Les marqueurs radioactifs ont été largement utilisés dans le domaine de l'imagerie médicale et de l'immunologie.

En raison des inconvénients qu'ils présentent, ils ont été remplacés en grande partie par des marqueurs fluorescents.

Cependant l'utilisation des marqueurs fluorescents pré- sente quelques inconvénients, notamment dus à l'auto-fluo- rescence des milieux biologiques étudiés et à la diffusion de lumière dans les appareillages. Les complexes d'ions lan- thanides ont été proposés pour permettre une acquisition en temps résolu qui supprime ces inconvénients. Pour être uti- lisé comme marqueur luminescent en temps résolu, un complexe d'ion lanthanide doit présenter de nombreuses caractéristi- ques, parmi lesquelles les plus importantes sont l'hydrophi- licité, la stabilité dans l'eau, la présence de chromophores capables de générer l'effet d'antenne (Sabbatini, N. et al.

Coord. Chem. Rev. 1990,123, 201), de bonnes propriétés photo-physiques (absorption élevée, excitation dans une gam- me énergétique facilement accessible, temps de vie de l'état excité élevé et rendement quantique de luminescence élevé) et une fonction réactive qui permet un greffage covalent.

Les composés actuellement proposés possèdent rarement la totalité de ces critères. Par exemple, les premiers com- plexes développés par la firme Wallac Oy sous l'appellation Delfia Chelate (Hemmilâ, I. et al. Anal. Biochem. 1984,137, 335) ne possèdent pas de bonnes propriétés photo-physiques et il est nécessaire de procéder à une étape d'extraction du lanthanide pour mesurer sa luminescence. Les composés développés par CIS Bio international sont des cryptates qui nécessitent l'utilisation d'anions fluorures pour augmenter la luminescence (Hemmilâ, I. et al. Drug Discovery Today, 1997,2, 373). La stabilité des composés pose également de

graves problèmes. Ainsi les composés développés par CyberFluor sous le nom de BCPDA ne forment des complexes stables luminescents qu'à fortes concentrations (Marriott, G. et al., Biophysical Journal, 1994,67, 957).

Des complexes de lanthanide, notamment de gadolinium, ont été utilisés comme agents de relaxation ou de contraste pour l'imagerie médicale par RMN (Caravan, P. et al. Chem.

Rev. 1999,99, 2293). Cette utilisation est permise par le fait que la première sphère de coordination du lanthanide n'est pas complètement saturée par le ligand en solution aqueuse, des molécules d'eau pouvant alors compléter la sphère de coordination.

Le but de la présente invention est de proposer des complexes de lanthanide qui présentent des propriétés améliorées par rapport aux complexes de lanthanide de l'art antérieur. C'est pourquoi l'invention a pour objet de nouveaux composés, leur utilisation pour la préparation de complexes avec des ions lanthanides, ainsi que l'utilisation des complexes obtenus comme marqueurs fluorescents, comme agents de relaxation pour la RMN, ou pour l'imagerie RMN.

Un composé selon la présente invention répond à la formule (I) dans laquelle -R1 est un groupe fonctionnel capable de réagir avec les fonctions présentes sur les protéines, les anti- corps ou sur des matériaux minéraux ou organiques ; - X représente une simple liaison ou une chaîne hydrocarbonée constituée par au moins un groupe choisi parmi les groupes alkylènes et les groupes alkénylènes qui com- prennent éventuellement au moins un hétéroatome, et parmi les groupes arylènes ;-R2 est un groupement anionique à pH

neutre A2 ou un groupe alkylène ou alkénylène ayant de 1 à 4 atomes de carbone et portant au moins un tel groupement A2, ledit groupe alkylène ou alkénylène comprenant éventuelle- ment au moins un hétéroatome dans la chaîne ; -R3 représente H ou un groupe alkylène ou alkénylène ayant de 1 à 5 atomes de carbone et contenant éventuellement au moins un hétéroatome dans la chaîne, ledit groupe portant éventuellement au moins un groupement anionique à pH neutre A3 ; -R4 est un groupement répondant à la formule -(C) n-C-Z1-C-C-Z2-C-A4 dans laquelle n est égal à 1 ou 2, Zu et Z2 représentent indépendamment l'un de l'autre un hétéro- atome choisi parmi O et N, l'un au moins étant un atome d'azote qui fait partie d'un hétérocycle aromatique avec les deux atomes de carbone qui l'entourent, et A4 est un groupe qui est anionique à pH neutre dans lequel l'atome portant la charge anionique est en position y par rapport à Z2 ; R 5 est est un groupement choisi parmi les groupe- ments définis pour R4 ou parmi les chaînes hydrocarbonées -C-C-E1-C-C-E2-C-A5 dans lesquelles E1 et E2 représentent indépendamment l'un de l'autre un hétéroatome choisi parmi O et N, et A5 est un groupe qui est anionique à pH neutre dans lequel l'atome portant la charge anionique est en position y par rapport à E2.

L'hétéroatome des substituants X, R2 et R3 peut être notamment O ou N.

Le substituant R1 peut être choisi par exemple parmi les groupes amino, thio, cyano, isocyano, acridinyle, hydrazino, halogénoacétate, anhydride, triazo, carbonyle, nitroben- zoyle, sulfonyle, thionyle, halogénure, époxyde, aldéhyde, imidazole, hydroxyphényle, mercapto, ester N-succinimique, ester N-sulfosuccinimique, maléimido, hydroxyle, carboxyle, thiocyano, et isothiocyano. Les groupes amino, thio, carboxyle, maléimido, ester N-succinimidique, ester N- sulfosuccinimidique et isothiocyano sont préférés.

Lorsque le groupement X est un groupement alkylène ou alkénylène, il a de préférence de 1 à 10 atomes de carbone.

Lorsque X est un groupement arylène, il a de préférence de 5 à 10 atomes de carbone. Par groupe arylène, on entend dans le présent texte, un groupe comprenant un noyau aromatique unique ou plusieurs noyaux aromatiques condensés ou non, le (s) dit (s) noyau (x) portant éventuellement un ou plusieurs groupements hydrocarbonés aliphatiques. A titre d'exemple de groupes arylènes, on peut citer les groupes-C6H4-, -CH2-C6H4-CH2-,-C6H4-CH2-,-C6H4-CH2-C6H4-,-C6H3 (CH3)-. X est avantageusement choisi parmi une liaison simple ou un groupement alkylène ou alkénylène ayant 2 ou 3 atomes de carbone.

Le substituant R2 est de préférence un groupe A2.

Le substituant R3 est de préférence H ou un alkyle en C à C3.

Dans les composés de la présente invention, chacun des substituants R4 et R5 est un substituant monovalent. Les substituants R4 et R5 ne forment pas ensemble un groupe divalent.

Le substituant R4 est un substituant qui a des proprié- tés d'absorption de lumière et qui permet de former trois cycles chélates avec un lanthanide. Les substituants R4 dans lesquels n est égal à 1 sont préférés. Comme exemple de sub- stituant R4 dans lequel l'un seul parmi Zl et Z2 est un ato- me d'azote qui fait partie d'un hétérocycle aromatique, on peut citer les substituants dans lesquels l'un des segments -C-Zi-C-fait partie d'un groupe hétérocyclique choisi parmi les groupes pyridyle, pyrimidinyle, quinolyle et isoquino- lyle. Les substituants R4 dans lesquels Z1 et Z2 font partie d'un groupe hétérocyclique aromatique sont particulièrement intéressants. Comme exemple d'un tel substituant, on peut citer les substituants dans lesquels chacun des segments -C-Z1-C-et-C-Z2-C-fait partie d'un groupe hétérocyclique choisi parmi les groupes pyridyle, pyrimidinyle, quinolyle et iso-quinolyle, les deux groupes hétérocycliques étant reliés au moins par les deux atomes de carbone séparant Z1 et Z2. Comme exemples de tels segments-C-Z1-C-C-z2-C-, on peut citer les groupes 2, 2'-bipyridinyle, 1, 10-phénanthro-

linyle, 2, 2'-bisquinolyle, 2, 2'-bisisoquinolyle et 2, 2'- bipyrimidinyle, lesdits groupes pouvant porter des substituants alkyle ou alkoxy sur au moins un atome de carbone d'un hétérocycle, de préférence un groupe alkyle ou alcoxy ayant de 1 à 5 atomes de carbone. A titre d'exemples, les formules ci-dessous représentent respectivement un groupe 2, 2'-bipyridyle portant un carboxyle, un monoalkyl- phosphonate, un monoarylphosphonate et un phosphonyle, ou un groupe phénanthrolinyle portant un groupe carboxyle. zozo - T O c HO H OR R = Alkyle, Aryle g HO/ - 1 N -pu HO Le substituant R5 est un substituant qui permet de former trois cycles chélates avec un lanthanide. Parmi les substituants Rs constitués par une chaîne hydrocarbonée -C-C-E1-C-C-E2-C-A5, on peut citer les groupements suivants :

dans lesquels R6 et R7 représentent des chaînes alkyles ayant de préférence de 1 à 5 atomes de carbone et contenant éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes. Les composés dans lesquels R4 et R5 sont identiques sont particulièrement préférés.

