FROEHLICH WOLFGANG (DE)
GIESEN CLAUDIA (DE)
HENNEKES HARTWIG (DE)
JAROCH STEFAN (DE)
SKUBALLA WERNER (DE)
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| EP0542203A2 | 1993-05-19 |
| 1. | Die Erfindung betrifft LeukotrienB4Antagonisten der Formel I, worin Rl CH2OH, COOR4 oder CONRsRg, R2 H oder einen organischen Säurerest mit 115 CAtomen darstellt, R3 H, gegebenenfalls einfach oder mehrfach substituiertes C1C14Alkyl, C3C1 oCycloalkyl, gegebenenfalls unabhängig voneinander einfach oder mehrfach durch Halogen, Phenyl, C1C4Alkyl, C1C4Alkoxy, Fluormethyl, Chlormethyl, Trifluormethyl, Carbonyl, Carboxyl oder Hydroxy substituierter C6 C10Arylrest oder ein 56gliedriger aromatischer heterocyclischer Ring mit wenigstens 1 Heteroatom symbolisieren, R4 H, ClCloAlkyl, C3CoCycloalkyl, gegebenenfalls durch 13 Halogen, Phenyl, Fluormethyl,Chlormethyl,Trifluormethyl,C1C4Alkoxy, Carboxyl oder Hydroxy substituierter C6C10Arylrest, CH2CO(C6C10)Aryl oder ein 56gliedriger aromatischer heterocyclischer Ring mit wenigstens 1 Heteroatom bedeutet, B eine C1C10geradoder verzweigtkettige Alkylengruppe, die gegebenenfalls durch Fluor substituiert sein kann oder die Gruppe symbolisiert, D eine Direktbindung, Sauerstoff, Schwefel,C_C,CH=CR7, oder gemeinsam mit B auch eine Direktbindung bedeuten können, Y ein gegebenenfalls einfach oder mehrfach substituiertes C1CgAlkyl, C3 C10Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert durch Aryl, R5 und R6 gleich oder verschieden sind und H oder gegebenenfalls durch Hydroxygruppen substituiertes C1C4Alkyl oder R6 H und R5 C1C15Alkanoyl oder RgSO2darstellen, gegebenenfalls mit OH substituiert sind, R7 H, C1C5Alkyl, Chlor oder Brom bedeutet, R8 die gleiche Bedeutung wie R3 besitzt, m 13 bedeutet, n 25 ist sowie, wenn R4 Wasserstoff bedeutet, deren Salze mit physiologisch verträglichen Basen und deren Cyclodextrinclathrate. |
| 2. | Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der aligemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Aldehyd der Formel II, worin Y und m die oben angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls nach Schutz freier Hydroxygruppen mit einem Olefinierungsreagenz der allgemeinen Formel III, worin B, D und R3 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen und Rg vorzugsweise eine Alkylgruppe mit 15 CAtomen bedeutet, in Gegenwart einer Base umsetzt und die resultierende Ketofunktion reduziert und gegebenenfalls anschließend in beliebiger Reihenfolge Isomere trennt, freie Hydroxygruppen schützt und/oder geschützte Hydroxygruppen freisetzt und/oder die 1 Hydroxygruppe zur Carbonsäure oxidiert und/oder eine Carboxylgruppe verestert und/oder eine freie Carboxylgruppe in ein Amid überführt oder eine Carboxylgruppe mit einer physiologisch verträglichen Base in ein Salz überführt. |
| 3. | Pharmazeutische Präparate bestehend aus einem Leukotrien B4Derivat oder mehreren LeukotrienB4Derivaten der Formel I und üblichen Hilfsund Trägerstoffen. |
gebildet, das dann durch eine spezifische Hydrolase in das LTB4 umgewandelt wird.
Die Nomenklatur der Leukotriene kann foigenden Arbeiten entnommen werden : a) B. Samuelsson et. al., Prostaglandins 19,645 (1980) ; 17,785 (1979). b) C. N. Serhan et al., Prostaglandins 34,201 (1987).
Die physiologische und insbesondere die pathophysiologische Bedeutung des Leukotrien B4 wird in einigen neueren Arbeiten zusammengefaßt : a) The Leukotrienes, Chemistry and Biology eds. L. W. Chakrin, D. M. Bailey, Academic Press 1984. b) J. W. Gillard et al., Drugs of the Future 12,453 (1987). c) B. Samuelsson et al., Science 237,1171 (1987). d) C. W. Parker, Drug Development Research 10,277 (1987), e) W. R. Henderson. Annals of Interna ! Medicine 121,684 (1994). Hieraus ergibt sich, daß LTB4 ein wichtiger Entzündungsmediator für entzündliche Erkrankungen ist, bei denen Leukozyten in das erkrankte Gewebe einwandern.
Die Effekte von LTB4 werden auf zellulärer Ebene durch Bindung von LTB4 an einen spezifischen Rezeptor ausgelöst.
Von LTB4 weiß man, daß es die Adhäsion von Leukozyten an die Blutgefäßwand verursacht. LTB4 ist chemotaktisch wirksam, d. h. es löst eine gerichtete Wanderung von Leukozyten in Richtung eines Gradienten steigender Konzentration aus. Außerdem verändert es aufgrund seiner chemotaktischen Aktivität indirekt die vasculäre Permeabilität, wobei ein Synergismus mit Prostaglandin E2 beobachtet wird. LTB4 spielt offensichtlich bei entzündlichen, allergischen und immunologischen Prozessen eine entscheidende Rolle.
Leukotriene und insbesondere LTB4 sind an Hauterkrankungen beteiligt, die mit entzündlichen Prozessen (erhöhte Gefäßpermeabilität und Odembildung, Zellinfiltration), erhöhter Proliferation der Hautzellen und Juckreiz einhergehen, wie beispielsweise bei Ekzemen, Erythemen, Psoriasis, Pruritis und Akne.
Pathologisch erhöhte Leukotrien-Konzentrationen sind an der Entstehung vieler Dermatiden entweder ursächlich beteiligt, oder es besteht ein Zusammenhang zwischen der Persistenz der Dermatiden und den Leukotrienen. Deutlich
erhöhte Leukotrienkonzentrationen wurden beispielsweise in der Haut von Patienten mit Psoriasis oder atopischer Dermatitis, allergischer Kontaktdermatitis, bullöse Pemphigoide, verzögerte Druckurtikaria und allergischer Vasculitis gemessen.
Leukotriene und insbesondere LTB4 sind auch an Erkrankungen innerer Organe beteiligt, für die eine akute oder chronische entzündliche Komponente beschrieben wurde, z. B. : Gelenkerkrankungen (Rheumatische Arthritis) ; Erkrankungen des Respirationstraktes (Asthma und chronisch obstruktive Lungenerkrankungen (OPD)) ; entzündliche Darmerkrankungen (ulceröse Colitis und Morbus Crohn) ; sowie Reperfusionsschäden (an Herz-, Darm-oder Nierengewebe), die durch zeitweisen krankhaften Verschluß von Blutgefäßen entstehen, wie Glomerulonephritis, NSAID Gastropathien, Multiple Sklerose, Rhinitis und entzündliche Augenerkrankungen.
Weiterhin sind Leukotriene und insbesondere LTB4 bei der Erkrankung an multipler Sklerose beteiligt und bei dem klinischen Erscheinungsbild des Schocks (ausgelöst durch Infektionen, Verbrennungen oder bei Komplikationen bei der Nierendialyse oder anderen extra besprochenen Perfusionstechniken).
Leukotriene und insbesondere LTB4 haben weiterhin einen Einfluß auf die Bildung von weißen Blutkörperchen im Knochenmark, auf das Wachstum von glatten Muskelzellen, von Keratinozyten und von B-Lymphozyten. LTB4 ist daher bei Erkrankungen mit entzündlichen Prozessen und bei Erkrankungen mit pathologisch gesteigerter Bildung und Wachstum von Zellen beteiligt.
Erkrankungen mit diesem Erscheinungsbild stellen z. B. Leukämie oder Artherosklerose dar. Leukotriene und insbesondere LTB4 und Derivate sind zur Senkung erhöhter Triglyceridspiegel geeignet und wirken somit antiartherosklerotisch und gegen Fettleibigkeit.
Durch die Antagonisierung der Effekte insbesondere von LTB4 sind die Wirkstoffe und deren Darreichungsformen dieser Erfindung spezifische Heilmittel bei der Erkrankung von Mensch und Tier, bei denen insbesondere Leukotriene eine pathologische Rolle spielen.
Neben therapeutischen Möglichkeiten, die sich aus einer Antagonisierung der LTB4-Wirkung mit LTB4-Analoga ableiten lassen, konnte auch die Nützlichkeit und potentielle Anwendung von Leukotrien B4-Agonisten zur Behandlung von Pilzerkrankungen der Haut gezeigt werden (H. Katayama, Prostaglandins 34, 797 (1988)).
