Die Erfindung betrifft ein Linkerpeptid, Fusionsproteine und Fusionsprotein-Komplexe, die dieses enthalten, Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen und deren Verwendung. Die Erfindung findet Anwendung im Bereich der Molekularbiologie, der Medizin, der Pharmazie und in der biomedizinischen Forschung.

Rekombinante Fusionsproteine, insbesondere bifunktionale rekombinante Fusionsproteine finden zunehmend Anwendung als Therapeutika. D abe i wi rd zur He rstellung der rekombinanten Fusionsproteine (hierin auch vereinfacht als Fusionsproteine bezeichnet) ein Fusionsgen erzeugt, indem eine Gensequenz nach Entfernung des Stop-Codons mit einer weiteren Gensequenz fusioniert wird. Bei der Translation dieses Fusionsgens wird ein Fusionsprotein erzeugt. Fusionsproteine bestehen aus einer Proteindomäne, welche mit einer weiteren Domäne fusioniert ist. Dabei ist mindestens eine Peptiddomäne (als Linkerpeptid) enthalten, ggf. sind weitere Proteindomänen enthalten.

Die Funktionalität der einzelnen Proteindomänen bleibt in Fusionsproteinen erhalten, da die funktionellen Domänen von Proteinen meist modular aufgebaut sind, so dass die Aminosäuresequenz einer Proteindomäne, welcher eine bestimmte Funktion zugeordnet ist, vom Rest des Proteins abgetrennt werden kann, ohne dass dessen Funktionalität beeinträchtigt wird.

Fusionsproteine werden einerseits in der Molekularbiologie eingesetzt, z.B. um den experimentellen Aufwand bei der Aufreinigung und Detektion von Proteinen zu erleichtern. Da die Produktion eines dafür geeigneten proteinspezifischen Antikörpers einen hohen Zeit- und Arbeitsaufwand bedeutet und ggf. durch Kreuzreaktivitäten oder unterschiedliche Affinität gegenüber unterschiedlichen Epitopen nachteilig ist, werden Fusionsproteine bevorzugt. Vor allem Fusionsproteine aus einem zu exprimierenden Protein (Zielprotein) mit Proteinmarkern oder Affinitätstags haben für die Molekularbiologie große Bedeutung erlangt, denn sie erlauben den spezifischen Nachweis und erleichtern die Aufreinigung der Zielproteine, ohne dass die Herstellung eines spezifischen Antikörpers gegen das betreffende Zielprotein nötig ist.

Viele weitere biochemische und molekularbiologische Verfahren beruhen auf der Synthese von Fusionsproteinen, wie beispielsweise der Yeast-Two-Hybrid-Assay und die Coimmunopräzipitation. Für all diese Verfahren wurden verschiedene Fusionspartner entwickelt und beschrieben, von denen sich viele in der Molekularbiologie mittlerweile fest etabliert haben. Beispiele für gebräuchliche Fusionen mit kompletten Proteinen oder Proteindomänen sind ß-Galactosidase, Protein A, Avidin, Streptavidin, Ubiquitin, GFP (green fluorescent protein), GST (glutathione S transferase), MBP (maitose binding protein), Calmodulin oder Thioredoxin.

Als besonders vorteilhaft für immunologische Anwendungen haben sich bi- und multifünktionale Fusionsproteine erwiesen. Beispiele für bifünktionale Fusionsproteine sind bispezifische Antikörper, die aus zwei über einen Linker verbundenen variablen Regionen von Antikörpern bestehen.

Weil große Proteine in Fusionsproteinen jedoch unter Umständen die Funktionalität ihres Fusionspartners beeinträchtigen können, wurde mittlerweile auch eine große Zahl kurzer Peptide bzw. Peptid-Tags entwickelt, die für die Herstellung von Fusionsproteinen eingesetzt werden. Viele von diesen werden von spezifischen Antikörpern erkannt (z.B. HA-Tag, Myc-Tag, Flag-Tag). Andere weisen zusätzlich spezielle Bindungseigenschaften auf, die für die Aufreinigung des Fusionsproteins verwendet werden können, wie beispielsweise die Bindung an Ni ²⁺ - oder Zn ²⁺ -Ionen durch den His- Tag. Selbst kurze Fusionspartner können jedoch im ungünstigsten Fall die Funktionalität des gewünschten Zielproteins beeinflussen.

Daher werden bevorzugt Peptiddomänen als Linker eingesetzt, die eine flexible Struktur aufweisen und die Fusionspartner so separieren, dass keine Wechselwirkung zwischen den Fusionspartnern auftritt. Die Funktionalität der Fusionspartner soll nicht verändert und insbesondere nicht beeinträchtigt werden.

US 5,525,491 offenbart Linkerpeptide der Struktur (Ser, Ser, Ser, Ser, Gly) _y , mit y>l (sogenannte Glycin-Serin-Linker), die zur Verknüpfung von zwei oder mehr Proteindomänen unter Bildung von rekombinanten Fusionsproteinen verwendet werden. Die fusionierten Proteindomänen behalten ihre jeweilige biologische Aktivität bei und sind stabil gegenüber Proteolyse.

Weiter sind Linkerpeptide der Struktur A(EAAAK) _n A (mit n=2 - 5) bekannt, die eine alpha-Helix- Struktur aufweisen. Entsprechende Verfahren zum Design entsprechender Linkerpeptide, die die Wechselwirkung der Fusionspartner minimieren sind in Arai R, Protein Engineering (2001) beschrieben.

Weitere bekannte Linkerpeptide mit einer helikalen Struktur sind Peptide der Struktur (EAAAR) ₄ . Eine Anwendung der Linkerpeptide in artifizell hergestellten Zink-Finger-Peptiden ist in Yan W, Biochemistry (2007) offenbart.

Für den Fall, dass einzelne Fusionspartner nach der Herstellung der Fusionsproteine abgetrennt werden sollen, werden vorzugsweise funktionalisierte Linkerpeptide eingesetzt. Diese enthalten entweder eine spezifische Sequenz (Spaltstelle), die von proteolytischen Enzymen erkannt wird, so dass eine enzymatische Spaltung innerhalb des Linkerpeptids erfolgt (Arnau J, Protein Expr Purif (2006)). Alternativ werden Linkerpeptide eingesetzt, die selbstspaltende oder autoproteolytische Sequenzen enthalten.

Nachteile bisher eingesetzter Linkerpeptide liegen in einer limitierten Stabilität beim Einsatz großer Proteindomänen als Fusionspartner. Um Fusionsproteine zur immunologischen Anwendung einzusetzen ist es meist erforderlich, dass zusätzlich zum Transport von Antigen weitere costimulatorische Signale, z.B. in der Form von Nukleinsäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Signalmolekülen mittransportiert werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein flexibles Linkerpeptid bereitzustellen, das durch seine Verwendung in Fusionsproteinen stabile und funktionalisierbare Fusionsproteine liefert; und welches modular einsetzbar ist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Linkerpeptid enthaltend eine Aminosäuresequenz mit mindestens 10 und maximal 50 Aminosäuren und mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99% Aminosäure-Sequenzidentität, zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 umfasst 18 Aminosäuren, bevorzugt umfasst daher ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid mindestens 18 und maximal 50 Aminosäuren. Dabei weist vorzugsweise der 18 Aminosäuren lange Teil des erfindungsgemäßen Linkerpeptids, der eine Homologie zur Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 1 aufweist, mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure- Sequenzidentität zu SEQ ID No. 1 auf. Weiter bevorzugte Linkerpeptide umfassen eine Aminosäuresequenz mit maximal 40, weiter bevorzugt maximal 30, Aminosäuren.

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung der Erfinder, dass sich Peptidstrukturen mit einer Aminosäuresequenz, die denen der Aminosäuren Nr. 311 - Nr. 328 des humanen La-Proteins (in der Literatur auch als SS-B bezeichnet) entspricht, zur Verknüpfung von Proteindomänen eignen. Die Aminosäuresequenz des humanen La-Proteins ist in SEQ ID No. 3 dargestellt.

Das humane La-Protein (hLa) wurde ursprünglich als Autoantigen in Patienten mit Systemischem Lupus Erythematodes und Sjögren's-Syndrom beschrieben und trägt die alternative Bezeichnung SS- B. Es umfasst 408 Aminosäuren gemäß SEQ ID No. 3. Die Primärstruktur des hLa-Proteins kann in drei Regionen unterteilt werden, die voneinander unabhängige räumliche Domänen bilden (Fig. 1). N- terminal ist das sogenannte La-Motiv angeordnet, gefolgt von einem zentralen RNA-Erkennungsmotiv (RNA recognition motif, RRM), das auch als RRMl bezeichnet wird. Diese beiden Domänen bilden die N-terminale Hälfte des Proteins und werden zusammen als LaN bezeichnet. Die zweite Hälfte, LaC, enthält das C-terminale RRM (RRM2, Aminosäuren 225-334) sowie ein sich anschließendes langes, flexibles Element von etwa 80 AS, das keine Sekundärstrukturmerkmale aufweist. Das humane La-Protein ist überwiegend im Zellkern lokalisiert, wo es über die RRMs an neu synthetisierte RNA-Polymerase III-Transkripte bindet. Das humane La-Protein weist weiter verschiedene Regulationselemente auf, wie ein nukleäres Retentionselement (nuclear rentention element, NRE), welches den Export aus dem Zellkern hemmt und das Protein im Zellkern zurückhält. Das NRE erstreckt sich über die Aminosäuren 316 - 332 der SEQ ID No. 3. Weiter erstreckt sich eine bisher nicht weiter eingeengte Dimerisierungsdomäne bei den Aminosäuren 293 - 348 von SEQ ID No. 3.

Peptide sind organische Verbindungen, die durch eine Verknüpfung von mehreren Aminosäuren resultieren, wobei die Aminosäuren in einer definierten Reihenfolge (Sequenz) über Peptidbindungen miteinander verbunden sind (Primärstruktur). Unter Peptiden im erfindungsgemäßen Sinn werden Aminosäuresequenzen mit einer maximalen Länge von 100 Aminosäuren verstanden. Polypeptide mit einer Länge von mehr als 100 Aminosäuren werden als Proteine bezeichnet. Die Sekundärstruktur von Peptiden und Proteinen kann alpha-Helices, beta-Faltblätter, beta-Schleifen und/oder random coil Strukturen enthalten. Linkerpeptide sind Peptide, die zur Verbindung mit mindestens einem weiteren Peptid oder Protein, vorzugsweise in der Form von Fusionsproteinen, eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Linkerpeptid enthält eine alpha-Helix-Struktur. Dadurch wird die Flexibilität des Linkerpeptids sichergestellt und vorteilhaft eine Anwendung mit einer Vielzahl möglicher Fusionspartner ermöglicht.