Telle qu'utilisée ici, l'expression"groupe qui est anionique à pH neutre"signifie un groupe fonctionnel qui, à pH neutre, se trouve sous forme anionique, c'est-à-dire porteur d'une charge négative. Dans un composé de l'invention, les groupes anioniques à pH neutre A2, A3, A4 Ou A5 peuvent être choisis indépendamment les uns des autres parmi les groupes-CO2H,-S03H,-P (O) (OR) OH,-P (O) R (OH) et -P (O) (OH) 2 dans lesquels R est un groupe alkyle (de préférence en Cl à C3) ou un groupe aryle (de préférence en Cs à Cg). Suivant le pH du milieu réactionnel, les composés (I) sont obtenus sous forme cationique, zwitterionique ou anionique. En milieu acide, l'azote porteur des substituants R4 et R5, ainsi qu'éventuellement les hétéroatomes Z1, Z2, E1 et E2 se trouvent sous forme protonée et le composé est sous forme cationique. En milieu basique, les différents groupes Ai se présentent sous forme de sels et le composé est sous forme anionique. A des pH intermédiaires, de l'ordre de 6 à 8, le composé s. e présente sous forme zwitterionique.

Un complexe selon la présente invention est constitué par un ion lanthanide Ln complexé par un ligand qui répond à la formule (I) ci-dessus. L'ion lanthanide est choisi parmi les ions europium, terbium, samarium, dysprosium, erbium, ytterbium, néodyme et gadolinium. On utilisera de préférence l'europium, le terbium, le samarium ou le dysprosium si le complexe est destiné à être utilisé pour le marquage par fluorescence, et l'europium, le dysprosium ou le gadolinium lorsque le complexe est destiné à être utilisé comme agent de contraste pour l'IRMN.

Dans un complexe selon l'invention dans lequel R4 est -C-C-Z1-C-C-Z2-C-A4, les 3 cycles chélates se forment entre le cation lanthanide et respectivement :

- l'atome N portant R4 et R5, Z1 et les atomes de carbone qui les séparent - Zl, Z2 et les deux atomes de carbone qui les séparent - le segment terminal Zz-C-A4.

Lorsque R5 est du même type que R4, il forme avec l'ion lanthanide des chélates du même type que ceux formés par R4.

Lorsque R5 est du type -C-C-E1-C-C-E2-C-A5, 3 cycles chélates à 5 membres se forment entre le cation lanthanide et respectivement : - l'atome N portant R4 et R5, E1 et les deux atomes de carbone qui les séparent - E1, E2 et les deux atomes de carbone qui les séparent - le segment terminal E2-C-A5.

Un composé (I) peut être obtenu par des procédés bien connus de l'homme de métier à partir de produits commerciaux ou décrits dans la littérature par le schéma suivant : dans lequel X, Ru, R2, R3, R4 et R5 ont la signification donnée précédemment, et R1,, R2,, R3', R4'et R5'représentent des groupements précurseurs de R, R2, R3, R4 et R5 respectivement.

Au cours des deux premières étapes, on introduit successivement les groupements R4'et R5'sur une molécule IA contenant X et les groupes R1,, R2, et R3, pour obtenir le composés IC.

Au cours d'étapes ultérieures, on transforme les groupes R1,, R2,, R3,, R4, et R5, du composé IC respectivement en groupes Ru, R2, R3, R4 et R5.

Lorsque les groupements R4, et R5, sont identiques en vue d'obtenir des groupements R4 et R5 identiques, ils sont introduits simultanément au cours de la première étape.

Lorsqu'ils sont différents, ils sont introduits dans un

ordre indifférent par réaction de la molécule IA successivement avec deux réactifs différents.

Lorsque le composé (I) est un composé dans lequel les groupements R1 et R2 sont des fonctions carboxyles, le groupement R3 est un atome d'hydrogène et le groupement X est une simple liaison, un groupe méthylène ou un groupe éthylène, on choisira avantageusement comme produit de départ IA respectivement le diester éthylique de l'acide aminomalonique, le diester méthylique de l'acide aspartique et le diester méthylique de l'acide glutamique, qui sont des produits disponibles dans le commerce.

Lorsque le composé (I) est un composé dans lequel : - les groupements R1 et R2 sont des fonctions carboxyles, - le groupement R3 est un atome d'hydrogène et - le groupement X est un propylène ou un benzène parasubstitué, on peut utiliser comme produit de départ IA respectivement le diester méthylique de l'acide 2-amino-adipique (dont la préparation est décrite par Lerch, E. et al, Helv. Chim.

Acta, 1974,57, 1584) et l'ester méthylique de l'acide (a- amino-4-methoxycarbonyl) benzène acétique (dont la prépara- tion est décrite par Chauvel, E. et al, J. Med. Chem. 1994, 37,1339).

Lorsque les groupements R4 et R5 sont identiques et leurs segments-C-C-Z1-C-C-Z2-C-sont dérivés de la 2, 2'- bipyridine, on fait réagir le produit de départ au cours de la première étape, avec la 6-bromométhyl-6'-bromo-2, 2'- bipyridine pour obtenir un composé dibromé IC. La 6- bromométhyl-6'-bromo-2, 2'-bipyridine peut être obtenue par une réaction de bromation radicalaire de la 6-méthyl-6'- bromo-2, 2'-bipyridine par la N-bromo-succinimide dans le benzène, la 6-méthyl-6'-bromo-2, 2'-bipyridine étant obtenue selon la méthode décrite par Houghton M. et al, J. Chem.

Soc., Dalton Trans. 1997,2725. Le schéma réactionnel de la première étape de ce cas particulier est donné ci-après.

Lorsque le composé dibromé IC est soumis à une carbo- alkoxylation, suivie d'une saponification avec NaOH et d'une acidification avec HCl, on obtient un composé (I) dans lequel les groupements A4 et As sont des groupes carboxyles.

La carboalkoxylation peut être effectuée suivant le procédé décrit par El-Ghayoury et al, J. Org. Chem., 2000,65, 7757.

Lorsqu'on fait réagir le composé dibromé IC avec le dialkylphosphite (selon la méthode décrite par Penicaud et al, Tetrahedron Lett. 1998,39, 3689), on obtient le dialkylester de l'acide phosphonique, chaque atome de brome étant remplacé par un groupe P (O) (OR) 2. Le dialkylester de l'acide phosphonique donne, par une saponification avec NaOH dans l'eau, suivie d'une acidification avec HCl, un composé (I) dans lequel les groupements A4 et As sont des groupements P (O) (OH) OR.

Par réaction du dialkylester de l'acide phosphonique P (O) (OR) 2 avec le bromure de triméthylsilyle suivie d'une hydrolyse (selon la méthode décrite par McKenna C. et al., Tetrahedron Lett, 1977,18, 155), on obtient un composé (I) dans lequel les deux groupes anioniques A4 et As sont des groupements P (O) (OH) 2. Le même résultat peut être obtenu par une hydrolyse acide par HC1 du dialkylester de l'acide phosphonique P (O) (OR) 2- Le schéma réactionnel des trois modes de mise en oeuvre ci-dessus est donné ci-après.

Lorsque les groupements R4 et R5 sont identiques et leurs segments-C-C-Z1-C-C-Z2-C-sont dérivés de la 1,10- phénantroline, on fait réagir le produit de départ au cours de la première étape avec la 2-bromométhyl-9-éthoxycarbonyl- 1, 10-phénantroline. La préparation de la 2-bromométhyl-9- éthoxycarbonyl-1, 10-phénantroline est décrite par Ulrich G. et al, (Tetrahedron Lett. 2001,42, 6113). En soumettant le composé diester obtenu, à une saponification avec NaOH, suivie d'une acidification avec HCl dilué, on obtient un composé (I) dans lequel les groupements A4 et A5 sont des carboxyles. Le schéma réactionnel est donné ci-après.

Un substituant R1 souhaité peut être obtenu en choisissant soit un composé de départ qui le porte, soit un composé de départ qui porte un précurseur R1'du substituant souhaité. Lorsqu'un substituant R1 est obtenu à partir d'un précurseur R1t, la formation du substituant souhaité peut se faire sur un composé de formule (IC) contenant le précurseur ou sur un complexe formé avec un cation lanthanide et un composé de. formule (I) contenant le précurseur.

