CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção reúne um dispositivo e métodos para o diagnóstico molecular rápido de doenças. Mais precisamente, trata-se de uma plataforma voltada à detecção de patógenos por meio da amplificação isotérmica de DNA/RNA, que pode ser aplicado no diagnóstico de doenças de importância para a saúde humana, incluindo a COVID-19. Pode também ser reprogramado e/ou configurado para o diagnóstico de doenças de importância veterinária, em vigilância sanitária ou para o agronegócio.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A técnica de amplificação isotérmica de DNA/RNA mediada por loop, também conhecida como LAMP (do inglês Loop-Mediated Isothermal Amplification'), pode ser aplicada no desenvolvimento de testes diagnósticos para a identificação de diferentes patógenos. É uma técnica para a amplificação de ácidos nucleicos usando 4 a 6 iniciadores desenhados para amplificar a sequência alvo por meio da criação de estruturas de “stem-loop” (“haste e alça”) que auxiliam na síntese de novas moléculas de ácido nucleico pela DNA polimerase. A técnica LAMP ocorre em temperatura constante (normalmente variando entre 60 - 65 °C), e por usar vários iniciadores para amplificar uma sequência alvo, também é altamente específica.

[003] A técnica LAMP vem sendo cada vez mais utilizada como método alternativo para a detecção de alvos moleculares (DNA/RNA), em virtude da alta sensibilidade, especificidade, redução do tempo de reação e das vantagens da não necessidade de uma estrutura laboratorial complexa para a execução da reação de amplificação isotérmica.

[004] Os ensaios LAMP são executados em chamadas câmaras de ensaio LAMP, ou então dispositivos de ensaios LAMP como adotado no presente relatório, que possibilitam a amplificação do material genético (DNA ou RNA) em amostras para detecção de patógenos e diagnóstico de doenças, por meio do aquecimento de uma câmara de ensaio interna ao dispositivo.

[005] Nesses ensaios, de forma resumida, são adicionados reagentes às amostras biológicas sob análise e o conjunto é aquecido em uma câmara de ensaios LAMP até uma temperatura determinada, normalmente variando entre 60-65 °C. Essas amostras são então monitoradas durante o ensaio, cujo resultado pode ser mensurado pela alteração de coloração (ou fluorescência) da reação, indicando uma amostra positiva, realizando leituras em tempo real utilizando sondas deslocáveis na construção de uma curva fluorescência vs tempo, e confirmando a presença do patógeno em questão.

[006] Diversas configurações de câmaras de ensaios LAMP são conhecidas do estado da técnica, as quais serão descritas nos parágrafos a seguir.

[007] O documento CN203720089U descreve um analisador de intensidade de fluorescência de reações de LAMP que compreende um dispositivo de processamento de dados de computador, um sensor óptico, uma placa de aquecimento com temperatura constante e uma fonte de luz UV. A placa de aquecimento com temperatura constante é composta por uma base e cilindros ocos, onde são colocados tubos de reação feitos de material transmissível à luz. As paredes laterais dos cilindros possuem orifícios, de um lado alinhado com uma fonte externa de luz ultravioleta, e de outro lado alinhado com um sensor óptico, o qual está conectado a um dispositivo de processamento de dados de computador por meio de um cabo. O sensor é capaz de aferir a intensidade de fluorescência emitida pelo “corante” SYBR Green - um fluoróforo intercalante de DNA que fluoresce na presença de fitas duplas da molécula - como medida indireta do aumento da quantidade de DNA amplificado. Dessa forma é possível inferir, em tempo real, sobre a quantificação de um dado alvo (ou gene). Uma estratégia útil, por exemplo, para calcular cargas virais entre amostras.

[008] O artigo da Nature “A smartphone-based diagnostic platform for rapid detection of Zika, chikungunya, and dengue viruses” (Priye et al, 2017) descreve o desenvolvimento de um dispositivo impresso em 3D para ensaios LAMP, combinado com uma sistema de detecção por smartphone, que permite o diagnóstico simultâneo dos vírus Zika, Dengue, e Chikungunya. O dispositivo em formato de caixa, consiste em três componentes primários: (i) modulo de aquecimento (composto por uma superfície plana aquecida com contato com os tubos do módulo de reação); (ii) módulo de reação; e (iii) um módulo de detecção (composto por um LED compacto montado na superfície, acoplado a um filtro de banda de várias passagens para servir como fonte de excitação) e análise de imagem (o sinal de fluorescência emitido na reação é captado pela câmera de um smartphone e analisado por um aplicativo específico). Os três componentes são conectados e controlados à distância via bluetooth por um aplicativo de smartphone.

[009] O documento “Simultaneous and high sensitive detection of

Salmonella typhi and Salmonella paratyphi a in human clinical blood samples using an affordable and portable device” (Kaur et al, 2019) apresenta um sistema para a detecção de bactéria em amostra de sangue humano, baseado em LAMP, que é composto por uma unidade de amplificação por LAMP a qual consiste de múltiplos aquecedores do tipo cartucho e meios para controlar a temperatura, e por uma unidade de detecção. Para a detecção, o corante SYBR Green é adicionado à amostra e o tubo é acondicionado em um dispositivo portátil impresso em 3D, onde há uma fonte de luz LED acima do tubo e um fotodetector, posicionado em um ângulo reto em relação ao tubo, controlados eletronicamente. O dispositivo se comunica via bluetooth com um smartphone usando um aplicativo que pode exibir, registrar e armazenar detalhes de cada paciente.

[0010] Algumas limitações técnicas na operacionalização dos ensaios LAMP dificultam o estabelecimento de testes reprodutíveis e com alto nível de eficácia. Um destes pontos se relaciona à garantia do controle homogêneo de temperatura no interior dos tubos de reação. Nesse sentido, a utilização de câmaras que empregam o aquecimento por convecção ou de placas de aquecimento em contato com apenas uma porção da superfície dos tubos de reação não proporciona o equilíbrio satisfatório da temperatura no fluido da reação. Outro fator limitante diz respeito à necessidade de leitura acurada da mudança de cor como resultado da reação. Neste aspecto, é crucial o emprego de sensores que substituam a inspeção visual. Ademais, o tipo do sensor e o posicionamento do mesmo em relação ao tubo de reação têm forte influência no desempenho do ensaio.

[0011] Em adição ao exposto até aqui, a rápida disseminação do vírus SARS-CoV-2, agente causador da síndrome denominada de COVID-19, impôs inúmeros desafios à saúde pública global. Em razão das taxas de morbidade e letalidade observadas, do alto potencial de contágio e infectividade desse novo coronavirus, além da virtual impossibilidade de diagnóstico clínico diferencial em relação a outras infecções respiratórias virais e mesmo de outras etiologias, toma-se essencial a aplicação de sistemas diagnósticos sensíveis e diferenciais.

