LIPIDVERBINDUNGEN UNDDEREN VERWENDUNGZ.B. INLIPOSOMEN

Die Erfindung betrifft Lipidverbindungen und deren Verwen¬ dung, beispielsweise zum Transport biologisch aktiver Sub¬ stanzen oder Moleküle in Zellen.

Liposome sind sphärische, in sich geschlossene Strukturen aus Lipiddoppelschichten, die in ihrem Inneren einen Teil des Lösemittels, in dem sie schwimmen, einlagern. Sie können aus einer oder mehreren konzentrischen Membranen bestehen und ihre Größe liegt im Bereich von einigen Nanometern bis eini¬ gen Dutzend Mikrometern.

Liposome sind hauptsächlich aus amphiphilen Molekülen gebil¬ det, die durch eine hydrophile (oft polares Ende genannte) Gruppe und eine hydrophobe Gruppe (unpolares Ende) im selben Molekül gekennzeichnet sind. In den meisten Fällen sind lipo- sombildende Moleküle nicht wasserlöslich. Unter bestimmten Umständen können sie jedoch kolloide Dispersionen bilden.

Liposome können groß oder klein sein und sie können aus einer bis mehreren hundert konzentrischen Doppelschichten ausgebil¬ det sein. Bezüglich der Größe und Art der Schichten (Lamel¬ len) können sie in mehrschichtige Vesikel (MLV, multi-lamel- lar vesicles) , kleine einschichtige Vesikel (SUV, small uni- lamellar vesicles) und große einschichtige Vesikel (LUV, large uni-lamellar vesicles) eingeteilt werden.

SUV besitzen einen Durchmesser von 20 bis 600 nm und bestehen aus einer einzigen Lipiddoppelschicht, die die innere wäßrige Zone umgibt. LUV besitzen einen Durchmesser von 600 bis 30000 nm. MLV schwanken in ihrer Größe stark mit bis zu 10000 nm

und enthalten mehr als eine Lipiddoppelschicht, daher sind sie in ihrer Struktur in mehrere Zonen geteilt.

Liposomen können auf zahlreichen Wegen hergestellt werden. Das Verfahren der sogenannten "Dünnschichthydratisierung" führt zur Bildung heterogener Dispersionen, die hauptsächlich MLV enthalten. Bei Verwendung geladener Lipidzusammensetzun- gen können ziemlich hohe Fraktionen von LUV hergestellt wer¬ den. Diese Dispersionen können weiter behandelt werden (me- chanisch, elektrostatisch oder chemisch) , um Lösungen von

SUV herzustellen. Meist umfassen diese Verfahren eine Extru¬ sion durch Filter mit Poren unterschiedlicher Durchmesser oder Schallbehandlung.

Alternativ können Liposome durch Lyophilisierung hergestellt werden, wobei der Lipidfilm dann in einem flüchtigen Lösemit¬ tel gelöst (zum Beispiel in tert-Butylalkohol) , eingefroren und lyophilisiert wird.

In der Zeitschriften- und Patentliteratur wurden eine Reihe von Methoden zur Herstellung von Liposomen beschrieben wie: Szoka und Papahadjopoulos in: Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9 (1980), 467-508 sowie US-Patente Nr. 4229360, 4241046, 4235871.

Ein wichtiges Merkmal der Liposome ist ihre Fähigkeit, hydro¬ phile oder hydrophobe Moleküle zu lösen, zu schützen und zu tragen. Für negativ geladene Arzneistoffe, einschließlich einiger Proteine, können positiv geladene Liposome verwendet werden. Es wurden Verbesserungen der Therapie beobachtet, trotz der bekannten Tatsache, daß positiv geladene Liposome toxisch wirken können.

In den letzten zwanzig Jahren wurden verschiedene DNA-Trans- fektionsverfahren entwickelt. Diese Verfahren umfassen Cal- ciumphosphatfällung, das DEAE-Dextranverfahren, Elektropora-

tion, Mikroinjektion, rezeptorvermittelte Endozytose, Liposo¬ me und Virusvektoren. Die meisten dieser Verfahren weisen je¬ doch einige gravierende Nachteile auf: sie sind entweder zu uneffizient, zu toxisch oder zu kompliziert und aufwendig für eine effektive Anwendung in biologischen und therapeutischen Behandlungsplänen in vitro und in vivo. Beispielsweise ist das am häufigsten in vitro angewendete Calciumphosphatfäl- lungsverfahren zu uneffizient (durchschnittliche Transfek- tionsfrequenz 1 in 10 ⁴ Zellen) . Elektroporation ist viel effizienter als das Calciumphosphatverfahren. Das Verfahren ist jedoch zu aggressiv (maximale Effizienz wird bei ungefähr 50 % Zelltötung erreicht) und außerdem erfordert dieses Ver¬ fahren eine Spezialapparatur. Mikroinjektion ist effizient, aber sie ist zu mühsam und nicht praktisch anzuwenden. Insge- samt können diese Verfahren nicht in vivo angewendet werden.

Ein Endozytoseverfahren mit Rezeptorvermittlung verwendet Polylysin als Basispolymer zur Wechselwirkung mit und Ver¬ packung von DNA. Polylysin wurde mit verschiedenen Liganden (Transferrin, Insulin, Asialoorosomukoid oder Galactose) modifiziert, um modifizierte Protein-DNA-Komplexe auf Zell¬ oberflächenrezeptoren zu bringen: Wu, G.Y. et al. in: J. Biol. Chem. (1987) 262:4429-4432, Cotten, M. et al. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1990) 87:4033-4037, Huckett, B. et al. in: Biochem. Pharmacol. (1990) 40:253-263, Plank,

C. et al. in: Bioconjugate Chem. (1992) , 533-539. Das Verfah¬ ren wurde durch Verwendung von inaktivierten Adenoviren dra¬ matisch verbessert, um den Austritt von DNA aus Endosomen zu erleichtern, siehe: Wagner, E. et al. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1992) 89:6099-6103, Christiano, R. J. et al. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1993) 90:2122-2126. Der größte Nachteil der beschriebenen Ansätze betrifft die Unmöglich¬ keit, die Chemie der Proteinkonjugation zu steuern und solche Konjugate auf reproduzierbare Weise herzustellen.

Zur Zeit werden die besten Transfektionsergebnisse in vitro und in vivo mit Retroviren, Adenoviren und anderen erhalten, siehe beispielsweise: Kerr, W. G. und Mule J. J. in: J. Leu- cocyte Biol. (1994) 56:210-214, Hwu, P. und Rosenberg, S. A. in: Cancer Detect. Prevent. (1994) 18:43-50, Rosenfeld, M. A. et al. in: Cell (1992) 68:143-155. Trotzdem weist die Ver¬ wendung von viralen Vektoren verschiedene Aspekte auf wie die Notwendigkeit extensiver Zellkulturmanipulationen, geringe Titer für bestimmte Virussysteme und den Zelltropismus des Virus. Außerdem kann die Immunreaktivität gegen virale Vekto¬ ren Probleme bereiten. Insbesondere sind auch die Sicher¬ heitsanforderungen in Zusammenhang mit der Verwendung von viralen Vektoren bisher noch nicht vollständig gelöst.

Liposomen wurden auch verwendet, um in vitro und in vivo DNA in Zellen einzuführen. Die erfolgreichsten Liposomsysteme verwenden kationische Lipide wie Dioleyloxypropyltrimethyl- ammonium (DOTMA, das einen Reaktionspartner bildet in Kombi¬ nation mit Phosphatidylethanolamin (PE) ) , Dioleoyloxypropyl- trimethylammoniummethylsulfat (DOTAP) , Dimethylaminoethan- carbamoylcholesterol, Dioctadecylamidoglycylspermin, 2,3- Dioleyloxy-N-(2 (spermincarboxamido)ethyl) -N,N-dimethy1-1- propanamin (DOSPA) , das einen Reaktionspartner in Kombination mit PE bildet, siehe Feigner, P. L. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1987) 84:7413-7417, US-Patent Nr. 5208036,

Leventis, R. und Silviuε, J. R. in: Biochimica et Biophysica Acta (1990), 124-132, Gao, X. und Huang, L. in: Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 179:280-285, Behr, J.-P. et al. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1989) 86:6982-6986.

Der Vorteil der Verwendung der oben genannten Verbindungen liegt darin, daß das kationische Liposom einfach mit der DNA gemischt und der Zelle zugegeben wird. Die Transfektionseffi- zienz ist üblicherweise hoch im Vergleich zu anderen physika- lischen Methoden der DNA-Übertragung. Außer zur Abgabe von DNA wurde eine spezifische Verbindung zur Abgabe von mRNA

— D —

und Proteinen in kultivierte Zellen verwendet, siehe Malone, R. et al. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1989) 86:6077- 6081 und Debs, R. et al. in: J. Biol. Chem. (1990) 265:10189- 10193. Einige der oben genannten Verbindungen wurden zur Übertragung von Reportergenen oder therapeutisch nützlichen Genen in vivo verwendet, siehe Nabel, G. J. et al. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1993) 90:11307-11311, Zhu, N. et al. in: Science (1993) 261:209-211. Schließlich wurde ein DNA- Transfektionsprotokoll entwickelt, der das cyclische kationi- sehe Peptid Gramicidin S und PE verwendet, siehe Legendre, J.-Y. und Szoka, F. C. in: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) (1993) 90: 893-897. Das oben genannte System verwendet mit Vorteil die Bindungsfähigkeit von DNA und die Membrande- stabilisierungseigenschaften von Gramicidin S.

Der größte Nachteil der kationischen Liposomen betrifft ihre relativ hohe Zytotoxizität. Außerdem sind die meisten der oben genannten Verbindungen in Gegenwart von Serum nicht wirksam oder zeigen eine stark reduzierte Wirksamkeit. Die meisten erfordern die Verwendung von PE, möglicherweise weil PE Intramembran-Lipid-Zwischenverbindungen bilden kann, die die Membranfusion erleichtern. Untersuchungen des der Trans¬ fektion zugrundeliegenden Mechanismus unter Verwendung von kationischen Lipiden wurden bisher noch nicht vollständig abgeschlossen. Es besteht daher ein Bedarf an einer weniger toxischen, nicht infektiösen und wirksameren Abgabe von bio¬ logischen Molekülen, insbesondere in das Zytoplasma und die Kerne von lebenden Zellen.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, die geschilderten und weitere Nachteile des Standes der Technik zu vermeiden. Dabei sollen in erster Linie neue Lipidverbindungen zur Verfügung gestellt werden, die es erlauben, den Transport biologisch aktiver Stoffe oder Moleküle durch Membranen und damit in Zellen oder Zellorganellen zu verbessern.

