₄ -SO ₂ -, 2,4-(NO ₂ ) ₂ C ₆ H ₃ -

SO ₂ -, PBF-, ALLOC-, CBZ-, Bn-, BOC-, FMOC-, CHO-, Me ₃ Si-, ¹ BuMe ₂ Si-

Y: OH, OLi, ONa, OK, OMe, O ¹ Bu, OBn, OC ₆ F ₅ , SC ₆ H ₅ , F ₅ Cl

Los productos de reacción obtenidos pueden purificarse, si se desea, mediante métodos convencionales, tales como cristalización, cromatografía y trituración. Cuando los procedimientos descritos anteriormente para la preparación de los compuestos de la invención dan lugar a mezclas de esteroisómeros estas mezclas pueden utilizarse como tales, o bien estos isómeros pueden separarse mediante técnicas convencionales tales como cromatografía preparativa. Si hay centros quirales, los compuestos pueden prepararse en forma racémica, o los enantiómeros individuales pueden prepararse mediante síntesis enantioespecífíca o por resolución. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención se sintetizan a partir del compuesto original que contiene un resto básico o ácido mediante métodos químicos convencionales. En general, tales sales se preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de base o ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base o el ácido apropiados en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. En general, se prefieren medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de las sales de adición de ácidos incluyen sales de adición de ácido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato;, fosfato, y sales de adición de ácido orgánico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. Ejemplos de sales de adición de bases incluyen sales inorgánicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales básicas orgánicas tales como, por ejemplo, etilendiamina, etanolamina, N ₅ N-dialquilenetanolamma _s trietanolamina, glucamina y sales de aminoácidos básicos. Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina como compuestos libres o como solvatos y se pretende que ambas formas estén dentro del alcance de Ia presente invención. Los métodos de solvatación se conocen generalmente dentro de la

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

técnica. Los solvatos adecuados son los solvatos farmacéuticamente aceptables. En una realización particular, el solvato es un hidrato.

Una forma farmacéuticamente aceptable preferida es la forma cristalina, incluyéndose tal forma en la composición farmacéutica. En el caso de las sales y los solvatos, los restos de disolventes y compuestos iónicos adicionales también deben ser no tóxicos. Los compuestos de la invención pueden presentar diferentes formas polimórfícas; se pretende que la invención englobe todas esas formas.

La presente invención proporciona adicionalmente composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de esta invención, o una sal, derivado, profármaco o esteroisómero farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un portador, adyuvante, o vehículo farmacéuticamente aceptable, para la administración a un paciente.

Ejemplos de composiciones farmacéuticas incluyen cualquier composición sólida (comprimidos, pildoras, cápsulas, granulos, etc.) o líquida (soluciones, suspensiones o emulsiones) para la administración oral, tópica o parenteral. Otro aspecto de esta invención se refiere a un método para tratar o prevenir enfermedades mediada por la sobreexpresión de integrinas del tipo (Xvβ ₃ , ttu$ ₃ , Cfyβs y Oi ₅ P ₁ en humanos y animales. Las propiedades antiangiogénicas y de inhibición de integrinas mencionadas en la introducción son de utilidad en el tratamiento del cáncer, especialmente en caso de metástasis de tumores sólidos cancerosos. También para el tratamiento de la trombosis, restenosis posterior a la angioplastía coronaria transluminal percutánea (PTCA) ₅ artritis reumatoide o la osteoporosis.

Los siguientes ejemplos son dados a simple titulo de ilustración y no se pueden utilizar para limitar la extensión de la invención.

EJEMPLOS

En los ejemplos 1-8 se indica la metodología para la preparación de nuevos compuestos de acuerdo con la invención. Se describe también la preparación de sales fisiológicamente compatibles. En los ejemplos 9 y 10 se estudia la conformación en disolución acuosa dé los

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

compuestos preparados en los ejemplos 7 y 8. El ejemplo 11 muestra la actividad biológica de estos compuestos.

Las abreviaturas de los reactivos ó técnicas utilizados se definen como: DAPI 4,6-Diamidino-2-fenilindol

DIPA Diisopropilamina

DIPEA Diisopropiletilamina

DMEM Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco

DMF N,N-Dimetilformamida EDCl Clorhidrato de l-[3-(dimetiIamino)propil]-3-etilcarbodiimida

HATU Hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-l-il)N,N,N',N'-tetrametiluronio

HOAT 1 -Hidroxi-7-azabenzotriazol

HOBT Hidrato de 1-hidroxibenzotriazol

LDA Diisopropilamiduro de litio LHMDS Bis(trimetilsilil)amiduro de litio

MS (ESI) Espectrometría de masas con ionización de electrospray

THF Tetrahidrofurano

TMEDA N,N,N',N'-Tetrametiletiléndiamina

EJEMPLO 1:

Preparación de 2-Nθ ₂ C ₆ H ₄ -Sθ ₂ -(beta-Lactam)-OH.

(beta-Lactam): R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H; configuración (35), según fórmula (II).

