Die Erfindung betrifft eine Anordnung sowie ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie. Auch betrifft die Erfindung die Verwendung der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie zur Um wandlung oder Ergänzung eines Mikroskops in ein Lichtblattmikroskop.

Die optische Mikroskopie ist prinzipiell in ihrer räumlichen Auflösung durch Beugung be grenzt und, je nach Wellenlänge, auf ca. 250 nm beschränkt. Die überwiegende Zahl an mole kularbiologischen und damit auch biomedizinisch relevanten Prozessen findet allerdings auf einer Skala unterhalb dieser Grenze statt. So ist zum Beispiel das HI Virus (HIV-1) mit ca. 120 nm Durchmesser um einen Faktor 2 kleiner als die Auflösungsgrenze. Als weiteres Bei spiel sind Ribosomen, die Protein-Fabriken der Zelle, noch wesentlich kleiner als 100 nm. Diese Strukturgrößen waren uns daher bisher nur durch Röntgenstrukturanalyse oder Elektro nenmikroskopie zugänglich. Im Jahr 2014 wurde der Nobelpreis für Chemie an die Physiker Stefan Hell, W.E. Moerner, und Eric Betzig verliehen, um damit ihre Entdeckung von Metho den, die zur Umgehung der optischen Beugungsgrenze geeignet sind, zu würdigen. Bisher konnten diese Methoden jedoch in der Mehrzahl nur mit hohem Kostenaufwand und nicht in lebenden Zellen genutzt werden.

Eine derzeit hochattraktive Methode zur hochauflösenden Abbildung lebender Zellen und Organismen ist die Lichtblattmikroskopie (SPIM - Selective Plane Illumination Microscopy). Hier wird z.B. mithilfe einer Zylinderlinse ein ca. 1-2 pm dünnes Lichtblatt erzeugt und seit lich in eine Probe eingestrahlt. Die so beleuchtete Fläche innerhalb der Probe wird dann senk recht zu diesem Lichtblatt (also unter 90° zur Anregungsfläche) abgebildet. Durch Trennung der Anregungs- und der Detektionsebene wird immer nur der Teil der Probe mit Licht durch strahlt, der auch zur Signalerzeugung benötigt wird. Dadurch wird diese Methode sehr kon trastreich und ist äußerst probenschonend. Dieses Prinzip wurde zuerst von Zsigmondy 1912 zur Untersuchung von kolloidalen Lösungen eingesetzt und geriet dann für lange Zeit in Ver gessenheit. Erst in der 1990er Jahren wurde diese Methode wieder entdeckt und hat seitdem rapide an Interesse gewonnen und wurde bereits von mehreren Anbietern kommerziell umge setzt. Ein Problem dieser konventionellen Lichtblattmikroskopie ist allerdings, dass sie in ihrer räumlichen Auflösung immer noch durch das optische Beugungslimit begrenzt ist. Hier sind gerade in jüngerer Zeit interessante Varianten aufgekommen, die dieses Beugungslimit in Kombination mit der Erzeugung von Interferenzmustern umgehen. Die erste Veröffentlichung in dieser Richtung stammt aus dem Jahr 2008 (L. Shao et al., I(5)S: Wide-field light microscopy with 100-nm-scale resolution in three dimensions. Biophys J 94, 4971-4983 (2008)). Hier wird ein dreidimensionales Interferenzmuster auch in axialer Richtung erzeugt, um eine weitestgehend isotrope Auflösung von ca. 100 nm in sämtlichen Raumrichtungen zu erzeugen. Die Auflösungsverbesserung in axialer Richtung wird hier durch zwei entgegenge setzt angeordnete hochauflösende Objektive erreicht, deren Strahlen miteinander zur Interfe renz gebracht werden. Diese Implementierung ist allerdings höchst aufwändig und teuer. Au ßerdem beschränkt sie das zur Verfügung stehende Probenvolumen auf kleinste Probenkam mern, mit einer axialen Dicke von max. ca. 200 mih Aufgrund dieser Einschränkungen wurde diese Methode seither nicht weiter eingesetzt. Vor ca. 20 Jahren wurde schon einmal versucht, die Mikroskopie mit entgegengesetzt angeordneten Mikroskopobjektiven als 4 -Mikroskopie kommerziell umzusetzen (Leica 4 -Mikroskop). Dieses System war allerdings sehr teuer und konnte sich, auch aufgrund des hohen täglichen Justier-Aufwands nicht am Markt durchset zen. Vor kurzem wurde in der Arbeitsgruppe von Emst Stelzer am Buchmann-Institute for Molecular Life Sciences an der Wolfgang-Goethe-Universität Frankfurt gezeigt, dass die Lichtblattmikroskopie, in Verbindung mit gegenläufig erzeugten Lichtblättern, durch die sich ein stehendes Interferenzmuster im Lichtblatt ausbildet, ebenfalls zur signifikanten Erhöhung der räumlichen Auflösung benutzt werden kann (B. J. Chang, V. D. Perez Meza, E. H. K. Stelzer, csiLSFM combines light-sheet fluorescence microscopy and coherent structured Illu mination for a lateral resolution below 100 nm. Proc. Natl. Acad. Sei. U S A 114, 4869-4874 (2017)). Auch diese Realisierung wurde unter hohem technischem Aufwand getätigt, in der 3 hochauflösende Mikroskopobjektive wiederum das Probenvolumen signifikant einschränken. Außerdem konnte die Erhöhung der Auflösung nur in lateraler und nicht in axialer Richtung umgesetzt werden, sodass die dadurch entstehenden Mikroskopie- Aufnahmen nur in lateraler Richtung und damit anisotrop mit ca. 90 nm Auflösung erzeugt werden. Eine hochempfindliche und gleichzeitig sehr schnelle optisch hochauflösende Mikroskopie methode ist die Methode der strukturierten Beleuchtung (englisch: structured Illumination microscopy (SIM)). In der SIM-Mikroskopie wird die zu untersuchende Probe mit einem Be leuchtungsmuster zur Fluoreszenz angeregt, das durch Interferenz von mehreren Laserstrahlen erzeugt wird. Bei bisher kommerziell umgesetzten SIM Mikroskopen werden diese Laser strahlen durch Beugung an einem optischen Gitter erzeugt und typischerweise werden die Strahlen, die durch Beugung in die +1. und -1. Beugungsordnung entstehen in einem Mikro skopobjektiv unter hohen Winkeln (von bis zu ca. 65° zur optischen Achse - in Figur 1 b) ist dies als 115° gezeigt, wenn man den Winkel nach oben hin misst, wie in der Figur angedeu tet) zur Interferenz gebracht, was ein laterales Streifenmuster in der Probe erzeugt. Wird zu sätzlich noch die 0. Beugungsordnung zentral in die Probe eingestrahlt, so entsteht auch ein Interferenzmuster in axialer Richtung.