Diese Aufgabe wird in erster Linie gelöst durch die Verbin¬ dungen gemäß Anspruch 1. Bevorzugte Verbindungen sind in den Unteransprüchen 2 bis 11 beansprucht. Erfindungsgemäße Folge¬ produkte und Anwendungen der neuen Verbindungen ergeben εich aus den Ansprüchen 12 bis 24 (Komplexe) , den Ansprüchen 25 und 26 (Verfahren zur Herstellung der Komplexe) , Anspruch 27 (Liposom) , den Ansprüchen 28 bis 32 (Liposom-Formulierungen) und den Ansprüchen 33 bis 42 (Verfahren zum Transport von Substanzen oder Stoffen durch Membranen) . Der Wortlaut sämt- licher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich durch die Formel I wie folgt darstellen:

X ^" (CH ₂ ) _n - Z - R-L

- N+ - CH - y - N

worin

R-L und R ₂ gleich oder verschieden sind und eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe mit 6 bis 24 Kohlenstoff¬ atomen sind; R ₃ , R ₄ und R ₅ gleich oder verschieden sind und Wasser¬ stoff, Alkyl oder Alkylamin, jeweils mit 1 bis 8 Kohlen¬ stoffatomen, oder eine Aminosäure, ein Aminosäurederi¬ vat, ein Peptid oder ein Peptidderivat sind; W Wasserstoff, ein Carboxylrest oder ein Seitenketten- rest von Aminosäuren, Aminosäurederivaten, Peptiden oder Peptidderivaten ist;

Y eine Verbindungsgruppe (linking group) mit mindestens einem Atom, das nicht Wasserstoff iεt, insbesondere -CO-, -(CH ₂ )mC0-, -(CH ₂ -) _m , -(CHOHCH ₂ -) _m , jeweils mit m gleich 1 bis 20, -CH ₂ -S-CH ₂ -, -CH ₂ -SO-CH ₂ , -CH ₂ -S0 ₂ -CH ₂ -, -CH ₂ -S0 ₂ - oder -S0 ₂ - ist;

Z eine Ester-, Ether- oder Amidbindung ist; n gleich 1 bis 8 ist; und

X ein Anion, insbesondere ein pharmazeutisch annehmbares

Anion ist.

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Lipide (Detergentien, Tenside) , deren wesentliche Eigenschaf¬ ten bereits beschrieben wurden. Die von der Formel I umfaßten Verbindungen können in Form ihrer optischen Isomere (R- oder S-Konfiguration) oder in Form deren Gemische vorliegen.

Gemäß Formel I sind die Lipidverbindungen in Form von aus Ionen gebildeten Salzen dargestellt. Dies ergibt sich daraus, daß auch an sich neutrale Verbindungen in (wäßriger) Lösung in Form von Ionen vorliegen. Selbεtverständlich soll die Er¬ findung gegebenenfalls auch die entsprechenden neutralen Ver¬ bindungen umfassen. Verbindungen der Formel I können durch entsprechende Wahl der Substituenten weitere Ladungen tragen, beispielsweise im Substituenten W durch entsprechende Wahl des Seitenkettenrestes einer Aminosäure.

Zum besseren Verständnis der Ansprüche und der Beschreibung werden die folgenden Definitionen gemacht:

Alkyl bezeichnet ein voll gesättigtes verzweigtes oder unverzweigtes Kohlenstoffkettenradikal.

Alkenyl bezeichnet ein verzweigtes oder unverzweigtes unge¬ sättigtes Kohlenstoffkettenradikal mit einer oder mehreren Doppelbindungen. Alkinyl bezeichnet ein verzweigtes oder unverzweigtes unge- sattigtes Kohlenstoffkettenradikal mit einer oder mehreren

Dreifachbindungen.

Aminosäure bezeichnet eine monomere Einheit eines Peptids, Polypeptids oder Proteins. Die zwanzig Proteinaminosäuren (L- Isomere) εind: Alanin ("A") , Arginin ("R") , Asparagin ("N") , Aspariginsäure ("D") , Cystein ("C") , Glutamin ("Q"), Glut¬ aminsäure ("E") , Glycin ("G"), Histidin ("H"), Isoleucin

("I"), Leucin ("L") , Lysin ("K") , Methionin ("M") , Phenylala- nin ("F") , Prolin ("P") , Serin ("S") , Threonin ("T") , Trypto- phan ("W") , Tyrosin ("Y") und Valin ("V"). Der hier verwen¬ dete Ausdruck Aminosäure umfaßt auch Analoge der Protein- aminosäuren, D-Isomere der Proteinaminosäuren, ß-, y ⁴ - usw. Aminosäuren, unnatürliche Aminosäuren und ihre Analogen.

Biologisch aktive Substanz bezeichnet jedes Molekül oder Mischung oder Komplex von Molekülen, die in vitro und/oder in vivo eine biologische Wirkung erzielen, einschließlich Phar- mazeutika, Arzneistoffe, Proteine, Steroide, Vitamine, Poly¬ anionen, Nukleoside, Nukleotide, Polynukleotide usw.

In dieser Beschreibung bezeichnete Puffer umfassen: "Hepes" , eine N-2-Hydroxyethylpiperazin-N ^/ -2-ethansulfonsäure, die hier als Puffer bei pH um 7 verwendet wird; "PBS", eine Phos¬ phatpuffersalzlösung mit 10 mM Phosphat und 0,9 Gew.-% NaCl, das hier als isotonischer physiologischer Puffer bei pH 7,4 verwendet wird; "Transfektionspuffer", 10 mM Hepes und 0,9 Gew.-I NaCl, das hier als Puffer bei pH um 7,4 verwendet wird; "Tris", Trishydroxymethylaminomethan, das hier eben¬ falls als Puffer bei pH um 7 verwendet wird.

Komplexe oder Liposome, die auf Zellen gebracht werden (cell- targeted), besitzen weitere Moleküle z. B. auf ihrer Oberflä¬ che, die fähig εind, eine Verbindung auf der Oberfläche der betreffenden Zelle zu erkennen. Zeilerkennungsverbindungen umfassen: Liganden für Zeiloberflächenrezeptoren, Antikörper für Zelloberflächenantigene usw.

Ladungsmaskierte (charge-masked) Komplexe oder Liposomen sind als positiv geladen zu verstehen, die eine Verbindung der Formel I umfassen und ein gebundenes Polymer, das z. B. die Oberfläche deε Liposoms bedeckt. Ein Polymer kann kovalent mit einem Lipid verbunden εein, das das Liposom bildet oder auf der Oberfläche adsorbiert sein.

Ein Komplex ist definiert als daε durch Miεchen zweier oder mehrerer Komponenten hergestellte Produkt. Ein solcher Kom¬ plex ist gekennzeichnet durch eine nichtkovalente Wechsel- Wirkung (ionisch, hydrophil, hydrophob usw.) zwischen zwei oder mehr Komponenten.

DNA stellt Desoxyribonukleinsäure dar, die unnatürliche Nukleotide umfassen kann. Die DNA kann einsträngig oder doppelsträngig sein.

Arzneistoff bezeichnet alle prophylaktischen oder therapeuti¬ schen Verbindungen, die zur Vorbeugung, Diagnose, Linderung, Behandlung oder Heilung von Krankheiten bei Mensch oder Tier verwendet werden.

Eine Liposomformulierung ist eine Zusammensetzung von Stoffen umfassend ein Liposom, das eingeschlossene Substanz zu diagnostischen, biologischen, therapeutischen oder anderen Verwendungszwecken enthält.

Ein gegebenenfalls vorhandenes Co-Lipid ist als eine Verbin¬ dung zu verstehen, die fähig ist, allein oder in Kombination mit anderen Lipidkomponenten ein stabiles Liposom zu bilden. Beispiele der wahlweisen Co-Lipide umfassen phospholipid- artige Substanzen wie Lecithin, Phosphatidylcholin, Dioleyl- phosphatidylcholin (DOPC) , Phosphatidylethanolamin (PE) , Phoεphatidylserin, Phosphatidylglycerin, Phosphatidylinoεi- tol, Sphigomyelin, Cephalin, Cardiolipin, Phoεphatidsäure, Cerebroside, Dicetylphosphat usw. , phosphorfreie Lipide wie Steroide und Terpene. Weitere phosphorfreie Lipide sind z. B. Stearylamin, Dodecylamin, Hexadecylamin, Acetylpalmitat, Glycerinricinoleat, Hexadecylstearat, Iεopropylmyristat, Dioctadecylammoniumbromid, amphotere Polymere, Triethanol- aminlaurylsulfat, kationische Lipide wie sie zuvor beschrie¬ ben wurden und dergleichen Verbindungen.

Ein pharmazeutisch akzeptables Ion ist ein Ion, das selbst nicht toxisch ist.

Ein Polyanion ist eine polymere Struktur, wo mehr als eine Einheit des Polymers eine negative Ladung trägt und die Nettoladung des Polymers negativ ist.

Ein Polykation ist eine polymere Struktur, wo mehr als eine Einheit des Polymers eine positive Ladung trägt und die Nettoladung des Polymers positiv ist.

Ein Polynukleotid ist z. B. DNA oder RNA, die mehr als ein Nukleotid enthalten. Polynukleotide sollen auch cyclische Polynukleotide und unnatürliche Nukleotide umfassen und sie können nach chemischen Verfahren hergestellt werden oder durch Verwendung der Rekombinantentechnik oder durch beides.

Ein Polypeptid ist als eine Reihe von zwei oder mehr Amino- säuren zu verstehen, die über kovalente Bindung verknüpft sind.

RNA stellt Ribonukleinsäure dar, die auch unnatürliche Nukleotide umfassen kann. Die RNA kann einsträngig oder doppelsträngig εein.

Bei den bereits beschriebenen Verbindungen gemäß Formel I ist es bevorzugt, wenn Y Carbonyl, d. h. -CO- ist. Damit erfolgt die Verknüpfung nach Art einer Peptidbindung -CO-N"" ^" .

Die Gruppe Z umfaßt bei den Lipidverbindungen gemäß Formel I vorzugsweise eine Esterbindung, d. h. die Gruppe -0-CO-.

Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen sind R-^ und R ₂ eine Alkyl- oder Alkenylgruppe mit 10 bis 20, vorzugsweise 12 bis 18 Kohlenstoffatomen. Dabei sind die Reste R-L und R ₂ vor-

zugεweise gleich. Von den beεchriebenen bevorzugten Gruppen sind wiederum Alkenylgruppen bevorzugt. Dementsprechend han¬ delt es sich bei den Resten R _^ und R ₂ neben Palmityl- oder Stearylgruppen, vorzugsweise um die Oleylgruppe oder um Reste der Linol- oder Linolensäure.

Bei der Formel I ist n vorzugsweise gleich 2. Weiter handelt es sich bei der Gruppe W vorzugsweise um den Seitenkettenrest einer basischen Aminosäure, insbesondere um einen Seitenket- tenrest von Lysin oder Ornithin.

Bei den Resten R ₃ , R ₄ und R ₅ kann es sich um Alkylgruppen mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen, insbesondere um die Methylgruppe handeln. Dabei sind die drei Reste R ₃ , R ₄ und R ₅ vorzugsweise gleich. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen sind R ₃ , R ₄ und R5 Wasserεtoff.

Als Gegenion X können im Prinzip alle denkbaren Anionen verwendet werden, wobei für die meiεten Anwendungen der Erfindung pharmazeutiεch annehmbare Anionen bevorzugt εind.

Vorzugεweise kann es sich bei X um ein Halogenidanion, insbesondere um das Chloridanion handeln.

Bevorzugte Verbindungen gemäß Formel I ergeben sich aus Anspruch 10, auf den hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Eine besonders bevorzugte Verbindung ist L-Lysin-bis-(0,0'- ciε-9-octadecenoyl-ß-hydroxyethyl) amid-dihydrochlorid oder ein optisches Isomer davon.

Verbindungen, die unter die Definition der Formel I fallen und erfindungsgemäß bevorzugt sind, lasεen εich auch dadurch darεtellen, daß man die entεprechenden Verbindungen durch die folgende Verknüpfung darstellt:

Aminosäure oder Peptid Dialkanolamin Fettsäure oder

Fettalkohol

Die auf diese Weise darstellbaren Verbindungen sind für die im folgenden noch zu diskutierenden Anwendungen besonderε geeignet. Insbesondere zeichnen sie εich durch eine weitaus geringere Toxizität als bisher bekannte Lipidverbindungen, die für ähnliche Anwendungen eingesetzt werden, aus.