Un substituant Ru du type carboxyle peut être obtenu par une réaction de saponification à partir d'un groupe précur- seur R1'contenant une fonction ester carboxylique. Un subs- tituant R1 du type amino peut être obtenu à partir de la réduction d'un groupe précurseur R1 contenant une fonction nitro. Un substituant R1 du type isothiocyano peut être obtenu par réaction d'un précurseur R1'contenant une fonc- tion amino avec le thiophosgène. Un substituant R1 du type maléimido peut être obtenu par réaction d'un précurseur R1' contenant une fonction amino avec l'ester N-succinimidique de l'acide 4-maléimidobutyrique.

Un substituant R1 du type ester N-succinimidique peut être obtenu à partir d'un complexe par activation d'un précurseur carboxyle avec de la N- (3-diméthylaminopropyl)- N'-éthylcarbodiimide suivie d'une réaction avec la N- hydroxy-succinimide.

Un complexe selon l'invention peut être obtenu par réaction d'un composé donneur de cation lanthanide avec un composé de formule (I). Comme exemple de composés donneurs de cation lanthanide, on peut citer les halogénures de lan- thanide hydratés, les nitrates de lanthanide hydratés, les carbonates de lanthanide et les triflates de lanthanide. La réaction est effectuée en solution dans un solvant. Le sol- vant est choisi de préférence parmi l'eau, le méthanol, l'éthanol ou l'acétonitrile.

Dans un mode de réalisation préféré, on fait réagir le composé (I) avec le précurseur de l'ion lanthanide dans un mélange de méthanol et d'eau à un pH allant de 3 à 5, pendant une durée comprise entre 10 minutes et 24 heures, à

une température comprise entre 25°C à 80°C. Ensuite, le pH de la solution est porté à 7,0 et le méthanol est évaporé avant d'isoler le complexe formé.

Les complexes de la présente invention peuvent être utilisés notamment pour le marquage par fluorescence ou pour l'imagerie par résonnance magnétique nucléaire. Pour ces applications, les groupes R1 préférés sont les groupes amino, thio et carboxyle (qui doivent être activés avant le couplage covalent avec la molécule à marquer), et les grou- pes maléimido, ester N-succinimidique et isothiocyano (qui peuvent se lier directement avec la molécule à marquer).

Les complexes de la présente invention sont utiles pour des analyses ou des dosages de composés par marquage des composés. Le procédé consiste à lier de manière covalente au composé à doser, un marqueur constitué par un complexe selon l'invention, et à détecter ou quantifier la présence du composé marqué grâce aux propriétés de luminescence du marqueur. Les complexes d'europium, de terbium, de samarium ou de dysprosium sont particulièrement préférés pour cette application.

Lorsque les complexes d'ions lanthanides selon l'inven- tion sont destinés à être utilisés comme agents de relaxation pour la résonnance magnétique nucléaire, on utilise de préférence des complexes de gadolinium, d'europium ou de dysprosium.

La présente invention sera décrite plus en détail par les exemples donnés ci-après à titre d'illustration, auxquels elle n'est cependant pas limitée.

Exemple 1 Préparation du compose 1 Le composé 1 a été obtenu selon le schéma synthétique suivant. L'isomère (S) de l'ester glutamique choisi pourrait être remplacé par l'isomère (R) ou un mélange des deux isomères. 0 0 Ho ber p-- N Me N/I HCL H=N OMe 2 N 3 Ber " C CO (lamm.) EtOH/Et3N O O HQ Me0 O HO 1) N OMe 1 2) Nez N QH 1 4

Préparation du composé 2 Le composé 2 a été préparé selon le procédé décrit par S. Mameri, et al., dans Synthesis, 2003,17, 2713. Dans un ballon de 250 mL, on introduit 1,5 g (6,0 mmol) de 6-méthyl- 6'-bromo-2, 2'-bipyridine, 66 mg (0,4 mmol) d'azo-bis- isobutyronitrile (AIBN), et 1,3 g (7,3 mmol) de N-bromosuc- cinimide dans 90 mL de benzène. La solution est chauffée à reflux pendant 2h30 en l'irradiant avec une lampe halogène standard de 100 W. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu solide est chromatographié sur silice en utilisant un gradiant de CH2Cl2/hexane de 50/50 à 100/0.

On obtient 940 mg (2,9 mmol) de composé 2 (correspondant à un rendement de 48%) qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0, 42, Si02, CH2C12.

1H-RMN (CDC13, 200 MHz) : # 4, 61 (s, 2H), 7,48 (d, 1H, 3J=7, 5 Hz), 7,50 (d, 1H, 3J=7, 5 Hz), 7,68 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7,83 (t, 1H, 3J=8, 0 Hz), 8,33 (d, 1H, 3J=8, 0 Hz), 8,44 (d, 1H, 3J=8, 0 Hz).

13C-RMN (CDC13, 50 MHz) : # 34,0, 120,1, 120,7, 124,0, 128, 2, 138,1, 139,3, 141,6, 154,3, 156,4, 156,9.

Analyses calculées pour CllH8N2Br2 : C 40,28, H 2,46, N 8,54.

Trouvées : C 40,12, H 2,34, N 8,44.

FAB+/MS : 327 (50%), 329 (100%), 331 (50k, [2+H] +).

Préparation du composé 3 Dans un tube de Schlenk sous atmosphère d'argon, on introduit 470 mg (2,22 mmol) de chlorhydrate du diméthyle ester de l'acide L-glutamique et 1,23 g de K2CO3 (8,90 mmol) dans 100 mL d'acétonitrile fraîchement distillée sur P205. La solution est chauffée à 80°C pendant 30 minutes. On ajoute 1,60 g (4,88 mmol) de composé 2 et on chauffe pendant 23 heures à 80°C. La solution est évaporée à sec, le résidu est redissous avec 100 mL de CH2Cl2 et 20 mL d'eau. La phase aqueuse est lavée avec deux portions de 20 mL de CH2Cl2 et la somme des phases organiques est séchée sur MgSO4, filtrée, puis évaporée à sec. Le résidu solide est soumis à une chro- matographie flash sur silice (=5 cm, h=12 cm) avec un mé- lange de CH2Cl2/MeOH (100/0 à 97/3) comme éluant. On obtient 995 mg (1,49 mmol) de composé 3 (correspondant à un rendement de 67%) qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0,34, SiO2, CH2Cl2/MeOH (98/2).

1H-RMN (CDCl3, 200 MHz) : # 2,06-2, 20 (m, 2H), 2,39-2, 68 (m, 2H), 3,50 (s, 3H), 3,54-3, 62 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,99- 4,16 (m, 4H), 7,43-7, 48 (m, 4H), 7,63 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7,71 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,23 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,39 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz).

13C-RMN (CDC13, 50 MHz) : 6 24,8, 30,3, 51,5, 57,2, 62,1, 119,6, 119,7, 123,5, 127,8, 137,3, 139,1, 141,5, 153,8, 157,4, 159,1, 173,1, 173,4.

Analyses calculées pour C29H27N5O4Br2 : C 52,04, H 4,07, N 10,46. Trouvées : C 51,81, H 3,85, N 10,19.

FAB+/MS : 670 2 ([3+H]+, 100%).

Préparation du composé 4 Dans un ballon bicol de 250 mL, on introduit 995 mg (1,49 mmol) de composé 3 et 150 mg (0,21 mmol) de [Pd (PPh3) 2Cl2] dans 50 mL d'éthanol et 50 mL de triéthyl- amine. La solution est chauffée à 70°C pendant 15 heures en faisant barboter un flux de CO. La solution est évaporée à sec, le solide obtenu est redissous dans 100 mL de CH2C12, filtré sur célite, puis la phase organique est extraite avec 20 mL d'eau. La phase aqueuse est lavée avec deux portions de 20 mL de CH2Cl2 et les phases organiques combinées sont séchées sur MgSO4, filtrées puis évaporées à sec. Le résidu est soumis à une chromatographie flash sur silice (=5 cm, h=10 cm) avec un mélange de CH2Cl2/MeOH (99/1 à 90/10) comme éluant. On obtient 588 mg (0,90 mmol) de 4 sous forme d'une huile légèrement orangée (correspondant à un rendement de 60%), qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0, 30, Si02, CH2Cl2/MeOH (95/5).

1H-RMN (CDC13, 200 MHz) : # 1,46 (t, 6H, 3J=7, OHz), 2,06-2, 19 (m, 2H), 2,38-2, 65 (m, 2H), 3,49 (s, 3H), 3,55-3, 63 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 4,02-4, 19 (m, 4H), 4, 48 (q, 4H, 3J=7, 0 Hz), 7,47 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7,75 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7,92 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,10 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,40 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,62 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz).

13C-RMN (CDCl3, 50 MHz) : # 14,3, 24,8, 30,4, 51,5, 57,2, 61,8, 62,0, 119,9, 123,5, 124,2, 124, 8,137, 3,137, 7,147, 8, 154,6, 156,5, 159, 0, 165, 4, 173,2, 173,5.