Una suspensión de éster metílico de (S)-α-bencilserina (4.0 g, 19 mmol), cloruro de 2-nitrobenGenosulfoBÜα (8.5 g, 38 mmol)χKHC0 ₃ _(9.5 g, 95 mmol) en acetonitrilo (150 mL) se calentó a reflujo durante 16 h. Seguidamente, se enfrió a 20 ⁰ C y so ^~ bre la mezcla

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

compuesta por (S)-2-bencil-2-metoxicarbonil-l-(2-nitrobencenosulfonil)azir iclma y

KHCO ₃ sobrante, se adicionó alilamina (2.13 mL, 28.5 mmol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La suspensión resultante se añadió sobre una disolución acuosa de NaHCO ₃ (100 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL) para dar una fase orgánica que se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó, La purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: Hexano/EtOAc 3/1) proporcionó (S)- 3-alilamino-2-benciI-2-(2-nitrobencenosulfonilamino) propanoato de metilo (6.09 g 74%). Sobre una disolución de dicho compuesto en THF anhidro (30 mL) enfriada a 0 ⁰ C se añadió LHMDS (IM en THF) (35 mL, 35 mmol) goteando durante 5 min y la mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante 6 h. Seguidamente, se añadió una disolución acuosa de NaHCθ ₃ (sat.) (50 mL) y se extrajo con CH ₂ CI ₂ (3 x 5 mL). La fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó para dar (S)-3-bencil-3G(2- nitrobencenosulfonilarnino)-l-alilazetidin-2-ona pura (5.13 g, 94%) que se disolvió en acetonitrilo (30 mL). A la mezcla agitada y enfriada a 0 ⁰ C se le añadió peryodato sódico (10.65 g, 50 mmol) y una cantidad catalítica de tricloruro de rutenio hidratado (50 mg). Tras agitar durante 3 h a la misma temperatura, se añadió una disolución acuosa de HCl (0.1 M) (50 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 30 mL). Tras secar la fase orgánica (MgSO ₄ anhidro) y evaporar se obtuvo el producto de interés puro. Rendimiento global: 4.05 g (51%). [Ot] ²⁰ _D = -2.5 (c = 0.075, MeOH); ¹ H RMN(SOOMHz, CD ₃ OD, 6): 7.77-8.12 (m, 4H, arom.), 7.31-7.21 (m, 5H, arom), 3.67 (d, IH, NCH ₂ , β-Lactam, J= 6.0 Hz), 3.59 (s, 2H ₅ PhCH ₂ CO ₂ H), 3.56 (d, IH, NCH ₂ , β-Lactam, J- 6.1 Hz). 3.28 (dd, 2H, CH ₂ Ph).

EJEMPLO 2:

Preparación de 2-NO ₂ C ₆ H ₄ -SO ₂ -(^a-IaCZeWi)-OH. (beta-Lactam): R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H; configuración (3R), según fórmula (II).

Una suspensión de éster metílico de (Z?)-α-bencilserina (2.1 g, 10 mmol), cloruro de 2-nitrobencenosulfonilo (2.2 g, 38 mmol) y KHCO ₃ (5.0 g, 50 mmol) en acetonitrilo (80 mL) se calentó a reflujo _duι;ante 16 h. Seguidamente, se enfrió a 20 ⁰ C y sobre la mezcla compuesta por (i?)-2-bencil-2-metoxicarbonií-l-(2-nitrobencenosulfonil)aj ziridina y KHCO ₃ sobrante, se adicionó 2-(0-terc-butildimetilsililoxi)-etüamina (1.75 g, 10 mmol) y

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La suspensión resultante se añadió sobre una disolución acuosa de NaHCO ₃ (50 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 25 mL) para dar una fase orgánica que se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó. La purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: Hexano/EtOAc 4/1) proporcionó (R)- 3 -(2-/er _í ?-butildimetilsililoxietil)-2-bencil-2-(2-mtrobencenos ulfonilamino)propanoato de metilo (3.75 g 68%). Sobre una disolución de dicho compuesto en THF anhidro (30 mL) enfriada a 0 ⁰ C se añadió LHMDS (1 M en THF) (25 mL, 25 mmol) goteando durante 5 min y la mezcla se dejó agitar a temperatura ambiente durante 6 h. Seguidamente, se añadió una disolución acuosa de NaHCO ₃ (sat.) (20 mL) y se extrajo con CH ₂ Cl ₂ (3 x 15 mL). La fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó para dar (5)-3-bencil-3-(2- nitrobencenosulfonilamino)- 1 -(2-/e/r-butildimetilsililoxi-etil)-azetidin-2-ona pura (3.43 g, 97%) que se disolvió en acetona (50 mL). Sobre esta disolución se goteó a 0 ⁰ C una mezcla conteniendo trióxido de cromo (3.3 g, 33 mmol), ácido sulfúrico (2.86 mL) y ácido fluorhídrico (48%) (0.8 mL, 8 mmol) disuelta en agua (9 mL) y, tras agitar la disolución resultante a temperatura ambiente durante 1 h, se le añadió primero isopropanol (5 mL) y después agua (100 mL). El extracto de la fase acuosa con EtOAc (3 x 20 mL) se secó (NaISO ₄ ) y se evaporó. El producto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: Hexano/EtOAc 1/5). Rendimiento global: 2.43 g (58%). [α] ²⁰ _D = +2.8 (c = 0.10, MeOH).

EJEMPLO 3:

Preparación de 2~NO ₂ C ₆ lÍ ₄ ,'Sθ2-(beta-Lactam)~OH.

(beta-Lactam): R ¹ - CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁵ =R ⁶ = H; R ⁴ = Ph; configuración (3S), (VR), según fórmula (II).

Se siguió el procedimiento del ejemplo 2, partiendo de (5)-α-bencilserina (2.1 g, 10 mmol), y (i?)-2-(O-terc-butildimetilsililoxi)-2-fenil-etilamina (2.51 g, 10 mmol). Rendimiento global: 2.18 g (44%). p.fus = 195-7 ⁰ C; [α] ²⁰ _D = -42.8 (c = 0.75, CH ₂ Cl ₂ ); ¹ H RMN(SOOMHz, _Cq(Cp ₃ ) ₂₅ δ): 7.21-7.89 (m, 14H, arom.), 5.45 (s, IH, PhCHCO ₂ H), 3.79 (d, IH, NCH ₂ , β-Lactam, J- 6.0 Hz), 3.42 (d, IH, NCH ₂ . β-Lactam, J= 5.6 Hz), 3.32 (s ancho, 2H, CH ₂ Ph).