Neben den beschriebenen Lipidverbindungen umfaßt die Erfin¬ dung Komplexe, die mit Hilfe dieser neuen Verbindung her¬ stellbar sind. Dabei soll "Komplex" im Sinne der obigen Definition verstanden werden. Es muß sich nicht notwendiger- weise um ein vollständig ausgebildetes Liposom handeln. Da allerdings die genauen Mechanismen bei der Komplexbildung nicht bekannt sind, soll der Fall, daß sich aus dem Lipid zunächst Liposome bilden und diese dann mit Polyanionen, Polykationen oder deren Komplexe komplexieren, nach der Erfindung nicht ausgeschloεsen sein.

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Komplexe sind in den Ansprüchen 12 bis 17 bzw. 18 bis 24 beanεprucht und beschrie¬ ben. Auf diese Ansprüche wird ausdrücklich Bezug genommen. Die Komplexbildung ist dabei im wesentlichen darauf zurückzu¬ führen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen positiv gela¬ den sind.

Das Verhältnis zwischen Lipidverbindung und den anderen Be- standteilen des Komplexes, d. h. bei den (binären) Polyanion- Lipid-Komplexen das Verhältnis zwischen Polyanion und Lipid¬ verbindung kann je nach gewünschter Anwendung stark variiert werden. Vorzugsweise ist das Verhältnis zugunsten der Lipid¬ verbindung größer als 1 : 1 (bezüglich der Ladung) , so daß für den Komplex eine positive Gesamt- bzw. Nettoladung resul¬ tiert, um auf einfache Weise mit der negativ geladenen Ober-

fläche von biologischen Membranen wechselwirken zu können. Gegebenenfalls wird ein besonders vorteilhaftes Verhältnis experimentell bestimmt. So kann beispielsweise bei einer DNA-Transfektion daεjenige Verhältnis von DNA und Lipidver- bindung experimentell ermittelt werden, das zu einer optima¬ len Expression der transfektierten DNA führt.

Grundsätzlich können die erfindungsgemäßen Komplexe mit allen Molekülen ausgeführt werden, die eine negative Ladung aufwei- sen. Bevorzugt sind solche Komplexe, bei denen ein Polynuk- leotid als Polyanion eingeεetzt wird.

Bei den in den Ansprüchen 18 bis 24 dargestellten ternären Komplexen ist es bevorzugt, wenn es sich bei dem Polykation um ein Polypeptid handelt. Grundsätzlich ist es jedoch mög¬ lich, auch neutrale Polypeptide zur Bildung ternärer Polynuk- leotid-Polypeptid-Lipid-Komplexe einzuεetzen, die ebenfalls von der Erfindung umfaßt sein sollen.

Überraschenderweise wurde durch die Ausbildung ternärer Kom¬ plexe festgestellt, daß beim Einsatz von Polypeptiden bei¬ spielsweiεe die Tranεfektion von Polynukleotiden gegenüber dem Einεatz von Polynukleotid-Lipid-Komplexen weiter be¬ trächtlich erhöht werden kann. Dabei können die in Anεpruch 23, auf den hier auεdrücklich Bezug genommen wird, genannten Peptidseguenzen bevorzugt eingesetzt werden. Dabei repräsen¬ tiert die erste Sequenz den C-terminalen Part des Kernprote¬ ins des Hepatitis-B-Virus (HBV) . Obwohl eine abschließende wisεenεchaftliche Erklärung zur Zeit noch nicht gegeben wer- den kann, εcheint ein Zuεammenhang deε poεitiven Einfluεεes dieser Peptidεequenzen bei den ternären Komplexen und dem vergleichεweise hohen Anteil an basischen Aminosäuren in den Sequenzen möglich zu sein.

Gegebenenfalls können die beschriebenen Komplexe für bestimm¬ te Anwendungen ladungsmaskiert (charge-masked) oder zur Wech-

selwirkung mit bestimmten Zellen oder Zellorganellen ausge¬ bildet (cell-targeted) sein.

Weiter umfaßt die Erfindung die in den Ansprüchen 25 und 26 beschriebenen Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Komplexe. Dabei erfolgt diese Herstellung und das damit ver¬ bundene in Kontakt bringen durch übliche Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind. So werden beispielsweise zur Herstel¬ lung von binären Komplexen Pufferlösungen, die das Polyanion bzw. die Lipidverbindung enthalten, vereinigt. Entsprechendeε gilt für die Herεtellung von ternären Komplexen, wobei zu- nächεt in einer Pufferlösung ein Polyanion-Polykation-Komplex dargestellt und diese Pufferlösung anschließend mit einer die Lipidverbindung enthaltenden Pufferlösung vereinigt wird.

Weiter umfaßt die Erfindung Liposome, die mit mindestens einer erfindungsgemäßen Lipidverbindung herstellbar oder her¬ gestellt sind. Die Herstellung der Liposomen erfolgt dabei in üblicher auε dem Stand der Technik bekannter Weise.

Weiter umfaßt die Erfindung Liposom-Formulierungen in wäßri¬ ger Lösung, die mindestenε eine biologisch aktive Substanz (Stoff, Molekül usw. ) und eine Lipidkomponente umfassen. Dabei enthält die Lipidkomponente mindestenε eine der erfin- dungsgemäßen Lipidverbindungen. Neben der biologisch aktiven Substanz und der Lipidkomponente enthält die Liposom-Formu- lierung übliche Lösungsbeεtandteile der wäßrigen Lösung, wo¬ bei es sich um eine Lösung in reinem Wasεer oder vorzugεweiεe um übliche Pufferlösungen handeln kann.

Wie aus der Formulierung von Anspruch 28 hervorgeht, kann als Lipidkomponente eine einzelne Verbindung der Formel I oder ein Gemisch solcher Verbindungen eingesetzt werden. Außerdem ist es möglich, die erfindungsgemäße Verbindung bzw. Verbin- düngen mit weiteren Co-Lipiden wie sie bereits definiert sind, zum Beispiel PE, POPE in Mischung einzusetzen.

Solange eine Liposombildung möglich ist, ist die Menge an biologisch aktiver Subεtanz grundsätzlich nicht kritisch. Üblicherweise wird die Substanz in Mengen bis zu 10 Gew.-% in der Liposom-Formulierung vorhanden sein. Als Untergrenze ist beispielsweise ein Wert von 0,01 Gew.-% zu nennen. Ein Men¬ genbereich von 1 bis 5 Gew.-% an biologisch aktiver Substanz ist bevorzugt.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann vorzugsweise 1 % bis 100 % der Lipidkomponente ausmachen. Bei bevorzugten Ausführungen der Liposom-Formulierung sind ein oder mehrere Co-Lipide vor¬ handen, wobei diese Co-Lipide vorzugsweise 30 bis 70 % der Lipidkomponente ausmachen.

Handelt es sich bei der biologisch aktiven Substanz um einen Arzneistoff, so wird dessen Menge üblicherweise nach der ge¬ wünschten Therapie ausgewählt. Dabei sind vorzugsweise 1 bis 5 Gew.-% des Arzneistoffes in der Liposom-Formulierung vor- handen. Gegebenenfalls können beim Einεatz von Arzneistoffen als biologiεch aktiver Subεtanz pharmazeutisch akzeptable Exzipienten in der Liposom-Formulierung vorhanden sein.

Wie bei den erfindungsgemäßen Komplexen bereits erwähnt, können auch die erfindungsgemäßen Liposomen oder Liposom- Formulierungen gegebenenfalls ladungsmaskiert oder zur Wechεelwirkung mit beεtimmten Zellen (cell-targeted) ausge¬ bildet sein.

Schließlich umfaßt die Erfindung Verfahren zum Transport von Polyanionen oder Polykationen bzw. zum Transport von biolo¬ gisch aktiven Substanzen allgemein durch biologische Membra¬ nen, insbesondere zum Einbringen in Zellen oder Zellorganel¬ len. In diesem Zusammenhang wird ausdrücklich auf die Ansprü- ehe 33 bis 38 bzw. 39 bis 42 Bezug genommen. Für die erfin¬ dungsgemäßen Verfahren können entweder die erfindungsgemäßen

Verbindungen selbst oder Zusammensetzungen, die solche Ver¬ bindungen enthalten, eingesetzt werden.

Bei Durchführung der Verfahren durch Inkubieren in vivo kön- nen zusätzliche Stabilisatoren wie beispielsweise Polyethy- lenglykol vorhanden sein.

Weitere Einzelheiten der erfindungsgemäßen Verfahren werden noch beschrieben.

Die Verbindungen und andere Teile der vorliegenden Erfindung bringen verschiedene Vorteile. Einer der Vorteile der hier beschriebenen Verbindungen ist, daß sie bis zu 100 % Ein¬ schluß von polyanionischen Substanzen mit einem zweckmäßigen Protokoll erlauben. Andererseits führt die Inkubation von positiv geladenen Komplexen mit negativ geladenen Zellober¬ flächen zu einer schnellen und besseren Aufnahme insbesondere von polyanionischen Substanzen und anderen biologisch aktiven Verbindungen im allgemeinen. Das letztere erlaubt das Einfüh- ren von komplexierten bzw. eingeεchlossenen polyanionischen Substanzen wie beispielsweise DNA in einem Maße wie es bisher bei diesen Zellen nicht bekannt ist.

Die speziellen Vorteile der hier offenbarten Verbindungen sind wie folgt. Zunächst stellen diese Verbindungen die neuen liposombildenden Lipide dar. Die Geometrie der beiden alipha¬ tischen Ketten in den Verbindungen der Formel I erlaubt ihre Organisation in εtabile Doppelschichtstrukturen. Der polare Kopf (z. B. Aminosäure) kann in Abhängigkeit von der Anwen- düng variiert sein. Dies erlaubt zum Beispiel leicht das Ein¬ führen verschiedener Modifikationen an der Aminogruppe, der Seitenkette und der Bindung. Die Zytotoxizität der meisten der hier offenbarten kationischen Verbindungen sind im Ver¬ gleich zu den zuvor bei anderen kationischen Amphiphilen be- richteten günstig. Alle bei den Verbindungen der Formel I dargestellten Bindungen können leicht in der Zelle hydroly-

siert werden, was zur Ausbildung nicht toxischer Verbindungen führt.

Die positiv geladenen Lipide der Formel I besitzen ferner, im Gegensatz zu anderen kationischen Lipiden aus dem Stand der Technik, eine bessere Transfektionseffizienz in Gegenwart von Serum. Die Fähigkeit, Zellen in der ständigen Gegenwart von Serum zu transfektieren iεt aus verschiedenen Gründen vor¬ teilhaft: die Transfektion verläuft leichter und ist weniger zeitaufwendig, die Anforderungen an Medien und Serum sind geringer, den Zellen wird kein Serum entzogen, was Zellfunk¬ tionen und Lebensfähigkeit beeinträchtigen könnte.

Der zweite spezifische Vorteil der hier offenbarten Technik leitet sich von dem neuen Verfahren zum Einbringen von Poly- nukleotid (inεbesondere DNA) in ternäre Komplexe ab. Dieser Komplex ist insbesondere gebildet aus positiv geladenen Lipi¬ den der Formel I und einem Komplex aus Polynukleotid und kat¬ ionischem Polypeptid. Gemäß dem Verfahren wird zuerst der erste Komplex aus Polynukleotid-kationischem Polypeptid gebildet, der im nächsten Schritt mit einem positiv geladenen Lipid der Formel I komplexiert wird. Ein exaktes Abstimmen der Zusammensetzung bestimmt die biologische Aktivität des schließlich erhaltenen Komplexes.