Die Erfindung betriffl Leukotrien-B4-Antagonisten der Formel I, worin Rl CH2OH, COOR4 oder CONR5R6, R2 H oder einen organischen Säurerest mit 1-15 C-Atomen darstellt, R3 H, gegebenenfalls einfach oder mehrfach substituiertes C1-C14-Alkyl, C3-C p-Cycloalkyl, gegebenenfalls unabhängig voneinander einfach oder mehrfach durch Halogen, Phenyl, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy, Fluormethyl, Chlormethyl, Trifluormethyl, Carbonyl, Carboxyl oder Hydroxy substituierter C6- C1 o-Arylrest oder ein 5-6gliedriger aromatischer heterocyclischer Ring mit wenigstens 1 Heteroatom symbolisieren, R4 H, Cl-Clo-Alkyl, C3-Clo-Cycloalkyl, gegebenenfalls durch 1-3 Halogen, C1-C4-Alkoxy,Fluormethyl,Chlormethyl,Trifluormethyl,Phenyl,C 1-C4-Alkyl, Carboxyl oder Hydroxy substituierter C6-C10-Arylrest, CH2-CO-(C6-C10)Aryl oder ein 5-6gliedriger aromatischer heterocyclischer Ring mit wenigstens 1 Heteroatom bedeutet, B eine C1-C10-gerad-oder verzweigtkettige Alkylengruppe, die gegebenenfalls durch Fluor substituiert sein kann oder die Gruppe
symbolisiert, D eine Direktbindung, Sauerstoff, Schwefel,-CC-,-CH=CR7, oder gemeinsam mit B auch eine Direktbindung bedeuten können, Y ein gegebenenfalls einfach oder mehrfach substituiertes C1-Cg-Alkyl, C3- C10-Cycloalkyl, gegebenenfalls substituiert durch Aryl, R5 und R6 gleich oder verschieden sind und H oder gegebenenfalls durch Hydroxygruppen substituiertes C1-C4-Alkyl oder R6 H und R5 C1-C15-Alkanoyl oder RgSO2-darstellen, gegebenenfalls mit OH substituiert sind.
R7 H, C1-C5-Alkyl, Chlor oder Brom bedeutet, R8 die gleiche Bedeutung wie R3 besitzt, m 1-3 bedeutet, n 2-5 ist sowie, wenn R4 Wasserstoff bedeutet, deren Salze mit physiologisch verträglichen Basen und deren Cyclodextrinclathrate.
Die Gruppe OR2 kann a-oder ß-ständig sein. Die Formel I umfaßt sowohl Racemate als auch die möglichen reinen Diastereomeren und Enantiomeren.
Als Alkylgruppen R4 kommen gerad-oder verzweigtkettige Alkylgruppen mit 1- 10 C-Atomen in Betracht, wie beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, tert.-Butyl, Pentyl, Neopentyl, Hexyl, Heptyl, Decyl.
Die Alkylgruppen R4 können gegebenenfalls ein-bis mehrfach substituiert sein durch Halogenatome, Alkoxygruppen, gegebenenfalls substituierte Aryl-bzw.
Aroylgruppen mit 6-10 C-Atomen (bezüglich mög ! icher Substituenten siehe unter Aryl R4), Dialkylamino und Trialkylammonium mit 1-4 C-Atomen im Alkyl- Teil, wobei die einfache Substitution bevorzugt sein soll. Als Substituenten seien beispielsweise genannt Fluor, Chlor oder Brom, Phenyl, Dimethylamino, Diethylamino, Methoxy, Ethoxy. Als bevorzugte Alkylgruppen R4 sind solche mit 1-4 C-Atomen zu nennen.
Die Cycloalkylgruppe R4 kann im Ring 3-10, vorzugsweise 5 und 6 Kohlenstoffatome enthalten. Die Ringe können durch Alkylgruppen mit 1-4 Kohlenstoffatomen substituiert sein. Beispielsweise seien genannt Cyclopentyl, Cyclohexyl, Methylcyclohexyl.
Als Arylgruppen R4 kommen sowohl substituierte wie auch unsubstituierte Arylgruppen mit 6-10 C-Atomen in Betracht, wie beispielsweise Phenyl, 1- Naphthyl und 2-Naphthyl, die jeweils substiuiert sein können duch 1-3 Halogenatome (F, Cl, Br), eine Phenylgruppe, 1-3 Alkylgruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen, eine Chlormethyl-. eine Fluormethyl-, Trifluormethyl-Carboxyl-, Hydroxy-oder Alkoxygruppe mit 1-4 C-Atomen. Bevorzugte Substituenten in 3- und 4-Stellung am Phenylring sind zum Beispiel Fluor, Chlor, Alkoxy oder Trifluormethyl, in 4-Stellung dagegen Hydroxy.
Als heterocyclische Gruppen R4 kommen 5-und 6-gliedrige aromatische Heterocyclen in Frage, die wenigsten 1 Heteroatom, vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten. Beispielsweise seien genannt 2-Furyl, 2- Thienyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, 3-Furyl, 3-thienyl, 2-Tetrazolyl u. a.
Als Säurereste R5 kommen solche von physiologisch verträglichen Säuren in Frage. Bevorzugte Säuren sind organische Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1-15 Kohlenstoffatomen, die der aliphatischen, cycloaliphatischen, aromatischen, aromatisch-aliphatischen und heterocyciischen Reihe angehören.
Diese Säuren können gesättigt, ungesättigt und/oder mehrbasisch und/oder in üblicher Weise substituiert sein. Als Beispiele für die Substituenten seien Cl-4- Alkyl-, Hydroxy-, C1 4-Alkoxy, Oxo-oder Aminogruppen oder Halogenatome (F, Cl, Br) erwähnt. Beispielweise seien folgende Carbonsäuren genannt : Propionsäure,Buttersäure,Isobuttersäure,Amelsensäure,Ess igsäure, Valeriansäure, Isovaleriansäure, Capronsäure, Onanthsäure, Caprylsäure, Undecylsäure,Laurinsäure,Tridecylsäure,Pelargonsäure,Cap rinsäure,
Myristinsäure, Pentadecylsäure, Trimethylessigsäure, Diethylessigsäure, tert.- <BR> <BR> <BR> Butylessigsaure, Cyclopropylessigsaure, Cyclopentylessigsäure,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Cyclohexylessigsäure, Cyclopropancarbonsäure, Cyclohexancarbonsäure,<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Pheny ! essigsäure, Phenoxyessigsäure, Methoxyessigsäure, Ethoxyessigsäure, Mono-, Di-und Trichloressigsäure, Diethylaminoessigsäure, <BR> <BR> <BR> <BR> Piperidinoessigsäure, Morpholinoessigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Benzoesäure, mit Halogen (F, Cl, Br) oder Trifluormethyl-, Hydroxy, C1 4-Alkoxy-oder Carboxy-Gruppen substituierte Benzoesäuren, <BR> <BR> <BR> <BR> Nikotinsäure, Isonikotinsäure, Furan-2-carbonsäure, Cyclopentylpropionsäure.
Als bevorzugte Arylsufonylreste und Alkansulfonylreste RgSO2-werden solche betrachtet, die sich von einer Sulfonsäure mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen ablei- ten. Als Sulfonsäuren kommen beispielsweise Methansulfonsäure, Cyclohexansulfonsäure,Ethansulfonsäure,Isopropansulfonsäu re, p-Chlorbenzolsufonsäure,N,N-Benzolsulfonsäure,p-Toluolsufo nsäure, N,N-Di-Dimethylaminosulfonsäure,N,N-Diisobutylaminosufonsä ure, butylaminosulfonsäure, Pyrrolidino-, Piperidino-, Piperazino-, M- Methylpiperazino-und Morpholinosulfonsäure in Frage.
Als Alkylgruppen R3 kommen gerad-und verzweigtkettige, gesättigte und ungesättigte Alkylreste, vorzugsweise gesättigte, mit 1-14, insbesondere 1-10 C- Atomen, in Frage, die gegebenenfalls durch gegebenenfalls substituiertes Phenyl (Substitution s. unter Aryl R5) substituiert sein können. Beispielsweise seien genannt Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isobutyl-, tert.-Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Butenyl-, Isobutenyl-, Propenyl-, Pentenyl-, Benzyl-, m- und p-Chlorbenzylgruppen. Sind die Alkylgruppen R3 Halogen-substituiert, kommen als Halogene Fluor, Chlor und Brom in Frage.
Als Beispiele für Halogen-substituierte Alkylgruppen R3 kommen Alkyle mit terminalen Trifluormethylgruppen in Betracht.
