Die Verabreichung von pharmazeutischen Wirkstoffen, insbesondere von großen Wirkstoffmolekulen, ist häufig problematisch. Der Wirkstoff verteilt sich in Abhangigkeit von seiner Löslichkeit in Wasser oder in lipophilen Losungsmittel in unterschiedlichen Mengen uber die einzelnen Körperbereiche, wobei häufig nur geringe Mengen an Wirkstoff das Zielorgan erreichen. Ferner können die Wirkstoffe aufgrund von Reaktionen mit im Körper vorhandenen Stoffen metabolisiert werden und es kann zu unerwünschten Nebeneffekten fur den Gesamtorganismus kommen.

Insbesondere für relativ große Wirkstoffmoleküle werden Liposomen als Trägersubstanzen eingesetzt. Die Wirkstoffe sind in den Liposomen eingeschlossen und können von anderen Stoffen nicht angegriffen werden. Ferner lassen sich die Liposomen derart aufbauen, dass die darin eingeschlossenen Medikamente uber einen spezifischen Aufbau der Liposomenhulle in bestimmte Zielorgan dirigieren.

Liposome sind künstlich hergestellte kugelförmige Lipid-Vesikel, die aus einer oder mehreren konzentrischen Lipid-Doppelschichten mit wässerigem Innenraum bestehen. Sie lassen sich durch mechanische Feinverteilung (Dispergierung) von Phospholipiden in wasserigen Medien herstellen. Man unterscheidet multilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von etwa 0, 1 bis 5 urn von unilamellaren Vesikeln mit einer Größe von 0, 02 bis 0, 05 um beziehungsweise um ca. 1 um. Die Liposome spielen insbesondere bei der Behandlung von Tumoren als Trägersysteme eine wichtige Rolle. Ein Wirkstoff, der liposomal verkapselt verabreicht wird, ist z. B. Paclitaxel. Paclitaxel zeigt nur eine geringe Löslichkeit in Wasser und wird daher häufig in Kombination mit Lösungsvermittlern, wie Cremophor (polyethoxyliertes Rizinusöl) verwendet. Der Einsatz dieser Kombination fuhrt jedoch zu erheblichen Nebenwirkungen wie z. B. zu anaphylaktoiden Reaktionen. Die Verdünnung solcher Lösungen mit physiologischer Kochsalzlosung zur Applikation hat den Nachteil, dass Paclitaxel in physiologischer Kochsalziösung keine ausreichende Stabilität besitzt.

In der internationalen Patentanmeldung WO 93/18751 werden Paclitaxel-Liposomen- Kombinationen offenbart, von denen insbesondere Vesikel mit positiver Ladung auf Basis von Cardiolipin, Phosphatidylcholin und Cholesterol hergestellt wurden. Die hergestellten Liposomen mussten, wie die Beispiele zeigen, jedoch in Tierversuchen an vier aufeinander folgenden Tagen appliziert werden, woraus sich schließen last, dass nach einer einmaligen Gabe nicht die gewünschte Antitumorwirkung erreicht werden konnte.

Auch bei der liposomalen Verkapselung von anderen Wirkstoffen tritt häufig das Problem auf, dass die Liposomen zum Teil zu Nebenwirkungen fuhren oder diese direkt in die Leber gelangen, wo sie umgehend eliminiert werden.

Auch umfangreiche Forschungen, die die Kapazität von Liposomen erhöhen sollen, fuhren nicht zu den gewünschten Wirkungen, da die Liposomen selbst nicht das Zielorgan erreichen.

Der vorliegenden Erfindung lag demgemäß die Aufgabe zugrunde, ein liposomales System zur Verfugung zu stellen, worin die Aktivität von Wirkstoffen bei der Behandlung von Krankheiten beziehungsweise die Akkumulation von Wirkstoffen und/oder pharmazeutischen Substanzen, die in einem bestimmten Zielorgan akkumuliert werden sollen, wie z. B.