Der Vorteil dieser Vorgehensweiεe gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Transfektionεtechniken liegt beispiels¬ weise darin, daß die neue Methode zu einer bis zu 300fach höheren Transfektionseffizienz führt. Darüber hinaus kann bei Anwendung der neuen Methode ein Nachweis der Transfektion (z. B. Nachweis des exprimierten Proteins) nach weniger als zwei Stunden nach Beginn der Transfektion leicht registriert wer¬ den. Außerdem erlaubt das neue Verfahren ein Arbeiten im "Mikromaßstab" zur Transfektion von Zellen (beispielsweise 96-Loch-Format) , was für das Screening einer großen Zahl von

Proben wünschenswert ist und die Automatisierung des gesamten Verfahrens ermöglicht.

Die Verbindungen der Formel I sind insbesondere nützlich bei der Herstellung von Liposomen, können aber auch in anderen Fällen verwendet werden, wo kationische Lipide Anwendung fin¬ den. Zum Beispiel können sie in industriellen Anwendungen verwendet werden. Von besonderem Interesse ist die Verwendung dieser Verbindungen in Zusammenhang mit kationischen Lipiden, die für pharmazeutische Formulierungen (Cremes, Pasten, Gele, kolloide Disperεionen und dergleichen) und/oder kosmetische Zusammensetzungen (Makeupε, Lippenεtifte, Nagellacke, Körper¬ lotionen, Feuchtigkeitscremes, Shampoos und dergleichen) akzeptabel sind.

Formulierungen umfasεend die Verbindungen der Formel I εind vorteilhaft zur Erzielung einer gewünschten intrazellulären Abgabe von biologisch aktiven Substanzen wie Polynukleotiden, Peptiden, Proteinen, Steroiden und anderen natürlichen oder synthetischen Verbindungen. Die intrazelluläre Abgabe kann in das Zytoplasma, in den Kern oder beides erfolgen. Eine solche intrazelluläre Abgabe kann in Gewebekulturen (in vitro) er¬ reicht werden und kann beispielsweise verwendet werden, um Zellen mit gewünschten Polynukleotiden (z. B. DNA) zu trans- fektieren oder um Proteine oder dergleichen abzugeben.

Formulierungen umfassend die Verbindungen der Formel I können auch zur Therapie ex vivo verwendet werden, wo aus den Orga¬ nismus isolierte Zellen in vitro transfektiert werden und dann in den Organismus implantiert werden. Ein Beispiel für diese Anwendung ist das Transfektieren von Knochenmarkεzel- len.

Eine intrazelluläre Abgabe kann auch im ganzen Organismus (in vivo) erreicht werden und kann daher bei verschiedenen Anwen¬ dungen nützlich sein wie Gentherapie, Antisensibilisierungs-

und Antigentherapie. Intrazelluläre Abgabe in vivo kann auch zur DNA-Impfung verwendet werden mit dem Ziel, eine Immun¬ reaktion (humoral und/oder zellulär) auf daε gewünschte Pro¬ tein zu induzieren.

Intrazelluläre Abgabe unter Verwendung der Verbindungen der Formel I kann auch nützlich sein zur Abgabe von Antikrebs¬ und Antivirusverbindungen, Antibiotika und dergleichen.

Eine Zellselektivität kann erreicht werden durch Einbringen von Zellerkennungsverbindungen, z. B. auf der Oberfläche des Vesikelε wie Antikörper, Liganden für Zelloberflächenrezep- toren und dergleichen. Eine erhöhte Stabilität und weitere Selektivität kann erreicht werden, z. B. durch Überziehen deε Lipoεomvesikels mit einer geeigneten ladungsmaεkierten natür¬ lichen oder synthetischen Verbindung wie Polymeren und neu¬ tralen oder negativ geladenen Lipiden.

Liposomvesikel umfassend Verbindungen der Formel I können zur Auslösung einer spezifischen Immunreaktion auf ein bestimmteε

Antigen verwendet werden, das in daε Lipoεom eingebracht ist. Weitere Komponenten wie N-Palmitoyl-S-(2 ,3-bis(palmitoyl- oxy) -(2RS)-propyl)-R-cystein (Pam ₃ Cys) oder N-Acetyl-myramyl- L-threonyl-D-isoglutamin (MDP) und Derivate davon können besonderε nützlich εein.

Verbindungen der Formel I sind von Interesεe für die Einfüh¬ rung einer lipophilen Gruppe in Polymere und insbesondere in Peptide, um ihre Aufnahme durch eine Zelle zu erhöhen oder um ihre Inkorporation in die lipidhaltigen Vesikel und der¬ gleichen zu erhöhen. Aktivierte Verbindungen der Formel I können auch zur Modifizierung von Proteinen verwendet werden.

Weitere Einzelheiten der bisher vorgestellten Teile der Erfindung ergeben sich durch die folgende Beschreibung von Herstellungsverfahren, Lipidverbindungen und Beispielen für

deren Verwendung. Auf die beigefügten Figuren wird jeweils bei der Beschreibung des jeweiligen Beispiels verwiesen.

Verfahren zur Darstellung ausgewählter Verbindungen der Formel I

Unter Verwendung bekannter Techniken kann der Fachmann die hier angegebenen bevorzugten Polypeptidaminosäuresequenzen leicht durch Zusätze, Elimination oder Substitution, Erhöhung oder Verringerung abwandeln oder einfach eine andere Sequenz¬ kodierung für verschiedene kationische Polypeptide verwenden. Es ist jedoch anzumerken, daß solche Variationen im Rahmen dieser Erfindung liegen. Es iεt ferner anzumerken, daß die nachfolgend angeführten Beiεpiele nur zum Zwecke der Erläute¬ rung angegeben sind und nicht als Einschränkung dieser Erfin¬ dung in irgendeiner Weise zu verstehen sind.

0 CH- CH. OH

.COOH (Pl I!

Pl—NH-CH Pl—NH-CH-C ^• -N (3 ⁾

CH, C'Λ, OH

P2 Pl

0 o CH--CH- O—C—Rl n

Pl—NH-CH-C—N (O

w CH- CH- O— C—R2 ι P2

O CH--CH- O—C—R1

NH-CH-C II —N ^/ o

\ II

CH, CA, O—C—R2

Dieses Reaktionsschema ist für die Synthese von bevorzugten Verbindungen der Formel I anwendbar, worin Z eine Esterbin¬ dung und n gleich 2 ist. In diesem Reaktionsschema sind P ¹ und P ² Schutzgruppen und sie sind gleich oder unterschied- lieh, W ist eine Seitenkette einer Aminosäure, R ¹ und R ² sind gleich und sind Alkyl oder Alkenyl mit 6 bis 24 Kohlenstoff¬ atomen.

Verbindungen der Formel (A) sind im Handel in optisch reiner Form erhältlich. Zur Bildung der Verbindungen der Formel (B) wird die Carboxylgruppe der Aminosäure der Formel (A) mit einem geeigneten Reagens aktiviert und dann mit der Imino¬ gruppe von Diethanolamin umgesetzt. Verfahren zur Aktivierung von Aminosäuren εind im Stand der Technik bekannt. Beispiels- weise kann das Verfahren mit Dicyclohexylcarbodiimid/N-Hydr- oxysuccinimid zur epimerisierungslosen Amidierung geschützter Aminosäuren angewendet werden.

Das Amid der Formel (B) wird durch Auflösen der Aminosäure von Formel (A) und einem zuvor gebildeten Salz von N-Hydroxy- succinimid und Diethanolamin in einem geeigneten polaren Lösungsmittel wie Dimethylformamid hergeεtellt. Die Mischung wird auf 0 °C gekühlt und dann eine Lösung von Dicyclohexyl¬ carbodiimid zugegeben. Die Umsetzung wird durch Rühren der Lösung eine Stunde lang bei 0 °C und acht Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Das erhaltene Amid der Formel (B) wird dann nach üblichen Abtrennverfahren gewonnen.

Um die Bildung der Verbindungen der Formel (C) zu erreichen, wird das Amid der Formel (B) in einem geeigneten Lösemittel (z. B. Dichlormethan) aufgelöst. Dazu wird ein geeignetes tertiäres Amin wie beispielsweise Triethylamin in molarem Überschuß zugegeben. Die Mischung wird auf ungefähr 0 °C gekühlt. Das Alkylierungsmittel mit gewünschter Kettenlänge und ungesättigten Gruppen wird in einem molaren Überschuß zugegeben, bevorzugt in ungefähr der 3- bis 4fachen Menge des

Amids der Formel (B) . Es kann beiεpielsweise Oleoylchlorid verwendet werden, um die Addition von 9-Octadecenoylgrupppen zu erreichen. Diese Mischung wird dann ungefähr 3 Stunden unter N ₂ -Atmosphäre bei Raumtemperatur gerührt. Dann wird das Produkt der Formel (C) extrahiert.

Die Verbindung der Formel (C) wird dann in geeigneter Weise von ihren Schutzgruppen befreit, wobei die Verfahrensweise von den verwendeten Schutzgrupppen abhängt, extrahiert und durch Chromatographie gereinigt.

Beispiel 1

Herstellung von L-Lysin-bis-(0,0'-oleoyl-ß-hydroxyethyl) amid- dihydrochlorid (1)

Boc-Lys(Boc) -OH *DCHA (2,63 g, 5 mmol) werden in Ethylacetat suspendiert und unter Verwendung von eiskalter 2 M H ₂ S0 ₄ in die freie Säure überführt. Boc-Lys(Boc) -OH in Ethylacetat wird mit MgS0 ₄ getrocknet und zur Trockene verdampft. Das verbliebene Öl wird in ungefähr 15 ml Dimethylformamid (DMF) suεpendiert, das 1,1 g (5 mmol) eines zuvor gebildeten Salzes von N-Hydroxysuccinimid und Diethanolamin (HθSu*N(EtθH) ₂ ) enthält, und wird mit Eiswasser auf 0 °C gekühlt. Unter Rüh- ren wird eine Lösung von 1,13 g (5,5 mmol) Dicyclohexylcarbo¬ diimid (DCC) in 5 ml DMF der Mischung zugegeben, die eine Stunde bei 0 °C gerührt wird und dann nochmals 8 Stunden bei Raumtemperatur. Die Mischung wird im Vakuum zur Trockene kon¬ zentriert. Nach Zugabe von ungefähr 50 ml Ethylacetat zum Rückstand fällt der größte Teil des Dicyclohexylharnstoffes (DCU) aus und wird abfiltriert. Die Ethylacetatphase wird mit wäßrigen Löεungen von NaHC0 ₃ (5 %) und Citronenεäure (5%) in 0,1 M NaCl gewaschen, mit MgS0 ₄ getrocknet und zur Trockene eingedampft, so daß 1,7 g deε Rohproduktε alε farbloses Öl erhalten werden.

