CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção está relacionada a técnicas de ensaios conhecidos como LAMP, do inglês “ Loop-Mediated Isothermal Amplification” . Mais particularmente, a invenção está relacionada a um dispositivo de ensaios LAMP, o qual tem por objetivo a amplificação do DNA/cDNA para detecção do material genético de patógenos extraídos de uma amostra biológica.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Técnicas de amplificação isotérmica de DNA mediada por loop, também conhecidas por técnicas LAMP (do inglês Loop-Mediated Isothermal Amplification ), são largamente conhecidas no estado da técnica, e aplicadas para o desenvolvimento de testes diagnósticos para a detecção de parasitas em amostras biológicas.

[003] A técnica LAMP é cada vez mais usada em substituição à técnica PCR ( Polymerase Chain Reaction - Reação em Cadeia da Polimerase), uma vez que o tempo e custo para a execução da técnica PCR ainda inviabilizam seu uso em larga escala em laboratórios de rotina.

[004] Os ensaios LAMP são executados em condições isotérmicas, as quais podem ser mantidas em diferentes instrumentos, tais como termocicladores e banhos-maria, ou então dispositivos de ensaios LAMP como adotado no presente relatório. O referido equipamento possibilita a amplificação do DNA/cDNA de amostras para detecção de patógenos através do aquecimento de uma câmara de ensaio interna ao dispositivo.

[005] Nos ensaios desenvolvidos no equipamento referido neste relatório, de forma resumida, alíquotas de uma amostra biológica sob análise são adicionados à reagentes e o conjunto é aquecido em uma câmara de ensaios LAMP. Essas amostras são então monitoradas durante o ensaio com o intuito de identificar uma possível mudança de cor (por exemplo, do violeta para o azul-celeste quando utilizado o reagente Azul de hidroxinaftol), o que representa uma reação positiva da amostra com relação ao reagente utilizado.

[006] Diversas configurações de câmaras de ensaios LAMP são conhecidas do estado da técnica, as quais serão descritas nos parágrafos que se seguem.

[007] O artigo“A novel CMOS image sensor system for quantitative loop-mediated isothermal amplification assays to detect food-borne pathogens”, de Wang, TT, publicado em “ Journal of microbiological methods”, apresenta um sistema de baixo custo de sensor de imagem CMOS para ensaios LAMP para detectar agentes patogênicos transmitidos por alimentos. O sistema descrito monitora a variação de fóton, causada pelas mudanças de cor durante a amplificação, em tempo real. O artigo conclui afirmando que o design simples, compacto e de baixo custo, com baixo consumo de energia, representa um avanço significativo no desenvolvimento de ferramentas analíticas quantitativas portáteis, sensíveis, fáceis de usar, em tempo real para o diagnóstico in loco.

[008] O artigo “ Development and evaluation of real-time loop- mediated isothermal amplification assay for rapid detection of cystic echinococcosis”, de Ahmed, ME, publicado em“ BMC Veterinary Research”, descreve o desenvolvimento e avaliação de um ensaio LAMP em tempo real para detecção rápida de equinococose cística. O ensaio descrito foi realizado a uma temperatura constante (63°C), com um acompanhamento em tempo real utilizando um instrumento de amplificação e detecção e corante fluorocromo. Após ciclos de amplificação em um banho-maria, os produtos LAMP foram observados para detectar mudança de cor a olho nu e foram visualizados sob fonte de luz UV.

[009] O artigo “A microfluidic lab-on-a-disc integrated loop mediated isothermal amplification for foodborne pathogen detection”, de Sayad, AA, publicado em“ Sensor s And Actuators B-Chemical” relata um dispositivo de plataforma microflmdica centrífuga de amplificação LAMP para detecção de patógenos alimentares, na qual foi utilizada uma fonte de aquecimento por convecção forçada para a atuação de uma válvula de cera e aquecimento de temperatura para a amplificação LAMP.