Das erfindungsgemäße Linkerpeptid umfasst eine Aminosäuresequenz, welche mindestens 90 %, vorzugsweise 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu einer mindestens 10, vorzugsweise mindestens 10 und maximal 50, Aminosäure langen Aminosäuresequenz aus der RRM2 -Region des humanen La-Proteins aufweist, insbesondere aus der langen C-terminalen alpha-Helix von RRM2.

Unter Aminosäure-Sequenzidentität wird erfindungsgemäß der prozentuale Anteil an Aminosäuren einer Kandidatensequenz (an dieser Stelle: der Aminosäuresequenz der zentralen RNA-bindenden Region des humanen La-Proteins) verstanden, die identisch mit der Aminosäuresequenz eines erfindungsgemäßen Linkerpeptids sind.

Ein bevorzugtes Linkerpeptid umfasst eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 (hierin wird dieses spezielle Linkerpeptid auch als„E7B6" bezeichnet). Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 umfasst die Aminosäuren Nr. 311 - Nr. 328 von SEQ ID No. 3. Vorzugsweise enthält ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid eine Nukleinsäure-Bindungs-Domäne und/oder eine Proteindimerisations-Domäne. Ggf. sind die Nukleinsäure-Bindungs-Domäne und die Proteindimerisations -Domäne so angeordnet, dass deren Aminosäuresequenzen überlappen.

Die Nukleinsäurebindungs-Domäne ist dabei ein Teil des Linkerpeptids, an welchen Nukleinsäuren binden können. Die Nukleinsäurebindungs-Domäne kann dabei auf einer linearen oder räumlichen Peptiddomäne basieren.

Die Proteindimerisations-Domäne ist ein Teil des Linkerpeptids, über welchen mehrere, insbesondere zwei, Linkerpeptide miteinander unter Bildung eines Dimers interagieren. Dadurch können vorteilhaft erfindungsgemäße Fusionsproteine mit anderen erfindungsgemäßen Fusionsproteinen über die im Linkerpeptid befindliche Proteindimerisations-Domäne dimerisieren und dadurch einen Fusionsprotein-Komplex bilden. Ein bevorzugtes Linkerpeptid mit einer Proteindimerisations-Domäne umfasst die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 (hierin wird dieses spezielle Linkerpeptid auch als„E7B6L" bezeichnet).

In einem erfindungsgemäßen Linkerpeptid können die Nukleinsäurebindungs-Domäne und die Proteindimerisations-Domäne ggf. überlappen, d.h. dass ein Teil der Aminosäuresequenz des Linkerpeptids sowohl der Nukleinsäurebindungs-Domäne als auch der Proteindimerisations-Domäne zugeordnet werden kann.

Ein weiter bevorzugtes Linkerpeptid umfasst eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2. Die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 umfasst die Aminosäuren Nr. 303 - Nr. 344 des humanen La-Proteins (gemäß SEQ ID No. 3). Besonders bevorzugt ist ein Linkerpeptid mit einer Aminosäuresequenz, die identisch mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 ist.

Das Linkerpeptid mit der Aminosäuresequenz von mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 enthält vorzugsweise eine Nukleinsäure-Bindungs-Domäne.

In einem Linkerpeptid, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 umfasst, ist eine Nukleinsäure-Bindungs-Domäne enthalten.

Das Linkerpeptid mit der Aminosäuresequenz von mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 enthält vorzugsweise eine Proteindimerisations-Domäne. In einem Linkerpeptid, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 umfasst, ist eine Proteindimerisations-Domäne enthalten.

Bevorzugt enthalten erfindungsgemäße Linkerpeptide neben ggf. vorhandenen Nukleinsäure- Bindungs-Domänen und/oder Proteindimerisations-Domänen ein Peptidepitop. Darunter wird eine Peptidstruktur (linear oder dreidimensional) verstanden, an welche ein spezifischer Antikörper bindet. Die Aminosäuren des Peptidepitops können dabei mit den anderen Domänen (Nukleinsäurebindungs- Domäne und/oder Proteindimerisations-Domäne) überlappen.

Eine bevorzugte Aminosäuresequenz des Peptidepitops entspricht einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure- Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1.

Die Erfindung umfasst weiter die Verwendung eines erfindungsgemäßen Linkerpeptids als Teil eines Fusionsproteins.

Bevorzugte Fusionsproteine, als deren Teil ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit einer Nukleinsäure-Bindungs-Domäne verwendet wird, sind Transportmoleküle für Nukleinsäuren, insbesondere siRNA. Ebenso bevorzugte Fusionsproteine, als deren Teil ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit einer Nukleinsäure-Bindungs-Domäne verwendet wird, sind Transportmoleküle für Liganden von Pattern Recognition Rezeptoren (PRR), insbesondere für Liganden von Toll-like Rezeptoren (TLR), davon besonders bevorzugt für CpG-reiche DNA, dsRNA, ssRNA oder davon abgeleitete Derivate, insbesondere Imiquimod oder Resiquimod.

Der Begriff Nukleinsäuren im Sinne der Erfindung umfasst neben Desoxyribonukleinsäuren (DNA) und Ribonukleinsäuren (RNA) auch alle anderen linearen Polymere in denen die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T) oder Uracil (U) in entsprechender Abfolge angeordnet sind, insbesondere Nukleinsäuren mit verändertem Rückgrat, wie z. B. einem Phosphothioat-, Phosphoramidat- oder O-Methyl-derivatisierten Rückgrat, Peptid-Nukleinsäuren (PNA), und locked nucleic acids (LNA).

Die Erfindung umfasst dabei auch die korrespondierenden RNA-Sequenzen in denen Thymin durch Uracil ersetzt ist, komplementäre Sequenzen und Sequenzen mit modifiziertem Nukleinsäurerückgrat oder 3' oder 5 '-Terminus. Der Begriff modifizierter 3' oder 5' Terminus umfasst dabei sowohl Modifikationen, die der Stabilisierung dienen als auch das Anbinden von Markern. Beispiele für Marker sind Enzyme, Farbstoffe oder Fluoreszenzfarbstoffe, Radionukleotide, sowie Haptene, wie z. B. Digoxigenin oder Biotin. Bei den Enzymen wird der Nachweis meist über eine von dem Enzym katalysierte Farbbildungsreaktion geführt. Farbige oder fluoreszierende Moleküle können direkt photometrisch oder fluorometrisch nachgewiesen werden. Hapten-Liganden werden meist mit einem entsprechenden enzym- oder farbstoffmarkierten Rezeptor, der eine Affinität für den Liganden hat, in Kontakt gebracht und darüber nachgewiesen.

Transportmoleküle sind Fusionsproteine, die dazu verwendet werden, um Moleküle, in diesem Fall Nukleinsäuren, insbesondere ausgewählt aus siRNA, Liganden des angeborenen Immunsystems, Antigenen des adaptiven Immunsystems, davon insbesondere TLR-Liganden, an Zielzellen zu transportieren, indem sie spezifisch an Zielzellen binden und anschließend eine Aufnahme der transportierten Moleküle in die Zielzelle erfolgt. Besonders bevorzugte Moleküle, die durch Transportmoleküle transportiert werden, ist siRNA. Weiter bevorzugte Moleküle, die transportiert werden, sind Liganden von TLR7, TLR8 und TLR9.

Ebenfalls von der Erfindung umfasst sind Fusionsproteine, welche mindestens ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid und mindestens ein weiteres Protein oder Peptid als Fusionspartner enthalten. Dafür wird ein Fusionsgen erzeugt, welches die Nukleinsäuresequenz eines erfindungsgemäßen Linkerpeptids mit der Gensequenz eines Proteins oder Peptids (hierin: Fusionspartner) nach Entfernung des Stop-Codons mit fusioniert wird. Die Translation eines solchen Fusionsgens führt zur Bildung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsproteine enthalten als Fusionspartner einen Antikörper oder ein Antikörperfragment. Ein besonders bevorzugter Fusionspartner in erfindungsgemäßen Fusionsproteinen ist eine variable Region eines Antikörpers.

Der Begriff„Antikörper" im erfindungsgemäßen Sinn umfasst alle Antikörper, Fragmente und Derivate derselben, die in der Lage sind, spezifisch an ein Antigen zu binden. Dazu zählen die kompletten monoklonalen Antikörper und auch die epitopbindenden Fragmente dieser Antikörper. Hierbei umfassen die epitopbindenden Fragmente (hier auch als Antikörperfragmente oder Antikörperderivate bezeichnet) alle Teile des Antikörpers, die in der Lage sind, an das Antigen zu binden. Beispiele für erfindungsgemäß umfasste Antikörperfragmente beinhalten, sind aber ausdrücklich nicht limitiert auf, Fab, Fab', F(ab') ₂ , Fd, Einzelketten (single-chain) variable Fragmente (scFv), Einzelketten-Antikörper, disulfidverlinkte variable Fragmente (sdFv) und Fragmente die entweder eine variable Region der leichten Kette (VL) oder eine variable Region der schweren Kette (VH) beinhalten. Weiterhin zählen dazu rekombinant hergestellte Antikörper, wie Diabodies, Triabodies, Tetrabodies.

Bevorzugt trägt der Antikörper ein Markermolekül, wie z. B. Biotin, Dioxygenin, ein Radionuklid oder einen Fluoreszenzfarbstoff.

Antikörperfragmente enthalten die variablen Regionen entweder allein oder in Kombination mit weiteren Regionen, die ausgewählt sind aus der Hinge-Region, und dem ersten, zweiten und dritten Bereich der konstanten Region (CHI, CH2, CH3). Ebenfalls durch den Begriff„Antikörper" umfasst sind chimäre Antikörper, bei denen unterschiedliche Teile des Antikörpers aus verschiedenen Spezies stammen, wie beispielsweise Antikörper mit einer murinen variablen Region, welche mit einer humanen konstanten Region kombiniert ist.