Die Cycloalkylgruppe R3 kann im Ring 3-10, vorzugsweise 3-6 Kohlenstoffatome enthalten. Die Ringe können durch Alkylgruppen mit 1-4
Kohlenstoffatomen gegebenenfalls durch Halogene substituiert sein.
Beispielsweise genannt seien Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Methyl-cyclohexyl, Fluor-cyclohexyl.
Als substituierte bzw. unsubstitiuerte Arylgruppen R3 kommen beispielweise in Betracht : Phenyl, 1-Naphthyl und 2-Naphthyl, die jeweils substituiert sein können durch 1-3 Halogenatome (F, Cl, Br), eine Phenylgruppe, 1-3 Alkylgruppen mit jeweils 1-4 C-Atomen eine Chlormethyl-, Fluormethyl-, Trifluormethyl-, Carboxyl, C1-C4 Alkoxy-oder Hydroxygruppe. Bevorzugt ist die Substitution in 3-und 4-Stellung am Phenylring zum Beispiel durch Fluor, Chlor, Alkoxy oder Trifluormethyl oder in 4-Stellung durch Hydroxy.
Als heterocyclische aromatische Gruppen R3 kommen 5-und 6-gliedrige Heterocyclen in Frage, die wenigstens 1 Heteroatom, vorzugsweise Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel enthalten. Beispielsweise seien genannt 2-Furyl, 1- <BR> <BR> <BR> <BR> Thienyl, 2-Pyridyl, 3-Pyridyl, 4-Pyridyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Pyrimidinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, 3-Furyl, 3-Thienyl, u. a.
Als Alkylengruppen B kommen geragkettige oder verzweigte, gesättigte oder ungesättigte Alkylenreste, vorzugsweise gesättigte mit 1-10, insbesondere mit 1- 5 C-Atomen, in Frage, die gegebenenfalls durch Fluoratome substituiert sein können. Beispielsweise seien genannt : Methylen, Fluormethylen, Difluormethylen, Ethylen, 1,2-Propylen, Ethylethylen, Trimethylen, Te- tramethylen, Pentamethylen, 1,2-Difluorethylen, 1-Fluorethylen, 1- Methyltetramethylen, 1-Methyl-tri-methylen, 1-Methylen-ethylen, 1-Methylen- tetramethylen.
Die Alkylengruppe B kann weiterhin die Gruppe darstellen, wobei n=2-5, bevorzugt 3-5 bedeutet.
Als Säurereste R2 kommen solche von physiologisch verträglichen Säureresten in Frage. Bevorzugte Säuren sind organische Carbonsäuren und Sulfonsäuren mit 1-15 Kohlenstoffatomen, die der aliphatischen, cyclo-aliphatischen, aromatischen, aromatisch-aliphatischen oder heterocyclischen Reihe angehören. Diese Säuren können gesättigt, ungesättigt und/oder mehrbasisch und/oder in üblicher Weise sustituiert sein. Als Beispiele für die Substituenten seien C1-4-Alkyl, Hydroxy, Cl-4-Alkoxy, Oxo-oder Aminogruppen oder Halogenatome (F, Cl, Br) erwähnt. Beispielsweise seien folgende Carbonsäuren Essigsäure,Propionsäure,Buttersäure,Isobuttersäure,genan nt:Ameisensäure, Capronsäure,Önanthsäure,Caprylsäure,Valeriansäure,Isova leriansäure, Undecylsäure,Laurinsäure,Tridecylsäure,Pelargonsäure,Cap rinsäure, Myristinsäure, Pentadecylsäure, Trimethylessigsäure, Diethylessigsäure, tert.- Butylessigsäure, Cyclopentylessigsäure, Cyclohexylessigsäure, Cyclohexancarbonsäure, Phenylessigsäure, Phen- Ethoxyessigsäure,Mono-,Di-undoxyessigsäure,Methoxyessigsä ure, Trichloressigsäure, Aminoessigsäure, Diethylaminoessigsäure, Milchsäure,Bernsteinsäure,Piperidinoessigsäure,Morpholino essigsäure, Adipinsäure, Benzoesäure, mit Halogen (F, Cl, Br) oder Trifluormethyl-, Hydroxy, Carboxy-GruppensubstituierteBenzoesäuren,oder Furan-2-carbonsäure,Cyclopentylpropionsäure.Nikotinsäure, Isonikotinsäure, Als bevorzugte Säurereste R2 und R3 werden solche Acylreste mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen betrachtet.
Die Alkylreste R5 und R6, die gegebenenfalls Hydroxygruppen enthalten, sind geradkettige oder verzweigte Alkylreste, insbesondere geradkettige wie zum Beispiel Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, besonders bevorzugt Methyl.
R7 als C1 s-Alkyi bedeutet geradkettige oder verzweigtkettige Alkylreste wie sie für R3 bzw. R4 bereits genannt wurden. Bevorzugte Alkylreste R7 sind Methyl, Ethyl, Propyl und Isopropyl.
Zur Salzbildung sind anorganische und organische Basen geeignet, wie sie dem Fachmann zur Bildung physiologisch verträglicher Salze bekannt sind.
Beispielsweise seien genannt Alkalihydroxide wie Natrium-und Kaliumhydroxid, Erdalkalihydroxide wie Calciumhydroxid, Ammoniak, Amine, wie Ethanolamin.
Diethanolamin, Triethanolamin, N-Methylglucamin, Morpholin, Tris- (hydroxymethyl)-methylamin usw.
Um zu den Cyclodextrinclathraten zu gelangen werden die Verbindungen der Formel I mit a-, ß-oder y-Cyclodextrin umgesetzt. Bevorzugt sindß- Cyclodextrinderivate.
Bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei die Reste die folgende Bedeutung haben : R1 ist CH2OH, CONRsR6, COOR4 mit R4 in der Bedeutung eines Wasserstoffatoms, eines Alkylrestes mit 1-10 C-Atomen, eines Cycloalkylrestes mit 5-6 C-Atomen, eines gegebenenfalls durch 1-2 Chlor, Brom, Phenyl, Cl-4- Alkyl, C1 4-Alkoxy, Chlormethyl, Fluormethyl, Trifluormethyl, Carboxy oder Hydroxy substituierten Phenylrestes.
Y ist eine Methylgruppe m ist 1-3 B ist eine geradkettige oder verzweigtkettige gesättigte oder ungesättigte Alkylengruppe mit bis zu 10 C-Atomen, die gegebenenfalls durch Fluor substituiert sein kann, oder die Gruppe mitn=2-5 ; D ist eine Direktverbindung, Sauerstoff, Schwefel, eine -C#C-Gruppe oder eine-CH=CR7-Gruppe mit R7 als Wasserstoff, C1-5-Alkyl, Chlor oder Brom ; B und D sind gemeinsam eine Direktbindung ;
R2 bedeutet Wasserstoff oder einen organischen Säurerest mit 1-15 C- Atomen ; R5 und R6 weisen die oben angegebenen Bedeutungen auf ; R3 ist ein Wasserstoffatom, C1 10-Alkyl, Cycloalkyl mit 5-6 C-Atomen, ein gegebenenfalls durch 1-2 Chlor, Brom, Phenyl, C1-4-Alkyl, C1-4-Alkoxy, Chlormethyl, Fluormethyl, Trifluormethyl, Carboxy oder Hydroxy substituierter Phenylrest und falls R4 ein Wasserstoff bedeutet, deren Salze mit physiologisch verträglichen Basen und Cyclodextrinclathrate.
Besonders bevorzugte Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel 1, wobei die Reste folgende Bedeutung haben : R1 ist CH2OH, CONR5R6, COOR4 mit R4 in der Bedeutung eines Wasserstoffsatoms, eines Alkylrestes mit 1-4 C-Atomen R2 bedeutet Wasserstoff oder einen organischen Säurerest mit 1-6 C- Atomen ; R3 ist ein Wasserstoffatom oder C1 10-Alkyl ; R5 und R6 weisen die oben angegebenen Bedeutungen auf ; B ist eine geradkettige oder verzweigtkettige Alkylengruppe mit bis zu 5 C- Atomen oder die Gruppe mit n=3-4 ; D ist eine Direktverbindung oder eine-C=C-Gruppe oder eine-CH=CR7- Gruppe mit R7 als Wasserstoff oder C1-5-Alkyl ; Y ist eine Methylgruppe m ist 1-2 B und D sind gemeinsam eine Direktbindung ;
und falls R4 ein Wasserstoffatom bedeutet, deren Salze mit physiologisch verträglichen Basen und deren Cyclodextrinclathrate.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Aldehyd der Formel II, worin Y und m die oben angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls nach Schutz freier Hydroxygruppen mit einem Olefinierungsreagenz der aligemeinen Formel III, worin B, D und R3 die oben angegebenen Bedeutungen aufweisen und Rg vorzugsweise eine Alkylgruppe mit 1-5 C-Atomen bedeutet, bevorzugt werden Methyl und Ethyl, in Gegenwart einer Base umsetzt und die resultierende Ketofunktion reduziert und gegebenenfalls anschließend in beliebiger Reihenfolge Isomere trennt, freie Hydroxygruppen schützt und/oder geschützte Hydroxygruppen freisetzt und/oder die 1-Hydroxygruppe zur Carbonsäure oxidiert und/oder eine Carboxylgruppe verestert und/oder eine freie Carboxylgruppe in ein Amid überführt oder eine Carboxylgruppe mit einer physiologisch verträglichen Base in ein Salz überführt.