In Figur 1 ist das Prinzip der hochauflösenden Mikroskopie basierend auf strukturierter Be leuchtung gezeigt. In Fig. 1 a) ist gezeigt, dass durch Einstrahlen von zueinander kohärenten Laserstrahlen in die rückwärtige Apertur 3 eines Mikroskopobjektivs 1 mit hoher numerischer Apertur, werden zwei der Strahlen 4, die am Rande der rückwärtigen Apertur fokussiert wer den, unter hohen Winkeln gebrochen und in der Probe zur Interferenz gebracht, wodurch ein laterales Interferenzmuster entsteht. Durch zusätzliches Einbringen eines zentral fokussierten Laserstrahls 5 entsteht ein dreidimensionales Interferenzmuster. In Fig. 1 b) ist die Simulation eines 3D Interferenzmusters gezeigt, wie es in einem 3D-SIM Mikroskop in der Proben- Ebene entsteht. Hier wurde eine Wellenlänge von 500 nm benutzt und die Strahlen, wie in dem in Fig. 1 c) gezeigten Schema, zur Interferenz gebracht. Außerdem wurde der Bre chungsindex von Wasser (n=l,33) als Medium benutzt. Dabei entsteht eine laterale Interfe renzstruktur mit 207,5 nm Periodizität, sowie eine axiale Interferenzstruktur mit 324,2 nm Periodizität. Wie man bereits an dem in Fig. 1 gezeigten Interferenzmuster erkennt, wird durch die Not wendigkeit, mehrere Laserstrahlen mithilfe eines einzigen hochauflösenden Mikroskopobjek tivs zur Interferenz zu bringen, die Interferenzstruktur anisotrop, d.h. die Periodizität in axia ler Richtung ist deutlich größer als in lateraler Richtung. Dadurch ist auch die Auflösung die ser Mikroskopiemethode auf ca. 100 nm in x-y -Richtung (lateral) und 300 nm in z-Richtung (axial) beschränkt, was dennoch die Auflösung eines herkömmlichen Fluoreszenzmikroskops bereits um einen Faktor 2 in sämtlichen Raumrichtungen erhöht.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Lösung zu schaffen, die es ermöglicht die isotrope Auflösung in der Lichtblattmikroskopie weiter zu erhöhen und die Lösung ge genüber dem Stand der Technik noch einfacher umzusetzen. Insbesondere liegt der vorliegen den Erfindung die Aufgabe zugrunde die Auflösung eines optischen Mikroskops isotrop in alle Raumrichtungen zu erhöhen und gleichzeitig die Aufnahmegeschwindigkeit zu steigern. Auch hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, eine Anordnung bereitzustellen, welches eine Nachrüstung oder Ergänzung eines Mikroskops mit einer Anordnung zur Lichtblattmik roskopie ermöglicht.