Eine Lösung von 1,7 g (3,92 mmol) Boc-Lys(Boc) -N(EtOH) ₂ , 1,64 ml Triethylamin und 3,93 ml Oleoylchlorid (jeweils 11,7 mmol) in 50 ml Dichlormethan (DCM) werden 30 min lang bei 0 °C und 4 Stunden unter N ₂ -Atmosphäre im dunkeln bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird mit Methanol abgeschreckt, im

Vakuum konzentriert, in Hexan aufgelöst und dreimal mit 0,1 M KOH in Methanol/Wasser (1 : 1 Vol.) bei 0 °C, dann einmal mit 0,1 M wäßriger NaCl gewaschen. Die Hexanphase wird im Vakuum konzentriert und der Rückstand mit 50 ml einer Mischung aus Trifluoresεigεäure (TFA) /DCM (1 : 1 Vol.) 40 min bei Raumtem¬ peratur behandelt. Die Miεchung wird wiederholt mit Toluol gemiεcht und im Vakuum aufkonzentriert und dann in Chloroform auf eine Säule mit Silica Gel 60 aufgegeben. Die Säule wird mit einem aufεteigenden Gradienten von Methanol in Chloroform eluiert und die reine Verbindung (2,3 g, 62 % Ausbeute) bei ungefähr 20 % Methanol eluiert. Das Hydrochlorid wird durch Auflösen des Produktes in trockenem Ethylacetat, daε mit HCl-Gaε gesättigt ist, und Eindampfen zur Trockene herge¬ stellt. (Analyse: ES-MS: bestimmte Molmaεεe 762 (berechnet 762) ; TLC: Rf = 0,69 in Ethylacetat:Essigsäure:Wasser =

(4:1:1) ; HPLC: Rt = 14,19 min, Säule Nucleosil C2 4,0x100 mm, Gradient 30 - 90 % Acetonitril in 0,1 % TFA in Waεεer in 20 min) .

In gleicher Weise, aber durch Substitution des geeigneten Ausgangsmaterials werden die folgenden Verbindungen herge¬ stellt:

L-Lyεin-bis-(0,0'-palmitoyl-ß-hydroxyethyl)amid-dihydro - Chlorid (2)

L-Lysin-bis-(0,O'-myristoyl-ß-hydroxyethyl)amid-dihydro- chlorid (3)

L-Ornithin-bis-(0,0'-myristoyl-ß-hydroxyethyl) amid-dihydro- chlorid (4) L-Ornithin-bis-(0,0'-oleoyl-ß-hydroxyethyl) amid-dihydro- chlorid (5)

L-Ornithin-bis-(0,0'-palmitoy1-ß-hydroxyethy1)amid-dihydro- chlorid (6)

L-Arginin-bis-(O,0'-oleoyl-ß-hydroxyethyl)amid-dihydroch lorid (7) L-Arginin-bis-(0,0'-palmitoy1-ß-hydroxyethyl)amid-dihydro¬ chlorid (8) L-Serin-bis-(0,0'-oleoyl-ß-hydroxyethyl)amid-dihydrochlorid

(9)

Glycin-bis- (0, 0' -palmitoy 1-ß-hydroxyethy 1 ) amid-dihydrochlorid ( 10 )

Sarcosin-bis-(0,0'-palmitoyl-ß-hydroxyethyl)amid-dihydro ¬ chlorid (11)

L-Hiεtidin-bis-(0,0'-palmitoyl-ß-hydroxyethy1)amid-dihy dro¬ chlorid (12) L-Glutamin-bis-(0,0'-palmitoy1-ß-hydroxyethy1)amid-dihydro ¬ chlorid (13) .

Beispiel 2

Synthese von N-β-tert-Butoxycarbonyl-L-Asparaginsäure-βCr-N ' - bis- (0, 0' -palmitoy 1-ß-hydroxyethyl) amid (Boc-Asp-N (EtOPalm) ₂ ( 14 ) ) und N-*£-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-Asparaginsäure- ^* *t- N ' -bis- (0 , 0 ' -palmitoy 1-ß-hydroxyethy 1 ) amid ( Fmoc-Asp- N ( Et0Palm) ₂ ( 15 ) )

Die Verbindung Boc-Asp(OBzl)-N(EtOH) ₂ wird auf dieselbe Weise hergestellt wie oben für die Herstellung der Verbindung Boc- Lys(Boc)-N(EtOH) ₂ beschrieben. Die Verbindung Boc-Asp(OBzl) - N(Et0Palm) ₂ wird mit wenigen Modifikationen in derselben Weise hergestellt wie die Verbindung Boc-Lys(Boc)-N(EtOOL) ₂ . Die Reaktion läuft über Nacht, die Mischung wird mit Ethyl¬ acetat verdünnt und dann in eine gesättigte Lösung von NaHC0 ₃ gegossen, um restliches Palmitoylchlorid zu zerstören und Natriumpalmitat auszufällen. Der Niederschlag wird abfil- triert und die organische Phase zur Trockene evakuiert und in heißem Methanol aufgelöst. Das Produkt wird in kaltem Metha-

noi ausgefällt und durch Filtration in einer Ausbeute von 55 % gewonnen (TLC: Rf = 0,64 in Chloroform : Methanol = 100 : 2). Die Benzylschutzgruppe wird vom Produkt (1,5 g) durch Behandeln mit NH ₄ COOH (0,65 g) in Gegenwart von friεchem Pd- Schwarz (ungefähr 0,1 g) in 15 ml DMF über Nacht entfernt. Pd-Schwarz wird abfiltriert und die Miεchung im Vakuum ver¬ dampft. Der Rückεtand wird auε Methanol/Wasser ausgefällt, so daß das gewünschte Produkt Boc-Asp-N(EtOPalm) ₂ (14) in einer Ausbeute von 85 % erhalten wird. (Analyse: ES-MS: bestimmte Molmasse 796,5 (berechnet 796); TLC: Rf = 0,4 in Chloroform : Ethylacetat : Methanol = 9 : 3 : 1).

0,5 g (0,62 mmol) Boc-Asp-N(EtOPalm) ₂ werden mit einer Mischung von TFA/DCM = 1 : 1 30 min lang bei Raumtemperatur behandelt. Die Miεchung wird wiederholt mit Toluol verdampft. Der Rückstand wird in 10 ml DMF aufgelöst, mit Diisopropyl- ethylamin (DIPEA) neutralisiert und zwei Stunden lang mit 1,2 Equivalenten 9-Fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat (Fmoc-OSu) umgesetzt. Die Reaktionsmischung wird verdampft und in Metha- noi wieder aufgenommen. Die gewünschte Verbindung Fmoc-Asp- N(EtOPalm) ₂ (15) wird ausgefällt, so daß 0,44 g der Verbin¬ dung in einer Ausbeute von 77 % erhalten werden (Analyεe: TLC: Rf = 0,4 in Chloroform:Ethylacetat:Methanol = 9:3:1).

Unter Verwendung ähnlicher Verfahrensweisen, aber Substitu¬ tion des geeigneten Ausgangεmaterialε, können die folgenden Verbindungen hergeεtellt werden:

N-«--tert-Butoxycarbony1-L-glutaminsäure-y-N'-bis-(0,0' - palmitoyl-ß-hydroxyethyl) amid Boc-Glu(N(EtOPalm) ₂ ) -OH (16)

N-βt-Fluorenylmethyloxycarbonyl-L-glutaminsäure-y-N'-bi s-

(0,0'-palmitoyl-ß-hydroxyethyl)amid Fmoc-Glu(N(EtOPalm) ₂ ) -OH

(17)

N-ct-tert-Butoxycarbony 1-L-asparaginεäure-ß-N ' -bis- (0 , 0 ' - palmitoyl-ß-hydroxyethyl) amid Boc-Asp (N ( EtOPalm) ₂ ) -OH ( 18 )

Außerdem können die Zwischenprodukte ihrer Synthese oder der oben beschriebenen Synthese zur Herstellung von Liposomen verwendet werden:

L-Glutaminsäure-y-N'-bis-(0,0'-palmitoyl-ß-hydroxyethyl )amid H-Glu(N(EtOPalm) ₂ ) -OH (19)

L-Asparaginsäure-ß-N'-bis-(0,0'-palmitoyl-ß-hydroxyeth yl) amid H-Asp(N(EtOPalm) ₂ ) -0H (20)

L-Aεparaginsäure-βt>-N'-bis-(0,0'-palmitoyl-ß-hydr oxyethyl) amid H-Asp(N(EtOPalm) ₂ ) (21)

Herstellung und Eigenschaften eines Komplexes aus DNA und Verbindung (1)

Beispiel 3

Fluoreszenz-Untersuchungen. Fluoreszenzmeεεungen werden mit einem Aminco SPF-lOOOSc Spektrophotometer durchgeführt, wobei eine 1 cm Lichtwegzelle mit einer Schlitzweite zur Anregung und Emission von 10 nm verwendet werden. Die Bindung von (1) an Nukleinsäuren wird aus der Verdrängung des Ethidiumbro- mids abgeleitet, das bei Einfügung zwischen die DNA-Basen¬ paare als Fluoreszenzεonde wirkt. Die Fluoreszenz wird un- mittelbar nach der Zugabe steigender Mengen von (1) zu mit Ethidiumbromid (5 μg/ml Kalbsthymuε-DNA, 8xl0~ ⁶ M bp (base pairs) ; Ethidiumbromid 1 : 50 bp in 10 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7,4) komplexierter DNA gemesεen. Die Ethidiumbromidver- drängung wird durch die Abnahme der Ethidiumbromidfluoreεzenz (Anregung = 540 nm, Emiεsion = 600 nm) verfolgt, die auf¬ tritt, wenn eε von der DNA freigeεetzt wird (Fig. 1) . Die Fluoreszenzintensität nimmt mit zunehmender Konzentration des kationischen Lipids graduell ab. Dies zeigt, daß Kompak- tierung und/oder Aggregation der DNA eintritt. Das Verhältnis zwischen (1) und DNA, bei dem die Fluoreszenzlöεchung sich nicht mehr ändert, entspricht ungefähr 6 : 1 (Gew. /Gew.) . Das

erhaltene Verhältnis entspricht einem Ladungsverhältnis von ungefähr 3,5 : 1.

Transfektion von Zellen

Beispiel 4

Zellkulturen und Plasmide

HeLa (CCL2, humanes Epithelkarizom) , COS-7 (CRL 1651, Niere, SV-40 transformiert, Afrikanischer grüner Affe) , HT-29 (HTB 38, humanes Kolon-Adenokarzinom) , CV-l (CCL 70, Niere, Afrikanischer grüner Affe) , 818-4 (humanes Pankreas-Adenokar- zinom) , H4IIE (CRL 1548, Hepatom, Ratte), K562 (CCL 243, humane chronische myelogene Leukämie), HL-60 (CCL 240, humane promyelotische Leukämie) werden in 5 % C0 ₂ bei 37 °C auf

Kunstεtoffgewebezellkulturflaεchen in RPMI 1640 oder DMEM mit 10 % fetalem Kalbsserum und versehen mit Penicillin zu 100 Einheiten pro ml, Streptomycin zu 100 μg pro ml, 2 mM Glut¬ amin und 0,1 μM Dexamethason für H4IIE-Zellen gezüchtet.

Die Plasmide pCMVL und pCMVß-gal kodieren Luciferase- bzw. ß- Galactoεidaεegene und ihre Expreεsion εteht unter der Kon¬ trolle des Promoters deε Cytomegalovirus (CMV) . Die Plasmide pZeoSV und pZeoSVLacZ kodieren das Sh-Ble-resiεtente Protein für Zeocin (eingetragenes Warenzeichen) , das eine Selektion sowohl in prokaryotische wie in eukaryotische Zellen erlaubt. Die eukaryotische Expression steht unter der Kontrolle des Promoters von CMV. pZeoSVLacZ kodiert außerdem das ß-Galacto- sidasegen unter Kontrolle des Verstärkerpromoters von SV40. Plasmid-DNA wird auf QIAGEN-Säulen (eingetragenes Warenzei¬ chen) unter Verwendung des QIAGEN-Plasmidreinigungsverfah- rens (eingetragenes Warenzeichen) gereinigt.