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

EJEMPLO 4:

Preparación de 2-NO ₂ C ₆ H ₄ -SO ₂ -(ltete-Iαctam)-OH.

(heta-Lactam): R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁵ =R ⁶ = H; R ⁴ = Ph; configuración (35), (l'S), según fórmula (II).

Se siguió el procedimiento del ejemplo 2, partiendo de (S)-α-bencilserina (2.1 g, 10 mmol), y (S)-2-(0-terc-butildimetilsililoxi)-2-fenil-etüamma (2.51 g, 10 mmol). Rendimiento global: 2.58 g (52%). [αf° _D = + 2.4 (c - 0.05, MeOH); ¹ H RMN(500MHz, CD ₃ OD, δ): 7.77-8.30 (m, 4H, arom.), 6.74-7.2 (m, 5H, arom), 5.07 (s, IH, PhCHCO ₂ H), 3.70 (d, IH, NCH ₂ β-Lactam, J= 6.3 Hz), 3.13 (dd, 2H, CH ₂ Ph), 3.11 (d, IH, NCH ₂ β- Lactam, J= 6.6 Hz),

EJEMPLO 5: Preparación de H-ψeta-Lactam)-OMe.

(beta-Lactam): R ¹ = CH ₂ (2-Naftilo); R ² = CH ₂ CH(CH ₃ ) ₂ ; R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H; configuración QR, 4R), según fórmula (II).

a) (3R,4R)-l-[bis(trimetilsilil)metil]-3-[(4S,5R)-4,5-difenil-2 -oxo-oxazolidin-3-il]-4- isobutü-3[-(2-naftil)metil]azetidm-2-ona: Sobre una disolución de DIPA seca (0.92 mL, 6.5 mmol) en THF (30 mL) enfriada a -78 ⁰ C con un baño de CO ₂ /acetona, se añadió una disolución de n-BuLi (2.5 M en hexano) (2.6 mL, 6.5 mmol) y la mezcla resultante se agitó durante 30 min a la misma temperatura. Sobre la LDA resultante se añadió una disolución de (3S,4R)-l-[bis(trimetilsilil)metil]-3-[(4S,5R)-4,5-difenil-2 -oxo-oxazolidin-3-il]-4- isobutil-azetidin-2-ona (2.61 g, 5 mmol) [obtenida según se describe en Chem. Eur. J., 3, 1432-1441 (1997)], disuelta en THF (40 mL) y la mezcla se agitó a -78 ⁰ C durante 10 min. Seguidamente, se añadió bromuro de 2-metilnaftilo (3.28 g. 15 mmol) disuelto en 30 mL de THF anhidro y la disolución resultante.se agitó durante 16_h_dejando que la mezcla alcanzase lentamente la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó en CH ₂ Cl ₂

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

(200 mL) y se lavó sucesivamente con disoluciones acuosas de NH ₄ Cl (sat.) (50 mL), HCl

(1 M) (50 mL) y NaHCO ₃ (sat.) (50 mL). La fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro), se evaporó, y el producto crudo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente; EtOAc/Hexano 1/6). Rendimiento: 2.58 g (78%). p.fus: 187-188 (EtOH); [Ct] ²⁰ _D = - 0.012 (c = 0.5, EtOH); IR(Cm ¹ , KBr): 1760.7, 1741.7 (C=O), 845.3 (C- Si). ¹ H RMN(500MHz, CDCl ₃ , δ): 8.00 (s, IH, H-I Naphth), 7.83 (d, IH, J= 7.5 Hz, H-8 Naphth), 7.78 (d, IH, J= 8.3 Hz, H-5, Naphth) 7.71 (d, IH, J- 8.4 Hz , H-3 Naphth), 7.62 (d, IH, J= 7.8 Hz, H-4 Naphth), 7.45 (m, 2H, H-6, H-7 Naphth), 7.01-6.99 (m, 1OH, Ph), 5.60 (d, IH, J= 7.2 Hz, OCHPh), 5.02 (d, IH, J= 7.2 Hz, NCHPh), 3.95 (t, IH, NCHiBu), 3,29 (d, IH, J- 15.8 Hz, CH ₂ Naphth), 3.09 (d, IH ₅ J= 15.8 Hz, CH ₂ Naphth), 2.02 (s, IH, CHSiMe ₃ ), 1.63 (m, IH, CH ₂ CHMe ₂ ), 1.26 (m, 2H, CH ₂ CHMe ₂ ), 0.86 (m, 6H, CH ₂ CHMe ₂ ), 0.28 (s, 9H, SiMe ₃ ), 0.04 (s, 9H, SiMe ₃ )