Die Umsetzung der Verbindung der allgemeinen Formel II mit einem Olefinierungsreagenz der aligemeinen Formel III wird bei Temperaturen von- 80°C bis 100°C, vorzugsweise-20°C bis 80°C in einem aprotischen
Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, beispielsweise Tetrahydrofuran, Diethylether, Ethylenglykoldimethylether, Dimethylsulfoxid in Gegenwart einer Base vorgenommen. Als Basen kommen beispielsweise Natriumhydrid, Methensulfinylmethylnatrium, Kalium-tert.-butylat, Lithiumdiisopropylamid, 1,5- Diazabicyclo [4.3.0] non-5-en und DBU in Frage.
Die anschließende Redukion wird mit einem für die Reduktion von Ketonen geeigneten Reduktionsmittel wie beispielsweise Diisobutylaluminiumhydrid, Zinkborhydrid oder Natriumborhydrid vorzugsweise in Gegenwart von Certrichlorid usw. durchgeführt. Als Lösungsmittel kommen Diethylether, Tetrahydrofuran bzw. Methanol oder Gemische dieser Lösungsmittel in Frage.
Die Reduktion wird bei Temperaturen von-50°C bis 30°C, vorzugsweise-30°C bis 0°C vorgenommen.
Die Oxidation der 1-Hydroxygruppe wird nach den dem Fachmann bekannten Methoden vorgenommen. Als Oxidationsmittel können beispielsweise dienen : Pyridiniumdichromat (Tetrahedron Letters, 1979,399), Jones Reagenz (J.
Chem. Soc. 1953,2555) oder Platin/Sauerstoff (Adv. in Carbohydrate Chem. 17, 169 (1962) oder Collins-Oxidation (Tetrahedron Letters 1968,3363) und anschließende Jones-Oxidation. Die Oxidation mit Pyridiniumdichromat wird bei Temperaturen von 0°C bis 100°C vorzugsweise bei 20°C bis 40°C in einem gegen das Oxidationsmittel inerten Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid, durchgeführt.
Die Oxidaton mit Jones-Reagenz wird bei Temperaturen von-40°C bis +40°C, vorzugsweise 0°C bis 30°C in Aceton als Lösungsmittel ausgeführt.
Die Oxidation mit Platin/Sauerstoff wird bei Temperaturen von 0°C bis 60°C, vorzugsweise 20°C bis 40°C in einem gegen das Oxidationsmittel inerten Lösungsmittel, wie z. B. Essigester, durchgeführt.
Die Einführung der Estergruppe-COOR4 für R1, bei welcher R4 eine Alkylgruppe mit 1-10 C-Atomen darstellt, erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Die 1-Carboxy-verbindungen werden beispielsweise mit
Diazokohlenwasserstoffen in an sich bekannter Weise umgesetzt. Die Veresterung mit Diazokohlenwasserstoffen erfolgt z. B. dadurch, daß man eine Lösung des Diazokohlenwasserstoffs in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise in Diethylether, mit der 1-Carboxyverbindung in dem gleichen oder in einem anderen inerten Lösungsmittel, wie z. B. Methylenchlorid, vermischt. Nach beendeter Umsetzung in 1 bis 30 Minuten wird das Lösungsmittel enffernt und der Ester in üblicher Weise gereinigt. Diazoalkane sind entweder bekannt oder können nach bekannten Methoden hergestellt werden (Org. Reactions Bd. 8, Seiten 389-394 (1954)).
Die Einführung der Estergruppe-COOR4 für Ri, bei welcher R4 eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe darstellt, erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Beispielsweise werden die 1- Carboxyverbindungen mit den entsprechenden Arylhydroxyverbindungen mit Dicyclohexylcarbodiimid in Gegenwart einer geeigneten Base, beispielsweise Pyridin, Dimethylaminopyridin, Triethylamin, in einem inerten Lösungsmittel umgesetzt. Als Lösungsmittel kommen Methylenchlorid, Ethylenchlorid, Chloroform, Essigester, Tetrahydrofuran, vorzugsweise Chloroform in Frage.
Die Reaktion wird bei Temperaturen zwischen-30°C und +50°C, vorzugsweise bei 10°C durchgeführt.
Die Leukotrien-B4-Derivate der Formel I mit R4 in der Bedeutung eines Wasserstoffs können mit geeigneten Mengen der entsprechenden anorgansichen Basen unter Neutralisierung in ein Salz überführt werden.
Beispielsweise erhält man beim Lösen der entsprechenden Säuren in Wasser, das die stöchiometrische Menge der Base enthält, nach Abdampfen des Wassers oder nach Zugaben eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z.
B. Alkohol oder Aceton, das feste anorganische Salz.
Zur Herstellung eines Aminosalzes wird LTB4-Säure z. B. in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Ethanol, Aceton, Diethylether, Acetonitril oder Benzol gelöst und mindestens die stöchiometrische Menge des Amins der
Lösung zugesetzt. Dabei fallut das Salz gewöhnlich in fester Form an oder wird nach Verdampfen des Lösungsmittels in üblicher Weise isoliert.
Die Einführung der Amidgruppe-CONHR5 mit R5 in der Bedeutung von Alkanoyl erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden. Die Carbonsäuren der Formel I (R4=H), werden zunächst in Gegenwart eines tertiären Amins, wie beispielsweise Triethylamin, mit Chlorameisensäureisobutylester in das gemischte Anhydrid überführt. Die Umsetzung des gemischten Anhydrids mit dem Alkalisalz des entsprechenden Amids oder mit Ammoniak (Rs=H) erfolgt in einem inerten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, wie beispielsweise Tetrahydrofuran, Dimethoxyethan, Dimethylformamid, Hexamethylphosphorsäuretriamid, bei Temperaturen zwischen-30°C und +60°C, vorzugsweise bei 0°C bis 30°C. Eine weitere Herstellungsart für die Amide besteht in der Amidolyse des 1-Esters (R1 =COOR4) mit dem entsprechenden Amin.
Eine weitere Möglichkeit für die Einführung der Amidgruppe-CONHRg besteht in der Umsetzung einer 1-Carbonsäure der Formel I (R4=H), in der freie Hydroxygruppen gegebenenfalls intermediär geschützt sind, mit Verbindungen der Formel IV, 0 = C = N-R5 (IV) worin R5 die oben angegebene Bedeutung hat.
Die Umsetzung der Verbindung der Formel I (R4=H) mit einem Isocyanat der Formel IV erfolgt gegebenenfalls unter Zusatz eines tertiären Amins, wie z. B.
Triethylamin oder Pyridin. Die Umsetzung kann ohne Lösungsmittel oder in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise Acetonitril, Tetrahydrofuran, Aceton, Dimethylacetamid, Methylenchlorid, Diethylether, Toluol, bei Temperaturen zwischen-80°C bis 100°C, vorzugsweise bei 0°C bis 30°C, vorgenommen werden.
Zur Herstellung der übrigen Amide kann man beispielsweise die gewünschten Säureanhydride mit Ammoniak oder den entsprechenden Aminen umsetzen.
Enthält das Ausgangsprodukt OH-Gruppen im Leukotrien-B4-Rest, so werden diese OH-Gruppen auch zur Reaktion gebracht. Werden letztlich Endprodukte gewünscht, die freie Hydroxylgruppen enthalten, geht man zweckmäßigerweise von Ausgangsprodukten aus, in denen diese durch vorzugsweise leicht abspaltbare Ether-oder Acylreste intermediär geschützt sind oder werden.
Die Trennung von Diastereomeren und Enantiomeren erfolgt nach den dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise durch Säulenchromatographie und/oder HPLC.