Die Bezeichnung„variable Region" ist erfindungsgemäß definiert als die Teile der schweren und leichten Ketten der Antikörper, die sich in ihrer Sequenz zwischen Antikörpern unterscheiden und die Spezifität des Antikörpers und die Bindung an sein Antigen bestimmen. Die Variabilität ist hierbei nicht gleichmäßig in der variablen Region verteilt. Sie ist üblicherweise innerhalb dreier definierter Segmente der variablen Region konzentriert, die als komplementaritätsbe stimmende Regionen (CDRs) oder auch hypervariable Regionen bezeichnet werden und in den variablen Regionen sowohl der leichten als auch der schweren Ketten vorhanden sind. Die stärker konservierten Teile der variablen Regionen werden Gerüstregionen (framework regions) genannt. Die variablen Regionen der schweren und leichten Ketten enthalten vier Gerüstregionen, die überwiegend eine beta-Faltblatt Struktur annehmen, wobei jede Gerüstregion mit drei CDRs verbunden ist, die Schleifen bilden, die die beta- Faltblatt-Strukturen verbinden und in manchen Fällen Teil der beta-Faltblatt-Struktur sind. Die CDRs der jeweiligen Kette sind durch die Gerüstregionen in unmittelbare Nähe gebracht und tragen gemeinsam mit den CDRs der anderen Kette zur Bildung der Antigenbindungsregion der Antikörper bei.

Weiter bevorzugte Fusionsproteine enthalten als Fusionspartner ein Antigen. Ein besonders bevorzugter Fusionspartner ist ein bakterielles, virales oder eukaryontisches Antigen.

Weiter bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsproteine enthalten mindestens zwei Fusionspartner, vorzugsweise ausgewählt aus Antikörpern, Teilen von Antikörpern, insbesondere variable Regionen eines Antikörpers, Antigenen, insbesondere bakterielle, virale oder eukaryontische Antigene, sowie Kombinationen davon.

Ist das Linkerpeptid so ausgestaltet, dass es eine Nukleinsäurebindungs-Domäne, eine Proteindimerisations-Domäne, ein Peptidepitop oder Kombinationen davon enthält, kann durch Bindung eines weiteren Moleküls an die vorgenannten Domänen eines Linkerpeptids eines erfindungsgemäßen Fusionsprotein ein Fusionsprotein-Komplex ausgebildet werden. Dabei eignen sich zur Bindung an die Nukleinsäurebindungs-Domäne Nukleinsäuren als weitere Moleküle und zur Bindung an die Proteindimerisations-Domäne Peptide oder Proteine als weitere Moleküle. Zur Bindung an das Peptidepitop eignen sich spezifische Antikörper oder Antikörperfragmente, welche die Sequenz oder Struktur des Peptidepitops binden.

Zur Bindung an die Proteindimerisations-Domäne eignen sich erfindungsgemäße Fusionsproteine, die ein Linkerpeptid mit einer Proteindimerisations-Domäne enthalten. Dabei können die beiden erfindungsgemäßen Fusionsproteine, die dadurch als Fusionsprotein-Komplex ein Dimer bilden, gleich beschaffen sein oder unterschiedlich aufgebaut sein. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Fusionsproteine in einem Dimer unterschiedlich.

Die Bindungen zwischen den Domänen und den weiteren Molekülen ist dabei nicht kovalent, sondern vorzugsweise aus nicht-kovalenten Bindungen zwischen den funktionellen Gruppen der weiteren Moleküle mit den Aminosäuren der Domänen ausgebildet.

Daher umfasst die Erfindung auch Fusionsprotein-Komplexe, die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein enthalten, wobei ein weiteres Protein oder Peptid über die Proteindimerisations- Domäne des Linkerpeptids gebunden ist und/oder eine Nukleinsäure über die Nukleinsäure-Bindungs- Domäne des Linkerpeptids gebunden ist und/oder ein weiteres erfindungsgemäßes Fusionsprotein übet die Proteindimerisations-Domäne gebunden ist. Weiterhin sind ggf. weitere Moleküle, insbesondere Glykolipide oder Glykoproteine, indirekt über einen Fusionspartner gebunden.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsprotein-Komplexe sind dadurch gekennzeichnet, dass siRNA an die Nukleinsäurebindungs-Domäne gebunden ist.

Bevorzugt enthält besagtes Fusionsprotein dabei ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit einer Aminosäuresequenz von mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, bevorzugt identisch zur Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2. Im mit Hilfe dieses Fusionsproteins gebildeten erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Komplexes ist siRNA über die Nukleinsäurebindungs-Domäne an das Fusionsprotein gebunden. Solche Fusionsprotein-Komplexe sind dazu geeignet, um siRNA zu CD33-positiven Zellen, insbesondere zu CD 33-positiven Tumorzellen zu transportieren.

Weiter bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsprotein-Komplexe sind dadurch gekennzeichnet, dass ein weiteres erfindungsgemäßes Fusionsprotein an die Proteindimerisations-Domäne gebunden ist.

Weiter bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsprotein-Komplexe sind dadurch gekennzeichnet, dass ein spezifischer, gegen ein Peptidepitop des erfindungsgemäßen Linkerpeptids gerichteter Antikörper, an das Peptidepitop des Linkerpeptids gebunden ist. Dieser Antikörper kann selbst wiederum Bestandteil eines Fusionsproteins ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid oder eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins sein. Somit enthält ein erfindungsgemäßer Fusionsprotein- Komplex als Einzelbestandteil des Komplexes mindestens ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein. Besonders bevorzugte Antikörper, die in erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Komplexen enthalten sind, sind bispezifische Antikörper, wobei eine variable Region des bispezifischen Antikörpers gegen ein Peptidepitop des erfindungsgemäßen Linkerpeptids gerichtet ist und die andere variable Region gegen ein anderes Antigen, insbesondere ein Oberflächenantigen von Immunzellen, insbesondere von T Zellen, dendritischen Zellen, B Zellen, NK Zellen oder Makrophagen, gerichtet ist.

Bevorzugte erfindungsgemäße Fusionsprotein-Komplexe enthalten ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein umfassend ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit mindestens 95 %, bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu SEQ ID No. 1, besonders bevorzugt zu SEQ ID No. 2.

Über nicht-kovalente Bindung ist ein Antikörper oder Antikörperderivat an das erfindungsgemäße Linkerpeptid gebunden, wobei der Antikörper oder das Antikörperderivat vorzugsweise variable Regionen aufweist, die die folgenden CDR Regionen oder CDR-Regionen mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu den folgenden CDR-Regionen umfassen: a) variable Region der schweren Kette

- CDR1 SEQ ID No. 4, CDR2 SEQ ID No. 5, CDR3 SEQ ID No. 6, und b) variable Region der leichten Kette

- CDR1 SEQ ID No. 7, CDR2 SEQ ID No. 8, CDR3 SEQ ID No. 9.

Die so definierten Antikörper oder Antikörperfragmente binden spezifisch folgende Sequenz des erfindungsgemäßen Linkerpeptids: SEQ ID No. 1 .

Grundsätzlich sind zur Bildung von Fusionsprotein-Komplexen mit Hilfe von Antikörpern alle Antikörper geeignet, die ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid spezifisch binden. Daher umfasst die Erfindung auch Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid binden sowie die Verwendung dieser Antikörper oder Antikörperfragmente in Fusionsproteinen. Ebenfalls von der Erfindung umfasst ist die Verwendung erfindungsgemäßer Antikörper oder Antikörperfragmente zur Herstellung von erfindungsgemäßen Fusionsprotein- Komplexen.

Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Antikörper oder Antikörperfragmente weisen variable Regionen auf, deren CDR-Regionen mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, bevorzugt mindestens 99 % Aminosäure-Sequenzidentität zu den folgenden CDR-Regionen aufweisen: variable Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 4, CDR2 SEQ ID No. 5, CDR3 SEQ ID No. 6 variable Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 7 , CDR2 SEQ ID No. 8 , CDR3 SEQ ID No. 9.

Ein besonders bevorzugter Antikörper oder ein bevorzugtes Antikörperfragment, das spezifisch an ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid bindet, umfasst die CDR-Regionen gemäß SEQ ID No. 4 bis SEQ ID No. 9.

Von der Erfindung ist auch ein Kit zur Herstellung erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplexe umfasst, welcher die folgenden Bestandteile umfasst: a) mindestens ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, vorzugsweise enthaltend einen erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit einem Peptidepitop und/oder eine Nukleinsäurebindungs-Domäne, und b) mindestens ein erfindungsgemäßer Antikörper und/oder mindestens ein erfindungsgemäßes Antikörperfragment oder mindestens eine Nukleinsäure, vorzugsweise siRNA, oder mindestens ein weiteres erfindungsgemäßes Fusionsprotein.

In dem erfindungsgemäßen Kit liegen die Bestandteile aus a) und b) separat verpackt vor.

Bevorzugte erfindungsgemäße Kits enthalten ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, welches ein Linkerpeptid mit einer Nukleinsäurebindungs-Domäne enthält und eine Nukleinsäure, insbesondere siRNA. Weiter bevorzugte erfindungsgemäße Kits enthalten ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, welches ein Linkerpeptid mit einem Peptidepitop enthält und einen erfindungsgemäßen Antikörper oder ein erfindungsgemäßes Antikörperfragment. Weiter bevorzugte erfindungsgemäße Kits enthalten zwei erfindungsgemäße Fusionsproteine, welche ein Linkerpeptid mit einer Proteindimerisations- Domäne enthalten und von denen mindestens eines eine Nukleinsäurebindungs-Domäne enthält und und eine Nukleinsäure.

Erfindungsgemäße Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe eignen sich zum Targeting von Zielzellen. Demzufolge sind erfindungsgemäße Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe zur gezielten therapeutischen Behandlung von Erkrankungen geeignet.