[0010] O documento W02013043203 é direcionado a um recipiente para ensaios LAMP de ácidos nucleicos isotérmicos e não isotérmicos compreendendo um corpo tendo uma superfície interior/exterior e uma extremidade aberta, além de uma tampa encaixável com a extremidade aberta do corpo e material flexível que se prolonga através da passagem.

[0011] Segundo este documento, o recipiente desenvolvido garante uma maior flexibilidade em comparação com os chips microfluídicos conhecidos devido à sua flexibilidade inerente para o manuseio de pequenos e grandes volumes de fluidos. Outra vantagem destacada consistiria no fato de que o recipiente revelado pode também permitir a extração de amostras, e possuir funcionalidades de transferência de fluido.

[0012] O documento US20160231324, descreve um sistema de multiplexagem de alto rendimento para detectar um alvo que compreende encapsular uma amostra biológica com ensaio ou sensor compreendendo, por exemplo, DNAzima capaz de gerar um sinal detectável e detectar o sinal, em que o sistema de ensaio, ou sensor, compreende um ensaio baseado em LAMP.

[0013] De acordo com este documento, a amostra analisada pode ser aquecida, em que o sistema compreenderia um diodo emissor de luz e um detector, além de um software de análise de dados, mostradores visuais para transmitir informações, conexões com dispositivos eletrónicos, dentre outras características.

[0014] O documento WO2011150115 é direcionado a um método

LAMP e um dispositivo para a detecção in loco de ácido nucleico em uma amostra. E descrito que o método utilizado compreende a introdução de reagentes de amplificação de ácido nucleico e aquecimento dos reagentes de amplificação de ácido nucleico.

[0015] Segundo este documento, o passo de aquecimento é realizado utilizando um aquecedor descartável, e o passo de detecção envolve a detecção de uma alteração de cor em um corante colorimétrico em comunicação fluida com os reagentes de amplificação de ácido nucleico. Pouco detalhe construtivo acerca do dispositivo descrito é fornecido.

[0016] O documento US20140356874 revela um método e dispositivo para amplificação e detecção de ácido nucleico portátil em que o instrumento preferencialmente utiliza uma técnica de amplificação isotérmica de ácido nucleico, tal como LAMP. A detecção da amplificação alvo pode ser conseguida, por exemplo, através da detecção de um desvio de cor ou fluorescência num corante adicionado à reação de amplificação.

[0017] De acordo com este documento, o dispositivo revelado compreende uma câmara de aquecimento, na qual a amostra é aquecida e um sensor para detectar a mudança de cor da amostra, em que os elementos podem ser controlados por um sistema de controle central.

[0018] O documento US9476836 revela um método de detecção de ácido nucleico (DNA) por método LAMP em uma amostra (de Sangue, por exemplo) que envolve colocar em contato o ácido nucleico com um reagente de detecção dentro de um sistema fechado, e a observação da mudança de cor do ácido nucleico e/ou do reagente de detecção.

[0019] Ainda é descrito que a observação da alteração de cor sob luz visível também pode ser realizada pela medição da absorbância da solução de amostra na gama de luz visível.

[0020] Entretanto, pouca informação é fornecida com relação a detalhes construtivos do dispositivo como um todo, como disposição de sensores e fontes de luz, dispositivos de display, etc.

[0021] O documento US20130331298 revela um cartucho de ensaio para detectar uma variedade de analitos, incluindo agentes patogênicos, que compreende uma porta de injeção, um canal central, câmaras de processamento, recipientes de reagente e uma câmara de resíduos. E descrito que o ensaio em questão pode ser do tipo LAMP.

[0022] O dispositivo descrito ainda compreende uma série de elementos, como aquecedor, controlador de aquecedor, sensores ópticos para a medição do fluxo que flui no cartucho. Nada é citado com relação ao uso de sensores para identificar uma mudança de cor na amostra sob análise.