Analyses calculées pour C35H37N5O8 : C 64,11, H 5,69, N 10,68.

Trouvées : C 64,07, H 5,55, N 10,53.

FAB+/MS : 656,2 ([4+H] +, 100W).

Préparation du composé 1 Dans un ballon équipé d'un réfrigérant, 588 mg (0,90 mmol) de 4 et 144 mg (3,60 mmol) de NaOH sont dissous dans un mélange de 50 mL de MeOH et 15 mL d'eau. Le mélange est chauffé à 70°C pendant 5 heures. La solution est évaporée à sec et le solide est dissous dans 10 mL d'eau sur lesquels on ajoute lentement une solution d'HCl 2N jusqu'à pH = 2-3.

Le précipité qui se forme est isolé par centrifugation et

séché sous vide. On obtient 411 mg (0,60 mmol) de composé 1 sous forme d'hydrochlorure 1. 3HC1 jaune pâle (correspondant à un rendement de 67%) dont les caractéristiques sont les suivantes : 1H-RMN (CD30D, 300 MHz) : # 2, 26-2,48 (m, 2H), 2,80-2, 84 (m, 2H), 3,95-3, 99 (m, 1H), 4,53-4, 81 (m, 4H), 7,47 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz), 7,63 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7, 90 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,02 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz), 8,42 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz), 8,58 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz).

13C-RMN (CD3OD, 75 MHz) : # 23, 1,32, 1,57, 0,67, 0,122, 3, 125,1, 125, 9,126, 1,139, 7,140, 1,149, 0,154, 1,155, 5, 156,1, 168,0, 173,7, 176,4.

Analyses calculées pour C29H25N5O8. 3HCl: C 51,15, H 4,14, N 10,28. Trouvées : C 51,01, H 4,43, N 9,95.

FAB+/MS : 572,5 ([1+H] +, 100W).

Exemple 2 Préparation du complexe 5 de formule [Eu. (1-4H). H20] Na 60 mg de 1. 3HC1 (88 mol) sont dissous dans un mélange de 30 mL de MeOH et de 30 mL d'eau. A cette solution est ajouté un mélange de 36 mg (98 pmol) de EuCl3. 6H2O dissous dans 3 mL de MeOH et 3 mL d'eau. La solution est chauffée à 70°C pendant 1 heure. Après refroidissement, le pH de la solution est remonté à 7,4 avec une solution à 5% de NaOH dans l'eau. La solution est concentrée à l'évaporateur rota- tif jusqu'à apparition d'un léger trouble. Puis on ajoute du THF jusqu'à la formation d'un important précipité. Le

précipité est isolé par centrifugation, puis séché sous vide pour donner 62 mg (74 pmol) de composé 5 (correspondant à un rendement de 85%) sous forme de solide beige dont les caractéristiques sont les suivantes : 1H-RMN (D20/t-BuOH, 200 MHz, tous les signaux se présentent sous forme de singulets larges) : # -9,40 (1H), -8, 95 (1H),- 4,23 (2H), -3, 17 (1H),-2, 21 (1H), 1,88 (1H), 2,73 (1H), 4,17 (1H), 6,06 (1H), 7,12 (1H), 7,80 (1-H), 7,88 (1H), 8, 90 (1H), 9,60 (1H), 9,89 (1H), 11,08 (1H), 11,38 (1H), 12,01 (1H).

Analyses calculées pour C29H21NaN508Eu. 5H20 : C 41,84, H 3,75, N 8,41. Trouvées : C 41,93, H 3,62, N 8,44.

FAB+/MS : 720,2 (80%), 722,2 (100%), [5-H2O-Na+2H] +.

IR (KBr, cm~1) : 3420,1619, 1574,1460, 1384,1274.

Propriétés photo-physiques dans 1'eau : Absorption, #max [nm] (#max [M-1.cm-1]) : 320 (épaulement), 308 (19700), 276 (8700), 267 (9700), 253 (14400).

Emission : caractéristique des composés de l'europium avec des bandes fines à 581,594, 615,650 et 701 nm. Temps de vie de l'état excité : 0,62 ms. Rendement quantique (référence [Ru (bipy) 3] 2+ dans l'eau) : 8%. Temps de vie de l'état excité dans l'eau lourde : 2,48 ms. Rendement quantique dans l'eau lourde : 35%.

Exemple 3 Préparation du complexe 6 de formule :

40 mg (48 jj. mol) de complexe 5 et 12 mg (63 J. mol) de sels d'hydrochlorure d'éthyle-N, N-diméthyle-3-aminopropyle- carbodiimide (EDCI. HCl) sont mis en suspension dans 6 mL de DMSO. A cette solution, on ajoute 7,0 mg (61 µmol) de N- hydroxysuccinimide. La solution est agitée à température ambiante pendant 66 heures, durant lesquelles le complexe 5 se dissout, puis un précipité blanc se forme. Le solide est isolé par centrifugation et séché sous vide à 50°C pendant 2 heures. On obtient 31 mg (34 J. mol) de 6 (correspondant à un rendement de 71%) dont les caractéristiques sont les suivantes : Analyses calculées pour C33H25EuN6O10.5H2O : C 43,67, H 3,89, N 9,26. Trouvées : C 43,60, H 3,80, N 9,16.

FAB+/MS : 720,1, 722,1 ([6-H2O-C4H4NO2+2H]+, 100%), 817,1, 819,1 ([6-H2O+H]+, 30%).

IR (pastille de KBr, cm-1). 3420,1739, 1629,1573, 1459, 1384.

Propriétés photo-physiques dans l'eau : Absorption, #max [nm] (#max [M-1.cm-1]) : 320 (épaulement), 309 (20000), 276 (10000), 267 (10500), 253 (16000).

Emission : caractéristique des composés de l'europium avec des bandes fines à 581,593, 615,649 et 701 nm. Temps de vie de l'état excité : 0,63 ms. Rendement quantique (référence [Ru (bipy) 3] 2+ dans l'eau) : 8%. Temps de vie de l'état excité dans l'eau lourde : 2,47 ms. Rendement quantique dans l'eau lourde : 34%.

Exemple 4 Marquage d'une amine par le complexe 5 10 mg de complexe 5 (13,1 µmol) sont mis en suspension dans 5 mL d'eau. On ajoute 3,5 mg (18, 3 jj. mol) d'EDCI. HCl, puis 1, 7 LL (13,2 jj. mol) de (+)-cx-méthylbenzylamine. Après 15 minutes, puis une heure, on ajoute chaque fois 1,7 gL de (+)-a-méthylebenzylamine à température ambiante. L'agitation est poursuivie pendant 15 heures. La phase aqueuse est lavée avec 2 fois 10 mL de CH2Cl2, puis évaporée à sec, et l'on obtient 14 mg de solide jaune pâle. Après recristallisation

avec un mélange MeOH/Et2O, centrifugation et séchage sous vide, le complexe 7 (8,0 mg, 9,5 jumol) est récupéré sous forme de poudre crème (73%).

ISI-TOF/MS : 847,0513 ([7-H2O+Na]+, 60 %), 825,0912 ( [7- H2O+H] +, 28%). La formule du complexe 7 est représentée ci- dessous.

Exemple 5 Marquage de l'albumine sérique de boeuf ASB par le complexe 6 Le complexe 6 (2,0 mg) est ajouté à une solution d'ASB (5,4 mg) dans 1 mL de tampon borate (50 mM dans l'eau, pH = 7,0) afin d'obtenir un rapport molaire 6/ASB de 30 : 1. La solution est agitée à température ambiante, conduisant à une dissolution complète de 6 après 2 heures. Après 24 heures d'agitation, la solution est déposée sur un filtre centrifu- ge (Centricon, Millipore, filtre à 30 KDa) et le volume de la solution est réduit à 200-300 juL par filtration. La solution est diluée avec 3 mL d'eau, puis le volume est réduit de nouveau à 200-300 µL par filtration. Cette dernière opération est répétée 3 à 4 fois, jusqu'à ce que les eaux de filtration ne soient plus luminescentes sous irradiation UV (absence d'europium). Les 200-300 fi-L de solution résiduelle contenant la protéine marquée et restant sur le filtre sont récupérés et stockés au frigidaire à 4°C.

Caractérisation de l'ASB marquée Le spectre d'absorption UV-Vis de la solution aqueuse d'ASB marquée montre une absorption intense due aux comple- xes d'europium, qui recouvre en partie l'absorption due à la protéine (. max = 278 nm, Emax = 38000 M~1. cm-1). Par excitation de la solution dans la bande d'absorption des bipyridines (308 nm), on observe un spectre d'émission typique des composés d'europium, avec un temps de vie de l'état excité moyen de 1,1 ms (la décroissance n'est pas purement mono- exponentielle) et un rendement quantique de luminescence de 13%.