Die als Ausgangsmaterial dienenden Verbindungen der allgemeinen Formel II können beispielsweise hergestellt werden, in dem man in an sich bekannter Weise ein Nitril der allgemeinen Formel V, worin m die oben angegebenen Bedeutungen aufweist, mit einem Halogenid der allgemeinen Formel (VI) Y-Hal (VI) in der Y die oben angegebene Bedeutung hat und Hal ein Halogenatom, wie Chlor, Brom oder lod ist, in Gegenwart von Lithiumdiisopropylamid alkyliert, das Nitril mit Natriumhydroxid in Ethylenglycol zur Säure verseift, den Methylether mit HBr spaltet und anschließend die Säure mit Methyliodid in Gegenwart von Kaliumcarbonat in den Ester der allgemeinen Formel (VII) uberführt.
Intermediärer Schutz der phenolischen Hydroxygruppe mit Benzylbromid, anschließende Reduktion der Estergruppe mit Diisobutytylaluminiumhydrid, Silylierung des entstandenen Alkohols mit Tert.-butyl-dimethylsilylchlorid und wieder Spaltung des zuerst hergestellten Benzylethers durch Hydrierung liefert das Phenol der allgemeinen Formel (VIII) Das so erhaltene Phenol wird mittels Trifluormethansulfonsäureanhydrid in das Triflat überführt und durch eine palladium-katalysierte Reaktion in Methanol und einer Kohlenmonoxidatmosphäre der Ester der aligemeinen Formel (IX) erhalten.
Reduktion des Ester der aligemeinen Formel (IX) mit Diisobutylaluminiumhydrid, Oxidation des primären Alkohols durch Braunstein, Wittig-Horner-Olefinierung mit dem Phosphonoessigsäuretriethyl oder-trimethylester, anschließende Hydrierung und Silyletherspaltung liefert den Alkohol der aligemeinen Formel (X) Oxidation des erhaltenen primären Alkohols z. B. mit dem Collinsreagenz oder dem Swern-Verfahren führen zu einem Aldehyd, der mittels Wittig-Horner- Olefinierung mit dem Phosphonoessigsäuretriethyl oder-trimethylester den Diester der allgemeinen Formel (XI) liefert Der Diester (XI) wird mit Diisobutylaluminiumhydrid zum entsprechenden Diol reduziert und der Allylalkohol mit Braunstein zum a, b-ungesättigten Aldehyd der allgemeinen Formel (II) oxidiert
Der Einbau der chemisch und metabolisch labilen cis-A6 7-Doppelbindung des LTB4 in einen cis-1,2-substituierten Cycloalkylring führt zu einer Stabilisierung, wobei insbesondere durch weitere Derivatisierung der funktionellen Gruppen und/oder strukturelle Veränderungen der unteren Seitenkette, LTB4-Derivate erhalten wurden, die als LTB4-Antagonisten wirken können (DE-A 3917597 und DE-A 42 27 790.6 und DE-A 41 08 351 und DE-A 41 39 886.8 und DE-A 42 42 390).
Es wurde nun gefunden, daß durch Einführung einer Alkylgruppe in die 7- Position und durch Einführung eines benzoannelierten Ringsystems für die 4,5,6,7-Position (LTB4-Nomenklatur, Zählweise beginnend beim Carboxyl-C- Atom mit 1) in derartigen Leukotrien B4-Derivaten eine längere Wirkungsdauer, größere Selektivität und bessere Wirksamkeit erzielt werden kann.
Die Verbindungen der Formel I wirken antientzündlich, antiallergetisch und antiproliferativ. Die Verbindungen sind außerdem zur Senkung erhöhter Triglyceridspiegel geeignet. Daneben besitzen sie antimykotische Eigenschaften. Folglich stellen die neuen Leukotrien-B4-Derivate der Formel I wertvolle pharmazeutische Wirkstoffe dar. Die Verbindungen der Formel I sind zur topischen und oralen Applikation geeignet.
Die neuen Leukotrien-B4-Derivate der Formel I eignen sich in Kombination mit den in der galenischen Pharmazie üblichen Hilfs-und Trägermitteln zur lokalen Behandlung von Erkrankungen der Haut, bei denen Leukotriene eine wichtige Rolle spielen, z. B. : Kontaktdermatitis, Ekzemen der verschiedensten Art, Neurodermatosen, Erythrodermie, Pruritis vulvae et ani, Rosacea,
Erythermatodes cutaneus, Psoriasis, Lichen ruber planus et verrucosus und ähnlichen Hauterkrankungen.
Außerdem sind die neuen Leukotrien-B4-Antagonisten zur Behandlung der multiplen Sklerose und der Symptome des Schocks geeignet.
Die Herstellung der Arzneimittelspezialitäten erfolgt in üblicher Weise, indem man die Wirkstoffe mit geeigneten Zusätzen in die gewünschte Applikationsform, wie zum Beispiel : Lösungen, Salben, Cremes oder Pflaster, überführt.
In den so formulierten Arzneimitteln ist die Wirkstoffkonzentration von der Applikationsform abhängig. Bei Lotionen und Salben wird vorzugsweise eine Wirkstoffkonzentration von 0,0001% bis 3% verwendet.
Darüberhinaus sind die neuen Verbindungen gegebenenfalls in Kombination mit den üblichen Trägermitteln und Hilfsstoffen auch gut zur Herstellung von Inhalationsmitteln geeignet, welche zur Therapie allergischer Erkrankungen der Atemwege wie zum Beispiel des Bronchialasthmas oder der Rhinitis verwendet werden können.
Ferner eignen sich die neuen Leukotrien-B4-Derivate auch in Form von Kapseln, Tabletten oder Dragees, die vorzugsweise 0,1 bis 100 mg Wirkstoff enthalten und oral appliziert werden oder in Form von Suspensionen, die vorzugsweise 1-200 mg Wirkstoff pro Dosiseinheit enthalten und rektal appliziert werden auch zur Behandlung von Erkrankungen innerer Organe, bei denen Leukotriene eine wichtige Rolle spielen, wie z. B. : allergische Erkrankungen des Darmtraktes, wie der Colitis ulcerosa und der Colitis granulomatosa.
In diesen neuen Applikationsformen eignen sich die neuen LTB4-Derivate neben der Behandlung von Erkrankungen innerer Organe mit entzündlichen Prozessen auch zur Behandlung von Erkrankungen bei denen leukotrienabhängig das gesteigerte Wachstum und die Neubildung von Zellen im Vordergrund stehen. Beispiele sind Leukämie (gesteigertes Wachstum
weißer Blutkörperchen) oder Artherosklerose (gesteigertes Wachstum glatter Muskelzellen von Blutgefäßen).
Die neuen Leukotrien-B4-Derivate können auch in Kombination, wie z. B. mit Lipoxygenasehemmern, Cyclooxygenasehemmern, Glukokortikoiden, Prostacyclinagonisten, Thromboxanantagonisten, Leukotrien D4-Antagonisten, <BR> <BR> <BR> <BR> Leukotrien E4-Antagonisten, Leukotrien-F4-Antagonisten, Phosphodiesterasehemmern, Calciumantagonisten, PAF-Antagonisten oder an- deren bekannten Therapieformen der jeweiligen Erkrankungen, verwendet werden.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Beispiel 1 3-{(8RS)-8-Methyl-8-[(1 E, 3E)-(5RS)-5-hydroxy-6, 6-trimethylen-9-phenyl-1,{(8RS)-8-Methyl-8-[(1 E, 3E)-(5RS)-5-hydroxy-6, 6-trimethylen-9-phenyl-1, 3- nonadien-8-inyl]-5, 6,7,8-tetrahydronaphth-2-yl}-propan-1-ol Zu einer Suspension von 660 mg Natriumhydrid (65% ig in Mineralöl) in 34 ml Ethylenglycoldimethylether tropft man bei 0°C unter Stickstoff eine Lösung aus 5,85 g 2-Oxo-3,3-trimethylen-6-phenyl-hex-5-in-phosphonsäuredimeth ylester in 34 ml Ethylenglycoldimethylether und rührt 30 Minuten bei 0°C. Dann tropft man eine Lösung aus 4,1 g des in Beispiel 1q) hergestellten Aldehyds in 34 ml Ethylenglycoldimethylether zu und rührt 4 Stunden bei 50°C. Anschließend wird in gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung gegossen, mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen mit halbkonzentrierter Natrium-chlorid-Lösung gewaschen. Man trocknet über Natriumsulfat und nach Filtration wird im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel. Mit Hexan/0-30% Essigester erhält man 4,51 g 3-{(8RS)-8-Methyl-8-[(1E,3E)-5-oxo-6,6-trimethylen-9-phenyl- 1,3-nonadien-8- inyl]-5,6,7,8-tetrahydronaphth-2-yl}-propan-1-ol als farbloses Öl.
IR (Film): 3440 (breit), 2932,2841,2709,1694,1682,1626,1501,1454,1105, 1058,980,819, 758 cm-1.