Transfektion von Gewebekulturzellen. Herstellung der Zellen, Transfektionsprotokoll und Untersuchungen zur Transfektions-

effizienz. Die einzelnen Tranεfektionen sind im Ergebnisteil ausführlich angegeben.

a) Anhaftende Zellen. Ungefähr 24 Stunden vor einer Transfek- tion werden fast confluente Zellmonoschichten trypsinisiert.

Die Zellen werden erneut in frischem Medium suεpendiert und entweder in 24-Lochplatten (5xl0 ⁴ Zellen pro Probenvertie¬ fung) oder in 6-Lochplatten (2-2,5xl0 ⁴ Zellen pro Probenver¬ tiefung) eingebracht. Unmittelbar vor der Tranεfektion werden die Zellen in frisches Medium mit oder ohne 10 % FCS ge¬ bracht. Im allgemeinen werden die Zellen bei 50 - 70 % Confluenz transfektiert. 24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen mit 2 ml PBS dreimal gewaschen und in 100 μl (24-Lochplatten) oder 200 μl (6-Lochplatten) Lysispuffer (77 mM K ₂ HP0 ₄ , 23 mM KH ₂ P0 ₄ , 0,2 % Triton X-100, 1 mM Dithio- treitol, pH 7,8) lysiert. Zellrückstände werden durch Zentri- fugieren entfernt (14000 Upm 2 min lang) . Ãœblicherweise wird die Enzymaktivität (εiehe unten) direkt nach der Zellyεis be¬ stimmt. Die Lysate können jedoch bei -20 °C gelagert werden, ohne ihre Aktivität zu verlieren.

b) Suspensionszellen. 24 Stunden vor einer Transfektion werden die Zellen in frisches vollständiges Wachstumεmedium eingebracht. Unmittelbar vor der Transfektion werden die Zellen aufgenommen, erneut in frischem Medium mit oder ohne

10 % FCS bei 0,25xl0 ⁶ Zellen pro ml suspendiert und in 24- Lochplatten mit 2 ml pro Probenvertiefung eingebracht.

Die Zellen werden normalerweise 24 Stunden nach der Transfek- tion geerntet (die Erntezeit ist eine wichtige Größe und sollte optimiert werden) , durch Zentrifugieren abgetrennt und in 10 ml PBS suspendiert, wiederum zentrifugiert und die Zel¬ len in ein Eppendorfröhrchen von 1,5 ml mit 1 ml PBS übertra¬ gen. Die Zellen werden in der EppendorfZentrifuge zentrifu- giert (14000 Upm 20 s lang) . Die erhaltenen Zellen werden in 100 μl Lyεiεpuffer (oben beschrieben) lysiert. Die Probe

wird dann zentrifugiert (14000 Upm 2 min lang) und der Über¬ stand sorgfältig in eine frisches Zentrifugierröhrchen übertragen.

c) Transfektionεprotokolle

Transfektion von Zellen unter Verwendung von Verbindung (1) . Plasmid-DNA (auε einer Stamm-Löεung mit einer Konzentration von etwa 1 mg/ml) und kationisches Lipid (aus einer Stamm- Lösung mit einer Konzentration von 1 - 2 mg/ml) werden getrennt verdünnt in Eppendorfröhrchen von 1,5 ml mit 10 mM Hepes, 0,9 % NaCl-Puffer, pH 7,4 auf ein Endvolumen von 100 μl. Bei typischen Transfektionen schwankt die Menge an DNA von 1 bis 2 μg pro 100 μl. Die Menge eines kationischen Lipids schwankt von 0 bis 20 μg pro 100 μl. Zwei Löεungen werden zuεammengemiεcht, so daß sich eine DNA-Lipid-Lösung bildet. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur wird die erhaltene DNA-Lipid-Lösung den Zellkulturen zugegeben, wie zuvor kultiviert und vorsichtig vermischt. Alternativ kann die DNA-Lipid-Lösung mit 800 μl (für 24- oder 6-Lochplatten) des geeigneten Mediums (+/- FCS) verdünnt und gemischt wer¬ den. Die verdünnte Lösung wird den Zellen überεchichtet und mit dem geeigneten Medium geεpült. Die Komplexe werden mit den Zellen 1 - 24 Stunden lang inkubiert. Eine typische Inku¬ bationszeit in Abwesenheit von Serum beträgt 4 Stunden. Das Transfektionεmedium wird dann gegen ein vollständigeε Wachs- tumεmedium ersetzt. In Gegenwart von Serum wird das Tranεfek- tionsmedium üblicherweise nicht ersetzt und die Zellen wachsen weiter in Gegenwart von Komplexen bis zum Ende der Versuche (einstufige Transfektion) . Nach 24 Stunden werden die Zellen aufgearbeitet wie es oben beschrieben ist.

Transfektion von Zellen unter Verwendung von ternären Komple¬ xen mit (1)

Plasmid-DNA wird mit 10 mM Hepes, 0,9 % NaCl-Puffer (pH 7,4) , der das geeignete Peptid (beispielεweiεe gemäß Anεpruch 23) enthält, auf ein Endvolumen von 100 μl verdünnt. Die Menge an

Peptid schwankte von 0 bis 20 μg pro 100 μl Puffer. Eine typische Konzentration ist 2 - 5 μg Peptid pro 100 μl Puffer. Nach 10 min Inkubation wird die erhaltene Löεung mit 100 μl einer kationischen Lipidlösung gemiεcht und die ganze Vorge- hensweise wie oben beschrieben fortgeführt.

d) Enzymassays

Luciferase-Assay. Die Luciferaseaktivität in Zellextrakten wird unter Verwendung eines Berthold Lumat-Gerätes (LB 9501) durchgeführt. Der Luziferase-Aεsay wird durch Zugabe von 5 - 10 μl Zellextrakt durchgeführt. Die Probe wird in das LB 9501 eingebracht und daε Gerät spritzt automatisch 100 μl Injek¬ tionspuffer (20 mM Tricin, 1,07 mM (MgC0 ₃ ) ₄ Mg(OH) ₂ , 2,67 mM MgS0 ₄ , 0,1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 270 μM Coenzym A, 470 μM Luciferin, 530μM ATP, pH 7,8) in die Probe, mißt Lichtemis¬ sion und zeigt sie als integrierten Wert für die ersten 10 Sekunden der Lichterzeugung.

ß-Galactosidase-Aεεay. Die ß-Galactoεidaseaktivität in Zell- extrakten wird auf 96-Loch-Mikrotiterplatten gemessen. 10 μl Zellextrakte werden mit 70 μl "ß-Gal"-Puffer (33 mM NaH ₂ P0 ₄ , 66 mM Na ₂ HP0 ₄ , 2 mM MgS0 ₄ , 40 mM ß-Mercaptoethanol) und 25 μl ONPG-Lösung (o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid 4 mg/ml in "ß-Gal"-Puffer) verdünnt. Die Mischung wird 30 Minuten bis 1 Stunde lang auf 37 °C gehalten und die Reaktion durch Zusatz von 150 μl IM Natriumbicarbonat gestoppt. Die Absorption wird bei 405 nm gemesεen.

Anfärben von Zellen mit 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-D-galacto- pyranosid (X-Gal) . Die gespülten Zellen werden mit 1 %iger Glutaraldehydlösung in 0,1 M Natriumphosphat, 1 mM MgCl ₂ - Puffer (pH 7,0) 15 min lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Fixierlösung wird entfernt, die Zellen dreimal mit PBS ge¬ waschen und Anfärbelösung (0,2 % X-Gal, 10 mM Natriumphos- phat, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl ₂ , 3,3 mM K ₄ Fe(CN) ₆ und 3,3 mM K ₃ Fe(CN) ₆ , pH 7,0) auf die Zellen überschichtet und 1 bis 8

Stunden bei 37 °C inkubiert. Die angefärbten Zellen auf Kulturplatten oder Objektträgern werden unter Verwendung von Inverεions- bzw. Phasenkontrastmikroskopen sichtbar gemacht.

Proteinbestimmung. Der Proteingehalt im Überstand wird unter Verwendung der Technik von Lowry (Bio-Rad-Proteinbestimmungs¬ kit) untersucht.

Die Bestimmung der Zytotoxizität wird unter Verwendung des MTT-Assays (3-(4 , 5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl- tetrazoliumbromid) durchgeführt.

Ergebniεεe

Anhaftende Zellen. a) Verbindung (1) . Die Tranεfektionseffizienz von Verbindung (1) auf HeLa-Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Serum wird mit DOTAP verglichen. 5xl0 ⁴ Zellen pro Probenvertiefung (24-Lochplatte) in 1 ml vollständigem RPMI 1640 werden einen Tag vor der Transfektion aufgebracht. Unmittelbar vor der

Transfektion wird das Medium entfernt und die Zellen mit 1 ml frischem Medium mit oder ohne Serum versorgt. Zur Bestim¬ mung des optimalen Verhältnisses von kationischen Lipiden zu DNA werden verschiedene Mengen beider Lipide im Transfek- tionεpuffer (Endvolumen 100 μl) mit 100 μl DNA-Lösung ge¬ mischt, die 1 μg pCMVL enthält. Nach 10 min Inkubation bei Raumtemperatur werden 100 μl dieεer Mischung, die 0,5 μg des Plasmids und die Hälfte der angegebenen Menge des Lipids ent¬ hält, zu jeder Probe zugegeben. In Gegenwart von Serum werden die Platten 24 Stunden inkubiert, ohne das Medium zu wech¬ seln. In Abwesenheit von Serum wird das Transfektionsmedium nach 4 Stunden entfernt und die Zellen werden mit 1 ml fri¬ schem mit Serum versetztem Medium versehen.

Die Zellen werden 24 Stunden nach der Transfektion für den Luciferase-Assay geerntet wie es oben beschrieben ist. Die

Ergebnisse sind in Fig. 2 als Gesamtmenge eines kationiεchen Lipids pro 1 μg pCMVL angegeben. In dem Fall, wo Zellen in Gegenwart von Serum transfektiert werden, wird die optimale Expression der Luciferaseaktivität unter Verwendung eines Verhältnisses von DOTAP/DNA von 10 : 1 (Gew. /Gew.) bzw. einem Verhältnis von Verbindung (1)/DNA von 5 : 1 (Gew. /Gew.) er¬ halten. In Abwesenheit von Serum wird die optimale Expression der Luciferaseaktivität bei beiden Lipiden unter Verwendung eineε Verhältniεses von Lipid/DNA von 5 : 1 (Gew. /Gew.) er- halten. Die Transfektion unter Vermittlung von Verbindung (1) ist im Vergleich zur DOTAP-Transfektion in Gegenwart von Serum I2mal bzw. in Abwesenheit von Serum 6mal höher.

b) Ternärer Komplex mit Verbindung (1) . 5xl0 ⁴ Zellen pro Probenvertiefung in 1 ml vollständigem RPMI 1640 werden einen Tag vor der Transfektion aufgebracht. Unmittelbar vor der Transfektion wird das Medium entfernt und die Zellen mit 1 ml frischem Medium mit oder ohne Serum versehen. Zur Bestimmung des Einflusses von HBV-Peptid auf die Transfektion von HeLa- Zellen werden verschiedene Mengen des Peptids mit 1 μg pCMVL gemischt, so daß sich ein Endvolumen von 100 μl ergibt und 10 min inkubiert. Dann werden 100 μl einer Lösung, die 7,5 μl Verbindung (1) enthält, durch Mischen zugegeben. Nach weite¬ ren 10 min Inkubation werden 100 μl der Transfektionslösung (enthält 0,5 μg DNA und 3,75 μg Verbindung (1)) auf die Zel¬ len aufgebracht. Nach 4 Stunden wird das Transfektionsroedium gegen 1 ml frisches vollständiges Wachstumεmedium ersetzt.