Unter Zielzellen im erfindungsgemäßen Sinn werden Zellen, insbesondere Zellen des menschlichen Körpers, verstanden, an die ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein oder ein erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplex binden kann . Dadurch wird vorzugwe ise eine Aufnahme de r erfindungsgemäßen Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe in die Zielzellen ausgelöst und die Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe anschließend von den Zielzellen prozessiert. Daher umfasst die Erfindung auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen oder erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Komplexen zum Targeting von Zielzellen. In bevorzugten Verwendungen sind die Zielzellen Tumorzellen, insbesondere Tumorzellen, die CD33 exprimieren. In weiter bevorzugten Verwendungen sind die Zielzellen Immunzellen, insbesondere ausgewählt aus T Zellen, Natürlichen Killerzellen (NK Zellen) und dendritischen Zellen (DCs).

Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe werden vorzugsweise zur therapeutischen Behandlung von Neoplasien, insbesondere Tumoren, verwendet. Weiter bevorzugt werden die erfmdungsgemäßen Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe zur therapeutischen Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, insbesondere Autoimmunerkrankungen oder Allergien verwendet.

Erfindungsgemäße Fusionsproteine werden rekombinant durch die Fusion von Genen, also Nukleinsäuresequenzen, hergestellt, wobei mindestens eine Nukleinsäuresequenz für ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid kodiert.

Daher umfasst die Erfindung auch eine, vorzugsweise isolierte, Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid kodiert. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer, vorzugsweise isolierten, Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid kodiert zur rekombinanten Herstellung von Fusionsproteinen. Bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen umfassen eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Nukleinsäure-Sequenzidentität zu SEQ ID No. 10.

Weiter bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen umfassen eine Nukleinsäuresequenz mit mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 99 % Nukleinsäure-Sequenzidentität zu SEQ ID No. 11.

Weiter von der Erfindung umfasst ist eine, vorzugsweise isolierte, Nukleinsäuresequenz, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kodiert. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer, vorzugsweise isolierten, Nukleinsäuresequenz, die für ein erfmdungsgemäßes Fusionsprotein kodiert zur rekombinanten Herstellung von Fusionsproteinen.

Zur Expression von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen werden die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen vorzugsweise in einen Expressionsvektor kloniert.

Daher umfasst die Erfindung weiter einen Expressionsvektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthält. Vorzugsweise sind mindestens die folgenden Bestandteile umfasst: a. mindestens eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, welche für ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid kodiert; und b. ggf. mindestens eine Nukleinsäuresequenz, kodierend für ein weiteres Protein oder Peptid als Fusionspartner.

Im Sinne der Erfindung wird unter einem Expressionsvektor ein Plasmid, Virus oder anderer Träger verstanden, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz rekombinant durch Insertion oder Inkorporation enthält. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Replikationsstartpunkt, einen Promoter, sowie spezifische Gensequenzen, die eine phänotypische Selektion von den Expressionsvektor enthaltenden Wirtszellen ermöglichen.

Weiter von der Erfindung umfasst ist eine Wirtszelle, die rekombinant eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthält.

Eine Wirtszelle ist eine natürlich vorkommende Zelle oder eine transformiert oder genetisch veränderte Zelllinie oder ein (multizellulärer) Wirtsorganismus, welche bzw. welcher mindestens einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor enthält. Die Erfindung umfasst dabei transiente Transfektanten (z. B. durch mRNA-Injektion), Wirtszellen oder -Organismen, in denen mindestens ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor als Plasmid oder künstliches Chromosom enthalten ist, sowie Wirtszellen oder -Organismen in denen ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor stabil in das Genom des Wirtes (oder einzelner Zellen des Wirtes) integriert ist. Die Wirtszelle ist bevorzugt ausgewählt aus Prokaryonten oder Eukaryonten. Bevorzugte Prokaryonten sind ausgewählt aus Escherichia coli, Bacillus subtilis. Bevorzugte Eukaryonten sind Hefezellen (z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris), Insektenzellen, amphibische Zellen oder Säugetierzellen, wie z. B. CHO, HeLa, HEK293. Bevorzugte Wirtsorganismen sind Pflanzen, wie z . B . Mais oder Tabak, Invertebraten oder Vertebraten, insbesondere Bovidae, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Xenopus laevis, Medaka, Zebrafisch oder Mus musculus, oder Zellen oder Embryonen der genannten Organismen.

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins umfasst die Erfindung ein Verfahren, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: a. Bereitstellen einer erfmdungsgemäßen Wirtszelle; b. Kultivieren der Wirtzelle unter Bedingungen, unter denen eine Expression und ggf. eine Sezernierung des Fusionsproteins stattfindet; und c. ggf. wenigstens teilweises Aufreinigen des Fusionsproteins. Bevorzugt werden Wirtszellen dabei in einem Selektivmedium gezüchtet (kultiviert), das auf das Wachstum der Zellen selektiert, die einen Expressionsvektor enthalten. Die Expression der Gensequenzen des Expressionsvektors resultiert in der Produktion des erfindungsgemäßen Fusionsproteins. Die exprimierten Fusionsproteine werden dann vorzugsweise durch ein beliebiges konventionelles Verfahren isoliert und gereinigt, einschließlich Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Elektrophorese oder auch durch Affinitätschromatographie.

Da erfindungsgemäße Fusionsproteine oder erfindungsgemäße Fusionsproteinkomplexe zum Targeting von Zielzellen geeignet sind, sind sie weiter für therapeutische Anwendungen geeignet. Besonders geeignete therapeutische Anwendungen sind, ohne zu beschränken, die Therapie von malignen Neoplasien oder Erkrankungen des Immunsystems, wobei vorzugsweise jeweils ein Targeting von Tumorzellen oder Immunzellen erfolgt.

Daher umfasst die Erfindung auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein oder einen erfmdungsgemäßen Fusionsprotein-Komplex oder eine Kombination davon in Kombination mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger enthält.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen verschiedene Dosierungsformen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden bevorzugt parenteral, besonders bevorzugt intravenös verabreicht. In einer Ausgestaltung der Erfindung liegt die parenterale pharmazeutische Zusammensetzung in einer Darreichungsform vor, die zur Injektion geeignet ist. Besonders bevorzugte Zusammensetzungen sind daher Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen des erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Fusionsprotein-Komplexes welcher in e ine m pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger vorliegt.

Als pharmazeutisch annehmbare Träger werden vorzugsweise Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Salzlösung, 0,3% Glycin und ähnliche Lösungsmittel eingesetzt. Die Lösungen sind steril. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch herkömmliche, gut bekannte Techniken sterilisiert. Die Zusammensetzungen enthalten bevorzugt pharmazeutisch akzeptable Hilfssubstanzen, wie etwa diejenigen, die erforderlich sind um näherungsweise physiologische Bedingungen zu ergeben und/oder die Stabilität des erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Fusionsprotein-Komplexes zu erhöhen, wie etwa Mittel zur Einstellung des pH- Werts und Puffermittel, Mittel zur Einstellung der Toxizität und dergleichen, vorzugsweise ausgewählt aus Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid und Natriumlactat. Die Konzentrationen der erfindungsgemäßen Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe in diesen Formulierungen sind je nach Anwendung variabel, sie betragen vorzugsweise weniger als 0,01 Gewichts-%, bevorzugt mindestens 0, 1 Gewichts-%, weiter bevorzugt zwischen 1 und 5 Gewichts-% und sie werden primär auf der Basis von Fluidvolumina, Viskosität, u.ä. ausgewählt oder in Übereinstimmung mit dem jeweiligen Verabreichungsmodus .

Die erfindungsgemäßen Fusionsproteine, Fusionsprotein-Komplexe oder die einzelnen Moleküle, aus denen der erfindungsgemäße Fusionsprotein-Komplex besteht, werden bevorzugt in eine Zusammensetzung aufgenommen, die für eine parenterale Verabreichung geeignet ist. Bevorzugt ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine injizierbare gepufferte Lösung, die zwischen 0, 1 bis 500 mg/ml Antikörper, besonders bevorzugt zwischen 0, 1 bis 250 mg/ml Antikörper, insbesondere zusammen mit 1 bis 500 mMol/1 Puffer enthält. Die injizierbare Lösung kann sowohl in einer flüssigen als auch ein einer lyophilisierten Dosierungsform vorliegen. Der Puffer kann bevorzugt Histidin sein (bevorzugt 1 bis 50 mM. besonders bevorzugt 5 bis 10 mM), bei einem pH-Wert von 5,0 bis 7,0 (besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von 6,0).

Andere geeignete Puffer umfassen, sind aber ausdrücklich nicht beschränkt auf, Natriumsuccinat, Natriumeitrat, Natriumphosphat oder Kaliumphosphat. Bevorzugt wird Natriumchlorid zwischen 0 bis 300 mM, besonders bevorzugt 150 mM für eine flüssige Darreichungsform, verwendet. Für eine lyophilisierte Darreichungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt Kälteschutzmittel, bevorzugt 0 - 10 % Sucrose (besonders bevorzugt 0,5 - 1,0 %). Andere Kälteschutzmittel umfassen Trehalose und Lactose. Für eine lyophilisierte Darreichungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt Quellmittel, bevorzugt 1 bis 10 % Mannitol. Andere Quellmittel umfassen Glycin und Arginin. Sowohl in flüssigen als auch in lyophilisierten Darreichungsformen werden bevorzugt Stabilisatoren eingesetzt, besonders bevorzugt zwischen 1 bis 50 mM L-Methionin (besonders bevorzugt zwischen 5 und 10 mM).

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die pharmazeutische Zusammensetzung erfmdungsgemäße Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe in einer Dosismenge von 0, 1 mg/kg bis 10 mg/kg pro Anwendung. Besonders bevorzugte Dosismengen umfassen 1 mg/kg Körpergewicht.

Pharmazeutische Zusammensetzungen müssen steril und unter den Herstellungs- und Aufbewahrungsbedingungen stabil sein. Die Zusammensetzung kann formuliert werden als eine Lösung, Mikroemulsion, Dispersion, in Liposomen oder einer anderen geordneten Struktur, die für hohe Konzentrationen an erfindungsgemäßen Fusionsproteinen oder Fusionsprotein-Komplexen geeignet ist. Sterile injizierbare Lösungen können hergestellt werden, indem man das Fusionsprotein oder den Fusionsprotein-Komplex in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel aufnimmt, mit einem oder mit einer Kombination der vorstehend aufgezählten Inhaltsstoffe je nach Bedarf, gefolgt von einer Filtersterilisation. Für sterile, lyophilisierte Pulver für die Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknen und Sprühtrocknen, was ein Pulver des erfindungsgemäßen Fusionsproteins oder Fusionsprotein- Komplexes plus etwaigen zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoffen aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon ergibt.