Zur Reduktion gibt man zu einer Lösung aus 4,69 g des vorstehend beschriebenen Ketons in 83 ml Methylenchlorid und 8,3 ml Tetrahydrofuran bei- 60°C 579 mg Certrichlorid Heptahydrat und rührt 20 Minuten bei dieser Temperatur. Zu dieser Lösung gibt man 588 mg Natriumborhydrid und rührt 1,5 Stunden bei-60°C. Anschließend tropft man 6,5 ml Aceton hinzu, rührt 15 Minuten, stellt den pH-Wert mit Eisessig auf pH7 ein und engt im Vakuum ein.
Der Rückstand wird mit Wasser/Ether 1 : 1 verdünnt, mit Ether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen mit halbkonzentrierter Natriumchlorid-Lösung gewa-schen. Man trocknet über Natriumsulfat und nach Filtration wird im Vakuum eingeengt. Man erhält ohne weitere Reinigung 4,46 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 3370 (breit), 1571,1490,1442,1280, cm-1.
Das Ausgangsmaterial für die obige Titelverbindung wird wie folgt hergestellt : 1a) 7-Methoxy-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yi-carbonitril Zu 154,6 ml Butyllithium gibt man bei 0°C unter Stickstoff 25,3 g Diisopropylamin in 121 ml Tetrahydrofuran und rührt 30 Minuten nach.
Anschießend werden 40,7 g 7-Methoxy-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl- carbonitril in 138 ml Tetrahydrofuran zum Reaktionsgemisch gegeben und Stunde gerührt. Nun gibt man 107,9 g Methyliodid in 374 ml N, N- Dimethylpropylenharnstoff zur Lösung, rührt 1 Stunde bei-30°C und 1 Stunde bei 0°C. Das Reaktionsgemisch wird auf gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung gegeben, mit Ether extrahiert, die vereinigten organischen Phasen mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt.
Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chroma-tographie an Kieselgel. Mit Hexan/0-10% Essigester erhält man 33,69 g der Titelver- bindung als farbloses ÖI.
IR (Film): 1614,1504,1322,1286,1241,1041, 867,811,735 cm-1.
1b) 7-Methoxy-1-methyl-1, 2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl-carbonsäure Zu einer Lösung von 45,7 g des in Beispiel 1a) hergestellten Nitrils in 1000 mi Ethylenglykol gibt man 280 g Natriumhydroxyd und rührt 16 Stunden bei 160°C. Ansch ! ieß. end wird abgekühlt, auf Wasser gegeben und mit konzen- trierter Salzsäure auf pH 1,5 eingestellt. Nun wird auf 0°C gekühlt, 2 Stunden gerührt, der Niederschlag abgesaugt und im Vakuum getrocknet.
Man erhält 46 g der Titelver-bindung als weiße Kristalle.
IR (CHC13) : 3037 (breit), 1505,1464,1284,1184,1043, 884 cm-1.
1 c) 7-Hydroxy-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl-carbonsaure -<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> methylester 20 g der in Beispiel 1 b) hergestellten Säure werden mit 100 ml Bromwasserstoff (47% ig) versetzt und 18 Stunden bei 140-150°C gerührt.
Anschließend wird auf Eiswasser gegeben, mit Natriumchlorid gesättigt und mit Essigester extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in 128 ml Aceton und 57 ml Dimethylsulfoxid gelöst, mit 13,9 g Kaliumcar- bonat gefoigt von 14,3 g Methyliodid versetzt und 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird der Niederschlag abgesaugt, mit Essigester nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Ether verdünnt, mit Wasser und gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatograpie an Kieselgel. Mit Hexan/0-50% Ether erhält man 12,4 g der Titelverbindung als farbloses 01.
IR (CHC13) : 3595,3402 (breit), 2950,1720,1612,1505,1435,1287,1259, 922,868 cm-1. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>1 d) 7-Benzyloxy-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl-carbonsä ure- methylester Zu einer Lösung von 12,4 g des in Beispiel 1c) hergestellten Esters in 150 ml Dimethylformamid gibt man 36,6 g Cäsiumcarbonat gefolgt von 19,2 g Benzylbromid und rührt 20 Stunden unter Stickstoff bei Raumtemperatur.
Anschließend saugt man ab, wäscht mit Essigester und verdünnt das Filtrat mit Ether. Die organische Phase wird mit Wasser und halbkonzentrierter Natriumchtorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel. Mit Hexan/0- 10% Ether erhält man 18,2 g der Titelverbind ung als farbloses 01.
IR (Film) : 1610,1503,1454,1377,1283,1237, 1194,1108,1026,809,738 cm-1.
1e) 7-Benzyloxy-1-methyl-1, 2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl-methanol Zu einer Lösung aus 18,2 g des unter Beispiel 1d) hergestellten Esters in 290 ml Toluol gibt man bei-70°C unter Stickstoff 98 ml Diisobutylaluminiumhydrid (20% ig in Toluol) und rührt 2 Stunden.
Anschließend werden vorsichtig 5 ml Isopropanol zugetropft und 10 Minuten gerührt. Nun wird mit Wasser versetzt, 2 Stunden bei Raum- temperatur gerührt, der weiße Niederschlag abfiltriert und gut mit Essigester gewa-schen. Nach dem Einengen des Filtrats im Vakuum erhält man 18,1 g der Titelver-bindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 3386 (breit), 2930,2882,1607,1574,1495,1454,1380,1285, 1235.1026,924,858,797,733 cm-1. lfl 7-Benzyloxy-1-methyl-1, 2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl-methanol-tert- butyldimethylsilylether Zu einer Lösung aus 18,1 g des unter Beispiel 1e) hergestellten Alkohols in 310 ml N, N-Dimethylformamid gibt man 11,4 g Imidazol gefolgt von 12,6 g tert.-Butyldimethyl-silylchlorid und rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff. Anschließend verdünnt man mit Ether/Hexan 1 : 1 und wäscht die organische Phase wird mit Wasser und halbkonzentrierter Natriumchlorid-Lösung. Nach Trocknung über Natriumsulfat und Filtration wird im Vakuum eingeengt. Man erhält 26,1 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 3040,2928,2856,1609,1574,1496,1471,1383,1255,1094, 837, 775, cm-1.
1g) 7-Hydroxy-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydronaphth-1-yl-methanol-te rt- butyldimethylsilylether Zu einer Lösung aus 26,1 g des unter Beispiel 1f) hergestellten Silylethers in 261 ml Essigester gibt man 2,6 g Pd/C (10% ig) und rührt 24 Stunden unter Wasserstoff. Anschließend wird über Celite abgesaugt, mit Essigester nachgewaschen und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel.
Mit Hexan/0-20% Ether erhält man 16,9 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 3420 (breit), 839, 777, 735 cm-1.
1h) 8-Methyl-8-(tert-butyidimethylsilyloxymethyl)-5,(tert-butyid imethylsilyloxymethyl)-5, 6,7,8-tetrahydronaphth- 2-yl-carbonsäuremethylester Zu einer Lösung von 15,8 g des unter Beispiel 1 g) hergestellten Phenols in 26,5 ml Pyridin tropft man bei 0°C unter Stickstoff 16.05 g Trifluormethansulfonsäureanhydrid und rührt 20 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend gibt man die Reaktions-mischung auf Wasser und extrahiert mit Ether. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser, 10% iger Salzsäure, Wasser und halbgesättigter Natrium-chlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Man erhält 21,2 g des entsprechenden Triflates als schwach ge ! bgefärbtes Öi.
IR (Film) : 3010,2930,2880,2837,1607,1581,1490,1472,1424,1362, 1211,1044,1006,921,838,776,730 cm-1.
Zu einer Lösung von 17,2 g des zuvor hergestellten Triflates in 40 ml Methanol und 59 ml Dimethylsulfoxid gibt man 4,38 g Triethylamin gefolgt von 133 mg Palladium (Il)-acetat und 244 mg Bis (diphenylphosphino) propan. Durch dieses Reaktionsgemisch wird 3 Minuten CO-Gas geleitet und 18 Stunden unter CO-Atmosphäre bei 80°C gerührt. Anschließend wird auf gesättigte Natriumchlorid-Lösung gegeben und mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit halbkonzentrierter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromato-graphie an Kieselgel. Mit Hexan/ 0-10% Ether erhält man 7,1 g der Titelverbindung als farbloses ÖI.
IR (Film) : 3020,2929,2843,1728,1610,1573,1434,1409,1386,1361, 1250,1191,1108,1006,987,939,837,776 cm-1.
1 i) 8-Methyl-8-(tert-butyid imethylsilyloxymethyl)-5,(tert-butyid imethylsilyloxymethyl)-5, 6,7,8-tetrahydronaphth- 2-yl-methanol Zu einer Lösung von 7,1 g des unter Beispiel 1h) hergestellten Esters in 100 mi Toluol tropft man bei-70°C unter Stickstoff 34 ml Diisobutylaluminiumhydrid (20% ig in Toluol) und rührt 2 Stunden.