24 Stunden nach der Transfektion werden die Zellen lysiert und die Zellextrakte auf die Genexpreεεion analyεiert wie es oben beschrieben ist. Die Transfektionsgrade (mit Transfek¬ tion in Gegenwart von Serum) sind in Fig. 3 als Prozentsatz des mit DOTAP erhaltenen Wertes angegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß die optimale Menge an Peptid in diesem Experiment 5 μg beträgt und die Expression der Luciferaseaktivität 14mal höher ist als die bei Transfektionen mit Verbindung (1) bzw.

20mal höher als mit DOTAP. Im Falle der Tranεfektion unter εerumfreien Bedingungen iεt die optimale Menge deε Peptids gleich und die Expresεion der Luciferaseaktivität ungefähr lOmal höher als bei Transfektionen mit Verbindung (1) bzw. 150mal höher als mit DOTAP (Daten nicht angegeben) .

c) Zeitabhänqigkeit. 5xl0 ⁴ HeLa-Zellen pro Probenvertiefung (24-Lochplatte) in 1 ml vollständigem RPMI 1640 werden einen Tag vor der Tranεfektion aufgebracht. Unmittelbar vor der Tranεfektion wird daε Medium entfernt und die Zellen mit 1 ml frischem Medium mit Serum versehen. 50 μl der Transfektionε- lösung, die 0,25 μg pCMVLuc, 0,5 μg HBV-Peptid und 1,87 μg Verbindung (1) enthält, werden jeder Probenvertiefung unter Mischen zugegeben. Nach 2 Stunden wird das Transfektionsme- dium durch 1 ml frischeε vollεtändigeε Wachεtumsmedium er¬ setzt. Die Zellen werden zur angegebenen Zeit für das Luci- feraεe-Aεεay geerntet wie es oben beschrieben ist. Die Luci¬ feraseaktivität nimmt raεch zu, wobei εie ein Maximum nach 12 - 16 Stunden erreicht. Schon nach 2 Stunden werden 4,5xl0 ⁴ Lichteinheiten erhalten. Dieselbe Luciferasekativität wird nach 3 Stunden mit Transfektion unter Vermittlung von Verbin¬ dung (1) und erst nach 5 - 6 Stunden bei Transfektion unter Vermittlung von DOTAP erhalten.

Suspenεionεzellen. et.) Verbindung (1) . Die Tranεfektionεeffizienz von Verbindung (1) auf K562-Zellen in Gegenwart von Serum wird mit DOTAP verglichen. Zur Beεtimmung deε optimalen Verhältniεεes zwi- εchen kationiεchen Lipiden und DNA werden verschiedene Mengen der beiden Lipide einer bestimmten Menge von pCMVL (1 μg pro Probenvertiefung oder pro 0,5xl0 ⁶ Zellen in 2 ml des voll¬ ständigen RPMI 1640, 24-Lochplatten) zugegeben. Jeder Proben¬ vertiefung werden 200 μl der Transfektionsmischung zugegeben und die Platte 24 h bei 37 °C inkubiert (einstufige Transfek- tion) . Die Zellen werden lyεiert, wie es oben beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 als Luciferasegesamtakti-

vität pro Probenvertiefung gegen die Menge des kationischen Lipids pro 1 μg DNa aufgetragen. Die optimale Expression der Luciferaseaktivität wird unter Verwendung eines Verhältnisseε von DOTAP/DNA von 5 : 1 (Gew./Gew.) und von Verbindung (1)/DNA von 7,5 : 1 (Gew. /Gew.) erhalten. Das erhaltene Ver¬ hältnis entspricht einem Ladungsverhältnis von Lipid zu DNA von ungefähr 2 : 1 für DOTAP bzw. 5 : 1 für Verbindung (1) (unter der Annahme, daß 1 μg DNA 3 , 1 nm anionische Phosphat¬ ladungen enthält) . Die Transfektion unter Vermittlung von Verbindung (1) iεt lOmal höher als mit DOTAP.

ß) Ternärer Komplex mit Verbindung (1) .

Zur Bestimmung des Einflusses der Peptidkonzentration auf die

Transfektion von K562-Zellen, werden verschiedene Mengen von HBV-Peptid mit 1 μg pCMVL gemischt, so daß sich ein Endvolu¬ men von 100 μl ergibt und dann 10 min lang inkubiert. Dann werden 100 μl einer Lösung, die 10 μg Verbindung (1) enthält, unter Mischen zugegeben. Nach weiteren 10 min Inkubation wird die Transfektionslöεung (200 μl) auf die Zellen aufgebracht. Alle anderen Verfahrensbedingungen sind dieselben wie im vorigen Experiment beschrieben. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 als Luciferasegesamtaktivität pro Probenvertiefung gegen die Menge an zugeεetztem Peptid (pro 1 μg DNA) aufgetragen. Die Ergebniεse zeigen, daß die optimale Menge des Peptids 2 μg beträgt und daß die Expresεion der Luciferaεe 3- bis 4mal höher ist als die bei Transfektion mit Verbindung (1) bzw. 30- bis 40mal höher als bei Transfektionen mit DOTAP.

^• f) Dosisabhängigkeit. Eine "Stamm"-Lösung wird aus 1 μg pCMVL, 2 μg HBV-Peptid und 10 μg Verbindung (1) in einem Endvolumen von 200 μl herge¬ stellt. Die DNA-Dosiεabhängigkeit wird bei der einstufigen Transfektion durch Zugeben von 5 bis 200 μl dieser Löεung zu den Zellen geprüft. Ergebniεεe dieεes Versuchs sind in Fig. 6 angegeben. Die Expression der Luciferaseaktivität hängt von der Menge der zugesetzten DNA ab und ist im Bereich von 0

bis 0,25 μg DNA linear. Generell können unter diesen Bedin¬ gungen 0,5 ng Reporter-DNA (ohne Träger-DNA) nachgewiesen werden. Die erhaltenen Ergebnisse geben auch an, daß die ter¬ nären Komplexe, wenn sie einmal gebildet εind, sehr stabil sind und bei Verdünnung nicht dissoziieren.

Intrazelluläre Einführung von Oligonukleotiden

Beispiel 5

Fluoresceinmarkiertes Phoεphothioatoligonukleotid (5'-ACT TGG ATA CGC ACG-Fluorescein-3' ) wird verwendet, um die intra¬ zelluläre Abgabe und Verteilung von Oligonukleotid in Gegen¬ wart und Abwesenheit von Verbindung (1) zu bestimmen.

HeLa-Zellen (einen Tag vor dem Experiment auf Platten aufge¬ bracht, 2xl0 ⁵ Zellen pro Probenvertiefung, 6-Lochplatte) werden auf Glassobjektträgern in 2 ml RPMI 1640 versehen mit 10 % FCS kultiviert. Vor dem Versuch wird das Medium durch RPMI 1640 ohne Serum ersetzt.

Die Bildung von Komplexen aus Oligonukleotid und Verbindung (1) wird wie folgt vorgenommen. 10 μg Phosphothioatoligonuk- leotid wird in 90 μl Transfektionspuffer aufgelöst. 16 μg und 50 μg Verbindung (1) werden mit Tranεfektionspuffer auf ein Endvolumen von 100 μl verdünnt. Die zwei Lösungen werden miteinander gemischt und 10 min inkubiert. Die Oligonukleo- tidlösung ohne Verbindung (1) wird mit 100 μl Transfektions¬ puffer verdünnt. Die erhaltenen Lösungen (200 μl pro Proben- Vertiefung) werden den Zellkulturen zugegeben (Endkonzentra¬ tion des Oligonukleotids ungefähr 1 μM, Verbindung (1) 8 μM und 25 μM) . Die Komplexe werden mit den Zellen 4 Stunden lang inkubiert. Dann wird das Medium durch ein vollständiges Wach- εtumεmedium erεetzt.

Nach 4 und 24 Stunden werden die Zellen dreimal mit PBS gewa¬ schen und mit 1 %iger Glutaraldehydlösung 15 min lang fixiert. Nach der Fixierung werden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit Glycerinfixierlösung (10 mM Phosphat, 150 mM NaCl, 70 % Glycerin, pH 7,5) behandelt. Die Anordnung des fluoresceinmarkierten Phosphothioatoligonukleotids wird durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Fluores¬ zenzmikroskops von Zeisε bestimmt.

Die Inkubation von Zellen mit l μM fluoresceinmarkiertem Oligonukleotid führte sowohl nach 4 wie nach 24 Stunden zu einer schwachen Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu zeigten alle Zellen, die mit 1 μM fluoresceinmarkiertem Oligonukleotid in Gegenwart von Verbindung (1) inkubiert werden, bei Cyto- plasmaanfärbung nach 4 Stunden eine klare Kernfluoreεzenz. Nach 24 Stunden zeigten die Zellen εehr klare punktuelle Fluoreεzenz im Cytoplaεma. Die Fluoreszenzintenεität iεt in Gegenwart von 25 μM Verbindung (1) höher.

Die in Gegenwart von Serum durchgeführten Experimente zeigten keine Veränderungen der Gesamtfluoreszenz und Verteilung des fluoresceinmarkierten Oligonukleotids.

Intrazelluläre Einführung von anionischen Polypeptiden

Beispiel 6

Ein fluoresceinmarkiertes anionisches Polypeptid (Fluo- rescein-poly(Glu) ₂ Ï„ _. ) wird verwendet, um die intrazelluläre Abgabe und Verteilung von anioniεchem Polypeptid in Gegenwart und Abwesenheit von Verbindung (1) zu untersuchen. Die Ver- εuchεbedingungen εind genau dieselben wie beim zuvor be¬ schriebenen Beispiel.

Inkubation von Zellen mit 1 μM fluoresceinmarkiertem poly- (Glu) ₂ χ führte weder nach 4 noch nach 24 Stunden zu einer

Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu zeigten alle mit 1 μM fluo¬ resceinmarkiertem Oligonukleotid in Gegenwart von 25 μM Verbindung (1) inkubierten Zellen klare punktuelle Cytoplas- ma-Fluoreεzenz schon nach 45 min. Die Anordnung der Fluores- zenzvesikel ist etwas anders als bei dem mit fluoresceinmar¬ kiertem Oligonukleotid. Nach 24 Stunden zeigten die Zellen sehr klare punktuelle Fluoreszenz im Cytoplasma, die höchst- wahrεcheinlich in denεelben Strukturen angeordnet sind.

Beiεpiel 7

Liposomformulierungen

Die folgenden Zusammensetzungen zeigen die Verwendung der Verbindungen dieser Erfindung in Formulierungen, die biolo¬ gisch aktive Stoffe umfassen:

7.1 Eine topiεche Formulierung wird durch Auflösen von 0,25 mg Prednisolonacetat (21-Acetoxy-l, 4-pregnadien-llß, 17a(--diol-3,20-dion) und 50 mg L-Lyεin-bis(0,0'-oleoyl-ß- hydroxyethyl)amiddihydrochlorid in 2 ml Dichlormethan-/Etha- nollösung (1 : 1) hergestellt. Das Lösemittel wird im Stick¬ stoffström verdampft. Die Filmmischung wird über Nacht im Vakuum gehalten, um das restliche Lösemittel vollständig zu verdampfen. Zur Liposomformulierung wird der trockene Film dann in 2 ml 0,9 %iger NaCI-Lösung suspendiert und die erhal¬ tene Lösung schallbehandelt bis sie εichtbar klar ist.