[0023] Portanto, à luz dos documentos citados, nota-se que o estado da técnica compreende uma série de equipamentos para reação e leitura de ensaios LAMP, com distintas configurações, em que muitas melhorias ainda podem ser propostas, em especial com relação à praticidade e eficácia na realização de ensaios LAMP in loco.

[0024] Assim, como será mais bem detalhado nas próximas seções, a presente invenção visa a apresentação de uma câmara de ensaios LAMP que compreende características construtivas que facilitam seu uso e tomam a realização dos ensaios mais eficiente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0025] A presente invenção tem por objetivo prover um dispositivo de ensaios LAMP que permite a realização de ensaios LAMP de forma eficiente, simples e rápida.

[0026] De forma a alcançar os objetivos acima descritos, a presente invenção provê um dispositivo de ensaios LAMP compreendendo uma câmara de aquecimento adaptada para receber um trilho de suporte de pelo menos uma amostra, em que o trilho de suporte é inserido em seu interior através de uma abertura de inserção de amostras, em adição, a câmara de aquecimento compreende: pelo menos um elemento de aquecimento interno, com um circuito microcontrolado de temperatura; um circuito de elementos emissores de luz posicionado em uma parede frontal ou em uma parede traseira; e um circuito de sensores de luz em uma parede oposta ao circuito de elementos emissores de luz.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] A descrição detalhada apresentada adiante faz referência às figuras anexas e seus respectivos números de referência.

[0028] A figura 1 ilustra uma vista em perspectiva de uma configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP da presente invenção.

[0029] A figura 2 ilustra uma vista desmontada do dispositivo de ensaios LAMP ilustrado na figura 1.

[0030] A figura 3 ilustra uma vista frontal da configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP ilustrado na figura 1.

[0031] A figura 4ilustra o corte AA indicado na figura 3.

[0032] A figura 5 ilustra o corte BB indicado na figura 3.

[0033] A figura 6 ilustra uma vista isolada e explodida da câmara de aquecimento de acordo com uma configuração opcional da presente invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0034] Preliminarmente, ressalta-se que a descrição que se segue partirá de uma concretização preferencial da invenção. Como ficará evidente para qualquer técnico no assunto, no entanto, a invenção não está limitada a essa concretização particular.

[0035] Conforme citado anteriormente, o objetivo da presente invenção é o de prover um dispositivo de ensaios LAMP de baixo custo e uso prático. Assim, o dispositivo de ensaios LAMP descrito a seguir tem como objetivo a amplificação do DNA/cDNA para detecção de doenças através do aquecimento de um sistema resistivo, onde o controle realizado se baseia na inércia térmica dos elementos resistivos alocados na parte interna do dispositivo.

[0036] O dispositivo de ensaios LAMP, de uma forma geral, compreende circuitos integrados diretamente em sua estrutura que permitem a realização do controle térmico e detecção da mudança de cor das amostras. O conjunto de detecção é composto por emissores de luz e detectores que acompanham a mudança de cor das amostras avaliadas durante o ensaio, registrando o momento em que ocorre a mudança de cor no caso de uma reação positiva.

[0037] A principal redução de custos e diferencial deste dispositivo é o uso exclusivo da inércia térmica para o controle da temperatura, o que difere a invenção dos sistemas comerciais que usam técnicas de remoção e/ou resfriamento para o controle da temperatura elevando os custos dos equipamentos, assim como o seu consumo de energia.

[0038] As vantagens descritas acima ficarão mais evidentes a partir da descrição das figuras que segue.

[0039] A figura 1 ilustra uma vista em perspectiva de uma configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP da presente invenção. Observa-se que o dispositivo de ensaios LAMP compreende uma abertura de inserção 1 de amostras, preferencialmente posicionada em uma parede lateral do dispositivo.

[0040] A figura 2 ilustra uma vista desmontada da configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP ilustrado na figura 1. Nesta configuração opcional, o dispositivo compreende uma base 3, uma tampa superior 4 e um trilho de suporte 2 de pelo menos uma amostra. De modo a facilitar a descrição, o trilho de suporte 2 de pelo menos uma amostra, será referido simplesmente como trilho de suporte 2.