[0012] Assim, a chegada da pandemia da Covid-19 trouxe consigo novos desafios no seu enfrentamento por parte das instituições hospitalares. Portanto, faz-se necessária a ampliação da capacidade diagnóstica para os casos suspeitos atendidos nos hospitais, sejam eles relacionados aos pacientes ou mesmo entre os profissionais de saúde diretamente expostos.

[0013] A exposição destes profissionais ao vírus durante os atendimentos, coloca esta categoria profissional como de risco aumentado para o contágio, gerando uma série de afastamentos por pedidos de licença médica mediante suspeita clínica, muitos deles sem confirmação diagnóstica. Trata-se de um grave problema relacionado a gestão de pessoal, gerando desfalques frequentes nas equipes de trabalho e configurando-se como gargalo assistencial à população.

[0014] Tão logo a ocorrência do surgimento da epidemia na China foi noticiada, foram divulgados diversos protocolos de detecção do SARS-CoV-2 por meio da PCR em tempo real com transcrição reversa (RT-PCR). Não obstante, o desenvolvimento de sistemas diagnósticos mais simples, baratos, que façam uso de tecnologia IoT - Internet das coisas {Internet of Things') e igualmente ágeis, toma-se algo relevante e bastante desejável, visto que a atual capacidade instalada nacional brasileira para diagnóstico em massa e disponibilidade de acesso para os usuários de sistemas públicos de saúde, como o SUS, encontram-se fortemente limitados.

[0015] As principais limitações para a implementação de soluções em diagnóstico molecular são o alto custo, a necessidade de infraestrutura adequada e a capacitação de pessoal. Em virtude da alta demanda e apesar dos esforços, nota-se, ultimamente no Brasil e também no mundo, uma enorme dificuldade em testar massivamente os casos suspeitos para o SARS-CoV-2, tanto no setor público como na iniciativa privada. Apesar de eficaz, a técnica de RT-PCR é ofertada de forma centralizada e não há produção suficiente de insumos para atender à população, levando o sistema a priorizar o diagnóstico obedecendo a critérios de gravidade.

[0016] Portanto, à luz dos documentos do estado da técnica citados, nota-se que o estado da técnica compreende uma série de equipamentos para reação e leitura de ensaios LAMP, com distintas configurações. No entanto, fica claro que muitas melhorias ainda podem ser propostas, em especial com relação à eficácia na realização de ensaios LAMP in loco, visto que não se identifica até o momento um único dispositivo de ensaios LAMP que represente solução técnica para superar as limitações ao controle da temperatura de reação e à leitura acurada da mudança de cor.

[0017] Assim, como será mais bem detalhado nas próximas seções, a presente invenção visa a apresentação de um dispositivo de ensaios LAMP que compreende características construtivas que facilitam seu uso e tomam a realização dos ensaios mais eficiente.

[0018] A invenção revela ainda uma abordagem baseada no método LAMP para diagnóstico de doenças. Ilustrativamente, o método é usado para o diagnóstico de arboviroses, como Zika, Dengue, Chikungunya e Febre amarela, e SARS-CoV-2.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0019] A presente invenção tem por objetivo prover um dispositivo de ensaios LAMP aplicado para a identificação de patógenos, que seja capaz de ser aplicado em locais remotos para o diagnóstico de Dengue, Zika, Chikungunya, Febre Amarela e SARS.CoV-2, dentre outros patógenos.

[0020] O dispositivo de ensaios LAMP é controlado por software multiplataforma compatível com smartphones, tablets ou computadores. A aplicação comunica com o firmware do dispositivo via conexão sem fio (wireless), sendo esse último responsável por gerenciar o controle térmico, fazer a leitura dos sensores e realizar a interpretação automático dos resultados, por meio de processamento de imagem software multiplataforma compatível com smartphones, tablets ou computadores. A aplicação comunica com o firmware do dispositivo via conexão sem fio (wireless), sendo esse último responsável por gerenciar o controle térmico, fazer a leitura dos sensores e realizar a interpretação automático dos resultados, por meio de processamento de imagem. Além de ser a interface gráfica homem-máquina, o software possui banco de dados local, georreferenciamento e, quando conectado à Internet, estabelece automaticamente comunicação com um servidor WEB, capaz de realizar a centralização dos dados e compilação de relatórios através de técnicas de data mining. Como se trata de dispositivo dotado de tecnologia IoT (Internet of Things), em que os dados dos pacientes/clientes são enviados para o servidor por meio de conexão com a internet, há riscos de vazamento de informações sensíveis. Dessa forma, todo o sistema foi desenvolvido seguindo a Lei Geral de Proteção de Dados Pessoais (LGPD ou LGPDP), Lei n° 13.709/2018. Tanto o Software quando o sistema WEB trabalham sob protocolos de criptografia e rotinas de segurança que garantem tanto a integridade dos dados, quanto sua segurança.

[0021] De forma a alcançar os objetivos acima descritos, a presente invenção provê um dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada à identificação de patógenos, compreendendo: uma câmara de ensaios LAMP; um compartimento dentro do gabinete reservado para o correto acondicionamento da eletrônica do dispositivo, um meio de alimentação de energia; e uma tampa superior para fechar a câmara de ensaios LAMP, em que intemamente o dispositivo compreende: um termobloco cilíndrico metálico compreendendo aberturas para posicionar microtubos; a eletrônica contém uma placa eletrônica de potência; pelo menos um elemento aquecedor em contato com o termobloco e adaptado para aquecer o termobloco microtubos por indução; um sensor de temperatura adaptado para medir a temperatura do termobloco; LEDs RGB posicionados na parte inferior de uma câmara escura, ao lado da câmera inferiormente e adaptados para excitar cada microtubo posicionado no termobloco; uma câmera posicionada inferiormente ao termobloco e adaptada para captar imagens de cada um dos microtubos posicionados no termobloco; e uma placa de controle com processamento central, responsável por executar o processamento das imagens captadas pela câmera; controlar a temperatura no termobloco e realizar a comunicação com um dispositivo de usuário (tablet, computador, smartphone, etc.).

[0022] Em adição, a invenção provê um método para identificação de patógenos a partir de um dispositivo de ensaios LAMP e RT-LAMP como o descrito.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0023] A descrição detalhada apresentada adiante faz referência às figuras anexas e seus respectivos números de referência.

[0024] A figura 1 ilustra uma vista em perspectiva de uma configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada à identificação de patógenos da presente invenção.

[0025] As figuras la, 1b e 1c ilustram, respectivamente, vistas frontal, lateral e superior do dispositivo de ensaios LAMP da figura 1.

[0026] A figura 2 ilustra uma vista explodida da configuração do dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada a identificação de patógenos da figura 1.