b) (3R,4R)-3-[(4S,5R)-4,5-difenil-2-oxo-oxazolidin-3-il]-4-isob utíI-l-[(metoxicarbonil) metil]-3[-(2-naftil)metil]azetidin-2-ona: Se disolvió (3R,4R)-l-[bis(trimetilsilil)metil]-3- [(4S,5R)-4,5-difenil-2-oxo-oxazolidin-3-il]-4-isobutil-3[-(2 -nañíl)metil]azetidin-2-ona (2.58g, 3.9 mmol) en acetonitrüo (10 mL), se enfrió a 0 ⁰ C y se le añadió una disolución de Ce(NH ₄ ) ₂ (NO ₃ ) ₄ (11.5 g, 21 mmol) en H ₂ O (20 mL). La mezcla se agitó a 0 ⁰ C durante 10 min y a temperatura ambiente durante 2 h. Seguidamente se añadieron 100 mL de agua y la mezcla se extrajo con EtOAc (3 x 30 mL) y el extracto se lavó sucesivamente con NaHCO ₃ (sat.) (50 mL), se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó para dar un crudo consistente en (3R,4R)-[(4S,5R)-4,5-difenil-2-oxo-oxazolidin-3-il]-l-formil -3-4-ísobutil-3t-(2- naftil)metil]azetidin-2-ona (100%) que íue disuelta en MeOH (50 mL). A dicha disolución se añadió Na ₂ CO ₃ (0.70 g, 0.6 mmol) y una disolución acuosa de NaHCθ ₃ (sat) (20 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 90 min, los sólidos en suspensión se filtraron y el filtrado se lavó con MeOH (20 mL). Las disoluciones metanólicas combinadas se vertieron sobre H ₂ O (400 mL)/ CH ₂ Cl ₂ (10 mL) y la mezcla se extrajo con CH ₂ Cl ₂ (3 x 50 mL). La fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro),, se evaporó y el crudo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: EtOAc/Hexano 1/3). Rendimiento: 1.41 g (63%). Sobre una suspensión de NaH

(0.11 g, 3.8 mmol) en THF anhidra (25 mL) enfriada a 0 ⁰ C se añadió sucesivamente y con agitación una disolución de (3R,4R)-3-[(4S,5R)-4,5-difenil-2-oxo-oxazoridm-3-il]-4~

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

isobutil-3[-(2-nañil)metil]azetidin-2-ona (1.34 g, 3 mmol), bromoacetato de metilo (0.39 mL, 4.2 mmol) y el éter 15-corona-5 (0.13 g, 0.3 mmol). Seguidamente se agitó la mezcla reacción a temperatura ambiente durante 2 h, tras lo cual se le añadió una disolución acuosa de HCl (2 M) hasta pH fuertemente ácido y la mezcla se extrajo con CH ₂ Cl ₂ (2 x 30 mL). La fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó para dar un crudo que fue purificado por cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: EtOAc/Hexano 1/1). Rendimiento global: 1.12 g (72%).

c) (3R,4R)-3-Amino-4-isobutiH-[(metoxicarbonil)metil]-3[-(2-naf til)metil]azetidin-2- ona: Una suspensión de (3R,4R)-3-[(4S,5R)-4,5-difenil-2-oxo-oxazolidin-3-il]-4-isob util- l-[(metoxicarbonil) metil]-3[-(2-naftiI)metil]azetidin-2-ona (1.04 g, 2 mmol) y Pd(OH) ₂ al

10% sobre carbono (0.16 g) en metanol (20 mL) se agitó bajo atmósfera de hidrógeno (1 atm.) durante 48 h. Pasado ese tiempo, se filtró la mezcla sobre celita y se evaporó el disolvente a presión reducida para dar una mezcla de 1,2-difeniletano y el producto, que fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:

Hexano/EtOAc 10/1; luego MeOH/CH ₂ Cl ₂ 1/5). Rendimiento: 0.58 g (95%).

EJEMPLO 6:

Preparación de Boc-(beta-Lactam)-OH. (beta-Lactam): R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁵ =R ⁶ = H; R ⁴ = Me; configuración (3R, 4R), según fórmula (II).

a) (3i?,4ü!)-3-Bencil-l-[bis(trimetiIsilíI)metiI]-3-te/*c-but oxícarbonilamino-4-metil- axetidin-2-ona: Se siguió el procedimiento del ejemplo 5-a), partiendo de (3S,4R)-1- [bis(trimetilsilil)metil]-3-[(4S,5R)-4,5-difenil-2~oxo-oxazo lidin-3-il]-4-metil-azetidin-2- ona (2.61 g, 5 mmol) y bromuro de bencilo (5.55 mL, 15 mmol). Se obtuvo así la (3 R, 4R)- 3-bencil-l-[bis(trimetilsilil)metil]-3-[(4S,5R)-4,5-difenil- 2-oxo-oxazolidin-3-il]-4-metil- azetidin-2-ona. Rendimiento: 1.91 g (67 %). Dicho compuesto se disolvió en etanol anhidro (80 πϊL), seie añadió-dicarbonato-de ditere-butilo (6.06. g, 26.4_mmol)_y_Pd(OH) _2: _ C (0.24 g, catal.) y la suspensión resultante se agitó en atmósfera de hidrógeno (160 psi) a

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

60 ⁰ C durante 24 h. Tras filtrar sobre celita y evaporar la disolución el producto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: Hexano/EtOAc 30/1). Rendimiento global: 1.34 g (60%). p.füs: 66-69 ⁰ C; [α] ²⁰ _D = -10.5 (c = 1, CH ₂ Cl ₂ ). ¹ H RMN(500MHz, CDCl ₃ , δ): 7.29-7.18 (m, 5H, Ar), 4.98 (s, IH, NH), 3.83-3.79 (m, IH, CH ₃ CHN) 3.30 (d, IH, J= 13.8 Hz, PhCHHC), 2.89 (d, IH, J= 13.7 Hz, PhCHHC), 2.11 (s, IH, CH(SiMe ₃ ) ₂ ), 1.52 (s, 9H, (CH ₃ ) ₃ C), 1.39 (s, 3H, CH ₃ ), 0.20 (s, 9H, SiMe ₃ ), 0.13 (s, 9H, SiMe ₃ ).