[0041] O dispositivo ainda compreende uma câmara de aquecimento

5, em que o trilho de suporte 2 é inserido em seu interior através da abertura de inserção 1 de amostras. Adicionalmente, pelo menos uma placa de circuito integrado pode ser fixada diretamente na estrutura da base 3.

[0042] O circuito integrado é adaptado para realizar o controle térmico e a detecção da mudança de cor das amostras, como será mais bem detalhado mais adiante neste relatório.

[0043] Opcionalmente, pelo menos um circuito integrado pode ser fixado na tampa superior 4 do dispositivo. Outros elementos, como botões de acionamento, displays informativos, dentre outros, podem ser também posicionados na tampa superior 4 do dispositivo.

[0044] A figura 3 ilustra uma vista frontal F da configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP ilustrado na figura 1.

[0045] A figura 4 ilustra o corte AA indicado na figura 3, e a figura 5 ilustra o corte BB indicado na figura 3.

[0046] Observa-se mais claramente que a câmara de aquecimento 5 é adaptada para receber o trilho de suporte 2 de pelo menos uma amostra de material biológico em seu interior.

[0047] Opcionalmente, o trilho de suporte 2 compreende uma parede lateral 10 em sua extremidade exterior. Deste modo, quando o trilho está complemente inserido na câmara de aquecimento 5, a parede lateral 10 provê o isolamento da região interna da câmara de aquecimento 5.

[0048] E importante pontuar que o número de amostras que o trilho de suporte 2 pode acomodar é variável de acordo com cada concretização. O número mínimo previsto é de uma amostra, no entanto, podem ser acomodadas quantas amostras se julgue necessário em concretizações específicas.

[0049] A figura 6 ilustra uma vista isolada e explodida da câmara de aquecimento 5 de acordo com uma configuração opcional da presente invenção. A câmara de aquecimento 5 compreende pelo menos um elemento de aquecimento 8a, 8b interno. O elemento de aquecimento 8a, 8b é adaptado para aquecer o interior da câmara de aquecimento 5, o que poderá proporcionar o inicio da reação nas amostras, como descrito anteriormente.

[0050] Opcionalmente, pelo menos dois elementos de aquecimento são posicionados no interior da câmara de aquecimento 5, em que pelo menos um elemento de aquecimento inferior 8b é posicionado em uma porção inferior da câmara de aquecimento 5, e pelo menos um elemento de aquecimento superior 8a é posicionado em uma porção superior da câmara de aquecimento 5. No exemplo ilustrado na figura 6, dois elementos de aquecimento são posicionados na porção superior da câmara e dois na porção inferior, no entanto, ressalta-se que essa configuração é opcional.

[0051] Quando a configuração descrita no parágrafo anterior for adotada, o elemento de aquecimento superior 8a produz maior poder calorífico, configurado através do circuito microcontrolado. Por sua vez, o elemento de aquecimento inferior 8b compreende um circuito de aquecimento com menor poder calorífico, resultado da configuração do circuito microcontrolado. Esta configuração é adotada para que se obtenha menor radiação térmica na parte inferior da câmara de aquecimento 5, com isso evita-se que ocorra evaporação dos compostos mais voláteis dos microtubos durante o ensaio.

[0052] Também é previsto que a câmara de aquecimento 5 compreende um circuito de elementos emissores de luz 6, preferencialmente diodos emissores de luz 6 (LED), posicionado na parede frontal ou na parede traseira.

[0053] Posicionados na câmara de aquecimento 5 em uma posição oposta ao circuito de elementos emissores de luz 6, também é previsto um circuito de sensores de luz 7, opcionalmente LDRs ( Ligth Dependent Resistors).