Bei einer Anordnung zur Lichtblattmikroskopie der eingangs beschriebenen Art wird die Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die Anordnung zumindest sechs Beleuch tungsoptiken zur Beleuchtung einer Probe umfasst, wobei sich die Probe innerhalb einer Pro benkammer in einem Medium befindet. Dabei wird die Probenkammer parallel zur einer ebe nen Bezugsfläche ausgerichtet, während die Beleuchtungsoptiken jeweils einen Beleuch tungsstrahlengang umfassen und derart eingerichtet sind, ein Lichtblatt aus einem Anregungs strahl zu erzeugen und das Lichtblatt unter einem von Null verschiedenen Winkel bezüglich einer Normalen der Bezugsfläche auf die Probe zu lenken. Weiterhin umfassen die Beleuch tungsoptiken jeweils zumindest eine faseroptische Komponente, wobei die faseroptische Komponente derart eingerichtet ist, den in einer Laserquelle erzeugten Anregungsstrahl in den Beleuchtungsstrahlengang der Beleuchtungsoptik einzukoppeln. Die zumindest sechs Be- leuchtungsoptiken sind im Wesentlichen hexagonal um die Probenkammer angeordnet und die Anordnung umfasst zumindest einen faseroptischen Schalter, wobei der faseroptische Schalter derart eingerichtet ist, durch Schalten der faseroptischen Komponente zwei gegenläu figen Lichtblätter auf die Probe zu lenken. Der faseroptische Schalter ist weiter derart einge richtet, die gegenläufigen Lichtblätter mehrfach um einem Winkel von im Wesentlichen 60° in einer Ebene der Bezugsfläche zu verdrehen, so dass die Probe aus zumindest sechs ver schiedenen Winkeln beleuchtet wird. Außerdem umfasst die Anordnung zumindest eine De tektionsoptik mit einem Detektionsstrahlengang mit einer optischen Achse, wobei die Detek tionsoptik unterhalb der Probenkammer angeordnet ist und die optische Achse im Wesentli chen parallel zu der Normalen der Bezugsfläche ist, wobei die Detektionsoptik derart einge richtet ist, ein Fluoreszenssignal der Probe zu detektieren.

Grundidee der vorliegenden Erfindung ist es somit, zwei gegenläufige Lichtblätter eines An regungsstrahls unter einem Winkel auf eine Probe einzustrahlen wobei die Anregungsstrahlen mittels faseroptischer Komponenten kompakt in die Beleuchtungsoptik geführt werden kön nen und damit erst kurz vor der Probe ausgekoppelt und zur Interferenz gebracht werden. Mit tels einer faseroptischen Schalters können die Anregungsstrahlen schnell aus verschiedenen Richtungen auf die Probe eingestrahlt werden.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Beleuchtungsoptiken jeweils zumin dest ein optisches Element, wobei das optische Element derart eingerichtet ist, den Anre gungsstrahl in Richtung der Probe zu lenken.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Detektionsoptik eine faseropti sche Komponente und ist derart eingerichtet, einen zentralen Anregungsstrahl in der Probe zu fokussieren, der zentrale Anregungsstrahl derart eingerichtet ist mit den zwei zur Erzeugung eines strukturierten Lichtblatts gegenläufigen Lichtblättern zu interferieren und insgesamt ein dreidimensional strukturiertes Lichtblatt zu erzeugen. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Detektionsoptik ein Mikroskopobjektiv.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung beträgt der Winkel zwischen dem Licht blatt der Beleuchtungsoptik und der Normalen der Bezugsfläche zwischen 75° und 90°. Ins besondere kann es vorgesehen sein, dass die Beträge des Winkels zwischen dem Lichtblatt und der Normalen der Bezugsfläche und der Winkel zwischen einem gegenläufigen Lichtblatt und der Bezugsfläche gleich sind.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfassen die Beleuchtungsoptiken jeweils zumin dest eine Zylinderlinse, wobei die Zylinderlinse derart eingerichtet ist, das Lichtblatt aus dem Anregungsstrahl zu erzeugen.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Detektionsoptik in eine Bühne ein gefasst, wobei die Bühne derart eingerichtet, ist den Abstand zwischen der Probe und der De tektionsoptik zu verändern.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Bühne ein piezoelektrisches Element, wobei das piezoelektrisches Element derart eingerichtet ist, den Abstand zwischen der Probe und der Detektionsoptik zu verändern. Mittels eines piezoelektrischen Elements lässt sich beispielsweise die gesamte Probenkammer mit hoher Präzision entlang der z-Richtung relativ zur Detektionsoptik, also in axialer Richtung, verfahren.