b) (3/f,4R)-3-Bencil-3-terc-butoxicarbonilam¡no-l-(carboximeti l)-4-metil-azetidin-2- ona: Sobre una disolución de (3i?,4i?)-3-bencil-l-[bis(trimetilsilil)metil]-3-féπ> butoxicarbonil amino-4-metil-azetidin-2-ona (1.34 g, 3 mmol) disuelta en acetonitrilo seco (20 mL) y calentada a 7O ⁰ C se añadió CsF (1.32 g, 9 mmol). La mezcla de reacción se agitó a dicha temperatura durante 2 horas, se evaporó el disolvente y el residuo se disolvió en CH ₂ Cl ₂ (30 mL). Tras lavar con agua (20 mL) la fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó. La purificación mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: Hexano/EtOAc 2:1) proporcionó (3i?,4i?)-3-bencil-l-(trimetilsililmetil)-3-/ ^f erc- butoxicarbonilamino-4-rnetil-azetidin-2-ona. Rendimiento: 1.03 g (91%). Sobre una disolución de dicha β-lactama (1.03 g, 2.73 mmol) en THF (12 mL) bajo atmósfera de nitrógeno y enfriada a -78 ⁰ C se goteó TMEDA (1.02 mL, 6.8 mmol) y tBuLi (1.5 M en pentano) (4.5 mL, 6.8 mmol). Se agitó a la misma temperatura durante 1 h y seguidamente se borboteó CO ₂ seco durante 2 min. Se añadió NH ₄ Cl (2 mL) y se extrajo con CH ₂ Cl ₂ (3 x 5 mL). La disolución orgánica se trató con NaOH (1 M). La fase acuosa básica se aciduló con HCl 6 M y se extrajo con EtOAc (3 x 10 mL) para aislar el ácido. Rendimiento: 0.47 g (45%). IR KBr cm ^"1 : 3500-2800 (OH, ancho), 1768; 1753; 1714 (C=O); ¹ H RMN(500MHz, CDCl ₃ , δ): 7.38-7.27 (m, 5H, Ar) ₅ 5.03 (s, IH, NHBoc), 4.22 (d, IH, J=15.1Hz, NCHHCO ₂ H), 4.18 (m, IH, (CO)NCH), 3.95 (d, IH, J=15.2Hz, NCHHCO ₂ H), 3.18 (s, 2H ₅ CH ₂ Ph), 1.43 (s, 9H, CO ₂ CMe ₃ ) 1.39 (d, 3H, CH ₃ , J=5.4Hz).

EJEMPLO 7: Preparación de la sal trifluoroacética de ciclo[Árg^Gϊy-Ásp-(beϊa-Lactam)],

(beta-Lactam): R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H; configuración (35), según fórmula (II)

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

a) S-CBZ-AspíO'BuHéeta-XαcíαwO-OH: Sobre una disolución de (S)-3Gamino-3-bencil- l-metoxicarbonilmetilazetidin-2-ona [H-(beta~Lactam)-OMc¡ (1.30 g, 3.02 mmol), y N- metilmorfolina destilada (0.83 mL, 7.55 mmol) en diclorometano seco (20 mL) a 0 °C, se goteó una disolución del fluoruro de ácido CBZ-ASp-(O ¹ Bu)-F (1.62 g, 4.99 mmol) en diclorometano seco (20 mL). La reacción se agitó durante 16 h dejando que alcanzara lentamente la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó consecutivamente con una disolución acuosa de HCl (0.1 M) (2 x 20 mL) y una disolución saturada de NaHCO ₃ (2 x 20 mL). Tras secar la fase orgánica (MgSO ₄ anhidro) y evaporar el disolvente, el crudo resultante se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: EtOAc/Hexano 1/1). Rendimiento (1.08 g, 65%). El producto así obtenido, consistente en 3-CBZ-Asp(O ^t Bu)-(heta-Lactam)-OMe (0.627 g, 1.13 mmol), se disolvió en THF (12 mL), se añadió una disolución LÍOH.H ₂ O (71 mg, 1.7 mmol) en H ₂ O (6 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla se acidificó con ácido cítrico al 5%, se evaporó el THF a presión reducida, y la fase acuosa se extrajo con CH ₂ Cl ₂ (3 x 5 mL). La fase orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro) y el disolvente se evaporó a presión reducida para dar el producto de interés puro. (0.61 g, 100%). MS (ESI), m/z: 554.1. ¹ H RMN(500MHz, DMSO _d6 , δ): 7.37-7.26 (m, 1OH, Ph), 6.96 (s, NH β-Lactam), 5.84 (d, IH, J = 8.3 Hz, CbzNH), 5.12 (d, IH, J = 12.2 Hz, OCH ₂ Ph), 5.08 (d, IH, J = 12.2 Hz, OCH ₂ Ph), 4.49 (m, 1 H, CHCH ₂ C0 ₂ tBu), 4.12 (d, 1 H, J = 17.6 Hz, CHCH ₂ CO ₂ H), 3.78 (d, IH, J = 17.6 Hz, CHCH ₂ CO ₂ H), 3.67 (m, IH, CH ₂ , β-Lactam), 3.62 (d, IH, J = 4.9 Hz, CH ₂ , β-Lactam), 3.26 (d, IH, 14.2 Hz, CH ₂ Ph), 3.20 (d, IH, 12.7 Hz, CH ₂ Ph), 2.86 (dd, IH, J = 17.1, 4.4 Hz, CH ₂ C0 ₂ tBu), 2.58 (m, IH, J = 17.1, 16.6, 6.3, 5.9 Hz ₅ CH ₂ C0 ₂ tBu), 1.41 (s, 9H, tBu).