Von der Erfindung sind auch Verfahren zur therapeutischen Behandlung umfasst, bei denen einem Patienten eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht wird. Krankheiten, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden, sind vorzugsweise maligne Neoplasien, Erkrankungen des Immunsystems, Infektionserkrankungen oder Abstoßungsreaktionen in Folge von Transplantationen; insbesondere bevorzugt davon sind maligne Neoplasien. Bevorzugte Krankheiten sind davon: Autoimmunerkrankungen, bevorzugt ausgewählt aus Multipler Sklerose, Lupus erythematodes, Amyotropher Lateralsklerose (ALS), Glomerulonephritis, Rheumatoider Arthritis, Polyarthritis, Kollagenosen, Sjögren's-Syndrom, Sharp-Syndrom, progressive systemische Sklerose (systemische Sklerodermie), Polymyositis, Vaskulitiden, hämolytische Anämie, Immunthrombozytopenie (ITP), Immunneutropenie, Diabetes Typ I, Morbus Crohn, Colitis ulcerosa, Alopecia, Zöliakie, Chronic fatigue Syndrome, Psoriasis, Uveitis und Thyreoiditis; Allergien, insbesondere ausgewählt aus allergischem Asthma, allergischer Rhinitis, Konjunktivitis, Neurodermitis, Kontaktekzem, Urtikaria oder anaphylaktischem Schock; Infektionen, insbesondere virale oder bakterielle Infektionen; maligne Neoplasien, insbesondere ausgewählt aus Karzinomen, vorzugsweise Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom, Siegelringzellkarzinom oder Urothelkarzinom, Sarkome, neuroendokrine Tumoren, Leukämien und Lymphomen oder graft versus host disease (GvhD).

Erfindungsgemäße Linkerpeptide sind flexibel und ermöglichen vorteilhaft eine erhöhte Stabilität von Fusionsproteinen, besonders beim Einsatz großer Proteindomänen als Fusionspartner. Dadurch sind erfindungsgemäße Fusionsproteine auch mit großen Fusionspartnern stabil.

Durch die Eigenschaft erfindungsgemäßer Linkerproteine, dass die Bindung spezifischer Antikörper oder auch die Bindung von Nukleinsäuren erlaubt, wird der modulare Aufbau von Fusionsprotein- Komplexen ermöglicht. Mit erfindungsgemäßen Fusionsproteinen ist es vorteilhaft möglich weitere costimulatorische Signale, z.B. in der Form von Nukleinsäuren, Peptiden oder Proteinen, insbesondere Signalmolekülen zu Zielzellen mitzutransportieren.

Mit Hilfe erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplexe ist es beispielsweise vorteilhaft möglich, den Transport von verschiedenen Antigenen zu Zielzellen mit der Verwendung eines einzigen rekombinanten, bispezifischen Antikörpers zu gewährleisten. Dieser muss in der Lage sein, ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid einerseits und ein Antigen auf Zielzellen andererseits zu binden. Der Herstellungs- und Optimierungsaufwand für das Transportsystem ist also auf die Optimierung des bispezifischen Antikörpers limitiert. Durch Herstellung von Fusionsproteinen aus einem erfindungsgemäßen Linkerpeptid mit einem beliebigen Antigen können so mit einem einzigen bispezifischen Antikörper beliebig viele verschiedene Fusionsprotein-Komplexe als Transportmoleküle gebildet werden. Dieser modulare Aufbau ist durch die Verminderung des Herstellungsaufwands bisher beschriebenen Systemen zum Transport von Molekülen zu Zielzellen überlegen. Der klinische Aufwand bei der Zulassung von Therapeutika muss für ein Modul, was vielfältig einsetzbar ist, nur einmal erfolgen.

Durch erfindungsgemäße Fusionsproteine, welche siRNA an die Nukleinsäurebindungs-Domäne des Linkerpeptids gebunden ist, kann vorteilhaft siRNA gezielt an gewünschte Zielzellen transportiert werden. Das Linkerpeptid vermittelt dabei die Aufnahme der siRNA in die Zielzellen, was bisher nicht möglich war. Der gezielte Transport der siRNA mittels der erfindungsgemäßen Fusionsprotein- Komplexe bewirkt zudem vorteilhaft eine erhebliche Verminderung der einzusetzenden siRNA- Menge.

Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.

Folgende Abkürzungen werden in Folge verwendet: E - erfindungsgemäßes Linkerpeptid, E7B6 - erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1, E7B6L - erfindungsgemäßes Linkerpeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2, TZ - Zielzelle, TA - Zielantigen, EZ - Effektorzelle, GFP - grün fluoreszierendes Protein,

Fig. 1. Dreidimensionale Struktur des humanen La-Proteins (A: La-Motiv, B: RRM1, C: RRM2, A:

La-Motiv, B: RRM1, C: RRM2, D: La Domäne und detaillierte Herausvergrößerung der alpha-helikalen Region enthaltend die Sequenzregionen gemäß SEQ ID No. 1).

Fig. 2. Schematische Darstellung der einer therapeutischen Anwendung des erfindungsgemäßen Linkerpeptids in Fusionsprotein-Komplexen zugrundeliegenden Mechanismen. Fusionsproteine enthalten ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid und Antikörper oder Antikörperfragmente, die spezifisch an eine Zielzelle (TZ) binden, von links nach rechts: Fusionsprotein-Komplex, in dem Zytostatika kovalent an das Linkerpeptid gebunden sind; Fusionsprotein-Komplex, in dem Nukleinsäuren, z.B. siRNA, oder TLR-Liganden an das Linkerpeptid gebunden sind; Fusionsprotein-Komplex, in dem Toxine an das Linkerpeptid gebunden sind; Fusionsprotein-Komplex, in dem Radioisotope an das Linkerpeptid gebunden sind. Schematische Darstellung des Wirkmechanismus erfindungsgemäßer Fusionsproteine oder Fusionsproteinkomplexe bei der Therapie von Tumorerkrankungen oder Erkrankungen des Immunsystems. Erfindungsgemäße Linkerpeptide sind dabei entweder einfach oder zweifach in erfindungsgemäßen Fusionsproteinen enthalten.

A) Schema erfindungsgemäßer Fusionsproteine. Links: bispezifischer Antikörper enthaltend ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid, wobei der Antikörper gegen Effektorzelle (EZ) und Zielzelle (TZ) gerichtet ist. Mitte: bispezifischer Antikörper enthaltend zwei erfindungsgemäße Linkerpeptide und ein zentrales GFP, wobei der Antikörper gegen Effektorzelle (EZ) und Zielzelle (TZ) gerichtet ist. Rechts: Fusionsproteinkomplex, umfassend ein Effektor-Modul und ein Targeting-Modul. Das Effektor-Modul umfasst einen bispezifischen Antikörper, der gegen die Effektorzelle und das erfindungsgemäße Linkerpeptid gerichtet ist. Das Targeting-Modul ist ein Antikörperfragment, welches gegen eine Zielzelle gerichtet ist und ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid enthält.

B) Schema des Wirkmechanismus bei der therapeutischen Verwendung erfindungsgemäßer Fusionsproteine oder Fusionsprotein-Komplexe durch Targeting von T- Zellen an Zielzellen. a) Fusionsprotein-Komplex, umfassend einen monospezifischen Antikörper, der gegen CD3 gerichtet ist und ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid enthält und weiter umfassend einen bispezifischen Antikörper, der gegen ein Zielantigen (TA) und das erfindungsgemäße Linkerpeptid gerichtet ist.

b) Fusionsprotein-Komplex, umfassend drei Proteine, von denen eines zwei erfindungsgemäße Linkerpeptide enthält. Ein monospezifischer Antikörper enthält zwei erfindungsgemäße Linkerpeptide E. Weiter enthält der Fusionsprotein-Komplex zwei bispezifische Antikörper, die gegen das Linkerpeptid und gegen ein Zielantigen (TA) gerichtet sind.

c) Fusionsprotein-Komplex, umfassend einen monospezifischen Antikörper, der gegen ein Zielantigen (TA) auf einer Zielzelle (TZ) gerichtet ist und ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid enthält und weiter umfassend einen bispezifischen Antikörper, der gegen ein CD3 und das erfmdungsgemäße Linkerpeptid gerichtet ist.

d) Fusionsprotein-Komplex, umfassend einen Antikörper, der gegen ein Zielantigen (TA) auf einer Zielzelle (TZ) gerichtet ist und ein zentrales erfindungsgemäßes Linkerpeptid enthält und weiter umfassend einen bispezifischen Antikörper, der gegen ein CD3 und das erfindungsgemäße Linkerpeptid gerichtet ist.

Schematische Darstellung erfindungsgemäßer Fusionsproteine mit Peptidantigenen und deren Wirkmechanismus. Links: Fusionsprotein, enthaltend ein Antikörperfragment, welches gegen ein Oberflächenantigen auf dendritischen Zellen gerichtet ist, ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid, ein Peptidantigen, insbesondere Tetanustoxin. Mitte: Fusionsprotein-Komplex der aus einem Fusionsprotein, enthaltend ein zentrales Peptidantigen und zwei Linkerpeptide; und zwei bispezifischen Antikörpern aufgebaut ist, wobei die bispezifischen Antikörper jeweils das erfindungsgemäße Linkerpeptid und ein Oberflächenantigen auf dendritischen Zellen spezifisch binden. Rechts: Fusionsprotein-Komplex der aus einem Fusionsprotein mit drei erfindungsgemäßen Linkerpeptiden und drei bispezifischen Antikörpern aufgebaut ist. Das Fusionsprotein enthält zwischen den Linkerpeptiden jeweils ein GFP und ein Peptidantigen. Die die bispezifischen Antikörper binden jeweils das erfindungsgemäße Linkerpeptid und ein Oberflächenantigen auf dendritischen Zellen spezifisch.