Erfmdungsgemäß ist außerdem ein Verfahren zur Lichtblattmikroskopie angegeben, umfas send die folgenden Schritte:

- Bereitstellen einer Anordnung nach einem der vorherigen Ansprüche,

- Beleuchten der Probe mit zumindest zwei gegenläufigen Lichtblättern, wobei die Lichtblät ter aus zumindest zwei Anregungsstrahlen erzeugt werden, wobei die Anregungsstrahlen in zumindest zwei faseroptische Komponenten eingekoppelt werden und in die Beleuchtungs strahlengänge ausgekoppelt werden,

- Detektieren eines Fluoreszenzsignals der Probe mittels der Detektionsoptik,

- Einkoppeln der Anregungsstrahlen in zwei weitere faseroptische Komponenten mittels des faseroptischen Schalters derart, dass die gegenläufigen Lichtblätter um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe verdreht werden,

- erneutes Ausführen des Verfahrens bis zumindest die gegenläufigen Lichtblätter zweimal um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe verdreht wurden.

In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren den zusätzlichen Schritt:

- Verschieben zumindest einer lateralen Phase der gegenläufigen Lichtblätter.

Insbesondere kann es dabei vorgesehen sein, dass die faseroptische Komponente, beispiels weise eine optische Faser, entlang der optischen Achse verschoben wird und damit die Pha seneinstellung der optischen Faser geändert wird.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die folgenden zu sätzlichen Schritte:

- Beleuchten der Probe mittels eines zentralen Anregungsstrahls mittels der Detektionsoptik und Erzeugen eines 3D Interferenzmusters,

- Verändern eines Abstands zwischen der Probe und der Detektionsoptik.

In einer Ausführungsform der Erfindung erfolgt der Schritt des Veränderns eines Abstands zwischen der Probe und der Detektionsoptik mittels eines piezoelektrischen Elements.

Erfindungsgemäß ist außerdem die Verwendung der Anordnung zur Lichtblattmikroskopie zur Umwandlung oder Ergänzung eines Mikroskops in ein Lichtblattmikroskop angegeben. Mit der erfmdungsgemäßen Anordnung lässt sich die 3D hochauflösende strukturierte Be leuchtung mittels Lichtblattmikroskopie in einen kompakten Mikroskopiekopf integrieren, wodurch ein Fluoreszenzmikroskop zu einem Lichtblattmikroskop, sowie einem hochauflö senden 3D Fluoreszenzmikroskop erweiterbar ist. Insbesondere kann ein modularer Aufbau der Komponenten, unter Beibehaltung bereits vorhandener optomechani scher und optoelekt ronischer Bauteile, vorgesehen sein, um die Umwandlung einfach und kostengünstig zu ge stalten. Die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie wird dabei separat von einem Mikroskop bereitgestellt und kann nachträglich von dem Benutzer modular an das Mikroskop angekop pelt werden, um das Mikroskop nachträglich in ein Lichtblattmikroskop, sowie ein hochauflö sendes Mikroskop umzuwandeln oder zu ergänzen. In einer Ausführungsform der Erfindung weist die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie ein eigenes an das Gehäuse des Mikroskops koppelbares Gehäuse auf, beispielsweise einer aus Metall gefertigten Bühne, in welchem die Anordnung zur Lichtblattmikroskopie beherbergt ist.