[0027] A figura 3 ilustra uma vista superior isolada do termobloco da figura 2

[0028] A figura 3a ilustra uma vista do termobloco da figura 3 com microtubos inseridos nas aberturas para posicionar microtubos.

[0029] A figura 3b ilustra uma vista em corte do termobloco da figura 3a.

[0030] A figura 3c ilustra uma vista em corte do termobloco da figura 3a com foco em uma abertura para posicionar microtubos.

[0031] A figura 4 ilustra uma configuração opcional da arquitetura de hardware do dispositivo de ensaios LAMP da presente invenção.

[0032] A figura 5 ilustra a revelação da reação utilizando sonda deslocável específica de mudança de cor por diferença de pH, de acordo com um experimento realizado utilizando o dispositivo de ensaios LAMP da presente invenção para detecção de SARS-CoV-2.

[0033] A figura 6 ilustra a estratégia para o design de primers F3/B3; FIP/BIP; LF/LB utilizando o gene N de SARS-CoV-2, de acordo com experimentos realizados.

[0034] A figura 7 ilustra uma comparação entre amostras que foram

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) positivas para o SARS-CoV-2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0035] Preliminarmente, ressalta-se que a descrição que se segue partirá de uma concretização preferencial da invenção. Como ficará evidente para qualquer técnico no assunto, no entanto, a invenção não está limitada a essa concretização específica.

[0036] Particularmente, será descrito em mais detalhes o uso do dispositivo da presente invenção para a detecção molecular rápida do RNA de SARS-CoV-2. Entretanto, obviamente, a invenção provê um dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada a identificação de diferentes patógenos, como, por exemplo, Dengue, Zika, e Chikungunya, dentre outros. Ressalta-se que nos próximos parágrafos, à título de simplificação textual, a invenção será referida simplesmente como dispositivo LAMP, o que certamente não causará confusão a um leitor atento. [0037] A não ser que sejam definidos de maneira diferente, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado entendido por um técnico no assunto ao qual a invenção pertence. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem finalidade de descrever concretizações particulares somente, e não tem a intenção de limitar o escopo dos ensinamentos. A não ser que seja indicado de forma diferente, todos os números expressando quantidades, porcentagens e proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e nas reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados, em todos os casos, pelo termo “cerca de”. Assim, a não ser que seja indicado o contrário, os parâmetros numéricos mostrados no relatório descritivo e nas reivindicações são aproximações que podem variar, dependendo das propriedades a serem obtidas.

[0038] A figura 1 ilustra uma vista em perspectiva de uma configuração opcional do dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada a identificação de patógenos

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) da presente invenção. As figuras la, lb e 1c ilustram, respectivamente, vistas frontal, lateral e superior do dispositivo de ensaios LAMP da figura 1.

[0039] De acordo com essa configuração, o dispositivo LAMP compreende extemamente: uma câmara de ensaios 1 LAMP; uma fonte de energia 7 capaz de ser conectada a um ponto de entrada de energia (opcionalmente, uma bateria pode ser utilizada); uma tampa superior 2; uma tampa inferior 6; um gabinete 4 de eletrônica, onde os dispositivos eletrônicos de controle são posicionados; um sensor 3 de fechamento da tampa superior 2; e um botão 5 de acionamento.

[0040] Com relação à fonte de energia 7, o dispositivo LAMP da presente invenção pode ser conectado a uma tomada ou a uma bateria móvel que forneça a energia necessária para seu funcionamento, de modo que esta característica não representa um limitante ao escopo da invenção.

[0041] Ressalta-se que a posição dos elementos indicados nesta figura é opcional, de modo que outras configurações podem ser adotadas, em que a configuração mais geral da presente invenção será definida pela reivindicação principal, como de conhecimento de qualquer técnico no assunto.

[0042] A figura 2 ilustra uma vista explodida da configuração do dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada a identificação de patógenos da figura 1. Intemamente o dispositivo LAMP compreende: um termobloco 8 para microtubos cilíndrico metálico compreendendo aberturas 80 para posicionar microtubos 81; uma placa de controle com processamento central 14; uma placa eletrônica de potência 13; um elemento aquecedor 10 conectado ao termobloco 8 e adaptado para aquecer o termobloco 8 por indução; um sensor de temperatura 9 adaptado para medir a temperatura do termobloco 8; LEDs RGB posicionados na parte inferior de uma câmara escura, ao lado da câmera l i e adaptados para excitar cada microtubo posicionado no termobloco 8; e uma câmera 11 posicionada inferiormente ao termobloco (8) e adaptada para

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) captar imagens de cada uma dos microtubos posicionadas no termobloco 8.

[0043] Na configuração ilustrada nas figuras deste relatório, o termobloco 8 compreende um bloco de alumínio anodizado cilíndrico com dez aberturas adaptadas para acomodar justamente dez microtubos 81 de 0,2 mL cada. O formato cilíndrico e do termobloco 8, bem como o encaixe justo (sem folgas) entre cada microtubo e o termobloco 8, assegura o aquecimento concomitante e uniforme, além do controle homogêneo de temperatura no interior de cada um dos microtubos 81 posicionados nas aberturas.

[0044] O aquecimento se dá da seguinte forma, o elemento aquecedor 10 está em contato com o termobloco 8 e aquece o termobloco 8 por indução. Como o termobloco 8 é metálico (preferencialmente de alumínio anodizado) o aquecimento do mesmo se dá de forma rápida e substancialmente uniforme. Assim, os microtubos também são aquecidos de forma rápida e uniforme, já que os mesmos são encaixados de forma justa à cada uma das aberturas 80. Assim, a invenção assegura um rápido e uniforme aquecimento de cada uma das amostras no interior dos microtubos.

[0045] O número de elementos de aquecimento 10 adotados para o termobloco 8 pode variar em diferentes concretizações da invenção, em especial em dependência do número de aberturas 80 para microtubos 81 disponíveis no termobloco 8. Em configurações opcionais da invenção, em que é adotada uma pluralidade de aberturas 80 para microtubos 81, podem ser adotados mais de um elemento aquecedor 10, distribuídos de diferentes formas com o objetivo de prover o aquecimento mais rápido e uniforme possível do termobloco 8, e consequentemente dos microtubos 81 nele colocados.

[0046] Assim, resumidamente, a invenção prevê a adoção de pelo menos um elemento aquecedor 10, podendo ser adotados mais de um (até quantos se julgar necessário) conforme aplicações específicas, sem que se fuja do escopo de proteção da invenção.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [0047] Ressalta-se que os resistores do elemento aquecedor 10 são controlados eletronicamente pela placa de controle com processamento central 14. Assim, uma vez programada a temperatura final a ser utilizada no experimento, a placa de controle com processamento central 14 irá controlar o aquecimento do suporte até que o sensor de temperatura 9 identifique que a temperatura desejada foi atingida. A partir desse momento, a placa de controle com processamento central 14 irá controlar o elemento aquecedor 10 para manter a temperatura desejada ao longo do experimento.