La caractérisation par spectrométrie de masse en mode MALDI-TOF (Matrice Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Fly = Ionisation par désorption sur matrice assistée par Laser, analyse par temps de vol) s'effectue de la manière suivante. Une solution aqueuse d'ASB marquée est traitée à l'acide trifluoroacétique à 1% pour décomplexer l'europium, puis la protéine est adsorbée sur une colonne de chro- matographie dont la phase solide hydrophobe est constituée de chaîne en C4. Après lavage à l'eau, la protéine est relarguée avec de l'acétonitrile, puis analysée par MALDI- TOF (matrice d'acide a-cyano-4-hydroxycynnamique). La masse moyenne obtenue pour la protéine marquée sans europium est de 71700 Da (ASB, M = 66610 Da), conduisant à un rapport molaire marqueurs/BSA de 9/1 dans la protéine marquée.

Exemple 6 Préparation du complexe 8 de formule [Tb. (1-4H). H20] Na

Dans un ballon de 250 mL équipé d'un réfrigérant, 40 mg (59 µmol) de composé 1. 3HC1 sont dissous dans un mélange de 30 mL de MeOH et de 30 mL d'eau. A cette solution sont ajoutés 25 mg (67 pmol) de TbC13. 6H20 dissous dans 5 mL de MeOH et 5 mL d'eau. La solution est chauffée à 70°C pendant une heure. Après refroidissement, le pH de la solution est porté à 7,2 avec une solution à 1% de NaOH dans l'eau. La solution est concentrée à l'évaporateur rotatif jusqu'à apparition d'un léger trouble, puis on ajoute du THF jusqu'à la formation d'un important précipité. Un solide jaune pâle est isolé par centrifugation, puis séché sous vide. On obtient 46 mg (56 jjmol) de complexe 8 (correspondant à un rendement de 95%) dont les caractéristiques sont les suivantes : Analyses calculées pour C29H21NaN508Tb. 4H20 : C 42,40, H 3,56, N 8,53. Trouvées : C 42,28, H 3,31, N 8,38.

FAB-/MS : 668,2 ([8-N2O-CH2COONa]-, 100%), 726,2 ( [8-HzO-Na]', 30%).

IR (pastille de KBr, cm-1). 3428,1592, 1574, 1466, 1416, 1387.

Propriétés photo-physiques dans l'eau : Absorption, #max [nm] (#max [M-1.cm-1]) : 320 (épaulement), 308 (20800), 277 (8900), 267 (10400), 253 (15000).

Emission : caractéristique des composés du terbium avec des bandes fines à 487,543, 583 et 621 nm. Temps de vie de l'état excité : 1,48 ms. Rendement quantique (référence sulphate de quinine dans H2SO4 1N) : 31%. Temps de vie de l'état excité dans l'eau lourde : 2,53 ms. Rendement quantique dans l'eau lourde : 53%.

Exemple 7 Préparation du complexe 9 de formule Dans un ballon de 10 mL, 50 mg (61 llmol) de complexe 8 sont mis en suspension dans 5 mL de DMSO. A cette solution on ajoute 9 mg (78 ; j. mol) de N-hydroxysuccinimide et 13 mg (68 jJLmol) de sels d'hydrochlorure d'éthyle-N, N-diméthyle-3- aminopropyle-carbodiimide (EDCI. HCl). La solution est agitée à température ambiante pendant 138 heures durant lesquelles le complexe 8 se dissout, puis un précipité blanc se forme.

Le solide est isolé par centrifugation, lavé au THF et séché sous vide. L'addition de THF aux eaux-mères provoque la formation d'un précipité supplémentaire, que l'on récupère par centrifugation. On obtient en tout 49 mg (55 prnol) de complexe 9 (correspondant à un rendement de 90%) dont les caractéristiques sont les suivantes : Analyses calculées pour C33H25N6OlOTb. 4H20 : C 44,21, H 3,71, N 9,29. Trouvées : C 44,01, H 3,42, N 9,29.

FAB+/MS : 726,2 ([9-H2O-C4H4NO2] +, 15æ), 825,5 ( [9-H20+H]'', 100%).

IR (pastille de KBr, cm~1) : 3433,1741, 1624,1594, 1574, 1464, 1419, 1375.

Propriétés photo-physiques dans l'eau Absorption, #max [nm] (#max [M-1.cm-1]) : 308 (18700), 276,267, 253.

Emission : caractéristique des composés du terbium avec des bandes fines à 487,543, 583 et 621 nm. Temps de vie de l'état excité : 1,50 ms. Rendement quantique (référence sulphate de quinine dans H2SO4 IN) : 34%. Temps de vie de l'état excité dans l'eau lourde : 2, 42 ms. Rendement quantique dans l'eau lourde : 62%.

Exemple 8 Marquage de l'albumine sérique de boeuf ASB par le complexe 9 et mise en évidence par microscopie de luminescence en temps résolu.

Le marquage de l'albumine sérique de boeuf a été effectué selon la méthode décrite dans l'exemple 5 en remplaceant le complexe 6 par le complexe 9.

Détermination du rapport molaire marqueurs/BSA Le rapport molaire marqueurs/BSA (nombre de complexes 9 liés de façon covalente à l'ASB) est déterminé par absor- ption différentielle à 308 nm. Les coefficients d'absorption molaire de l'ASB native et de l'ASB marquée sont mesurés à 308 nm. La différence de ces deux valeurs est divisée par le coefficient d'absorption molaire du complexe 9 à 308 nm, pour donner un rapport molaire marqueurs/BSA de 6/1 dans la protéine marquée.

La figure 1 représente des goutelettes d'environ 750 microns de diamètre contenant l'ASB marquée par le composé 9 (colonnes de gauche et de droite sur chaque image) et un anticorps marqué par de la fluorescéine (colonne du milieu sur chaque image) servant de référence (Immunoglobuline de lapin marquée à la fluorescéine produit par Dako- Immunoglobuline sous le code produit F-123). L'image obtenue par microscopie de fluorescence conventionnelle (gauche) met en évidence la fluorescence des deux composés. L'image

obtenue par microscopie de luminescence en temps résolu (délai = 0, 5 ms, temps d'intégration = 5, 0 ms) montre la disparition de la fluorescence du composé de référence alors que la luminescence de l'ASB marquée perdure.

Exemple 9 Préparation du complexe 10 de formule [Gd. (1-4H). H20] Na Dans un ballon de 100 mL équipé d'un réfrigérant, 30 mg (44 jumol) de composé 1. 3HC1 sont dissous dans un mélange de 25 mL de MeOH et de 25 mL d'eau. A cette solution on ajoute 19 mg (51 mol) de GdCl3. 6H2O dissous dans 5 mL de MeOH et 5 mL d'eau. La solution est chauffée à 70°C pendant une heure.

Après refroidissement le pH de la solution est remonté à 7,5 avec une solution à 0, 5% de NaOH dans l'eau. La solution est concentrée à l'évaporateur rotatif jusqu'à apparition d'un léger trouble puis on ajoute du THF jusqu'à la formation d'un important précipité. Le solide jaune pâle est isolé par centrifugation puis séché sous vide pour donner 30 mg (37 umol) de complexe 10 (correspondant à un rendement de 85%) dont les caractéristiques sont les suivantes : Analyses calculées pour C29H2lGdNaN508. 3H2O : C 43,44, H 3,39, N 8,73. Trouvées : C 43,35, H 3,17, N 8,55.

FAB-/MS : 667,2 ([10-H2O-CH2COONa]-, 100%), 725,2 ([10-H2O- Na] ~, 45%).

IR (pastille de KBr, cm-1) : 3422,1637, 1592, 1459, 1419, 1385.

Exemple 10 Préparation du complexe 11 de formule

Dans un ballon de 10 mL, 50 mg (62 pmol) de composé 10 sont mis en suspension dans 5 mL de DMSO. A cette solution on ajoute 9 mg (78 µmol) de N-hydroxysuccinimide et 15 mg (78 Fmol) de sels d'hydrochlorure d'éthyle-N, N-diméthyle-3- aminopropyle-carbodiimide (EDCI. HC1). La solution est agitée à température ambiante pendant 48 heures durant lesquelles le complexe 10 se dissout, puis un précipité blanc se forme.

Le solide est isolé par centrifugation, lavé au THF et séché sous vide. L'addition de THF aux eaux-mères provoque la formation de précipité supplémentaire, que l'on récupère par centrifugation. En tout, on obtient 45 mg (51 µmol) de complexe 11 (correspondant à un rendement de 820-.) dont les caractéristiques sont les suivantes : Analyses calculées pour C33H25GdN6O10.3H2O : C 45,20, H 3,56, N 9,37. Trouvées : C 45,02, H 3,18, N 9,21.