Es zeigen:

Fig. 1 das Prinzip der hochauflösenden Mikroskopie basierend auf der strukturierten Beleuchtung gemäß dem Stand der Technik,

Fig. 2 simulierte dreidimensionale Interferenzmuster, die durch Überlagerung von drei Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung entstehen,

Fig. 3 eine Vorrichtung zur dreidimensionalen Lichtblattmikroskopie gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung,

Fig. 4 verschiedene Draufaufsichten auf eine Probenkammer mit von oben gezeigten Lichtblättern gemäß einem Ausführungsbeispiels der Erfindung,

Fig. 5 eine Draufaufsicht auf eine Probenkammer mit von oben gezeigten Lichtblät- tem gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung, Fig. 6 eine Simulation eines Interferenzmusters von unter 80° Grad zur Normalen einer Glasoberfläche einfallenden gegenläufigen Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbeispiels der Erfindung,

Fig. 7 ein Ablaufschema eines Verfahrens zur Lichtblattmikroskopie gemäß einem

Ausführungsbeispiels der Erfindung.

Figur 1 zeigt das bereits in der Einleitung der Beschreibung beschriebene Prinzip der hoch auflösenden Mikroskopie basierend auf der strukturierten Beleuchtung gemäß dem Stand der Technik.

Die Figur 2 zeigt simulierte dreidimensionale Interferenzmuster, die durch Überlagerung von drei Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung entstehen. Wie in Fig. 2 a) ersichtlich, erhält man die bestmögliche Auflösungserhöhung durch Einstrahlen von Laser strahlen unter den Winkeln 90°, -90° und 0°. Dies ist jedoch in der Praxis nur schwer reali sierbar, was im Wesentlichen daran liegt, dass biologische Proben auf einem transparenten Substrat, in der Regel einem dünnen Glasträger (Deckplättchen) präpariert werden müssen, um sie möglichst effizient und realitätsnah abbilden zu können. Diese Geometrie erschwert es daher, Laserstrahlen parallel zur Glasoberfläche in die Probe einzustrahlen und zur Interferenz zu bringen. Werden zwei der Strahlen gegenläufig in die Probe eingestrahlt (unter den Win keln 90° und -90° relativ zur optischen Achse), dann bildet sich in lateraler Richtung bereits die kl einstmögliche Interferenzstruktur mit einer Periodizität von 187,96 nm (bei 500 nm Wellenlänge und einem Brechungsindex von Wasser von 1,33 ) aus. Wird diese Struktur zu sätzlich unter 0° mit einem Laserstrahl durchdrungen, dann entsteht auch in axialer Richtung eine Interferenzstruktur (in der Simulation mit einer Periodizität von 188,03 nm). Das so ent standene Interferenzmuster ist also in allen Raumrichtungen isotrop. Die nächst beste Lösung besteht also darin, die Winkel unter der die Laserstrahlen zur Interfe renz gebracht werden, möglichst nahe an der idealen Lösung zu halten. Dies ist in Figur 2 b) am Beispiel einer Anordnung mit der Einstrahlung von Laserstrahlen unter den Winkeln 80°, -80° und 0° gezeigt. Hierbei wird sowohl die laterale als auch die axiale Periodizität etwas erhöht, das Muster ist aber im Vergleich zu dem in Fig. 1 b) gezeigten immer noch deutlich “feiner” und würde eine nahezu isotrope Auflösungserhöhung ermöglichen.

Die Figur 3 zeigt eine Anordnung zur dreidimensionalen Lichtblattmikroskopie gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die in Fig. 3 gezeigte Anordnung umfasst zumindest sechs Beleuchtungsoptiken 14 zur Beleuchtung einer Probe 13, wobei sich die Probe 13 in nerhalb einer Probenkammer 11 in einem Medium 12 befindet. Die Probenkammer 11 ist da bei parallel zur einer ebenen, optisch transparenten Bezugsfläche 16 ausgerichtet. Die Be leuchtungsoptiken 14 umfassen jeweils einen Beleuchtungsstrahlengang 17. Die Beleuch tungsoptiken 14 sind dabei derart eingerichtet, ein Lichtblatt 27 aus einem Anregungsstrahl 18 zu erzeugen und das Lichtblatt 27 unter einem von Null verschiedenen Winkel bezüglich einer Normalen 19 der Bezugsfläche 16 auf die Probe 13 zu lenken. Die Anregungsstrahlen 18 können beispielsweise mittels einer Laserquelle 21 erzeugt werden. Die Einkopplung von Anregungsstrahlen 18 für gegenläufige Lichtblätter 27 in die Beleuchtungsstrahlengänge 17 wird über faseroptische Komponenten 10, die die Anregungsstrahlen 18 als gaußförmige Strahlen auskoppeln, realisiert. Diese werden über jeweils entgegengesetzt angeordnete Spie gel 15 unter einem flachen Winkel von beispielsweise 5° bis 10° auf die Probe 13 gelenkt. Kurz bevor die Strahlen 18 in die Probenkammer 11 eindringen, werden sie durch Zylinder linsen 25 zu schmalen Lichtblättem 27 ausgeformt. Die Beleuchtungsoptiken 14 werden he xagonal um die Probe 13 angeordnet, wie in der Draufsicht in Fig. 4 gezeigt.