[0048] A figura 3 ilustra uma vista superior isolada do termobloco 8 da figura 2, a figura 3a ilustra uma vista do termobloco 8 da figura 3 com microtubos inseridos nas aberturas 80 para posicionar microtubos, a figura 3b ilustra uma vista em corte do termobloco 8 da figura 3a, e a figura 3c ilustra uma vista em corte do termobloco da figura 3a com foco em uma abertura 80 para posicionar microtubos.

[0049] A invenção ainda prevê que a reação de LAMP promovida com a utilização do dispositivo LAMP descrito é combinada com um método de detecção. Um exemplo é a detecção via alteração da cor em decorrência da diferença de pH das amostras positivas, que se tornam ácidas - pela liberação de prótons durante o processo de amplificação de DNA - e na presença do vermelho de fenol, ficam amarelas, diferindo das amostras negativas, não amplificadas, que apresentam a tonalidade cor de rosa. Em exemplos particulares, o corante colorido compreende vermelho de cresol, vermelho fenol, púrpura de m-cresol, púrpura de bromocresol, vermelho neutro, naftolftaleína, azul de timol. Em alguns exemplos, o corante indicador sensível a pH é um corante colorido detectável em luz visível. Em outros exemplos, o corante indicador sensível a pH é um corante indicador fluorescente, incluindo mas não limitado a 2',7-bis-(2-carboxietil)-5(6)- carboxifluoresceína, 5(6)-carboxi-2',7'-diclorofluoresceína, 5(6)- carboxifluoresceína, 3,6-diacetoxiftalonitrila, ácido 6,8-dihidroxi-l,3-

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) pirenedisulfônico, ou 5-(e-6)-carboxil seminaftorhodafluor.

[0050] É possível utilizar outros agentes que revelem característica intrínsecas à reação, como o a redução de íons magnésio disponíveis, pela precipitação com o pirofosfato. Corantes como o azul de hidroxinaftol (HNB) são capazes de detectar essa diferença de íons magnésio e passar da cor púrpura ou azul escuro, para o azul celeste.

[0051] Essa mesma característica da precipitação de pirofosfato de magnésio em reações de amplificação isotérmica, resultam na turbidez de amostras positivas, que ocorre por uma quantidade crescente de precipitado de pirofosfato de magnésio em solução como subproduto da amplificação. A turbidez é medida por inspeção visual após conclusão da reação ou em tempo real usando um turbidímetro.

[0052] Outra forma de detecção é por meio da cromatografia (ou migração) em gel de agarose a 2 % tratado com brometo de etídio ou qualquer intercalante fluorescente de DNA como SYBR green ou GelRed.

[0053] A invenção também prevê o emprego de agentes intercalantes fluorescentes, como SYBR Green, SYTO 9, SYTO 13, SYTO 16, SYTO 24, SYTO 60, SYTO 62, SYT 64, SYTO 82, SYBR Gold, YOPRO-1, TOTO-1, TOTO-3, BOBO3, POPO3 e TOPRO3 (Invitrogen), Eva Green (Biotium), Boxto (TATA Biocentre), Miami Green, Miami Yellow, Miami Orange (Kerafast), Pico 488 (Lumiprobe), verde malaquita, sem necessariamente haver uso da resolução de bandas em gel de agarose.

[0054] Em uma outra forma de concretização, a invenção compreende o uso de sondas fluorescentes deslocáveis para detecção, as quais se ligam com alta especificidade a seus alvos. Assim, a câmera 11 posicionada inferiormente ao termobloco 8 é adaptada para captar a fluorescência emitida pelas sondas presentes na reação de amplificação. Exemplos de corantes fluorescentes que podem ser usados na invenção incluem, por exemplo, calceína, Mag-Fura-2 e Magnesium green (Life Technologies, Grand Island,

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) N.Y.) e Fluo-2Mg, Fura-2Mg.Indo-l Mg, e Asante Magnesium Green (TEF Labs, Austin, Texas). A fluorescência é detectável usando um instrumento, como um fluorímetro que pode estar associado a um termociclador de PCR em tempo real, compondo um sistema único.

[0055] Para permitir a leitura acurada do resultado da reação, como ilustrado nas figuras 3, 3a, 3b, e 3c preferencialmente, as aberturas 80 para posicionar microtubos 81 são anguladas a um ângulo de aproximadamente 45° (podendo variar entre substancialmente 38° e 52°, como ilustrado na figura 3c).

[0056] Ressalta-se que as dimensões ilustradas na figura 3c representa apenas uma configuração opcional de um protótipo concretizado da invenção, em que essas dimensões específicas podem variar de acordo com a concretização realizada. Deste modo, a invenção não está limitada a essa concretização específica ilustrada nessa figura.

[0057] O termobloco 8 compreende ainda um orifício 82 na porção inferior interna de cada abertura 80 para posicionar microtubos 81. Assim, através do orifício 82 é permitida a excitação da luz com quatro faixas de sinal de fluorescência (ou canais de luz provenientes de LEDs RGB) disponíveis, além de ser possível a captura da imagem de cada microtubo pela câmera 11.

[0058] A leitura da fluorescência em diferentes faixas viabiliza a detecção concomitante de diferentes alvos e quantificação da carga presente na amostra, pelo uso de diferentes sondas marcadas na mesma reação.

[0059] Opcionalmente, foi adotada uma placa de controle com processamento central em que o processador é de 64-bits QuadCore 1.4GHz ARMV8 (código: BCM2837B0) devido à simplicidade de programação para a elaboração de um protótipo em que a invenção foi testada. Entretanto, qualquer outra placa de controle com processamento central poderá ser adotada para realizar as funções definidas neste relatório.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [0060] É importante pontuar que a placa de controle com processamento central (14) é responsável por gerenciar toda a realização dos ensaios, a saber: executar o processamento das imagens captadas pela câmera 11 ; controlar a temperatura no interior da câmara de ensaios 1 LAMP, fazer a detecção automática do teste por meio do processamento da imagem e realizar a comunicação com um software de interface gráfica compatível com tablet, computador, smartphone, etc.

[0061] Preferencialmente, a comunicação entre a placa de controle com processamento central 14 e o dispositivo de usuário é realizada pela tecnologia sem fio, preferencialmente bluetooth. Entretanto, em configurações alternativas, a comunicação pode ser realizada de diferentes formas incluindo formas sem fio, ou com cabos.

[0062] A figura 4 ilustra uma configuração opcional da arquitetura de hardware do dispositivo LAMP da presente invenção.