b) CBZ-Asp(O ^f Bu)-(6e/α-£αcíαm)-Arg(PBF)-Gly-OBn: En un matraz seco, bajo atmósfera de N ₂ , se introdujo una disolución de 3-CBZ-Asp(O ^í Bu)~(5eíα-£αcíαm)-OH (0.291 g, 0.54 mmol) y H-Arg(PBF)-Gly-OBn (0.293g, 0.52 mmol) en CH ₂ Cl ₂ (20 mL). Sobre la disolución se adicionaron consecutivamente trietilamina (0.145 mL, 1.04 mmol), EDCl (0.16 g, 0.835 mmol) y HOBT (0.99 g, 0.73 mmol). La disolución se agitó a temperatura ambiente durante 20TTy selávó ^" sucesivamente con una disolución acuos&-de_. HCl (0.1 M) (2 x 10 mL) y una disolución saturada de NaHCO ₃ (2 x 10 mL). La fase

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

orgánica se secó (MgSO ₄ anhidro) y se evaporó a presión reducida obteniéndose un crudo que fue purificado mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: MeOH/CH ₂ CÍ ₂ 1:25). Rendimiento: 0.569 g (82%). MS (ESI) ₅ m/z: 1095.3; IR KBr, cm ^"1 : 3456, 3343, 1757, 1663, 1550, 1461. ¹ H RMN(500MHz, DMSOo ₆ , δ): 8.38 (t, IH, J= 5.6 Hz, NH-GIy), 8.23 (s, IH, NH-β-Lactam), 8.50 (d , IH, J= 8.3 Hz, NH-Asp), 8.12 (d, IH, J= 7.8 Hz, NH-Arg), 7.35-7.22 (m, 15H, arom.), 5.12 (s, 2H, O CH ₂ Ph), 5.06 (d, IH, J= 12.0 Hz, OCH ₂ Ph), 4.98 (d, IH, J= 12.0 Hz, OCH ₂ Ph), 4.41 (m, IH, Hα-Asp), 4.25 (m, IH, Hα-Arg), 3.92 (dd, IH, J= 5.9, 17.6 Hz, Hα-Gly), 3.85 (dd, IH ₅ J= 5.9, 17.6 Hz, Ha- GIy), 3.77 (d, IH, J= 17.3Hz, Ha β-Lactam), 3.70 (d, IH, J= 17.3 Hz, Ha β-Lactam), 3.50 (d, IH, J- 5.4 Hz, Hβ β-Lactam), 3.36 (d, IH, J= 5.4 Hz, Hβ β-Lactam), 3.20 (d, IH, J= 14.2 Hz, CH ₂ Ph β-Lactam), 3.09 (d, IH, J= 14.2 Hz, CH ₂ Ph β-Lactam), 3.00 (m, 2H, Hδ- Arg), 2.92 (s, 2H, CH ₂ -PbI), 2.53 (dd, IH, J= 4.9, 16.1Hz, Hβ-Asp), 2.48 (s, 3H, Me-Pbf), 2.42 (s, 3H, Me-Pbf), 2.39 (dd, IH, J= 9.3, 16.1Hz, Hβ-Asp), 2.48 (s, 3H, Me-Pbf), 2.42 (s, 3H, Me-Pbf), 2.39 (dd, IH, J= 9.3, 16.1Hz, Hβ-Asp), 1.99 (s, 3H, Me-Pbf), 1.66 (m, 2H, Hβ-Arg), 1.49 (m, 2H, Hγ-Arg), 1.40 (s, 6H, 2xMe-Pbf), 1.34 (s, 9H, tBu).

c) ciclo [AFg(PBF)-GIy-ASp(O ⁴ Bu)-(A^e-ZnCiOWi)J: Se agitó una suspensión de CBZ- Asρ(O ^t Bu)-(¿>^to-Zαcte/«)-Arg(PBF)-Gly-OBn (86 mg, 0.08 mmol), Pd al 10% sobre carbono (9 mg) y etanoí (5 mL) bajo atmósfera de hidrógeno (1 atm.) durante 16 h. Pasado ese tiempo, se filtró la mezcla sobre celíta y se evaporó el disolvente a presión reducida. El crudo así obtenido (70 mg, 0.073 mmol, 92 % rendimiento) se disolvió en DMF (seca) (20 mL) a 0°C y, bajo atmósfera de N ₂ , se adicionó consecutivamente HATU (44 mg, 0.073 mol), HOAT (14 mg, 0.102 mmol) y DIPEA (0.076 mL, 0.44 mmol, 6 eq,). La reacción se; agitó durante 30 min. a 0 ⁰ C, tras los cuales se midió el pH de reacción cada hora humedeciendo una tira de papel pH y añadiendo una gota de la reacción sobre ella. Pasadas 6 h y siendo el pH=7-8 se añadió otro equivalente de DIPEA (0.013 mL, 0.073 mmol) para mantenerlo siempre entre 8-9. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente un total de 20 h, se evaporó el disolvente a presión reducida a una temperatura menor de 50 ⁰ C y el crudo se disolvió en EtOAc (5 mL) y se lavó con una disolución de NaHCθ ₃ al 5%. El producto obtenido~tras evaporar el- disolvente -a-presión reducida se purificó mediante cromatografía de capa fina preparativa eluyendo con MeOHZCH ₂ Cl ₂ (1:10). Rendimiento:

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

17 mg, (28%). MS (MALDI-TOF), m/z: 853.02; IR KBr, cirf ': 3446, 3386, 1752, 1730,