Die Anordnung umfasst weiter zumindest einen faseroptischen Schalter 20 der in Fig. 3 nicht gezeigt ist. Der faseroptische Schalter 20 ist derart eingerichtet, durch Schalten der faseropti schen Komponente 10 zwei gegenläufigen Lichtblätter 27 auf die Probe 13 zu lenken. Des Weiteren ist der faseroptische Schalter 20 derart eingerichtet, die gegenläufigen Lichtblätter 27 mehrfach um einem Winkel von im Wesentlichen 60° in einer Ebene der Bezugsfläche 16 zu verdrehen, so dass die Probe 13 aus zumindest sechs verschiedenen Winkeln beleuchtet wird.

Insbesondere kann es vorgesehen sein, dass der faseroptische Schalter 20 ein mikro elektromechanischer Faserschalter ist. Der Vorteil von mikro-elektromechanischen Faser- schaltem (fiber-MEMS switches) ist, dass diese Schalter es ermöglichen, Licht aus einer ein laufenden Lichtfaser in unter 1 Millisekunde zwischen mehreren auslaufenden Lichtfasern zu schalten. Mit einem einzelnen 1x3 MEMS Schalter lässt sich daher ein schneller Wechsel zwischen den faseroptischen Komponenten 10 realisieren. Vorteil dieser Methode ist, dass so gut wie kein Laserlicht verloren geht und sich durch Einsatz dieser Technologie sehr schnelle Schaltzeiten umsetzen lassen.

Der in Fig. 3 beschriebene Aufbau nutzt ein einzelnes Mikroskopobjektiv mit hoher numeri scher Apertur als Detektionsoptik 9, das zur Detektion des Fluoreszenzsignals benutzt wird und gleichzeitig einen zentralen Anregungsstrahl 24 in die Probe fokussiert kann. Das Mikro skopobjektiv 9 wird beispielsweise in einer aus Metall gefertigten Bühne 26 gehaltert. Ein Gegengewinde erlaubt es, die Bühne 26 in ein reguläres invertiertes Mikroskop einzuschrau ben. Ein zur Bühne 26 gefertigtes Gegenstück 29 hält die Probenkammer 11, sowie die faser optischen Komponenten 10 zur Einkopplung der Anregungsstrahlen 18 in den Beleuchtungs strahlengang 17 der Beleuchtungsoptik 14 für die Fluoreszenzanregung der Probe 13 mittels gegenläufiger Lichtblätter 27. Die Bühne 26 kann somit auch zur Aufnahme der Probe 13 und zur Feinjustage des Abstands zwischen Probe 13 und des Mikroskopobjektivs 9 genutzt wer den. Die Bühne 26 kann beispielsweise auch über ein Standard RMS-Gewinde in ein regulä res invertiertes Mikroskop verschiedenster Hersteller geschraubt werden, um dessen Abbil dungsoptik und die Kamera-Anschlüsse zu nutzen und stellt somit eine flexible Erweiterung bestehender Mikroskope um die hochauflösende Mikroskopie und die Lichtblattmikroskopie dar.

Durch diese Anordnung können die Anregungsstrahlen 18 der gegenläufigen Lichtblätter 27, mittels des faseroptischen Schalters 20, sehr schnell um jeweils 60° versetzt geschaltet wer den und auf diese Weise unter sechs verschiedenen Winkeln, wobei die Probe 13 durch die gegenläufigen Lichtblätter 27 bei jeder Verstellung um 60° unter zwei Winkeln ausgeleuchtet wird, ausleuchten. Dies ist vorteilhaft, um in der anschließenden Computer-basierten Bildre konstruktion eine gleichmäßige Auflösungserhöhung in lateraler Richtung zu erzeugen. Dabei kann auch eine Verschiebung der lateralen Phase der Interferenzmuster vorgesehen sein, die sich beispielsweis durch eine Verschiebung der faseroptischen Komponente 10 entlang der optischen Achse realisieren lässt.