[0063] Assim, de um modo mais amplo, o dispositivo de ensaios LAMP que promove a amplificação isotérmica de RNA/DNA aplicada a identificação de patógenos da presente invenção compreende: uma câmara de ensaios 1 LAMP; um gabinete de eletrônica, um meio de alimentação de energia 7 ; e uma tampa superior 2 para fechar a câmara de ensaios 1 LAMP, intemamente o dispositivo compreende: um termobloco 8 metálico cilíndrico compreendendo aberturas 80 para posicionar microtubos 81; uma placa de controle com processamento central 14; uma placa eletrônica de potência 13; pelo menos um elemento aquecedor 10 em contato com o termobloco 8 e adaptado para aquecer o termobloco 8 por indução; um sensor de temperatura 9 adaptado para medir a temperatura do termobloco 8; uma pluralidade de LEDs RGB 12 posicionados inferiormente ao termobloco 8; e uma câmera 11 posicionada inferiormente ao termobloco (8) adaptada para captar imagens de cada um dos microtubos posicionados no termobloco 8. De acordo com essa configuração mais geral, a placa de controle com processamento central (14)

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) compreende ainda meios para se comunicar com um dispositivo de usuário móvel (como um smartphone, um computador, um tablet, etc) e é adaptado para controlar a temperatura do termobloco 8 de acordo com uma programação estabelecida por meio do controle do elemento aquecedor 10 e em resposta ao sinal do sensor de temperatura 9. É adaptado, ainda, para executar o processamento das imagens captadas pela câmera 11.

[0064] Opcionalmente, existe um elemento visual de aviso de funcionamento para informar a um usuário sobre o status do dispositivo. Preferencialmente, esse elemento é um LED posicionado extemamente ao dispositivo LAMP para indicar a condição do dispositivo.

[0065] O dispositivo ainda pode adotar um sensor 3 de fechamento de tampa em comunicação com a placa de controle com processamento central (14), em que a placa de controle com processamento central (14) é adaptada para permitir o funcionamento do dispositivo apenas quando a tampa superior 2 estiver fechada. O sensor de fechamento de tampa pode ser qualquer um conhecido do estado da técnica, de modo que este não representa um limitante ao escopo da invenção.

[0066] Assim, para o uso do dispositivo descrito, a tampa superior 2 é aberta para possibilitar a inserção dos microtubos 81 em cada abertura 80 para posicionar microtubos 81 do termobloco 8. Como descrito, o número de aberturas 80 para posicionar microtubos 81 pode variar em diferentes configurações da invenção. O modelo específico ilustrado neste relatório adota um total de dez aberturas. Entretanto, como já descrito, o número de aberturas pode variar em diferentes concretizações da invenção, sem que se fuja do escopo de proteção das reivindicações.

[0067] Após o fechamento da tampa superior 2, o sensor 3 de fechamento de tampa desbloqueia o funcionamento do dispositivo que poderá prosseguir com o teste. Caso a tampa não esteja devidamente fechada, pode ser emitido um sinal/alerta de erro para que o usuário corrija o problema

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) (feche a tampa apropriadamente). Esse sinal pode ser um sinal visual no próprio dispositivo, ou uma mensagem (visual e/ou sonora e/ou por vibração do dispositivo de usuário) pode ser enviada para o dispositivo de usuário informando o usuário do problema identificado.

[0068] A partir deste momento, a interação do usuário com o dispositivo LAMP se dá por meio do dispositivo de usuário que está em comunicação com a placa de controle com processamento central (14). Então o usuário seleciona a reação de diagnóstico a ser realizada (Dengue, Zika, Chikungunya, Febre Amarela, Covid-19, etc) por meio de um aplicativo no dispositivo de usuário, o que iniciará um processo que contém as etapas de: acionar o pelo menos um elemento aquecedor 10 para elevar a temperatura do termobloco 8 até uma temperatura predefinida para a reação de diagnóstico definida; manter a temperatura do termobloco 8 na temperatura pré- definida por um período de tempo pré-definido para a reação de diagnóstico definida, e desligar o elemento aquecedor 10; ligar a pluralidade de LEDs RGB 12 para excitação de cada microtubo (amostra) posicionado no termobloco 8; capturar valores com imagem da câmera 11 para cada posição de cada microtubo e para cada uma das cores de excitação, e enviar essas informações para o dispositivo de usuário; processar as informações recebidas pelo dispositivo de usuário, o que envolve converter as informações das imagens de RGB para crominância e verificar em qual das regiões, do plano 2D, cada valor se encontra; definir um diagnóstico de positivo ou negativo para cada microtubo (amostra) a partir do processamento das informações; realizar leituras em tempo real utilizando sondas deslocáveis na construção de uma curva fluorescência vs tempo (opcional);

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) exibir o resultado de diagnóstico de cada microtubo através do dispositivo de usuário; armazenar o resultado de diagnóstico de cada microtubo em um banco de dados local (opcional); e enviar o resultado de diagnóstico de cada microtubo em um banco de dados na nuvem (opcional).

[0069] Mais especificamente, a etapa de capturar valores com imagem da câmera 11 para cada microtubo, e para cada uma das cores de excitação, pode incluir ainda utilizar os fluoróforos verde, vermelho e laranja, por exemplo.

[0070] Ao fim do processo, é possível ainda que seja adotada uma etapa de acionar um dispositivo de resfriamento (opcionalmente uma ventoinha) para resfriar a câmara de ensaios 1 do dispositivo LAMP.

[0071] A partir do descrito até aqui, e em vista dos recentes desdobramentos relacionados à pandemia de COVID-19 que o planeta enfrenta, foram realizados experimentos em que o dispositivo LAMP da invenção foi testado para verificar sua aplicabilidade em realizar testes para a identificação de contaminados pelo COVID-19.

[0072] Nesse sentido, foi proposta a utilização da técnica de amplificação isotérmica de DNA/RNA (LAMP - Loop Mediated Isothermal Amplification') para detecção molecular rápida de ácidos nucleicos em amostras biológicas.

[0073] A técnica LAMP é caracterizada pelas suas altas especificidade e sensibilidade que geram ácidos nucleicos amplificados em um curto intervalo de tempo usando uma polimerase de DNA com atividade de deslocamento de cadeia (Notomi et al., Nucl. Acids. Res. 28:E63, 2000). A LAMP também pode ser usada para amplificação de moléculas de RNA alvo pela adição de transcriptase reversa (RT) em uma reação de uma única etapa utilizando temperatura constante, sendo denominada de RT-LAMP. A

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) referida metodologia é utilizada para diagnóstico de patógenos a partir de amostras biológicas. De forma exemplificada, estes patógenos podem ser Zika, Dengue, Chikungunya, Febre amarela e SARS.CoV-2, dentre outros.

[0074] Em uma concretização, a referida técnica pode ser utilizada para detecção molecular do RNA de SARS-CoV-2 em amostras biológicas, preferencialmente de swab oro e nasofaríngeo e saliva, escarro, lavado broncoalveolar, etc.