Anschließend wird 1 ml Isopropanol zugetropft und 10 Minuten gerührt.
Nun wird mit Wasser versetzt, 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der weiße Niederschlag abfiltriert und gut mit Essigester gewaschen. Nach dem Einengen des Filtrats im Vakuum erhäit man 6,5 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 3347 (breit), 1386,1361.1255,1095, 939,836,775, 730 cm-1. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>1j) 8-Methyl-8- (tert-butyldimethylsilyloxymethyl)-5,6,7,8-tetrahydronaphth- <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 2-yl-carbaldehyd Zu einer Lösung von 6,49 g des unter Beispiel 1 i) hergestellten Alkohols in 112 ml Toluol gibt man 17,6 g Mangan (IV) oxid und rührt 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff. Anschließend wird über Celite abgesaugt, mit Essigester nach-gewaschen und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Man erhält 5,83 g der Titelver-bindung als schwach gelb- gefärbtes Öl.
IR (Film) : 2930,2840,2720,1698,1602,1570,1470,1385,1360,1255, 1210,1097,1006,931,901,837,776,730cm-1.
1k) (E)-3- [8-Methyl-8- (tert-butyidimethylsilyloxymethyl)-5,6,7,8- tetrahyd ronaphth-2-yl-]-propensäu reethylester Zu einer Suspension von 1,34 g Natriumhydrid (65% ig in Mineralöl) in 27 mi Ethylenglycoldimethylether gibt man bei 0°C unter Stickstoff eine Lösung von 8,18 g Phosphonoessigsäuretriethylester in 27 ml Ethylenglycoldimethylether und rührt 30 Minuten. Anschließend gibt man eine Lösung von 5,81 g des unter Beispiel 1j) hergestellten Aldehyds in 27 ml Ethylenglycoldimethylether dazu und rührt 4 Stunden bei 50°C. Nun
wird auf gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung gegeben und mit Ether ex- trahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit halbgesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel. Mit Hexan/0-10% Ether erhält man 6,54 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 2931,2870,1713,1636,1605,1470,1409,1388,1366,1316, 1006,983,938,837,775 cm-1.
11) 3- [8-Methyl-8- (tert-butyldimethylsilyloxymethyl)-5,6,7,8- tetrahydronaphth-2-yl-]-propansäureethylester Zu einer Lösung von 9. 86 g des unter Beispiel 1k) hergestellten Esters in 100 ml Essigester gibt man 986 mg Palladium/Kohle (10% ig) und rührt 18 Stunden bei Raum-temperatur unter einer H2-Atmosphäre Anschließend wird über Celite abgesaugt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Man erhält 9,69 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 1371,1255,1160,1095,939, 837, 775 cm-1.
1 m) 3- (8-Methyl-8-hydroxymethyl-5, 6, 7, 8-tetrahydronaphth-2-yl-)- propansäureethyl-ester Zu einer Lösung von 8,61 g des unter Beispiel 11) hergestellten Esters in 90 ml Tetrahydrofuran gibt man bei Raumtemperatur unter Stickstoff 13,9 g Tetrabutyl-ammoniumfluorid Trihydrat und rührt 5 Stunden. Anschließend wird mit Ether verdünnt und die organische Phase mit Wasser gewaschen.
Nach Trocknen über Natriumsulfat und Filtration wird im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chro- matographie an Kieselgel. Mit Hexan/0-25% Ether erhält man 5,31 g der Titelverbindung als farbloses Öl.
IR (Film) : 3344 (breit), 2932,1732,1613,1504,1455,1372,1255,1163, 1038,861,820,741 cm-1.
1 n) 3- (8-Formyl-8-methyl-5,6,7,8-tetrahydronaphth-2-yl-)-propansä ure- ethylester Zu einer Lösung von 3,04 g Oxalylchlorid in 23 ml Methylenchlorid wird bei -70°C unter Stickstoff eine Lösung von 4,05 g Dimethylsulfoxid in 15 ml Methylenchlorid vorsichtig zugetropft und 10 Minuten gerührt. In dieses Reaktionsgemisch gibt man nun eine Lösung von 5,3 g des unter Beispiel 1m) hergestellten Alkohols in 15 ml Methylenchlorid und rührt 1,5 Stunden bei-60° bis-70°C nach. Anschließend tropft man 5,43 g Triethylamin zu, rührt 1,5 Stunden und gibt das Reaktionsgemisch auf Wasser. Nun wird mit Methylenchlorid extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden mit 1N Schwefelsäure, gesättigter Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit gesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Man erhält 5.3 g der Titelverbindung als schwach gelbgefärbtes Öl.
IR (Film) : 1613,1573,1504,1455,1372,1346, 723 cm-1.
1 (E)-3- [8- (2-Ethoxycarbonyl-ethenyl)-8-methyl-5,6,7,8-tetrahydronaphth - 2-yl]-propansäureethylester Zu einer einer Suspension von 1,42 g Natriumhydrid (65% ig in Mineralöl) in 28 ml Ethylenglycoldimethylether gibt man bei 0°C unter Stickstoff eine Lösung von 8,64 g Phosphonoessigsäuretriethylester in 28 ml Ethylenglycoldimethylether und rührt 30 Minuten. Anschließend gibt man eine Lösung von 5,29 g des unter Beispiel 1 n) hergestellten Aldehyds in 28 ml Ethylenglycoldimethylether bei 0°C dazu und rührt 18 Stunden bei 40°C. Nun wird auf gesättigte Ammoniumchlorid-Lösung gegeben und mit Ether extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit halbgesättigter Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und nach Filtration im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel. Mit Hexan/0- 10% Ether erhält man 6,12 g der Titelverbindung als farbloses ÖI.
IR (Film) : 1500,1454,1372,1305,1270, 899,857,814,726 cm-1.
1p) (E)-3-[8-(3-Hydroxypropenyl)-8-methyl-5, 6,7,8-tetrahydronaphth-2-yl]- propan-1-ol Zu einer Lösung von 6,1 g des unter Beispiel 10) hergestellten Esters in 100 ml Toluol tropft man bei-70°C unter Stickstoff 60 ml Diisobutylaluminiumhydrid (20% ig in Toluol) und rührt 2 Stunden.
Anschließend werden 6 ml Isopropanol zugetropft und 10 Minuten gerührt.
Nun wird mit Wasser versetzt, 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, der weiße Niederschlag abfiltriert und gut mit Essigester gewaschen. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chroma-tograhie an Kieselgel. Mit Hexan/0-60% Essigester erhä ! t man 2,93 g der Titelverbin-dung als farbloses Öl.
IR (Film): 3408 (breit), 1613,1498,1454,1372,1242, 816cm-1. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> 1q) (E)-3- [8- (2-Formylethenyl)-8-methyl-5,6,7,8-tetrahydronaphth-2-yl]-&l t;BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> propan-1-ol Zu einer Lösung von 4,29 g des unter Beispiel 1p) hergestellten Alkohols in 100 mi Toluol gibt man 14,3 g Mangan (IV) oxid und rührt 5 Stunden bei Raumtemperatur unter Stickstoff. Anschließend wird über Celite abgesaugt, mit Essigester nachge-waschen und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Man erhält 4,12 g der Titelverbindung als schwach gelb- gefärbtes Öl.
IR (Film) : 3417 (breit), 2932,2842,2731,1682,1629,1498,1454,1375, 1144,1105,1057,979,897,818,732 cm-1.
Beispiel 2 <BR> <BR> <BR> <BR> 3- { (8RS)-8-Methyl-8- [ (l E, 3E)- (5RS)-5-hydroxy-6, 6-trimethylen-9-phenyl-1,3-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> nonadien-8-inyl]-5,6,7,8-tetrahyd ronaphth-2-yl}-propansäu re Eine Suspension aus 2 g Platindioxid in 28 ml Essigester wird zuerst 2 Stunden unter Wasserstoff-Atmosphäre und dann, vorsichtig (Knallgas), 2 Stunden unter Sauerstoff-Atmos-phäre gerührt. Zu dieser Suspension gibt man eine Lösung
aus 200 mg des in Beispiel 1) beschriebenen Alkohols in wenig Essigester und rührt 18 Stunden in einer 02-Atmosphare. Anschließend wird über eine G4- Fritte abgesaugt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Den so erhaltenen Rückstand reinigt man durch Chromatographie an Kieselgel. Mit Hexan/0-60% Essigester erhält man 93,3 mg der Titelverbindung als farbloses 0I.