Um zusätzlich die Auflösungserhöhung in axialer Richtung zu ermöglichen, wird durch Hin zuschalten eines zentralen Anregungsstrahls 24 ein 3D Interferenzmuster erzeugt. Der zentra le Anregungsstrahl 24 wird mittels des Mikroskopobjektivs 9 in die Probe 11 fokussiert. Wird auch noch der zentrale Anregungsstrahl 24 hinzugenommen, dann entsteht auf Höhe der Pro be 11 ein Interferenzmuster, wie beispielhaft in Fig. 2 b) gezeigt ist. Hierdurch wird die Auf lösung des optischen Systems nahezu isotrop in xy-Richtung und in z-Richtung erhöht.

Mit Hilfe von in der Bühne 26 integrierten piezoelektrischen Elementen lässt sich die gesamte Probenkammer 11 mit hoher Präzision entlang der z-Richtung, also in axialer Richtung, ver fahren und somit die zur 3D-Rekonstruktion notwendigen Bilder aufnehmen. Selbst wenn nur eine erhöhte Auflösung in xy-Richtung gewünscht wird, ist die hier dargestellte Lösung von Vorteil, da sich durch Weglassen des Zentral Strahls 24 immer noch ein laterales Interferenz muster der gegenläufigen Lichtblätter 27 ergibt, die die Probe 13 mit minimaler Anregungs leistung ausleuchtet und zur Fluoreszenz anregt. Die dabei entstehenden Fluoreszenzbilder werden wiederum mit der Detektionsoptik 9 beispielsweise einem hochauflösenden Mikro- skopobjektiv aufgenommen und im Rahmen einer Computer-gestützten Bildrekonstruktion als 2D hochauflösende Bilder berechnet. Die Auflösung, die mit dieser Anordnung erreicht werden kann liegt im Bereich von ca. der Hälfte der Periodizität der Lateral Struktur, also ca. 191 nm / 2 = 95,5 nm. In axialer Richtung sollte sich eine Auflösung von deutlich unter 200 nm realisieren lassen.

Die Figur 4 zeigt verschiedene Draufsichten auf eine Probenkammer 11 mit von oben gezeig ten Lichtblättern 27 gemäß einem Ausführungsbeispiels der Erfindung. In Fig. 4 ist die Pro benkammer 11 als Hexagon angedeutet und die von oben gesehenen Lichtblätter 27, die durch entgegengesetzt angeordnete Zylinderlinsen 25 erzeugt werden, gezeigt. In den Fig. 4 a) - c) werden die gegenläufigen Lichtblätter 27 mit Hilfe eines faseroptischen Schalter 20 unter jeweils 60° versetzt erzeugt, um eine gleichmäßige Rekonstruktion der hochaufgelösten Bild information zu erreichen, wie dies beispielsweise in der SIM Mikroskopie üblich ist.

Die Figur 5 zeigt eine Draufaufsicht auf eine Probenkammer 11 mit von oben gezeigten Lichtblättem 27 gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung. In Fig. 5 ist wiederum die Probenkammer 11 als Hexagon angedeutet und die von oben gesehenen Lichtblätter 27, die durch die entgegengesetzt angeordneten Zylinderlinsen 25 erzeugt werden, gezeigt. Zusätzlich ist eine Laserquelle 21 zur Erzeugung der Anregungsstrahlen 18 und ein faseroptischer Schal ter 20 gezeigt. Mittels des faseroptischen Schalters 20 lassen sich die Anregungsstrahlen 18 über die faseroptische Komponenten 10 schnell in den Beleuchtungsstrahlengang 17 der Be leuchtungsoptik 14 einkoppeln.

Die Figur 6 zeigt eine Simulation eines Interferenzmusters von unter 80° Grad zur Normalen einer Glasoberfläche einfallenden gegenläufigen Laserstrahlen gemäß einem Ausführungsbei spiels der Erfindung. Durch Reflexion an der Glasoberfläche entsteht auch in axialer Richtung (entlang z) ein Interferenzmuster. Hier wurde eine realistischere Simulation der Ausleuchtung der Probe mit gegenläufigen Laserstrahlen unter Berücksichtigung des Glasträgers mit der Optiksimulations-Software Zemax durchgeführt. Da die Laserstrahlen unter einem sehr fla chen Winkel auf die Grenzfläche zwischen der Flüssigkeit in der Probenkammer und dem Glasträger treffen, wird der Großteil des Laserlichts an dieser Grenzfläche reflektiert, was wiederum zur Interferenz mit dem aus der Gegenrichtung eingestrahlten Licht führt. Wenn man den Zentralstrahl nicht berücksichtigt, dann entsteht auf diese Art dennoch eine axiale Feinstruktur, welche wiederum manche Bereiche der Probe nicht zur Fluoreszenz anregt. Erst wenn die Probe axial verschoben wird (z.B. durch die Piezoelemente), werden auch diese Bereiche der Probe zur Fluoreszenz angeregt. Dies könnte, in Verbindung mit einem bildtei lenden Prisma genutzt werden, um mehrere Anregungsebenen in axialer Richtung gleichzeitig abzubilden, und die Probe dennoch möglichst schonend dem Anregungslicht auszusetzen.