A und B) Sequenzen und schematische Darstellung des Aufbaus von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1 (E7B6) oder SEQ ID No. 2 (E7B6L) gemäß SEQ ID No. 25 - SEQ ID No. 54, wie in den Ausführungsbeispielen verwendet; C) (a, b) Sequenzen und schematische Darstellung des Auf b au s von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen, enthaltend mindestens ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1 (E7B6) gemäß SEQ ID No. 55 - SEQ ID No. 58, wie in den Ausführungsbeispielen verwendet, (c, d) Sequenzen und schematische Darstellung des Aufbaus von bispezifischen Antikörpern ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 59 - SEQ ID No. 62 zur Bildung erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplexe mit erfindungsgemäßen Fusionsproteinen, (e-g) Sequenzen und schematische Darstellung des Aufbaus von bispezifischen Kontroll-Antikörpern gemäß SEQ ID No. 63 - SEQ ID No. 68 als Vergleichsbeispiel zu erfindungsgemäßen Fusionsproteinen in Form bispezifischer Antikörper.

Bestimmung der Stabilität und Funktion von Fusionsproteinen mit einem erfindungsgemäßen Linkerpeptid im Vergleich zu Fusionsproteinen mit Glycin-Serin-Linker (Gly-Ser-Linker). A) Schematische Darstellung der verwendeten Konstrukte. Oben: Bispezifischer Antikörper gegen CD3 und CD33 mit Gly-Ser-Linker (Vergleichsbeispiel). Unten: Bispezifischer Antikörper gegen CD3 und CD33 mit einem erfindungsgemäßen Linkerpeptid (E7B6). B) SDS-Page/Immunoblot der aufgereinigten Antikörper. C) Spezifische Lyse im Chrom- Freisetzungstest mit dem Fusionsprotein mit Glycin-Serin-Linker (Vergleichsbeispiel) und dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein.

Vergleich der Funktion von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen mit erfindungsgemäßem Linkerpeptid und zusätzlich eingebauten großen Proteindomänen (hier: GFP). A) Schematische Darstellung des verwendeten Konstrukts, eines bispezifischen Antikörpers gegen CD3 und CD33 mit zwei erfindungsgemäßen Linkerpeptiden (E7B6) und einem zentralen GFP. B) Vergleich der spezifischen Lyse im Chrom-Freisetzungstest mit dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein aus Fig. 6A und dem erfindungsgemäßen Fusionsprotein aus Fig . 7A . Es wurde kein Unterschied der Funktionalität festgestellt. C) (a,c,e) Phasenkontrastaufhahmen; (b,d,f) Fluoreszenzaufhahmen. (a,b) Effektorzellen (T-Zellen) und Targetzellen (CD33 positive Tumorzellen) verteilen sich in Abwesenheit des erfindungsgemäßen Fusionsproteins zufällig untereinander. (c,d,e,f) In Gegenwart des erfindungsgemäßen Fusionsproteins nach Fig. 7A interagieren die T-Zellen mit den Tumorzellen und es kommt zur Ausbildung von Synapsen ähnlichen Strukturen (f, Pfeilköpfe).

(A-F) Komplexbildung mit Nukleinsäuren durch erfindungsgemäße Fusionsproteine mit einem Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1 bestimmt durch Komplexbildung an SPR-Chips. Komplexbildung mit (A) dsDNA, (B) dsRNA, (C) ssRNA, (D) ssDNA. (E) Bindung eines spezifischen Antikörpers nach Komplexbildung mit Nukleinsäure. (F) Vergleichsbeispiel: Bindung eines Fusionsproteins mit Gly-Ser-Linker, ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid, an ssRNA. (G-H) Proteindimerisation erfindungsgemäßer Fusionsproteine. Fusionsproteine, die ein Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1 enthalten, binden an Proteine, die ebenfalls ein Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1 enthalten (G). Gleich aufgebaute Fusionsproteine ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid interagieren nicht untereinander (H).

Hemmung der Luciferase-Expression nach Transport von siRNA an Zielzellen durch erfmdungsgemäße Fusionsproteine nach unterschiedlicher Inkubationszeit. Fusionsprotein- Komplexe: Kontroll-siRNA (nicht Luziferase-spezifisch) mit CD33-E7B6L-CD33 (dargestellt als „Kontroll siRNA + CD33-E7B6L-CD33", offene Rechtecke); Luziferase-spezifische siRNA mit CD33-E7B6L-CD33 (dargestellt als „Luc siRNA + CD33-E7B6L-CD33", schwarze Rechtecke); Vergleichsbeispiele: Transfektion von Luziferase-spezifischer siRNA (dargestellt als„Luc siRNA transfiziert"); Zugabe von Luziferase-spezifischer siRNA ohne Transfektion (dargestellt als„Luc siRNA").

FACS-Analyse der Bindung von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen an: PSCA-positive Tumorzellen. Bindung von Fusionsproteinen scFv PSCA-E7B6 (A) bzw. E7B6L (B) an PSCA-positive Tumorzellen im Vergleich zu bispezifischen Antikörpern ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid (Vergleichsbeispiele C-E) CD3xPSCA im Tandem (C) bzw. scBsDB (D) Format bzw. zu anti-PSCA mAk (E).

FACS-Analyse der Bindung von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen an: CD3-positive T Zellen. Bindung von Fusionsproteinen scBsDB CD3xE7B6 (A) an CD3-positive humane T- Zellen im Vergleich zu bispezifischen Antikörpern ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid (Vergleichsbeispiele) CD3xPSCA im Tandem (C) bzw. scBsDB (D) Format bzw. zu anti-CD3 mAk (B).

FACS-Analyse der Bindung von erfindungsgemäßen Fusionsproteinen an: PSCA-positive Hek293T Zellen, deren Oberfläche mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 1 dekoriert war. Dafür wurden die Hek293T (A) mit dem Fusionsprotein scFv PSCA-E7B6, (B) mit dem Fusionsprotein scFv PSCA-E7B6L und die Bindung des erfindungsgemäßen Fusionsproteins scBsDB CD3xE7B6 bestimmt. Das Protein kann dort mit einem anti-La- Antikörper (D) detektiert werden. Auch die anti-E7B6 Domäne des Fusionsproteins scBsDB CD3xE7B6 bindet unter diesen Bedingungen an die mit dem Linkerpeptid dekorierten Zellen (C).

Fig. 13. Chromfreisetzungstest zum Nachweis der Funktionalität von erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Komplexen. PSCA-positive TZ wurden von Effektor T-Zellen in Gegenwart von Fusionsprotein-Komplexen aus dem Effektormodul scBsDB CD3x7B6 und den Targetmodulen anti-PSCA E7B6 (scFvPSCA-E7B6, diagonal schraffiert) bzw. anti-PSCA E7B6L (scFvPSCA-E7B6L, schwarz-weiß-gepunktet) spezifisch und effizient lysiert. Die Lyseeffizienz der Fusionsprotein-Komplexe ist vergleichbar zu konventionell aufgebauten bispezifischen Antikörpern (scBsDB CD3xPSCA, senkrecht schraffiert) . Keine der Einzelkomponenten bewirkt eine unspezifische Lyse bei den eingesetzten Effektor- (E) zu Target (T)-Zellverhältnissen von 5: 1 und 20: 1.

Fig. 14. Targeting von Antigenen zu dendritischen Zellen mit Hilfe erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplexe. Schematische Darstellung der Konstrukte: (A) bispezifischer Antikörper scBsDB DD2x7B6. (C) SDS-Page des aufgereinigten Fusionsproteins aus (A). (D) FACS Analyse von PBMCs: (a) slan DCs als Subklasse von CD 16 positiven Zellen (Färbung mit anti-slan IgM (DD2); (b) Bindung des monovalenten scBsDB DD2x7B6; (c) Bindung von Fusionsprotein E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B 6 ; (d) Bindung vom erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Komplex [E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B6]/[DD2x7B6] .

Fig. 15. (E) Fluoreszenz-mikroskopische Aufnahme der Bindung des Fusionsprotein-Komplexes [E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B6]/[DD2x7B6] a n s l a n D C. (a Fluoreszenz-; b Durchlichtaufhahme). Da die Fluoreszenz auch intrazellulär ist, wurde das Fusionsprotein von der gezeigten DC aufgenommen. (F) Proliferation von TTp-spezifischen CD4 T Zellen nach Inkubation von PBMCs eines TTp immunisierten Probanden mit Fusionsprotein. (F,a) Fusionsprotein E7B6-E7B6-GFP-E7B6 ohne Antigen (Vergleichsbeispiel) bei 37°C, keine Proliferation; (F,b) E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B6 Fusionsprotein bei 37°C, TTp spezifische Proliferation; Proliferation von TTp-spezifischen CD4 T Zellen nach Inkubation mit TTp- haltigen Fusionsprotein-Komplexen. (F,c) Fusionsprotein-Komplex [E7B6-E7B6-GFP- E7B6]/[DD2x7B6] bei 4°C, keine Proliferation; (F,d) Fusionsprotein-Komplex [E7B6-TTp- E7B6-GFP-E7B6]/[DD2x7B6] bei 4°C, Proliferation; (F,e) E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B6 Fusionsprotein bei 4°C, geringe Proliferation.

Beispiel 1 : Herstellung und Anwendung erfindungsgemäßer Fusionsproteine

Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins entsprechend dem schematischen Aufbau gemäß Fig. 3A (links) wurde der konventionelle Glycin-Serin-Linker in einem bispezifischen Antikörperderivat gemäß Fig. 6A (oben) durch eine erfmdungsgemäßes Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1 (E7B6; Fig. 6A, unten) ersetzt. Dieses Konstrukt ist in Fig. 5A schematisch dargestellt und wird hierin auch als„scBsTaFv CD33-E7B6-CD3" bezeichnet.

Für die anti-CD33 Spezifität sorgten als Fusionspartner hier Antikörperfragmente in der Form von variablen Regionen, deren CDRs die folgenden Sequenzen aufweisen: variable Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 13 , CDR2 SEQ ID No. 14, CDR3 SEQ ID No. 15, variable Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 16 , CDR2 SEQ ID No. 17 , CDR3 SEQ ID No. 18 .

Das erfindungsgemäße Konstrukt scBsTaFv CD33-E7B6-CD3 besitzt eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 30 (Nukleinsäuresequenz: SEQ ID No. 29). Das Konstrukt des Vergleichsbeispiels besitzt eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 68 (Nukleinsäuresequenz: SEQ ID No. 67).