[0075] Neste sentido, as amostras biológicas a que se refere a presente invenção são os swabs oro e nasofaríngeo, saliva, lavado broncoalveolar, dentre outros que contêm ácidos nucleicos, os quais podem ser isolados a partir do grupo compreendendo, mas não limitado a: células, tecidos, sangue, soro, plasma, saliva, urina, líquido cefalorraquidiano, aspirados nasofaríngeos, líquidos do ouvido médio, lavagem broncoalveolar, aspirados traqueais, escarro, vômito, swab vestibular, swab vaginal, swab retal e fezes. As amostras podem ser usadas diretamente na reação de amplificação. Em outra concretização, as amostras são primeiro tratadas com tampão de lise ou tratadas termicamente, anteriormente à sua adição ao meio de reação. As metodologias de isolamento/extração dos ácidos nucleicos a partir das amostras são amplamente conhecidas por qualquer técnico no assunto.

[0076] A técnica de amplificação isotérmica de DNA/RNA (LAMP- Loop mediated isothermal amplification) emprega um conjunto de pelo menos 4 quatro iniciadores (2 pares, um par interno e um par externo) que se ligam a seis regiões distintas dentro da molécula alvo. Os iniciadores internos (“FTP” - Forward inner primer, e “BIP” - Backward Inner Primer) apresentam duas regiões distintas de anelamento: a região F2, no caso de FIP, e B2, no caso de BIP, estão localizadas na porção 3’ dos iniciadores e se pareiam diretamente na molécula alvo; a região Flc e Blc são sequências complementares e invertidas à uma região interna da fita da molécula alvo que será polimerizada pelas regiões F2 e B2, respectivamente. Os iniciadores

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) externos, F3 e B3, se pareiam externamente aos iniciadores internos, de modo que a sua função é servir de ponto de ancoragem para que a DNA polimerase possa promover a invasão da fita formada na polimerização iniciada pela região F2/B2. Em algumas concretizações, mais dois iniciadores (2 pares) que se ligam ao “loop” (alça) podem ser usados (LoopF ou LF- Forward loop primer, e LoopB ou LB - Backward loop primer), totalizando, assim, 6 iniciadores e 8 regiões de ligação.

[0077] Para fins desta invenção, “iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo enzimaticamente extensível, que compreende uma sequência definida que é desenhada para hibridizar de maneira antiparalela com uma porção complementar de uma sequência de ácido nucleico alvo. Portanto, o iniciador é geralmente provido em excesso molar em relação com sua sequência de ácido nucleico alvo. Um iniciador não necessita ser 100% complementar como seu alvo para que a elongação ocorra; iniciadores com menos do que 100% de complementariedade podem ser suficientes para que a hibridização e elongação enzimática ocorram. Um iniciador é preferencialmente, mas não necessariamente, sintético, e tem, geralmente, cerca de 10 a cerca de 100 nucleotídeos de comprimento. Além disto, para fins desta invenção, incluem-se sequências com pelo menos cerca de 85%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os iniciadores aqui descritos, como medido por algoritmos bem conhecidos de avalição de identidade de sequência, como FASTA, BLAST ou Gap.

[0078] Diferente da técnica PCR, na técnica de LAMP não é necessária a utilização do termociclador e a reação ocorre, preferencialmente, em uma temperatura constante, preferencialmente a temperatura é entre 60- 70°C, e ainda mais preferencialmente, de 60-65 °C O tempo de reação pode variar entre 10 a 120 minutos, mais preferencialmente, entre 15 e 90 minutos, ainda mais preferencialmente, entre 20 e 60 minutos.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [0079] A DNA polimerase usada é selecionada do grupo que consiste de DNA polimerase Bst, DNA polimerase Bsm, DNA polimerase Gsl e DNA polimerase SD e combinações dos mesmos. Em particular, a enzima DNA polimerase é DNA polimerase Bst.

[0080] A transcriptase reversa (RT) usada na reação de RT-LAMP pode ser qualquer enzima RT apropriada para o ensaio, que pode ser selecionada pelo técnico no assunto. Em algumas concretizações, a enzima RT é de vírus de mieloblastose aviária (AMV) ou vírus de leucemia murina Moloney (MMLV).

[0081] Vale pontuar que o dispositivo LAMP da invenção atende a critérios point-of-care (POC) e pode ser útil para a descentralização e democratização do diagnóstico molecular de COVID-19.

[0082] Ainda, a utilização de insumos para diagnóstico molecular da COVID-19, diferentemente daqueles utilizados para a técnica de RT-PCR, tira de foco uma disputa internacional e favorece a diversificação na busca por soluções alternativas, dando chance do teste chegar a quem mais precisa, o paciente ou profissional de saúde suspeitos de contaminação.

[0083] Para fins de detecção, as sondas e iniciadores podem incluir um rótulo detectável, como um radiomarcador, corante fluorescente, biotina, enzima ou composto quimioluminescente, em que o rótulo pode ser fornecido antes, durante ou após a hibridização da sonda ou iniciador com a sequência alvo ou seu complemento.

[0084] Para fins desta invenção, o termo “sonda” é uma molécula de ácido nucleico que apresenta, ligado a si, um rótulo detectável ou molécula repórter. O tamanho da sonda é de, por exemplo, pelo menos, 10 nucleotídeos ou mais em comprimento, como 10-60, 15-50, 20-40, 20-50, 25-50, 30-60 nucleotídeos. Os rótulos detectáveis ou molécula repórter podem compreender rótulos fluorescentes e fluorogênicas (por exemplo, fluoróforos), porções cromogênicas, haptenos (como biotina, digoxigenina e fluoresceína),

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) etiquetas de afinidade e isótopos radioativos (como 32P, 33P, 35S e 1251). O rótulo pode ser diretamente detectável (por exemplo, detectável opticamente) ou indiretamente detectável (por exemplo, através da interação com uma ou mais moléculas adicionais que, por sua vez, são detectáveis).Para essa aplicação, poderá ser utilizada a técnica de sondas deslocáveis, em que o primer LF é funcionalizado com rótulos fluorescentes (fluoróforo), cujo output é específico ao alvo selecionado com maior sensibilidade do que a RT- PCR. O resultado desse teste pode ser comprovado também pela migração do produto da reação, ilustrado na figura 5 que mostra a imagem de seis microtubos de reação utilizando sonda deslocável específica de mudança de cor por diferença de pH onde os dois tubos à direita da imagem possuem coloração diferentes e que tais diferenças podem ser detectadas pelo processamento de imagem do dispositivo.

[0085] Em uma concretização preferencial da presente invenção, os rótulos incluem uma porção fluorescente e uma porção extintora (quencher).