7.2 (+) -et-Tocopherol (5,7,8-Trimethyltocol, Vitamin E) und 100 mg L-Lyεin-biε(O,0'-oleoyl-ß-hydroxyethyl) amiddi- hydrochlorid werden in 5 ml Dichlormethan-/Ethanollösung (1 : 1) aufgelöst. Das Lösemittel wird im Stickstoffström verdampft und der Rest unter Vakuum verdampft. Der trockene Film wird dann in 4 ml 10 mM Hepes, 0,9 %iger NaCl bei pH 7,4 suspendiert und schallbehandelt bis εie sichtbar klar ist.

7.3 20 mg Retinol (3 ,7-Dimethyl-9-(2, 6, 6, -trimethyl-1- cyclohexenyl)-2,4, 6,8-nonatetraen-l-ol) und 80 mg L-Lysin- bis(0,O'-myristoyl-ß-hydroxyethyl)amiddihydrochlorid werden in 5 ml Dichlormethan-/Ethanollösung (1 : 1) aufgelöst. Das Lösemittel wird verdampft und der trockene Film über Nacht im Vakuum gehalten. Der Film wird dann in 5 ml 10 mM Tris, 0,9 %iger NaCl bei pH 7,4 suspendiert.

7.4 3 mg N-Palmitoyl-S(2, 3-biε(palmitoyl-oxy) -(2RS) - propyl-R-cyεtein und 25 mg L-Lysin-bis(0,0'-palmitoyl-ß- hydroxyethyl) amiddihydrochlorid werden in 5 ml Dichlormethan- /Ethanollöεung (1 : 1) aufgelöst und unter Vakuum zur Trocke- ne verdampft. Der erhaltene Film wird in 1 ml destilliertem Wasser suεpendiert und mit Ultraschall behandelt bis die Suspenεion klar iεt.

Neben den biεher beεchriebenen Teilen umfaßt die Erfindung noch die Verwendung der erfindungsgemäßen Lipidverbindungen zur Einführung lipophiler Anteile in Peptide sowie die auf diese Weise hergestellten Lipopeptide. Nähere Einzelheiten ergeben εich auε dem folgenden:

Peptidsynthese

Allgemeine Vorgehenεweise: die Synthese von Peptiden mit lipophilen Modifikationen an ihren C- oder N-endεtändigen Gruppen oder beiden oder in der Kette wird durch schrittweise Syntheseverfahren ausgehend von

Fmoc in der festen Phase unter Verwendung des automatischen Peptidsyntheεegeräteε ABI 350 oder des multiplen Peptidsyn- thesegeräts durchgeführt.

Die Peptide werden üblicherweise auf einem Rinkamid MBHA-Harz (4-(2' ,4'-Dimethoxyphenyl-Fmoc-aminomethyl)phenoxyacetamido-

norleucylmethylbenzhydrylaminharz, Novabiochem) oder einem Tritylharz (2-Chlortritylchloridharz, Novabiochem) angeord¬ net.

Die Kupplungen der Fmoc-Aminoεäuren (lOmolarer Überschuß) werden mit N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) und 1-Hydroxy- benzotriazol (HOBt) in DMF üblicherweise in einer Stunde durchgeführt. Die Kupplungen der lipophilen Aminosäure-biε- hydroxyethylamide werden unter Verwendung eines dreifachen molaren Überschuεεeε, mit demselben DIC/HOBt-Aktivierungsver- fahren und einer Kupplungszeit von ungefähr 3 Stunden durch¬ geführt. Die Beendigung der Kupplung wird mit einem Ninhyd- rinteεt überprüft. Die Fmoc-Gruppe wird mit Piperidin:DMF = 1 : 2 in 15 min entfernt.

Abspaltung und Entfernung der Schutzgruppen wird in einer Mischung aus n-Kresol:Dimethylsulfid:Ethandithiol:TFA = 3:3:3:91 in zwei Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Abfiltrieren werden die Peptide aus der Mischung ausge- fällt und mehrfach mit Diethylether gewaεchen. Die rohen Pep¬ tide werden auf einer semipräparativen Säule mit Nucleosil C2 (8x250 mm) und mit einem aufsteigenden Gradienten von Acetonitril in Wasser, jeweils mit 0,1 % TFA, gereinigt. Die gereinigten Peptide werden aus der Mischung von tert-Butyl- alkohol:Wasser = 4:1 lyophilisiert und bei -4 °C aufbewahrt. Ihre Homogenität wird durch Aminosäureanalyse, analytische HPLC und Elektrosprayionisations-Massenspektrometrie be¬ stätigt.

Gemäß diesem Verfahren können die folgenden Lipopeptide hergestellt werden:

GLFGAIAAGFIENGWEGLIDG-D(N(EtOPalm) ₂ )-NH ₂ E(N(EtOPalm) ₂ )-MQRGNFRNQRKMVKGGRAPRKKG E(N(EtOMyr) ₂ )-MQRGNFRNQRKMVKGGRAPRKKG GRGDSPGSG-D(N(EtOPalm) ₂ )~NH ₂

Acetyl-GRGDSPGSG-D(N(EtOPalm) ₂ )-NH ₂

YNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTL-E(N(EtOPalm) ₂ -NH ₂

E(N(EtOPalm) ₂ -YNRNAVPNLRGDLQVLAQKVARTL-E(N(EtOPalm) ₂ -NH ₂

YPS-E(N(EtOPalm) ₂ -PDNPGEDAPAEDMARYYSALRHYINLITRQRY-NH ₂

Ferner umfaßt die Erfindung noch die Verwendung der erfin¬ dungsgemäßen Lipidverbindungen zur Einführung glycolipophiler Anteile in Peptide sowie die auf diese Weise hergestellten Glycolipopeptide. Nähere Einzelheiten ergeben sich aus dem folgenden:

Synthese von Glycolipopeptiden:

Lys(NH-Asn(Lactosyl) ) ₄ -Lys ₂ -Lys-Acx-bAla-Acx-E _. (N(EtOPalm) 2~ NH ₂

1,8 g (5 mmol) D(+)-Lactosemonohydrat wird mit 40 ml gesät- tigter NH ₄ HC0 ₃ 6 Tage lang bei 30 °C umgesetzt. Zur Entfer¬ nung des überschüsεigen NH ₄ HC0 ₃ wird die Reaktionsmischung mit Wasser (20 ml) verdünnt und im Vakuum bis auf die Hälfte ihres urεprünglichen Volumens aufkonzentriert. Dieses Vor¬ gehen wird 6 mal wiederholt. Schließlich wird das Wasser durch Lyophilisierung entfernt. Der erhaltene rohe Amino- zucker wird ohne weitere Reinigung zur Synthese von Fmoc- Asn(lactose) -OtBu-Derivaten verwendet. 480 mg (1,17 mmol) Fmoc-Asp-OtBu und 228 mg (1,52 mmol) HOBt werden in DMF ge¬ löst (5 ml) und nach Abkühlen auf 4 °C werden 205 mg (1,63 mmol) DIC zugegeben. Nach 15 min Rühren bei 4 °C und weitere 20 min bei 25 °C werden dem aktiven Ester 5,85 mmol rohe 1- Aminolactoεe in 6 ml DMF:H ₂ 0 = 2:1 zugegeben. Nach 6 Stunden Rühren wird das Lösemittel im Vakuum verdampft und Diethyl¬ ether zugegeben. Das ausgefällte Produkt wird filtriert, mit kaltem Ether und kaltem Wasεer gewaεchen. Die tBu-Schutz- gruppe wird durch 70 % TFA in Waεεer abgespalten (20 min bei

Raumtemperatur) . Nach Verdampfen der TFA-/Wasεermischung im Vakuum wird das Produkt in tert-Butylalkohol:Wasser = 4:1 gelöst und lyophilisiert. Daε rohe Fmoc-Aεn(lactose) -OH wird durch Umkehrphasenchromatographie gereinigt (Säule Lichroprep C18 25x310 mm, isokratische Elution bei 30 % Acetonitril/Was- ser/0,1 % TFA), so daß 280 mg HPLC-reines Fmoc-Asn(lactoεe) - OH erhalten werden (Ausbeute 35 %, bezogen auf das Ausgangs¬ produkt Fmoc-Asp-OtBu. Analyse: +FAB-MS (MH+) = 679 (berech¬ net = 679), Rt = 6,59 min auf Nucleoεil C18 4x150 mm, Gra- dient 30-100 % Acetonitril/0, l % TFA in Wasser/0,1 % TFA in 30 min) .

32,5 mg (0,048 mmol) Fmoc-Asn(lactose) -OH und 7,25 mg (0,05 mmol) HOBt werden in 200 μl DMF gelöst und 6,31 mg (0,05 mmol) DIC zugegeben. Nach 30 min Rühren wird der gebildete aktive Ester ober Nacht mit 30 mg (0,016 mmol) Boc- (Lys(NH ₂ ) ) ₄ -Lys ₂ -Lyε-Acx-bAla-Acx-E(N(EtOPalm) ₂ -peptidylharz gekuppelt. Das Harz wird sorgfältig gewaschen und die Fmoc- Gruppe durch Behandlung mit 20 %igem Piperidin entfernt. Das Glycopeptid wird abgespalten, von Schutzgruppen befreit und unter identischen Bedingungen wie oben beschrieben aufgear¬ beitet. Schließlich wird es durch semipräparative HPLC gerei¬ nigt, so daß 10,6 mg N-Lactosyliertes Lipopeptid erhalten werden.

Figur 1 der beigefügten Schaubilder zeigt die Fluoreεzenz- intensität in Abhängigkeit von der Menge an zugesetzter Verbindung (1)

Figur 2 zeigt den Einfluß des Verhältnisses von DOTAP/DNA und

Verbindung 1/DNA auf die Transfektion von HeLa-Zellen. Die Transfektion von Verbindung (1) ist in Gegenwart (») und in Abwesenheit (o) von Serum dargestellt. Die DOTAP-Transfektion ist in Gegenwart (•) und in Abwesenheit (o) von Serum darge- stellt. Die Transfektionεwerte sind als Gesamtlichteinheiten pro 50000 Zellen angegeben. Jeder Punkt soll den Mittelwert

+ SD von drei Transfektionen darstellen.

Figur 3 zeigt den durch Peptid verstärkten Gentransfer auf HeLa-Zellen. Transfektionswerte sind als Prozentsatz des bei DOTAP-Transfektion erhaltenen Wertes angegeben und zeigen den Mittelwert von drei Transfektionen.

Figur 4 zeigt den Einfluß deε Verhältniεses von DOTAP (•) /DNA und Verbindung l(β)/DNA auf die Transfektion von K562-Zellen. Die Transfektionεwerte εind als Gesamtlichteinheiten pro

500000 Zellen angegeben. Jeder Punkt bedeutet den Mittelwert + SD von drei Transfektionen.

Figur 5 zeigt den durch Peptid verstärkten Gentransfer auf K562-Zellen. Die Transfektionswerte sind als Gesamtlichtein¬ heiten pro 500000 Zellen angegeben und zeigen, den Mittelwert + SD von drei Transfektionen.

Figur 6 zeigt die Transfektionswerte gegen die Menge an zugesetzter DNA. Die Transfektionswerte sind als Gesamtlicht¬ einheiten pro 500000 Zellen angegeben und bedeuten den Mittelwert + SD von drei Transfektionen.