1663, 1550, 1259, 1160, 1130. ¹ H RMN(500MHz, DMSO _d6 , δ): 8.62 (t, IH, J= 5.4 Hz, NH-GIy), 8.35 (s, IH, NH-β-Lactam), 8.26 (d , IH, J= 7.8 Hz, NH-Asp), 8.11 (d, IH, J= 8.8 Hz, NH-Arg), 7.28-7.11 (m, 5H, arom.), 4.50 (m, IH, Hα-Asp), 4.17 (m, IH, Hα-Arg), 3.93 (dd, IH, J= 6.3, 13.7 Hz, Hα-Gly), 3.75 (IH, d, J= 14.2 Hz, Ha β-Lactam), 3.50 (s, IH, Hβ β-Lactam), 3.50-3.11 (m, 5H, Hα-Gly, Ha β-Lactam, Hβ β-Lactam, CH ₂ Ph), 3.00 (m, 2H, Hδ-Arg), 2.85 (s, 2H, CH ₂ -Pbf), 2.70 (dd, IH, J= 9.3, 16.1Hz, Hβ-Asp), 2.45 (m, 3H, Me-Pbf), 2.43 (m, IH, Hβ-Asp), 2.40 (s, 3H, Me-Pbf), 1.54 (m, IH, Hβ-Arg), 1.46 (m, 3H, Hβ,Hγ-Arg), 1.40 (s, 6H, 2xMe-Pbf), 1.38 (s, 9H, tBu).

d) Sal trifluoroacética de cic/o[Arg-Gly-Asp-(beía-Lactam)]: Se agitó una disolución de ciclo[Aig(PBF)-Gly-Asp(p ^{ Buy(beta-Lactam)] (18 mg, 0.02 mmol) a 35 ⁰ C durante 1 h en ácido trifluoroacético (0.3 mL). Pasado ese tiempo, se adicionó di-isopropileter (10 mL) para precipitar el producto final, y la suspensión se centrifugó. El residuo se lavó con diisopropileter (2 x 5mL) y se secó a presión reducida. Rendimiento: 14 mg (100%). MS (MALDI-TOF), m/z: 658.58. ¹ H RMN(500MHz, H ₂ O/D ₂ O 90/10, δ): 8.83 (s, IH, NH- Arg), 8.62 (t, IH, NH-GIy), 7.85 (d, IH, J= 5.4 Hz, NH-Asp), 7.73 (s, IH, NH-(5-Lactam), 7.34-7.02 (m, 5H, arom.), 7.15 (s, IH, NHω-Arg), 6.61 (s, IH, NHω-Arg), 4.5 5 (m, IH, Hα-Asp), 4.23 (dd, IH ₅ J= 7.23, 17.3 Hz, Hα-Gly), 3.94 (m, IH, Hα-Arg), 3.^2 (d, IH, J=14.0 Hz, Ha β-Lactam), 3.83 (s, IH, Hβ β-Lactam), 3.76 (d, IH, J= 14.0 Kz, Ha β- Lactam), 3.63 (s, IH, Hβ β-Lactam), 3.50 (dd, IH, J= 7.2, 17.3 Hz, Hα-Gly), 3.47 (d, IH, J=14.1 Hz Hδ, β-Lactam), 3.12 (m, 2H, Hδ-Arg), 3.10 (d, IH, J= 14.1 Hz, Hδ, β-Lactam), 2.85 (dd, IH, J= 5.1, 17.5Hz, Hβ-Asp), 2.67 (dd, IH, J= 8.0, 17.5 Hz, Hβ-Asp), 1.72 (m, 2H, Hγ-Arg), 1.62 (m, IH, Hβ-Arg), 1.54 (m, IH, Hβ-Arg).

EJEMPLO 8:

Preparación de la sal trifluoroacética de ciclo[Ávg-G\γ-Asχ>-(beta-Lactam)\,

(beta-Lactam): R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H; configuración (3R), según fórmula (II).

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Se siguió el procedimiento del ejemplo 7, partiendo de (#)-3-amino-3-bencil-l- metoxicarbonilmetilazetidin-2-ona (4.3Og, 10 mmol). Rendimiento global: 1.12 g (17%). p.fus = 180-220°C (desc); [α] ²⁰ _D = -0.3 (c = 0.28, IM HCl). ¹ H RMN(500MHz, H ₂ CVD ₂ O

90/10, δ): 9.22 (d, IH, J=5.3Hz, NH-Arg), 8.93 (s, IH ₅ NH-β-Lactam), 8.59 (t, IH, J= 6.3 Hz, NH-GIy), 8.11 (d, IH, J= 7.6 Hz, NH-Asp), 7.03-7.40 (m, 5H, arom.), 7.13 (m, 2H,

NH-Arg), 6.58 (m, IH, NH-Arg), 4.80 (m, IH, Asp), 3.98 (dd, IH, J= 6.8Hz, CH ₂ , Ha-

GIy), 3,86 (d, IH, J= 15.7Hz, CH ₂ ), 3.80 (m, IH, CH ₂ ), 3.20 (d, IH, J=14.7Hz, CH), 3.19

(d, IH, J= 13.9Hz, CH ₂ ), 3,14 (dd, 2H, J= 7.0Hz, J= 13.5Hz, CH ₂ ), 3.01 (d, IH, J= 13.8Hz,

CH ₂ ), 2.77 (dq, 2H, J= 6.9Hz, J= 16.6Hz, CH ₂ , Ha- Asp), 1.78 (m, 2H, CH ₂ , Hβ-Arg), 1.55 (m, 2H, CH ₂ , Hγ-Arg).

EJEMPLO 9:

Conformación en disolución acuosa de ciclo[Arg-Gly-Asp-(beta-Lactam)] conteniendo (beta-Lactam) según fórmula (II) de configuración (S), donde R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H (Compuesto A).