Die Figur 7 zeigt ein Ablaufschema eines Verfahrens zur Lichtblattmikroskopie gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.

Das Verfahren beginnt mit Schritt 700 mit dem Bereitstellen einer zuvor beschriebenen An ordnung zur Lichtblattmikroskopie.

In Schritt 710 wird eine Probe 13 mit zumindest zwei gegenläufigen Lichtblättern 27 beleuch tet, wobei die Lichtblätter 27 aus zumindest zwei Anregungsstrahlen 18 erzeugt werden, wo bei die Anregungsstrahlen 18 in zumindest zwei faseroptische Komponenten 10 eingekoppelt werden und in die Beleuchtungsstrahlengänge 17 ausgekoppelt werden.

In Schritt 720 wird ein Fluoreszenzsignal der Probe 13 mittels der Detektionsoptik 9 detek- tiert.

In Schritt 730 werden die gegenläufigen Lichtblätter 27 um einen Winkel von im Wesentli chen 60° um die Probe 13 verdreht. Dies geschieht dadurch, dass die Anregungsstrahlen 18 in zwei weitere faseroptische Komponenten 10 mittels des faseroptischen Schalters 20 derart einkoppelt werden, dass die aus den Anregungsstrahlen erzeugten gegenläufigen Lichtblätter 27 um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe 13 verdreht sind und die Probe 13 aus einem um im Wesentlichen 60° versetzten Winkel bestrahlen. In Schritt 740 wird das Verfahren erneut ausgeführt bis zumindest die gegenläufigen Licht blätter 27 zweimal um einen Winkel von im Wesentlichen 60° um die Probe 13 verdreht wur den. Wurden die Lichtblätter 27 zweimal um jeweils 60° zur Probe 13 verdreht, wurde die Probe 13 somit aus sechs verschiedenen Winkel beleuchtet um eine gleichmäßige Rekon struktion von hochaufgelösten Bildinformationen zu erreichen.

In einem Ausführungsbeispiel der Erfindung kann es zusätzlich vorgesehen sein, dass die Probe 13 mittels eines zentralen Anregungsstrahls 24 mittels der Detektionsoptik 9 zur Erzeu gung eines 3D Interferenzmusters beleuchtet wird. Ein weiterer Verfahrensschritt kann das Verändern eines Abstands zwischen der Probe 13 und der Detektionsoptik 9 sein. Der Ab- stand zwischen der Probe 13 und der Detektionsoptik 9 kann beispielsweise mittels eines pie zoelektrischen Elements erfolgen, das beispielsweise die Probenkammer 11 mit hoher Präzi sion in axialer Richtung entlang der Normalen 19 der Bezugsfläche 16 verschiebt.

Die Arbeiten, die zu dieser Erfindung geführt haben, wurden von der Europäischen Union (H2020-EU.1.3.1.) unter der Fördervereinbarung Nr. 766181 (DeLIVER-ITN) finanziert.

Bezugszeichenliste

1 Mikroskopobjektiv

2 Laserstrahlen

3 rückwärtige Apertur

4 Randstrahlen

5 zentral fokussierter Laserstrahl

9 Detektionsoptik

10 faseropti sehe Komponente

11 Probenkammer

12 Medium

13 Probe

14 Beleuchtungsoptik

15 Umlenkspiegel

16 Bezugsfläche

17 Beleuchtungsstrahlengang

18 Anregungsstrahl

19 Normale der Bezugsfläche

20 faseroptischer Schalter

21 Laserquelle

22 Detektionsstrahlengang

23 optische Achse

24 zentraler Anregungsstrahl

25 Zylinderlinse

26 Bühne

27 Lichtblatt

28 Kollimatorlinse

29 Gegenstück