[0086] A fração fluorescente emite energia luminosa, em um comprimento de onda de emissão específico quando excitada pela energia luminosa em um comprimento de onda de excitação apropriado. Quando a porção fluorescente e a porção extintora (quencher) são mantidas muito próximas, a energia luminosa emitida pela porção fluorescente é absorvida pela porção extintora. Mas quando uma sonda hibridiza com o ácido nucleico presente na amostra, as porções fluorescentes e extintoras são separadas umas das outras pela ação da DNA polimerase Bst e a energia luminosa emitida pela porção fluorescente pode ser detectada. Porções fluorescentes que são excitadas e emitem em comprimentos de onda diferentes e distinguíveis podem ser combinadas com diferentes sondas. As diferentes sondas podem ser adicionadas a uma amostra, e a presença e a quantidade de ácidos nucleicos alvo associados a cada sonda podem ser determinadas expondo alternadamente a amostra à energia luminosa em diferentes comprimentos de

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) onda de excitação e medindo a emissão de luz da amostra nos diferentes comprimentos de onda correspondente às diferentes porções fluorescentes.

[0087] Os fluoróforos que podem ser utilizados nas sondas e iniciadores aqui divulgados pode ser selecionados do grupo compreendendo: acridina e isotiocianato de acridina, 4-amino-N [3-vinil-sulfonil) fenil] naftalimida-3,5 dissulfonato ( Lúcifer Amarelo VS); Amarelo brilhante; cumarina e derivados tais como 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilcouluarina (Coumaran 151); cianina; 4', 6- diaminidino-2-fenilindole (D API); etidium; -fluoresceína e derivados como 5- carboxifluoresceína (FAM), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), fluoresceína, 6-carboxi-fluoresceína (HEX) e TET ( tetrametil fluoresceína); Vermelho de fenol; rodamina e derivados como 6-carboxi-X- rodamina (ROX), rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, N, N, N ’, N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); sulforodamina B; sulforodamina 101 e derivado de cloreto de sulfonil da sulforodamina 101 (Texas Red); LightCycler Red 640; Cy5.5; e Cy56- carboxifluoresceína; outros fluoróforos incluem Cy3; Cy5, VIC (da Applied Biosystems); LC Red 640; LC Red 705; e Quasar® 570, Quasar® 670, CalRed 590, CalRed 610, CalRed 615, CalRed 635, CalGreen 520, CalGold 540 e CalOrange 560 (Biosearch Technologies, Novato, Califórnia).

[0088] A presente invenção também inclui kits de diagnóstico. Como aqui descrito, o kit diagnóstico da invenção é baseado em ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para amplificar uma região alvo dentro de um patógeno alvo, compreendendo, mas não limitado a Zika, Dengue, Chikungunya, Febre amarela e SARS-CoV, em uma amostra, em que o kit compreende:

(1) uma mistura de iniciadores desenhados para amplificar uma sequência de patógenos por ensaio de amplificação isotérmica mediada por loop, produzindo assim, pelo menos um produto de reação.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) [0089] Em uma forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 1-6, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0090] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 7-12, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0091] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 13-18, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0092] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 19-24, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0093] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 25-30, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0094] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 31-36, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0095] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 37-42, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0096] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) nas SEQ ID NOS: 43-48, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0097] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 49-54, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0098] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 55-60, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[0099] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 61-66, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[00100] Em outra forma exemplar, os iniciadores são aqueles descritos nas SEQ ID NOS: 67-72, ou sequências com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com os mesmos.

[00101] Os conjuntos de iniciadores são providos em um ou mais recipientes, microtubos, placas com múltiplos poços ou cartão. Os iniciadores podem ser providos suspensos em uma solução aquosa ou como um pó liofilizado, por exemplo.

[00102] Em uma outra forma de concretização, o kit pode ainda compreender, em adição ao (1) acima:

(2) uma sonda de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo de pelo menos 10 nucleotídeos em comprimento que seja suficientemente complementar com a região amplificada, de tal forma que a sonda de ácido nucleico e o produto de amplificação sejam hibridizáveis, em

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) que a sonda é conjugada com um rótulo detectável ou molécula repórter.

[00103] De uma forma preferencial, a sonda compreende o iniciador LF (ou LB), ou uma sequência com pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% com o mesmo, funcionalizado com um rótulo detectável ou molécula repórter.

[00104] Em ainda outra forma de concretização, o kit pode ainda compreender, em adição ao (1) acima:

(2’) inclui um corante indicador sensível ao pH.

[00105] Em algumas concretizações, o kit ainda inclui um ou mais componentes para a realização da reação de LAMP ou RT-LAMP, por exemplo, tampão, DNA polimerase, transcriptase reversa, dNTPs, ou qualquer combinação dos mesmos.

[00106] Um ou mais iniciadores ou ácidos nucleicos usados como controle positivo e/ou negativo podem fazer parte do kit. Exemplos de controles negativos incluem quaisquer ácidos nucleicos de patógenos diferentes daqueles que são detectados pelo kit (por exemplo, ácido nucleico não-SARS-Cov-2 para um kit para detecção de SARS-Cov-2, um ácido nucleico não-zika para um kit para detecção de zika vírus, e assim por diante). [00107] Os seguintes exemplos são providos para ilustrar concretizações particulares. Estes exemplos não devem ser entendidos como limitantes da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1 : Iniciadores exemplares da invenção

[00108] Como alvo para detecção do ácido nucleico nas amostras biológicas, a presente invenção revela, de forma ilustrativa, os iniciadores das tabelas 1 a 10.

Tabela 1 - Iniciadores Zika

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)

Tabela 2 - Iniciadores Dengue

Tabela 3 - Iniciadores Chikungunya

Tabela 4 - Iniciadores Febre Amarela

Tabela 5 - Iniciadores gene N SARS-CoV2

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) Tabela 6 - Iniciadores gene E SARS-CoV2

Tabela 7 - Iniciadores gene RdRp de SARS-CoV2

Tabela 8 - Iniciadores gene N2 de SARS-CoV2

Tabela 9 - Iniciadores gene El de SARS-CoV2

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)

Exemplo 2: Diagnóstico de COVID-19

[00109] Em um exemplo de concretização, a metodologia revelada pela presente invenção utiliza como alvo para detecção do RNA de SARS.CoV-2 duas regiões do gene N que codifica para a nucleoproteína, como ilustrado na figura 6. Esse alvo se mostrou específico e não reage com o RNA de outros vírus como ficou claro em testes realizados (figura 7).

[00110] No entanto, também é antecipada a utilização de outros alvos para detecção do RNA de SARS-Cov-2, como o gene que codifica para as proteínas E, N2, e parte da ORFlab (NSP3, RdRp, Asle).