FAB+/MS : 726,5 111-H20-C4H4NO2+2H] 20-06), 824,2 ([11- H20+H] +, 1000--)- IR (pastille de KBr, cm-1) : 3435,1741, 1623,1573, 1465, 1420,1376.

Exemple 11 Préparation du composé 12 Ce composé est obtenu en deux étapes à partir du 5 composé 3 selon le schéma synthétique suivant : 0 0 0 Me0 Etc 0 q/O o P N rl / 1 ! J N (i-PrEtn'o) ticne// ! /\. gN \ -N I N I out 3 3

Préparation du composé 13 Dans un tube de Schlenk sous atmosphère d'argon, on introduit 200 mg (0,30 mmol) de composé 3, 90 J. L (0,70 mmol) de diéthylphosphite, 78 mg (0,30 mmol) de PPh3 et 300 pL de diisopropyléthylamine fraîchement distillée dans 10 mL de toluène. La solution est dégazée à l'argon pendant 20 minutes. On ajoute 34 mg (0,03 mmol) de Pd (PPh3) 4 et la solution est chauffée à 100°C pendant 16 heures. On ajoute 40 JL (0,31 mmol) de diéthylphosphite et 34 mg (0,03 mmol) de Pd (PPh3) 4 et la solution est à nouveau chauffée à 100°C pendant 16 heures. La solution est évaporée à sec. Le résidu solide est purifié par chromatographie flash sur silice (=3 cm, h=15 cm) avec un mélange de CH2Cl2/MeOH (99/1 à

95/5) comme éluant. Les fractions pures sont évaporées, solubilisées dans 30 mL de CH2Cl2 et lavées avec 10 mL d'eau.

La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et évaporée. On obtient 72 mg (0,09 mmol) de composé 13 (correspondant à un rendement de 31%) sous forme d'une huile qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0,56, Si02, CH2Cl2/MeOH (90/10).

1H-RMN (CDCl3, 200 MHz) : # 1,35 (t, 12H, 3J=7, 0 Hz), 2,02- 2,22 (m, 2H), 2,37-2, 71 (m, 2H), 3,47 (s, 3H), 3,54-3, 61 (m, 1H), 3,75 (s, 3H), 4,01-4, 17 (m, 4H), 4,18-4, 36 (m, 8H), 7,47 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz), 7,73 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7,81-7, 97 (m, 4H), 8,32 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz), 8, 59 (dt, 2H, 3JH-H=7, 0 Hz, 3JH-P=4JH-H=2, 0 Hz).

13C-RMN (CDCl3, 50 MHz) : # 16, 3,16, 4,24, 7,30, 3,51, 4, 57,1, 61,9, 63, 0,63, 1,119, 6,123, 2 (2), 123,4, 127,4, 127,9, 136,7, 137,0, 137,2, 149,0, 153,5, 154,5, 156,5, 156,9, 159,0, 173,1, 173,4.

31P-RMN (CDCl3, 162 MHz) : # 11,73.

Préparation du composé 12 Dans un ballon de 50 mL équipé d'un réfrigérant, 51 mg (65 J. mol) de composé 13 sont dissous dans 6 mL de solution de NaOH 0,05 N dans l'eau. Le mélange est chauffé à 100°C pendant 19 heures. Après refroidissement la phase aqueuse est extraite avec 4 portions de 5 mL de CH2Cl2 puis évaporée à sec. Le produit précipite dans un mélange H2O/THF. On obtient 45 mg (51 J. mol) de composé 12 (correspondant à un rendement de 79%) sous forme de poudre de couleur crème dont les caractéristiques sont les suivantes : 1H-RMN (D2O/tBuOH, 300 MHz ?. 8 1,18 (t, 6H, 3J=7, 0 Hz), 2,06- 2,27 (m, 2H), 2,37-2, 58 (m, 2H), 3,50 (t, 3H, 3J=7, 5 Hz), 3,86-3, 99 (m, 4H), 4,02-4, 24 (m, 4H), 7,48 (d, 2H, 3J=7, 0 Hz), 7,59-7, 81 (m, 10H).

"C-RMN (D2O/tBuOH, 75 MHz) : # 16,4, 16,5, 27,8, 35,6, 59,8, 62,4, 62,5, 71,6, 121,2, 124,0, 124,1, 125,7, 127,1, 127,4, 138,0, 138,2, 138,5, 154,6, 155,0, 156,3, 156,6, 157,8, 160, 6, 181,1, 183,6.

31P-RMN (D20, 162 MHz) : # 10,17

Analyses calculées pour C31H3lN5Na4Ol0P2. 5H2O : C 42,43, H 4,71, N 7,98. Trouvées : C 42,35, H 4,55, N 7,78.

FAB+/MS : 764,2 ([12-Na]+, 10%).

Exemple 12 Préparation du complexe 14 de formule Dans un ballon de 50 mL équipé d'un réfrigérant, 19 mg (22 µmol) de composé 12 sont dissous dans 35 mL d'eau. Le pH est ajusté à 3,1 avec une solution de HC1 dilué. A cette solution on ajoute 9 mg (25 pmol) de EuC13. 6H20 dissous dans 5 mL d'eau. La solution est chauffée à 80°C pendant une heure. Après refroidissement la solution est filtrée sur célite et le pH est remonté à 7,1 avec une solution à 0, 5% de NaOH dans l'eau. La solution est évaporée à sec, le produit précipite dans un mélange H2O/THF. Le solide jaune pâle est isolé par centrifugation puis séché sous vide, et l'on obtient 9 mg (10 umol) de complexe 14 (correspondant à un rendement de 47%) dont les caractéristiques sont les suivantes : FAB+/MS : 848,2 ([14-H2O-Na] +, 35W).

Exemple 13 Préparation du composé 15

Ce composé est obtenu en trois étapes selon le schéma synthétique suivant : 0 Me0 Br + 0 Mye0 meo OMe HCL Han N N Br 16 [Pd (PPh3) CO (I atmos.) EtOH/Et3N O HO 0 HO (EtO Ho M OH N I) N u N 2) HCI dil. OH OEt 15 out 15'lÎ

Préparation du composé 16 Dans un ballon de Schlenk de 500 mL sous atmosphère d'argon, on introduit 450 mg (2,13 mmol) de sels d'hydhrochlorure de diéthylaminomalonate et 1,18 g (8,54 mmol) de K2CO3 dans 150 mL d'acétonitrile fraîchement

distillée. La solution est chauffée à 80°C pendant une heure. On ajoute 1,46 g (4,45 mmol) de composé 2 et on chauffe pendant 21 heures à 80°C. La solution est évaporée à sec et le résidu est redissous avec 100 mL de CH2Cl2 et 20 mL d'eau. La phase aqueuse est lavée avec deux portions de 20 mL de CH2Cl2 et la somme des phases organiques est séchée sur MgSO4, filtrée, puis évaporée à sec. Le résidu solide est purifié par chromatographie flash sur silice (#=4 cm, h=14 cm) avec un mélange de CH2Cl2/MeOH (100/0 à 99/1) comme éluant. On obtient 794 mg (1,19 mmol) de composé 16 (correspondant à un rendement de 56%) sous forme de poudre jaune pâle qui présente les caractéristiques suivantes Rf = 0,57, SiO2, CH2Cl2/MeOH (97/3).

1H-RMN (CDCl3, 200 MHz) : # 1, 26 (t, 6H, 3J=7, 0 Hz), 4,22 (s, 4H), 4,23 (q, 4H, 3J=7, 0 Hz), 4,47 (s, 1H), 7,43 (dd, 2H, 3J=7, 5 Hz, 4J=0, 5 Hz), 7,60 (t, 2H, 3J=7, 5 Hz), 7,62 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz), 7,75 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8,22 (dd, 2H, 3J=7, 5 Hz, 4J=1, 0 Hz), 8,37 (dd, 2H, 3J=7, 5 Hz, 4J=1, 0 Hz).

13C-RMN (CDCl3, 50 MHz) : # 14,1, 58,0, 61, 4,67, 1,119, 7, 123,4, 127,7, 137,4, 139,0, 141,4, 153,5, 157,4, 158,9, 168,1.

Analyses calculées pour C29H27Br2N5O4 : C 52,04, H 4,07, N 10,46. Trouvées : C 51,93, H 3,93, N 10,31.

FAB+/MS : 670,2 (100%), 672,2 (50%), [16+H] +.