El compuesto A, preparado según el Ejemplo 7, se disolvió en agua bidestilada conteniendo un 10% de D ₂ O hasta una concentración de 10 mM y, empleando un espectrómetro Bruker Avance-500 provisto de sonda BBI con gradientes en eje z, se le efectuaron a 300K las medidas que se indican a continuación: a) un espectro IH monodimensional con pulso "water suppression by excitation sculpting" [J. Mag. Res., serie A, 112, 275-279 (1995)] (Figura 1), b) un espectro bidimensional TOCSY- WATERGATE "total correlation spectroscopy" [J Mag. Res., 130, 162-168 (1998)] (Figura 2), c) un espectro bidimensional ROESY-WATERGATE "rotating frame Overhauser enhancement spectroscopy" [J. Mag. Res., 63, 207-213 (1985)] con un tiempo de mezcla de 200ms (Figura 3). La asignación de los protones del espectro IH se efectuó mediante las correlaciones del experimento TOCSY siguiendo el procedimiento de asignación secuencial. Además, se midieron las distancias interprotónicas mediante integración de las señales de cruce del espectro ROESY. La dependencia de los protones de amida con la temperatura se determinó en el mismo disolvente entre 300K y 325Kτaτ intervalos de 5K (Figura 4).

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Considerando como puentes estables aquellos con coeficientes térmicos menores de

-5 ppb/K, sólo los NH(beta-Lactam) con -0.97 ppb/K y NH(Asρ) con -2.8 ppb/K participan en puentes de hidrógeno intramoleculares. El alto valor observado para NH(Arg) (-5.59 ppb/K) confirmó la inexistencia de un giro β entre NH(Arg) y C=O(Asp). La estructura tridimensional del compuesto A (Figura 5) se determinó en una caja de agua a 300K mediante la técnica de análisis de grupos conformacionales por Dinámica Molecular restringida con distancias interprotónicas, según el método descrito en J. Am. Chem. Soc. 123, 2393-2404 (2001) empleando el programa X-Plor (v2.9.2) [J Mag. Res., 160, 66-74 (2003)]. El compuesto A muestra un giro γ inverso formando puente de hidrógeno entre NH(beta-Lactam) y C=O (GIy), así como un giro γ formando puente entre NH(Asp) y C=O(Arg).

EJEMPLO 10:

Conformación en disolución acuosa de ciclo[Arg-G\y-Asp-(beta-Lactam)] conteniendo (beta-Lactam) según fórmula (II) de configuración (i?), donde R ¹ = CH ₂ Ph; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H (Compuesto B).

El compuesto B, preparado según el ejemplo 8, se disolvió en agua bidestilada conteniendo un 10% de D ₂ O hasta una concentración 5 mM. Empleando las mismas técnicas que en el caso del compuesto A, se registraron: a) un espectro IH con pulso

"water suppressíon by excitation sculpting" (Figura 6), b) un espectro bidimensional TOCSY-WATERGATE (Figura 7), c) un espectro bidimensional ROESY- WATERGATE con un tiempo de mezcla de 400ms (Figura 8). La asignación de los diferentes protones, así como la determinación de distancias interprotónicas o la medición de la dependencia de los protones de amida con la temperatura (Figura 9) se efectuaron de manera idéntica a la descrita para el compuesto A.

En el compuesto B, sólo NH(Asp) con -4.4 ppb/K participa en un puente de hidrógeno intramolecular. El alto valor observado para NH(Arg) (-8.4 ppb/K) confirmó la inexistencia de _uii_girg_β_ con puente de hidrógeno entre NH(Arg) y C=O(Asp). La estructura tridimensional del compuesto B (Figura 10) se determinó de manera idéntica al

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

del compuesto A, mostrando en este caso un giro γ con puente de hidrógeno entre

NH(Asp) y C=O (Arg).

EJEMPLO 11: Ensayo de adhesión celular de ciclo[Arg-Gly-Asp-(beta-Lactam)] conteniendo (beía- Lactam) según fórmula (II) de configuración (S), donde R ¹ = CH2PI1; R ² =R ³ =R ⁴ =R ⁵ =R ⁶ = H (Compuesto A).

Células endoteliales de cordón umbilical humano HUVEC (ATCC Cat.No. EC304) se cultivaron hasta una confluencia del 80% y se resuspendieron rápidamente utilizando

0.025% tripsina/EDTA (Sigma, USA). Las células se incubaron durante 20 minutos en medio DMEM (Gibco-BRL, USA) con diferentes concentraciones de los compuestos A y

B, preparados según los Ejemplos 7 y 8 descritos. Los ensayos se realizaron por triplicado a cada concentración y en tres experimentos distintos cubriendo un rango de concentración comprendido entre ICT ⁴ M y 10 ^""9 M y a intervalos de medio orden de magnitud. 4x10 ⁴

Células pretratadas se subcultivaron en 100 μl de medio DMEM completo/pocilio sobre placas de cultivo con 96 multipocillos recubiertas de vitronectína durante 1 hora e incubadas a 37 ⁰ C y 5%-Cθ ₂ /96%-humedad para permitir su adhesión. A continuación, los pocilios se lavaron tres veces con PBS para eliminar las células no adheridas. La determinación del número de células adheridas se realizó mediante tinción con el colorante fluorescente DAPI y contaje utilizando citometría de flujo (Becton Dinkinson Co.). El porcentaje de células adheridas relativo al control sin tratar con el compuesto se representó con la desviación estándar estadística en cada punto (Figura 11).

La figura muestra claramente que tanto el compuesto A como el compuesto B provocan una inhibición de integrina αvββ en cultivos celulares a concentración sub- micromolar, demostrando que dicha inhibición es posible independientemente de la configuración (R) o (S) de la posición α del anillo β-lactámico y del tipo y posición del giro gamma.

HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)