[0054] Preferencialmente é posicionado um elemento emissor de luz e um elemento sensor de luz em pontos opostos com relação a cada amostra no interior da câmara. Desta forma, o circuito de elementos emissores de luz 6 ilumina as amostras no interior da câmara de aquecimento 5 e o circuito de sensores de luz 7 identifica a cor da luz emitida por cada amostra.

[0055] Este sistema deve ser controlado por um sistema de controle em tempo real, de forma a identificar o momento exato em que uma amostra sofrer qualquer alteração de cor.

[0056] De modo a controlar a temperatura no interior da câmara de aquecimento 5, também é previsto, opcionalmente, que a câmara de aquecimento 5 compreenda um sensor de temperatura posicionado em seu interior. O sensor de temperatura é preferencialmente posicionado em uma região intermediária da câmara de aquecimento 5.

[0057] O sensor de temperatura também deve estar em comunicação com um sistema de controle. Assim, o sistema de controle irá gerenciar a potência do pelo menos um elemento de aquecimento 8 a, 8b em resposta às informações recebida pelos sensores de temperatura, mantendo a câmara de aquecimento 5 na temperatura desejada e planejada para cada ensaio.

[0058] Preferencialmente, o sistema de controle é posicionado em uma parede superior da câmara de aquecimento 5 e está em comunicação com os demais elementos descritos, a saber, pelo menos um elemento de aquecimento 8a, 8b, o circuito de elementos emissores de luz 6, o circuito de sensores de luz 7 e o sensor de temperatura. Em adição, o sistema de controle pode controlar fornecimento de energia para todos esses elementos.

[0059] Assim, o sistema de controle atua como uma unidade de processamento, controle e comunicação da câmara de aquecimento 5.

[0060] De forma resumida, de acordo com o descrito anteriormente, o conjunto de detecção é composto por emissores de luz 6 e detectores que acompanham a mudança de cor das amostras avaliadas durante o ensaio, registrando o momento em que ocorre a mudança de cor, no caso de uma reação positiva.

[0061] E importante ressaltar que a polarização dos elementos resistivos, internos à câmara de ensaio, ocasiona o fluxo de corrente que através da dissipação de potência gera calor, fenômeno conhecido como efeito Joule, aplicado neste caso para obtenção de uma faixa de temperatura homogénea na região onde as amostras estão posicionadas para reação.

[0062] Assim, a câmara de aquecimento 5 descrita tem como objetivo o baixo custo e neste caso não é aplicada nenhuma forma de retirada do calor e/ou circulação, de forma a obter a homogeneidade térmica unicamente através do controle do fluxo de corrente que passa pelo elemento resistivo considerando a sua inércia térmica para manter o ambiente interno da câmara na faixa de temperatura determinada para reação.

[0063] Portanto, após o pré-aquecimento o sistema atua através de um controle dedicado que ajusta a capacidade calorífica necessária para o equilíbrio da temperatura no interior da câmara de aquecimento 5. Este controle é feito pelo sistema de controle, através das informações dos elementos sensores distribuídos na região das amostras correlacionando a inércia térmica do elemento de aquecimento 8a, 8b para que não ocorram variações fora da faixa de reação da amostra.

[0064] O fluxo de corrente aplicado no elemento de aquecimento

8a, 8b precisa estar alinhado com a inércia térmica do elemento de aquecimento 8a, 8b devido ao tempo que este requer para entregar a quantidade de calor necessária para atingir a temperatura de equilíbrio determinada para o ensaio.

[0065] Deste modo, o sistema trabalha medindo a velocidade com que o ambiente no interior da câmara ganha ou perde calor para o ambiente externo e cria uma compensação controlada pelo fluxo de corrente aplicado no elemento de aquecimento 8a, 8b. Uma vez que a inércia térmica do ar não é elevada, não são necessários longos períodos para o equilíbrio térmico. Além disso, a boa condutividade térmica do ar também auxilia na homogeneização da temperatura no interior da câmara.