Préparation du composé 17 Dans un ballon bicol de 250 mL on introduit 778 mg (1,16 mmol) de composé 16 et 82 mg (0,12 mmol) de [Pd (PPh3) 2Cl2] dans 75 mL d'éthanol et 75 mL de triéthyl- amine. La solution est chauffée à 70°C pendant 16 heures en faisant barboter un flux de CO. La solution est évaporée à sec, le solide obtenu est redissous dans 75 mL de CH2Cl2, filtré sur célite, puis la phase organique est lavée avec 15 mL d'eau. La phase aqueuse est extraite avec deux portions de 20 mL de CH2Cl2 et l'ensemble des phases organiques est séché sur MgSO4, filtré puis évaporé à sec. Le résidu est purifié par chromatographie flash sur silice (+=3 cm, h=16 cm) avec un mélange de CH2Cl2/MeOH (99,5/0, 5 à 90/10)

comme éluant. Les fractions contenant le composé 17 avec de l'oxyde de triphénylphosphine sont dissoutes dans 40 mL de CH2Cl2 et extraites avec quatre portions de HCl 3N. Les phases aqueuses combinées sont neutralisées avec NaOH puis extraites avec trois portions de 30 mL de CH2Cl2. L'ensemble des phases organiques est séché sur MgSO4, filtré puis évaporé à sec. On obtient 522 mg (0,80 mmol) de composé 17 sous forme d'une huile incolore (correspondant à un rende- ment de 68%), qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0,55, Si02, CH2Cl2/MeOH (90/10).

1H-RMN (CDCl3, 200 MHz) : # 1,26 (t, 6H, 3J=7, 0 Hz), 1,45 (t, 6H, 3J=7, 0 Hz), 4,23 (q, 4H, 3J=7, 0 Hz), 4,24 (s, 4H), 4,47 (q, 4H, 3J=7, 0 Hz), 4,48 (s, 1H), 7,64 (dd, 2H, 3J=7, 5 Hz, 4J=0, 5 Hz), 7, 80 (t, 2H, 3J=8, 0 Hz), 7,91 (t, 2H, 3J=7, 5 Hz), 8,09 (dd, 2H, 3J=7, 5 Hz, 4J=1, 0 Hz), 8,40 (dd, 2H, 3J=7, 5 Hz, 4J=0, 5 Hz), 8,62 (dd, 2H, 3J=8, 0 Hz, 4J=1, 5 Hz).

13C-RMN (CDCl3, 50 MHz) : 8 14,1, 14,3, 58,0, 61,4, 61,8, 67,1, 120,0, 123,4, 124,2, 124,7, 137,5, 137,7, 147,7, 154,4, 156,5, 158,8, 165,3, 168,2.

Analyses calculées pour C35H37N5O8 : C 64,11, H 5,69, N 10,68.

Trouvées C 63, 81, H 5,43, N 10,43.

FAB+/MS : 496, 2 (35%), 656,1 ([17+H]+, 100%).

Préparation du composé 15 Dans un ballon de 50 mL équipé d'un réfrigérant, 103 mg (0,16 mmol) de composé 17 et 50 mg (1,25 mmol) de NaOH sont dissous dans un mélange de 10 mL de MeOH et 5 mL d'eau. Le mélange est chauffé à 70OC pendant 5 heures. La solution est évaporée à sec et le solide est dissous dans 8 mL d'eau sur lesquels on ajoute lentement à 0°C une solution de HCl 1N jusqu'à ce que le produit précipite massivement (pH=4-5). Le précipité est isolé par centrifugation et séché sous vide.

On obtient 59 mg (0,08 mmol) de chlorhydrate hydraté 15. 3HCl (correspondant à un rendement de 53%) sous forme de poudre blanche dont les caractéristiques sont les suivantes : H-RMN (NaOD/tBuOH, 300 MHz) : 8 3,75 (s, 4H), 4,04 (s, 1H), 6,84 (d, 2H, 3J=7,5 Hz), 7,15-7, 26 (m, 4H), 7,32 (d, 2H, 3J=7,5 Hz), 7,42 (t, 2H, 3J=7, 5 Hz), 7,56 (d, 2H, 3J=7, 5 Hz).

13C-RMN (NaOD/tBuOH, 75 MHz) : 8 60,3, 79,4, 119,9, 122,9, 124,1, 124,4, 138,2, 138,6, 152,8, 153,7, 154,0, 158,7, 168,6, 172,3, 177,3.

Analyses calculées pour C27H21N508. 3HCl. 3H2O : C 45,87, H 4,28, N 9,91. Trouvées : C 45,75, H 4,09, N 9,78.

FAB+/MS : 544,2 ([15+H] +, 20S).

Exemple 14 Préparation du complexe 18 de formule Dans un ballon de 10 mL, 15 mg de 15. 3HCl. 3H20 (21 J. mol) sont dispersés dans un mélange de 10 mL de MeOH et de 10 mL d'eau. A cette solution est ajouté 10 mg (27 µmol) de EuCl3. 6H20 dissous dans 5 mL de MeOH et 5 mL d'eau. La solution est chauffée à 70°C pendant une heure. Après refroidissement le pH de la solution est remonté à 7,3 avec une solution à 0, 5% de NaOH dans l'eau. La solution est concentrée à l'évaporateur rotatif jusqu'à apparition d'un précipité. Le solide blanc est isolé par centrifugation puis séché sous vide pour donner 14 mg (19 µmol) de composé 18 (correspondant à un rendement de 90%) dont les caractéristiques sont les suivantes : FAB-/MS : 692,3 ([18-H2O-Na)]-, 100%).

IR (pastille de KBr, cm-1) : 3442,1626, 1588, 1460,1411, 1373.

Exemple 15 Préparation du complexe 19 de formule :

Dans un ballon de 10 mL, 18 mg (22 mol) de complexe 5 sont mis en suspension dans 5 mL de DMSO. A cette solution on ajoute 6 mg (26 mol) de sel monosodique de N-hydroxy- succinimide-3-acide sulfonique hydraté et 5 mg (26 pmol) de chlorhydrate d'éthyle-N, N-diméthyle-3-aminopropyle-carbo- diimide (EDCI. HCl). La solution est agitée à température ambiante pendant 46 heures durant lesquelles le complexe 5 se dissout. L'ajout de THF à la solution provoque la formation d'un précipité que l'on récupère par centrifu- gation. On obtient 15 mg (15 pmol) de complexe 19 (corres- pondant à un rendement de 68%) sous forme de poudre blanche.

Exemple 16 Préparation du complexe 20 de formule :

Dans un ballon de 50 mL, 45 mg (55 jumol) de complexe 8 sont mis en suspension dans 10 mL de DMSO. A cette solution on ajoute 14 mg (60 jjmol) de sel monosodique de N-hydroxy- succinimide-3-acide sulfonique hydraté et 12 mg (63 mol) de chlorhydrate d'éthyle-N, N-diméthyle-3-aminopropyle-carbo- diimide (EDCI. HCl). La solution est agitée à température ambiante pendant 92 heures durant lesquelles le complexe 8 se dissout. L'ajout de THF à la solution provoque la formation d'un précipité que l'on récupère par centrifugation. On obtient 45 mg (44 µmol) de complexe 20 (correspondant à un rendement de 81%) sous forme de poudre jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : Analyses calculées pour C33H24N6NaO13STb. 5H20 : C 38,99, H 3,37, N 8,27. Trouvées : C 39,20, H 3,56, N 8,39.

FAB+/MS : 682,2 ([20-H2O-C5H3NNaO7S] +, 95W), 727,2 ([20-H20- C4H3NNaO5S+H] +, 55-06).

Exemple 17 Préparation du complexe 21 de formule :

Dans un ballon de 10 mL, 19 mg (24 pmol) de complexe 10 sont mis en suspension dans 5 mL de DMSO. A cette solution on ajoute 7 mg (30 jumol) de sel monosodique de N- hydroxysuccinimide-3-acide sulfonique hydraté et 5 mg (26 mol) de chlorhydrate d'éthyle-N, N-diméthyle-3-aminopropyle- carbodiimide (EDCI. HCl). La solution est agitée à températu- re ambiante pendant 24 heures durant lesquelles le complexe 10 se dissout. L'ajout de THF à la solution provoque la for- mation d'un précipité que l'on récupère par centrifugation.

On obtient 19 mg (19 jumol) de complexe 21 (correspondant à un rendement de 80%) sous forme de poudre jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : FAB+/MS : 681,2 ([21-H20-C5H3NNaO7S] +, 100W), 726,3 ([2l-H20- C4H3NNaO5S+H] +, 40%).

Exemple 18 Préparation du compose 25 Le compose 25 est obtenu en quatre étapes selon le schéma suivant :

Préparation du composé 22 Dans un tube de Schlenk sous atmosphère d'argon, on introduit 2,04 g (7, 6 mmol) de 7-hydroxy-9-carbométhoxy-2- méthyl-phénanthroline (obtenu selon Heindel, N. et al, J.