IR (Film) : 3310 (breit), 1407, 1006,756 cm-1. Dieses ist die bevorzugte Ausführungsform.
In vivo Testsystem (i). Herstellung von humanen polymorphnukleraren Leukozyten (PMN) PMNs von gesunden Freiwilligen werden aus heparinisiertem venösem Blut durch Dextran-Sedimentation und anschließender Zentrifugation über Ficoll-Histopaque (3 isoliert. Die verbleibenden Erytrozyten werden durch hypotonische Lyse in 0,2-prozentiger Natriumchlorid-Lösung beseitigt. Die PMNs werden in Hank's ballenced salt solution (HBSS) resuspendiert und mit Ei-Albumin von Hühnern (OVA) oder Rinder-Serum-Albumin (BSA) versetzt.
(ii). LTB4-Rezeptor-Kompetitions-Bindungsversuch Humane PMNs werden mit Tritium markiertem Leukotrien B4 (LTB4) in Gegenwart oder Abwesenheit von den getesteten Substanzen in Konzentrationen von 10 umol/l bis 0,05 mmol/l in HBSS zusammen mit OVA inkubiert. Zell-gebundenes, tritiummarkiertes LTB4 wird von den freien Liganden durch Vakuum-Filtration durch einen Glasfaser-Filter getrennt und in einem Szintillations-Meßgeråt gemessen. Die nicht spezifische Bindung von tritiummarkiertem LTB4 wird in Gegenwart von einem Überschuß an unmarkiertem LTB4 (500 mol/1) bestimmt. Der Kompetitionsfaktor (CF) wird aus dem Verhältnis von der Konzentration der Substanz zu der Konzentration des LTB4 errechnet, was zu einer 50-prozentigen Reduktion der tritiummarkierten LTB4 Rezeptor Bindung führt.
(iii). LTB4-induzierter Chemotaxis-Versuch Der Chemotaxis-Versuch wird mit modifizierten Boyden-Kammern ausgeführt, die aus Transweli (Modulen mit polyvinylpyrrolidon-ummantelten Polykarbon-Filtern mit einer Porengrößen von 3 um besteht. Der obere Kammerteil enthält die humanen PMNs in HBSS, welches mit BSA oder OVA ergänzt ist. Der untere Kammerteil wird allein mit Puffer oder mit dem chemotaktisch aktiven Leukotrien B4 (LTB4) in einer Konzentration im Rahmen von 1 nmol/l bis 100 nmol/l in Gegenwart oder Abwesenheit von der Testsubstanz hinzugegeben. Die Kammer wird für 60 Minuten in wassergesättigter Atmosphäre mit 5 % Kohlendioxid inkubiert. Die Anzahl der PMNs, die in den unteren Kammerteil gewandert sind, wird durch die Messung der Aktivität des Enzyms Myeloperoxidase (MPO) in einem kalibrierten Versuch bestimmt. Die Enzymaktivität wird spektrometisch (450 nm) durch Bestimmung der Rate an H202- abhängiger Oxidation vom aromatischen Amin 3,3,', 5, 5'-Tetramethylbenzidin (TMB) gemessen.
Der EC5o-Wert wird graphisch durch die nicht lineare Regressionkurve bestimmt. Der KB - Wert beschreibt das Vermögen des kompetitiven Antagonisten. Der KB - Wert wird als die Antagonisten-Konzentration ermittelt, der erforderlich ist, den ECSo-Wert des Agonisten um den Faktor 2 anzuheben.
Der KB - Wert wird wie folgt berechnet : KB = [LTB4-Rezeptor-Antagonist]/ (DR-1) (DR = ist das Verhältnis von der LTB4 Konzentration, die für die halb-maximale Stimulation in Gegenwart des Antagonisten benötigt wird, zu der LTB4 Konzentration, die für die halb-maximale Stimulation in Abwesenheit des Antagonisten benötigt wird.) (iv). LTB4/lloprost-induzierte Hautentzündung in den Ohren von Mäusen Weibliche NMRI-Mäuse mit einem Gewicht von 26 bis 28 g und einem Alter von 5 bis 6 Wochen werden für dieses in vivo Experiment verwendet. Zehn Tiere pro Gruppe werden nach dem Zufallsprinzip in die verschiedenen Behandlungsgruppen eingeteilt und einzeln gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zum Futter und Wasser. Um die orale Aufnahme von topisch zu applizierendem LTB4/lloprost Lösungen zu vermeiden, werden Sperr-Halsbänder um den Hals der Tiere unter Ether-Narkose kurz vor der topischen Applikation befestigt.
Leukotrien B4 (LTB4) und das stabilen Prostacyclin-Derivat Iloprost wird in Ethanol/Isopropylmyristat (95 + 5 v/v) bei einer Konzentration von 0,003 % (w/v) gelöst.
10 pi der LTB4/lloprost-Lösung wird topisch auf der äußeren Oberfläche eines jeden Ohres (Fläche etwa 1 cm2/Ohr) verabreicht. Dieses entspricht einer Dosis von 0, 3µg pro Ohr oder etwa 0,3 µg pro cm2. Tiere, die allein mit LTB4/lloprost-Lösung behandelt werden, entwickeln die typischen Merkmale einer entzündeten Haut unter Bildung von Ödemen und Infiltration von Neutrophilen. Diese Tiere dienen als Positiv- Kontrolle. Tiere, die allein mit Ethanol/Isopropylmyristat (95 + 5 v/v) auf der äußeren Oberfläche eines jeden Ohres (Fläche etwa 1 cm2/Ohr) behandelt werden, dienen als Negativ-Kontrolle.
Der Effekt des LTB4-Rezeptor-Antagonisten auf die LTB4/lloprost induzierte Entzündungsreaktion wird entweder bei einer topischen oder bei einer intragastralen Verabreichung von der Testsubstanz bestimmt.
Für die topische Applikation wird die Testsubstanz in einer LTB4/lloprost-Lösung in verschiedenen Konzentration gelost. 10 ut dieser Lösung wird topisch auf der äußere Oberfläche des Ohr aufgetragen.
Für die intragastrale Applikation wird der LTB4-Rezeptor-Antagonist in Ethanol gelost. Direkt nach der topische Verabreichung mit LTB4/lloprost wird der LTB4-
Rezeptor-Antagonist oder nur das Lösungsmittel intragastral bei verschiedenen Dosen <BR> <BR> <BR> mit Hilfe einer Sonde verabreicht Die höchste Endkonzentration von Ethanol ist 3 %.
Die Menge an Ethanol nimmt mit weiteren Verdünnungsschritten ab.
Die Tiere werden 24 Stunden nach dem Setzen der entzündlichen Reaktion getötet. Die Ohren werden abgetrennt, gewogen, schock-gefroren und für weitere Untersuchungen gelagert. Die Peroxidase Aktivität wird spektrometrische in dem Homogenat von der Ohrhaut bestimmt. Das Gewebe wird in HTAB-Puffer (0.5% Hexadecyltrimethylammoniumbromid (w/v) in 10-3 mol/I 3- [N- morpholino] propansulfonsäure mit pH 7,0) für 20 Sekunden mit einem Poltron PT 3000 (Kinematica AG, Schweiz) bei einer Rotation von 30000 Umdrehungen pro Minute homogenisiert. Das Homogenat wird für 20 Minuten bei 10 °C und bei 14500 Umdrehungen pro Minute (20000g) in einer Sorvall RC2-B Zentrifuge (SM-24 Rotor) zentrifugiert. Der wäßrige Überstand wird abgesaugt und auf seine Peroxidase Aktivität bei einer Verdünnung von 1 zu 50 in HTAB-Puffer ausgetestet. Die Peroxidase Aktivität wird durch photomethrische Messung der Rate an H202-abhängigen Oxidation des aromatischen Amins 3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) bestimmt. In einer 96-Loch- Mikrotiterplatte werden die verdünnten Überstände mit TMB-Lösung und Hydrogenperoxid inkubiert (Lösung von 6,5 mg 3,3', 5,5'- Tetramethylbenzidindihydrochlorid in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) ; 1 : 100 (v/v) gelöst mit 0,1 mol/I Natrium-Acetat-Zitrat-Puffer, pH 6,0, endgültige Konzentration in der Inkubationsmixtur : 1,57 a 10-4 mol/1) (Hydrogenperoxid 30% H202 1 : 16860 (v/v) gelöst mit 0.1 mol/I Natrium-Acetat-Zitrat-Puffer, pH 6,0, endgültige Konzentration in der Inkubationsmixtur : 4.93 # 10-5 mol/l). Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird die Reaktion durch Zugabe von 0,5 mol/l Schwefelsäure gestoppt. Die Extinktion wird bei 450 nm (maximale Absoption) in einer Mikrotiter-Platten Meßgerät bestimmt.