[00111] A metodologia LAMP com RNA virai é realizada por meio de reações de amplificação utilizando a enzima Bst 3.0 DNA Polimerase (New England Biolabs) ou ainda com uma mistura contendo Bst 2.0 DNA Polimerase WarmStart e RTx (New England Biolabs; em uma reação de 25 pL de volume final, contendo os iniciadores FIP, BIP, F3, B3 e os loops (LF/LB); dNTPs (1.4 mM de cada); tampão Tris-HCl (20 mM); KC1 (50 mM); (NH4)SO4 (10 mM); MgSO4 (8 mM); Tween 20 (0.1%); DTT (1 mM); com RNA viral. As reações são otimizadas com, no máximo 0, 1 ng de RNA virai por reação. A mistura é incubada a 65 °C/30-50 min.

[00112] E importante salientar que a reação de amplificação LAMP se dá ao mesmo tempo que há transcrição reversa (RT-LAMP one step) utilizando a DNA polimerase Bst 3.0 que também tem o RNA como molde ou na presença de RTx e Bst 2.0 WarmSmart (New England Biolabs).

[00113] Como indicado anteriormente neste relatório, foi desenvolvido um aplicativo WEB responsivo com acesso em qualquer dispositivo de

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) usuário com qualquer tamanho de tela disponível, como computador, tablet e smartphone, para monitoramento remoto do dispositivo LAMP da invenção. Neste teste específico, a aplicação utiliza a linguagem de programação JavaScript, com o ReactJS para o frontend e o NodeJS para o backend. Possui banco de dados relacional Postgresql para guardar todas as informações, além do banco de dados não relacional como o MongoDB ou Redis para consultas rápidas e processamento de relatórios gerenciais.

[00114] As informações são trafegadas criptografadas para o servidor na AWS com sistema de containers docker no Linux, permitindo distribuir a carga de múltiplos acessos. Além disso, todos os serviços prestados através da Telemedicina possuem a infraestrutura tecnológica apropriada, pertinentes e obedecem às normas de segurança relativas ao armazenamento, manuseio, transmissão de dados, confidencialidade, privacidade e garantia do sigilo profissional, de acordo com a legislação brasileira, Resolução CFM No 1.643/2002.

[00115] O dispositivo LAMP da presente invenção trata-se de dispositivo computacional dedicado microprocessado. O sistema é compatível com 10 microtubos 81 de 0,2 mL. O aquecimento necessário para a amplificação isotérmica (cerca de 65 °C) é atingido e estabilizado pelo acionamento de fios resistores de cerâmica. A tampa será aquecida de forma independente até cerca de 75 °C, controlada por algoritmo PID (Proporcional- Integrativo-Derivativo). A faixa de temperatura de trabalho do bloco será de 25°C a 70°C. O controle de temperatura será garantido pela utilização de termistores e algoritmo PID. A fonte de alimentação é bivolt 100/240 V; frequência: 50-60 Hz; consumo: 70 W. O sistema é operado via microcontrole por Arduino UNO R3 (ATmega328) que se comunica com o smartphone por um módulo de baixa energia HM 11 de Bluetooth. Uma das saídas digitais do Arduino alimenta 5 V de input utilizando MOSFET. Um sensor de temperatura monitora o aquecimento e envia um sinal à placa de controle com

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) processamento central. A leitura analógica é convertida em temperatura que será continuamente monitorada para operar o aquecimento de maneira isotérmica lançando mão da modulação por largura de pulso.

[00116] Amostras coletadas por swabs nasal e de garganta de pacientes com suspeita de COVID-19 são coletadas e diluídas em 2 mL de meio de cultura DMEM e 3 pL utilizados para realização da reação de amplificação isotérmica no dispositivo.

[00117] Para a reação de RT-LAMP em placas de 96 poços, são utilizados 12,5 pL do reagente “WarmSmart Colorimetric Lamp 2X Master mix” (New England Biolabs, Ml 800) na presença de água ultra pura tratada com DEPC, e dos primers específicos para SARS-CoV-2. São utilizados 3 pL de amostra contendo RNA. São utilizados controles na ausência de RNA (negativos) e controles internos da reação. A placa é incubada a 65 °C por 30 min. Altemativamente, o mesmo processo é repetido na presença de um intercalante de DNA, SYTO-9, para avaliar o perfil quantitativo utilizando termociclador de PCR em tempo real. A sensibilidade e especificidade das reações de LAMP são comparadas com a RT-PCR.

[00118] A Organização Mundial da Saúde - OMS recomendou a realização de testes em larga escala para cada caso suspeito de COVID-19 e o isolamento imediato para os casos em que os testes resultarem positivos. Tais ações são as principais armas na luta contra a disseminação do vírus, uma vez que possibilitam a quebra da cadeia de transmissão. Assim sendo, têm importância estratégica a melhoria, a ampliação e a celeridade diagnóstica na COVID.

[00119] Em relação à assistência hospitalar, quanto mais testes forem realizados nos pacientes suspeitos internados, mais ágil se tomará a prestação de serviços, com redução na taxa de ocupação e maior disponibilização de leitos, medicamentos e respiradores para a população, com impacto direto na redução dos custos e uma eficientização econômica e social. Pacientes com

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26) testes negativos não precisarão ficar em isolamento e terão outra condução na terapêutica, sem risco de exposição frente aos verdadeiramente infectados.

[00120] O esclarecimento diagnóstico também permite um melhor dimensionamento da pandemia, visto que atualmente os testes estão sendo disponibilizados somente para casos graves, gerando um subdimensionamento de dados de casos totais de infecção, e por outro lado um superdimensionamento da taxa de letalidade, com consequente viés não desejável no perfil epidemiológico. A apuração dos dados epidemiológicos permite um melhor conhecimento do comportamento do vírus na realidade local, subsidiando políticas em Saúde Coletiva.

[00121] Além disso, a ampliação na capacidade diagnóstica possibilita a otimização de processos de trabalho relativos à saúde dos profissionais de todo país. Médicos e enfermeiros, diretamente envolvidos na assistência a pacientes suspeitos, podem ter mais segurança na condução dos casos mediante o esclarecimento diagnóstico. A perspectiva de realização do teste nos próprios profissionais de saúde aponta para uma redução significativa de absenteísmo, podendo minimizar desfalques nas equipes de trabalho nos hospitais, com consequente aumento na carga de trabalho dos que atuam na linha de frente nos casos negativos para o vírus.

[00122] A presente invenção apresenta grande impacto positivo no combate/controle da pandemia de coronavirus global enfrentada pela humanidade nos tempos atuais.

[00123] Ressalta-se que inúmeras variações incidindo no escopo de proteção do presente pedido são permitidas. Dessa forma, reforça-se o fato de que a presente invenção não está limitada às configurações/concretizações particulares acima descritas.

FOLHAS DE SUBSTITUIÇÃO (REGRA 26)