Heterocycl. Chem. 1968,5, 869), 2,11 g (15,2 mmol) de K2CO3 et 950 pL (15,3 mmol) d'iodure de méthyle dans 60 mL d'acétonitrile fraîchement distillée sur P205. La solution est chauffée à 80°C pendant 19 heures. La solution est évaporée à sec, le résidu est dissous dans 100 mL de CH2Cl2 et 15 mL d'eau. La phase aqueuse est extraite avec 4 portions de 15 mL de CH2Cl2 et la somme des phases organiques est séchée sur MgSO4, filtrée, puis évaporée à sec. Le résidu est purifié par chromatographie sur alumine (#=5 cm, h=12 cm) avec un mélange de CH2Cl2/MeOH (99/1) comme éluant.

On obtient 2,05 g (7,3 mmol) de composé 22 (correspondant à un rendement de 95%) sous forme de poudre jaune qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0, 54, Al2O3, CH2Cl2/MeOH (98/2).

1H-RMN (CDC13, 200 MHz) : # 2,91 (s, 3H), 4,06 (s, 3H), 4,12 (s, 3H), 7, 47 (d, 1H, 3J=8, 5 Hz), 7,77 (d, 1H, 3J=9, 0 Hz),

7,83 (s, 1H), 8,08 (d, 1H, 3J=7, 5 Hz), 8,12 (d, 1H, 3J=9, 0 Hz).

13C-RMN (CDCl3, 50 MHz) : # 25, 8,52, 8,56, 2,102, 9,118, 7, 122,2, 123, 9,126, 9,127, 4,136, 0,145, 2,146, 1,148, 6, 160,1, 163,2, 166,5.

Analyses calculées pour C16H14N2O3 : C 68,07, H 5,00, N 9,92.

Trouvées : C 67,92, H 4,93, N 9,78.

FAB+/MS : 283,2 ([22+H]+, 100%).

Préparation du composé 23 Dans un ballon de 250 mL, on introduit 1 g (3,5 mmol) de composé 22,630 mg (3,5 mmol) de N-bromosuccinimide et 30 mg (0,2 mmol) d'azo-bis-isobutyronitrile (AIBN) dans 10 mL de benzène. La solution est irradiée pendant 30 minutes avec une lampe halogène standard de 100 W. Le solvant est évaporé sous pression réduite et le résidu est purifié par chromatographie sur alumine contenant 10% d'eau avec un mélange de CH2Cl2/hexane (50/50) comme éluant. On obtient 468 mg (1,3 mmol) de composé 23 (correspondant à un rendement de 37%) sous forme de poudre grise qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0, 71, A1203, CH2Cl2/MeOH (98/2).

1H-RMN (CDC13, 200 MHz) : # 4,06 (s, 3H), 4,12 (s, 3H), 4,93 (s, 2H), 7,77 (d, 1H, 3J=9, 0 Hz), 7,83 (s, 1H), 7,87 (d, 1H, 3J=8, 5 Hz), 8,17 (d, 1H, 3J=9, 0 Hz), 8, 21 (d, 1H, 3J=8, 5 Hz).

13C-RMN (CDC13, 50 MHz) : # 34,6, 53,0, 56,3, 103,3, 120,2, 122,4, 123,7, 127,0, 128,1, 137, 1, 144,5, 145, 9, 148,9, 157,6, 163,3, 166,2.

Analyses calculées pour C16H13BrN2O3 : C 53,21, H 3,63, N 7,76. Trouvées : C 52,94, H 3,26, N 7,51.

FAB+/MS : 281,2 ( [23-Br] +, 30 ), 361,2 (100%), 363,2 (100%), [23+H] +.

Préparation du composé 24 Dans un tube de Schlenk sous atmosphère d'argon, on introduit 96 mg (0,45 mmol) de chlorhydrate du diméthyle ester de l'acide DL-glutamique et 250 mg (1,81 mmol) de K2CO3 dans 15 mL d'acétonitrile fraîchement distillée sur P205. La

solution est chauffée à 80°C pendant 10 minutes. On ajoute 360 g (1 mmol) de composé 23 et on chauffe pendant 18 heures à 80°C. On ajoute une nouvelle portion de composé 23 (52 mg, 0,14 mmol) et on chauffe pendant 24 heures à 80°C. La solu- tion est évaporée à sec, le résidu est dissous dans 30 mL de CH2Cl2 et 10 mL d'eau. La phase aqueuse est extraite avec 4 portions de 30 mL de CH2Cl2 et la somme des phases organiques est séchée sur MgSO4, filtrée, puis évaporée à sec. Le résidu est purifié par chromatographie sur alumine contenant 10% d'eau avec un mélange de CH2C12/MeOH (100/0 à 99,3/0, 7) comme éluant. On obtient 46 mg (0,06 mmol) de composé 24 (correspondant à un rendement de 37%) qui présente les caractéristiques suivantes : Rf = 0,16, A1203, CH2Cl2/MeOH (98/2).

1H-RMN (CDC13, 200 MHz) : # 2, 17-2,28 (m, 2H), 2,61 (t, 2H, 3J=7, 5 Hz), 3,44 (s, 3H), 3,71 (t, 1H, 3J=7, 5 Hz), 3,83 (s, 3H), 4,06-4, 19 (m, 12H), 4,45-4, 70 (m, 4H), 7,82 (d, 2H, 3J=9, 0 Hz), 7,86 (s, 2H), 8,13 (d, 2H, 3J=8, 0 Hz), 8, 18 (d, 2H, 3J=9, 0 Hz), 8,24 (d, 2H, 3J=8, 5 Hz).

Préparation du composé 25. 3HC1 Dans un ballon de 50 mL, 46 mg (0,06 mmol) de 24 et 10 mg (0,25 mmol) de NaOH sont dissous dans un mélange de 9 mL de MeOH et 3 mL d'eau. Le mélange est chauffé à 75°C pendant 21 heures. Les solvants sont évaporés sous pression réduite, le solide est dissous dans 5 mL d'eau et la solu- tion obtenue est filtrée sur célite. Le milieu est acidifié avec une solution diluée d'acide chlorhydrique et la solu- tion est évaporée à sec. Le résidu est lavé avec 2 portions de 2 mL d'eau. On obtient 19 mg (0, 02 mmol) de chlorhydrate 25. 3HC1 (correspondant à un rendement de 39%) sous forme de poudre jaune-orange dont les caractéristiques sont les suivantes : 1H-RMN (CD30D, 200 MHz) : # 2, 38-2,52 (m, 2H), 2,84 (t, 2H, 3J=7, 0 Hz), 4,17 (t, 1H3J=7, 5 Hz), 4,35 (s, 6H), 4,81-4, 85 (m, 4H), 7,87 (d, 2H, 3J=9, 5 Hz), 7,89 (s, 2H), 8,16 (d, 2H, 3J=9, 0 Hz), 8,18 (d, 2H, 3J=8, 5 Hz), 8,65 (d, 2H, 3J=9, 0 Hz).

Exemple 19 Préparation du composé 26 de formule [Eu. (25-4H). H2O] Na

Dans un ballon de 50 mL, 19 mg de 25. 3HC1 (24 µmol) sont dissous dans un mélange de 15 mL de MeOH et de 15 mL d'eau. A cette solution est ajouté 10 mg (27 umol) de EuCl3. 6H : 20 dissous dans 2,5 mL de MeOH et 2,5 mL d'eau. La solution est chauffée à 70°C pendant une heure. Après refroidissement le pH de la solution est remonté à 7,0 avec une solution à 0, 5% de NaOH dans l'eau. La solution est concentrée à l'évaporateur rotatif jusqu'à apparition d'un léger trouble, puis on ajoute du THF jusqu'à la formation d'un précipité. Le solide jaune est isolé par centrifugation puis séché sous vide pour donner 7 mg (8 µmol) de composé 26 (correspondant à un rendement de 33%) dont les caracté- ristiques sont les suivantes : FAB-/MS : 791,2 (30%), 828,2 ([26-H20-Na)] ~, 50%).

Exemple 20 Marquage d'un anticorps antî-digoxigénine par le complexe 9 et caractérisation par spectrométrie de masse.

0,5 mg de complexe 9 sont ajoutés à une solution d'anticorps anti-digoxigénine contenant 1,0 mg d'anticorps dissous dans 500 pL de solution tampon (tampon borate 50 mM, pH = 7. 0), correspondant à un rapport 9/anticorps de 30 : 1.

La solution est agitée à température ambiante pendant 24

heures, puis l'anticorps marqué est purifié selon la procé- dure décrite dans l'exemple 5 et stocké à 4°C.

La caractérisation par spectrométrie de masse MALDI-TOF est effectuée selon la procédure décrite dans l'exemple 5, conduisant à une masse de 49220 Da pour l'anticorps marqué (47880 Da pour l'anticorps libre), soit un taux de greffage de 2,5.