Zur Expression wurden die Leserahmen der entsprechenden erfindungsgemäßen Fusionsproteine stabil in Hek293T, HeLa bzw. CHO Zellen transduziert bzw. transient transfiziert. Die Zellen wurden bei 37°C bzw. bei 30°C in verschiedenen Medien (RPMI1640, DMEM) enthaltend unterschiedliche Konzentrationen an FCS kultiviert. Der jeweils optimale Zeitpunkt der Ernte der Überstände unterschied sich zwar, aber erfolgte die Ernte der Expressionskulturen zum jeweils optimalen Zeitpunkt, dann unterschieden sich die Ausbeuten nur ca. um den Faktor 1,5. Die gezeigten Daten basieren auf Expressionen in Hek293T Zellen in 10% FCS . Die Überstände der Zellen wurden geerntet, gegebenenfalls mittels einer fraktionierten Ammoniumsulfatfällung (45-75%) aufkonzentriert und vorgereinigt (Fraktion 1 bis 45% Sättigung wurde verworfen; Fraktion 45 bis 75% Sättigung enthielt üblicherweise das entsprechende erfindungsgemäße Fusionsprotein) und schließlich mittels einer Nickel-Affinitätschromatographie gereinigt. Die Beladung der Affinitätssäulen erfolgte mittels PBS Puffer enthaltend 10 mM Imidazol. Nach Beladung wurde mit mehreren Säulenvolumina PBS (50 mM Imidazol) gewaschen und die gebundenen Fusionsproteine wurden mit PBS -Puffer enthaltend 350 mM Imidazol isoliert. Die isolierten Proteine wurden über Nacht bei 4°C dialysiert.

Nach Klonierung, Expression und Aufreinigung des bispezifischen CD33-CD3 Antikörpers (Fig. 5C, scBsDB CD33xCD3) mit Glycin-Serin Linker wurde mittels SDS-Gelelektrophorese/Immunoblots (Fig. 6B, scBsDB CD3xCD33) auf eine starke Fragmentierung des rekombinanten Proteins festgestellt. Beim erfindungsgemäßen Fusionsprotein wurde eine erhöhte Stabilität festgestellt (Fig. 6B).

Zur Bestimmung der Cytotoxizität wurde ein Chrom-Freisetzungs-Versuch durchgeführt. Zielzellen werden hierzu mit radioaktivem Chrom beladen. Wenn Effektorzellen (EZ) die Zielzellen (TZ) zerstören, wird das Chrom freigesetzt und kann im Überstand gemessen werden. Das Fusionsprotein ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid war nur schwach cytotoxisch wirksam (Fig. 6C, getrichelte Rechtecke). Das erfindungsgemäße Fusionsprotein zeigte eine deutlich höhere cytotoxische Wirkung (Fig. 6C, schwarze Rechtecke).

Das erfindungsgemäße Linkerpeptid wurde mehrfach in ein Fusionsprotein eingebaut, ohne dass dies die Stabilität und Funktionalität negativ beeinflusst. Weiter vorteilhaft ermöglicht ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid auch den Einbau großer Proteindomänen, wie z.B. von GFP. Dies ist bei der Verwendung von Gly-Ser-Linkern nicht möglich.

Um Stabilität und Funktionalität zu demonstrieren wurde ein Konstrukt gemäß Fig. 3A (Mitte) hergestellt. Das Konstrukt ist ein bispezifischer Tandem-Antikörper, der gegen CD33 und CD3 gerichtet ist und wird hierin auch„scBsTaFv CD33-E7B6-GFP-E7B6-CD3" bezeichnet (dargestellt in Fig. 5A).

Das erfindung sgemäße Konstrukt scB sTaFv CD 33-E7B6-GFP-E7B6-CD3 besitzt eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 34 (Nukleinsäuresequenz: SEQ ID No. 33).

Fig. 7B zeigt die Cytotoxizität dieses Konstrukts im Chrom-Freisetzungs-Versuch. Der Einbau von GFP hat keinen negativen Effekt auf die Funktionalität. Wie Fig. 7C zeigt, kann man mit dem erfindungsgemäßen anti-CD33-E7B6-GFP-E7B6-CD33 Fusionskonstrukt die Interaktion und die Ausbildung von Immunsynapsen zwischen Effektor- und Targetzellen sichtbar machen.

Beispiel 2: Gezielter Transport von siRNA an Zielzellen mit erfindungsgemäßen Fusionsproteinen

Es wurde ein Fusionsprotein hergestellt, das zum Transport von Nukleinsäuren an Tumorzellen geeignet ist. Dafür wurde die Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 37 in einen Expressionsvektor eingebracht. Das Fusionsprotein ist ein monospezifischer, gegen CD33 gerichteter Antikörper, der ein erfindungsgemäßes Linkerpeptid der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 enthält. Dieses Fusionsprotein ist schematisch in Fig. 2 und Fig. 5B dargestellt und wird hierin auch als„scTaFv CD33-E7B6L-CD33" bezeichnet. Für die anti-CD33 Spezifität wies der Fusionspartner variablen Regionen auf, deren CDRs die folgenden Sequenzen aufweisen: variable Region der schweren Kette: CDR1 SEQ ID No. 13 , CDR2 SEQ ID No. 14 , CDR3 SEQ ID No. 15, variable Region der leichten Kette: CDR1 SEQ ID No. 16, CDR2 SEQ ID No. 17, CDR3 SEQ ID No. 18 .

Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins scTaFv CD33-E7B6L-CD33 ist SEQ ID No. 38. Das Fusionsprotein wurde durch Transfektion bzw. Transduktion der Expressionsvektoren in Wirtszellen analog zu den in Beispiel 1 beschriebenen Fusionsproteinen exprimiert und anschließend aufgereinigt.

Im Folgenden wurden Experimente durchgeführt, die die Nukleinsäurebindungseigenschaften und Dimerisationseigenschaften des erfindungsgemäßen Linkerpeptids belegen.

Die Nukleinsäurebindung wurde mittels Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) bestimmt (Fig. 8A-E). Dazu wurden verschiedene Nukleinsäuren (dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA) an einen handelsüblichen SPR-CHIP gekoppelt und mit erfindungsgemäßen Fusionsproteinen (enthalten Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 2) und Fusionsproteinen ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid (Vergleichsbeispiel) kontaktiert. Erfindungsgemäße Fusionsproteine binden mit hoher Affinität an Nukleinsäuren vom Typ dsDNA (Fig. 8A), ssDNA (Fig. 8B), dsRNA (Fig. 8C) und mit geringerer Affinität ssRNA (Fig. 8D). Fusionsproteine ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid (Fig. 8F) binden nicht an Nukleinsäuren. Die Bindung an Nukleinsäuren behindert nicht die Bindung von spezifischen Antikörpern an das Linkerpeptid. Fig. 8E zeigt die Bindung eines Antikörpers (CDR-Regionen gemäß SEQ ID No. 4 - 9), der spezifisch an das Linkerpeptid bindet, nach Bindung an Nukleinsäuren. Die kürzeste gebundene Nukleinsäure war ein 15 mer ssDNA.

Zur Demonstration der Dimerisationseigenschaften erfindungsgemäßer Fusionsproteine wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein (mit Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 2) an einen CHIP gekoppelt und mit erfindungsgemäßen Fusionsproteinen (Fig. 8G) und für ein Vergleichsbeispiel mit einem Fusionsprotein ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid kontaktiert (Fig. 8H). Die SPR-Daten zeigen, dass die Dimerisation nur in Anwesenheit des erfindungsgemäßen Linkerpeptids erfolgt.

Um den erfolgreichen Transport von siRNA zu Zielzellen zu demonstrieren, wurden HeLa Zellen mit den Genen codierend für den Oberflächenrezeptor CD33 sowie für das Enzym Luziferase (als Expressionsmarker) permanent transduziert. Als Fusionsprotein wurde ein erfindungsgemäßes Fusionsproteins scTaFv CD33-E7B6L-CD33 bereitgestellt.

Die HeLa-Zellen wurden mit einer kommerziellen siRNA spezifisch für die Luziferase transfiziert (Fig. 9,„Luc siRNA transfiziert"). In Abhängigkeit von der Zeit ist eine Hemmung der Luziferase- Expression festzustellen. Die gleiche Menge an siRNA wurde komplexiert über das erfindungsgemäße Linkerpeptid des Fusionsproteins scTaFv CD33-E7B6L-CD33 zu den CD33 positiven Zielzellen transportiert (Fig. 9,„Luc siRNA + CD33-E7B6L-CD33"). Dies bewirkt ebenfalls eine Hemmung der Luziferase-Expression in den Zielzellen, die sogar stärker ist, als bei der Transfektion mit siRNA. Eine Kontroll siRNA hat unter gleichen Bedingungen keinen Effekt (Fig. 9,„Kontroll siRNA + CD33- E7B6L-CD33"), ebensowenig wie eine einfache Zugabe von Luc siRNA ohne Transportvehikel und ohne Transfektion (Fig. 9,„Luc siRNA"). So ist eine therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Fusionsproteine durch siRNA möglich, welche nunmehr gezielt verabreicht werden kann.

Beispiel 3: Gezieltes Targeting von CD3 T Zellen an Tumorzellen mit Hilfe erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplexe

Im folgenden Beispiel wurde die Funktionalität von Fusionsprotein-Komplexen zur Rekrutierung von Effektorzellen an Zielzellen untersucht. Als Zielantigene (TA) wurden die Tumorantigene CD33 sowie PSCA exemplarisch gewählt. Im Ausführungsbeispiel wurden CD3 T-Zellen als Effektorzellen an CD33-positive bzw. PSCA-positive Zielzellen (Tumorzellen) transportiert. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Tumorzellen so gezielt von Effektorzellen zerstört, die durch den erfindungsgemäßen Fusionsprotein-Komplex an die Zielzelle transportiert wurden. Die hierin eingesetzten Fusionsprotein-Komplexe enthalten mindestens ein Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 2.

Hierbei umfassen die Fusionsprotein-Komplexe ein Effektor-Modul und ein Targeting -Modul. Das Effektor-Modul dient zur Bindung an die Effektorzelle. Das Targeting-Modul dient zur Bindung an die Zielzelle.