[0066] Portanto, a habilidade do dispositivo de ensaios LAMP descrito em mudar rapidamente a temperatura é dada pela inércia térmica que está relacionada diretamente com a constante térmica, capacidade calorífica e a massa a ser aquecida no interior da câmara de aquecimento 5. O objetivo do controle térmico é regular os limites de temperatura estabelecidos, dentro do tempo determinado para cada reação, de modo que o sistema atue de forma segura.

[0067] Opcionalmente, a tampa superior 4 do dispositivo de ensaios

LAMP pode compreender botões de acionamento e configuração, um display de visualização, e outros elementos de interface que se julgar necessário. Esses elementos de interface tem o objetivo de possibilitar a configuração e o controle do dispositivo em cada aplicação.

[0068] Ressalta-se que todos os elementos de interface devem estar em comunicação com o sistema de controle descrito anteriormente.

[0069] Opcionalmente, o gerenciamento dos botões, a coleta dos dados dos sensores, a exibição das mensagens no display e o controle da temperatura da câmara são realizados por um programa escrito em linguagem C, chamado de software embarcado.

[0070] Também opcionalmente, o dispositivo de ensaios LAMP pode compreender um meio para se conectar remotamente a dispositivos eletrónicos que permitem controlar e/ou visualizar os ensaios realizados, baixar dados/resultados dos ensaios, dentre outras funções. Essa conexão pode ser efetuada de modo sem fio ou através de cabos.

[0071] O modo de operação do dispositivo de ensaios LAMP poderá ser como descrito a seguir.

[0072] Inicialmente, o dispositivo é conectado a uma fonte de fornecimento de energia e uma chave Liga/Desliga é acionada. Antes de iniciar o modo reação, o trilho de suporte 2 de amostras deve ser mantido fora da câmara de aquecimento 5.

[0073] Utilizando a interface de usuário (botões), o sistema é iniciado, entrando em um ciclo de estabilização por um período de tempo pré- determinado para atingir a faixa de temperatura determinada para o ensaio a ser realizado. Neste momento, o display pode exibir uma mensagem indicando que a câmara está sendo estabilizada.

[0074] Decorrido o tempo necessário para a estabilização da temperatura, o sistema estará pronto para dar início ao ensaio de reação e uma mensagem pode ser exibida, indicando que a câmara de aquecimento 5 está estabilizada.

[0075] Finalizado o ciclo de estabilização, ou seja, com a temperatura adequada para o ensaio estabilizada dentro da câmara de aquecimento 5, o trilho de suporte 2 de amostras é inserido na câmara de aquecimento 5 através da abertura de inserção 1 de amostras. Nesse momento, é dado o comando de início da reação. O comando de início de reação pode ser dado através de um botão na tampa superior 4 do dispositivo ou qualquer outro meio, como comando remoto.

[0076] Durante o ensaio de reação são exibidas no display as informações de temperatura interna da câmara, o tempo transcorrido do ensaio, o valor da leitura da cor de cada uma das amostras, bem como quaisquer outras informações que se julgarem relevantes.

[0077] Após transcorrido o tempo de ensaio determinado para a reação, o teste é finalizado e o display pode exibir uma mensagem informando: o resultado do ensaio; instruções para o usuário; ou outras informações relevantes.

[0078] Ressalta-se que o sistema de controle do dispositivo de ensaios

LAMP também pode se conectar remotamente, através de tecnologia Bluetooth, a outros dispositivos eletrónicos (como computadores, smartphones, notebook, etc.) de modo a produzir tabelas, gráficos, plotagem de dados dos ensaios, e exportar quaisquer informações relevantes dos ensaios realizados.

[0079] Assim, fica claro que o dispositivo de ensaios LAMP proposto soluciona os problemas do estado da técnica a que se propõe, ou seja, permite a realização de ensaios LAMP de forma eficiente, simples e rápida.

[0080] Inúmeras variações incidindo no escopo de proteção do presente pedido são previstas. Dessa forma, reforça-se o fato de que a presente invenção não está limitada às configurações/concretizações particulares acima descritas.