Folgende Fusionsprotein-Komplexe wurden untersucht: Targeting-Modul : scFv PSCA-E7B6: Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 49, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 50, scFv PSCA-E7B6L: Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 51, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 52,

- scTaFv PSCA-E7B6L-PSCA: Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 53, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 54, scFv CD33-E7B6 Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 25, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 26, scTaFv CD33-E7B6-CD33: Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 27, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 28,

Effektor-Modul: scBsDB CD3x7B6: Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 61, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 62.

Alle Module wurden einzeln in Expressionsvektoren kloniert. Die Module wurden rekombinant exprimiert und analog zu Beispiel 1 gereinigt.

Um die spezifische Bindung der einzelnen Module der Fusionsprotein-Komplexe an Zielzellen, Effektorzellen und das Linkerpeptid zu demonstrieren, wurde die Bindung der Module gegen PSCA- positive HEK293T-Zellen (Fig. 10) bzw. primäre PBMCs, enthaltend CD3-positive T-Zellen (Fig. 11), und gegen das Linkerpeptid auf Zellen (Fig. 12) bestimmt.

Die Bindung der Targetingmodule scFv PSCA-E7B6 (mit Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 50, mit einem erfindungsgemäßen Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 1; Fig. 10 A), scFv PSCA-E7B6L (mit Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 52, mit einem erfindungsgemäßen Linkerpeptid gemäß SEQ ID No. 2; Fig. 10 B) an PSCA-positive Zellen wurde mittels FACS Analyse nachgewiesen. Diese ist vergleichbar zu bispezifischen Antikörpern ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid (Fig. 10 C als Tandemantikörper, Fig. 10 D als Diabody) und monospezifischen Antikörpern gegen PSCA (Fig. 10 E).

Die Bindung des Effektormoduls scBsDB CD3x7B6 (mit Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 62) an CD3 T Zellen (Fig. I I A) ist vergleichbar mit kommerziell erhältlichem anti-CD3 (Fig. I I B) und bispezifischen Antikörpern ohne erfindungsgemäßes Linkerpeptid (Fig. 11 C als Tandemantikörper, Fig. 11 D als Diabody).

Darüber hinaus wurde die Bindung eines bispezifischen Antikörpers, der gegen das erfindungsgemäße Linkerpeptid gerichtet ist, an die Fusionsproteine scFv PSCA-E7B6 (Fig. 12 A) und scFv PSCA- E7B6L (Fig. 12 B) gezeigt.

Fusionsprotein-Komplexe wurden durch Inkubation der beiden Fusionspartner (Effektormodul und Targetingmodul) erzeugt. Die spezifische Lyse von PSCA-positiven Tumorzellen die gezielte Rekrutierung von CD3 T Zellen mit Hilfe erfindungsgemäßer Fusionsprotein-Komplexe wurde im Chrom-Freisetzungs-Versuch ermittelt. Die Ergebnisse des Chromfreisetzungsversuches sind in Fig. 13 dargestellt.

Erfindungsgemäße Fusionsprotein-Komplexe bestehend aus dem Effektormodul scBsDB CD3x7B6 und entweder dem Targetingmodul anti-PSCA E7B6 (Fig. 13 scFvPSCA-E7B6, diagonal schraffiert) oder anti-PSCA E7B6L (scFvPSCA-E7B6L, schwarz-weiß-gepunktet) führten zu einer spezifischen und effizienten Lyse der PSCA-positiven Zellen. Die Effizienz der Lyse durch die Fusionsprotein- Komplexe ist vergleichbar der konventioneller bispezifischer Antikörper (Fig. 13 scBsDB CD3xPSCA, senkrecht schraffiert). Keine der Einzelkomponenten, weder die anti-PSCA single chain Antikö er-Linkerpeptid-Fusionsproteine noch der scBsDB CD3x7B6 alleine, führten zu einer spezifischen Lyse der PSCA-positiven Zellen.

Beispiel 4: Transport von Antigen an dendritische Zellen durch erfindungsgemäße Fusionsprotein- Komplexe

Es wurden Fusionsprotein-Komplexe bereitgestellt, die zum Transport des Peptidantigens (PA) von Tetanustoxin (TT _P ) an dendritische Zellen (DC) geeignet sind. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein enthielt drei erfindungsgemäße Linkerpeptide der Sequenz gemäß SEQ ID No. 1. Der schematische Aufbau des hierin auch als„E7B6-TTp-E7B6-GFP- E7B6" bezeichnete Fusionsprotein ist in Fig. 14 A dargestellt (Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 56, Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 55). Als Fusionspartner wurde ein bispezifischer Antikörper eingesetzt (Schema in Fig. 14 B), der gegen das Linkerpeptid und slan, ein Oberflächenantigen auf dendritischen Zellen, gerichtet ist. Dieser bispezifische Antikörper wird hierin auch als„7B6xDD2" bezeichnet (Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 60, Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 59).

Fusionsprotein (Fig. 14 C) und Fusionspartner wurden kloniert, exprimiert und analog zu dem Fusionsprotein in Beispiel 1 affinitätsgereinigt. Fusionsprotein-Komplexe wurden durch Inkubation der beiden Fusionspartner erzeugt.

Zum Nachweis der Bindung an DC wurden die Fusionsprotein-Komplexe mit PBMCs bei 4°C inkubiert. Die Inkubation wurde bei 4°C durchgeführt, um eine Endozytose der Fusionsprotein- Komplexe auch von anderen antigen-präsentierenden Fresszellen (APCs) in PBMCs zu vermeiden.

Fusionsprotein-Komplexe binden an slan DCs (Fig. 14 D, d). Keine der Einzelkomponenten ist allein in der Lage, an slanDC zu binden (dargestellt für scBsDb DD2xE7B6 in Fig. 14 D, b); E7B6-TTp- E7B6-GFP-E7B6 in Fig. 14 D, c). Die Daten zeigen, dass erfindungsgemäße Fusionsprotein- Komplexe zum Transport von TTp an slan DCs geeignet sind.

Dies wird durch Epifluoreszenzmikroskopie der GFP-markierten Fusionsprotein-Komplexe bestätigt (Fig. 15 E, a). Da die Fluoreszenz auch intrazellulär ist, zeigen diese Daten zudem, dass nach Bindung die Komplexe von den slan DCs aufgenommen werden.

Um zu zeigen, dass über diesen Transport und die Aufnahme eine Prozessierung und Präsentation des PA erfolgt und darüber eine antigen-spezifische Immunreaktion (Im Falle von TTp als Beispiel eine Reaktivierung/Proliferation von anti-Tetanus Gedächtniszellen) ausgelöst werden kann, wurden wiederum Fusionsprotein-Komplexe aus dem bispezifischen scBsDB DD2x7B6 und dem in Fig. 15 (D) bereits besschriebenen Fusionsprotein (E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B6), welches somit das PA TTp enthält hergestellt und an Slan DCs in PBMCs bei 4°C transportiert. Parallel wurden ebenfalls Fusionsprotein-Komplexe aus dem bispezifischen scBsDB DD2x7B6 aber mit dem Fusionsprotein E7B6-E7B6-GFP-E7B6 (Fig. 5C, Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 58, Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID No. 57), welches das PA TTp nicht enthält, sich aber anderweitig nicht von dem Fusionsprotein E7B6-TTp-E7B6-GFP-E7B6 unterscheidet, hergestellt und ebenfalls an Slan DCs in PBMCs bei 4°C transportiert. Ungebundene Komplexe wurden danach durch Waschen entfernt und durch eine nachfolgende Inkubation bei 37°C die Aufnahme der gebundenen Fusionsprotein- Komplexe in die slan DCs erlaubt. Als Positiv bzw- als Negativkontrolle dienten die Fusionsproteine mit bzw. ohne PA, die hierzu direkt zu PBMCs bei 37°C gegeben wurden. Als weitere Negativkontrolle diente das Fusionsprotein mit PA, das zunächst bei 4°C mit den PBMCs inkubiert, gewaschen und danach bei 37°C ebenfalls inkubiert wurde . Die Daten sind in Fig. 15 F zusammengefasst. Sie zeigen: Wird ein Fusionsprotein wie das Fusionsprotein E7B6-TTp-E7B6- GFP-E7B6 bei 37°C von APCs in PBMCs aufgenommen, dann wird das darin enthaltene PA (hier TTp) prozessiert und MHC -abhängig präsentiert (hier Tetanus-spezifischen Gedächtniszellen), die daraufhin antigen-abhängig und spezifisch proliferieren (Fig. 15 F, b). Insgesamt proliferieren bei dem gezeigten Spender ca. 7% seiner CD4-positiven Zellen. Diese Proliferation ist TTp spezifisch, da das gleiche Fusionsprotein, dem nur der TTp Anteil fehlt, zu keiner spezifischen Proliferation führt (Fig. 15 F, a). Werden die multivalenten anti-DD2 Fusionsprotein-Komplexe an die slanDCs bei 4°C gebunden und nach Entfernen des ungebundenen Materials die Aufnahme der Komplexe in die slan DCs bei 37°C erlaubt, dann führt dies ebenfalls zu einer Proliferation von CD4-positiven T-Zellen (Fig. 15 F, d). Auch diese Proliferation ist TTp spezifisch, da die vergleichbaren Komplexe, in denen nur das TTp Peptidantigen fehlt, keine Proliferation bewirkt (Fig. 15 F, c). Die Proliferation der TTp- spezifischen Gedächtniszellen in Fig. 15 (F,d) ist nicht nur PA-spezifisch, sondern hängt auch von der Bindung/Transport der Fusionsprotein-Komplexe an die slan DCs ab. Denn Fusionsproteine, selbst wenn sie das Peptidantigen TTp enthalten, werden im Gegensatz zu den multivalenten anti-DD2 Fusionsprotein-Komplexen nur marginal bei 4°C gebunden, der größte Teil kann danach weggewaschen werden und führt somit nicht zu einer deutlichen Proliferation der Gedächtniszellen (Fig. 15 F, e).

Insgesamt zeigen diese Daten, dass Fusionsprotein-Komplexe zum Transport von PA an DCs geeignet sind, diese Komplexe von DCs aufgenommen, prozessiert und die PAs MHC-abhängig T-Zellen präsentiert werden und eine antigen-spezifische Immunreaktion auslösen.

Zitierte Nichtpatentliteratur: Arai R, Ueda H, Kitayama A, Kamiya N, Nagamune T. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Eng . 2001 Aug; 14(8):529-32.

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