Kontrastmittel von Bild gebenden Verfahren etc. akkumuliert werden können. Es sollten die Wirksamkeit derartiger Systeme bei der Behandlung von Krankheiten etc. erhöht und vorzugsweise auch die Anzahl der Nebenwirkungen verringert werden.

Überraschenderweise wurde festgestellt, dass sich die Wirkung von liposomal verkapselten Wirkstoffen, wie Antitumorwirkstoffen, um ein Vielfaches erhöhen last, wenn der Wirkstoff nicht vollständig liposomal verkapselt ist, d. h. wenn außerhalb der Liposomen noch freie Wirkstoffmolekule in der zu applizierenden Lösung/Emulsion vorliegen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein liposomal verkapselter Wirkstoff, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er in einem Anteil von 1 Gew.-% bis 90 Gew.-%, bezogen auf die eingesetzte Wirkstoffmenge, verkapselt ist.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Anteil der Verkapselung, dass verkapselte Wirkstoffmoleküle sich im Zentrum der Liposomen oder in der Membran befinden, im Gegensatz zu freien Wirkstoffmolekulen, die sich in dem die Liposomen umgebenden

Losungsmittel aufhalten oder durch van-der-Waal'sche Wechselwirkungen auf der Oberflache der Lipidmembranen locker gebunden sind.

Als aktive Wirkstoffe, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind Arzneimittel und pharmakologisch aktive Substanzen, Nahrstoffe, kosmetische Substanzen, diagnostische Substanzen und Kontrastmitte ! fur biidgebende Verfahren. Der Ausdruck Wirkstoff umfasst auch die pharmakologisch annehmbaren Salze der Wirkstoffe. Geeignete Verbindungen sind lipophile und amphiphile Moleküle, d. h. Substanzen, die wasserunlöslich oder nur eine geringe Wasserlöslichkeit aufweisen, und die in Form von Emulsionen oder micellaren Zubereitungen hergestellt werden konnen. Geeignete Arzneimittel sind z. B.

Antikrebsmittel, Antitumormittel, Antibiotika, antimikotische, antiviruale, anthelminthische und antiparasitische Verbindungen.

Bei der Behandlung von Tumoren oder Krebswachstum können als geeignete Verbindungen Anthracycline, wie Doxorubicin, Daunorubicin, Karinomycin, N-Acetylatriamycin, Rubidacon, 5-Imidodaunomycin, N-Acetyidaunomycin, Pirarubicin und Epirubicin, Alkaloid wie Vincristin, Vinblastin, Etoposid, Ellepticin und Damptothecin, eingesetzt werden. Weitere geeignete Substanzen sind 5-Fluorouracil, Taxane, wie Paclitaxel (Taxolo) und Derivate von Paclitaxel, z. B. Taxotere (Docetaxol@) oder Mitrotan, Platinverbindungen, wie Cisplatin, Carboplatin, Lobaplatin und Phenestrin).

Beispiele fur entzündungshemmende Mittel, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind steroide und nicht-steroide und andere entzündungshemmende Verbindungen, wie Prednison, Methyl-Prednisolon, Paramethazon, 11-Fluorocortisol, Triamciniolon, Betamethason und Dexamethason, Ibuprophen, Piroxicam, Beclomethason, Methotrexat, Acaridin, Etritinat, Anthralin, Psoraline, Salycilate, wie Aspirin, und Immunsupresiva, wie Cyclosporin. Insbesondere entzündungshemmende Corticosteoride und das entzündungshemmende und immunsupresiv wirkende Cyclosporin sind lipophile Verbindungen, die in der vorliegenden Erfindung besonders vorteilhaft eingesetzt werden können.

Weitere pharmakologisch aktive Substanzen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind Anasthetika, wie Methoxyfluran, Isofluran, N-Fluran, Halothan und Bezocain, antiulcerative Mittel wie Cimetidin, krampflösende Mittel wie Barbiturate, Azothioprin, ein Immunsupresivum und antirheumatisches Mittel, sowie Muskelrelaxanzien, wie Dantrolen und Diazepam.

Verfahren zur Herstellung von lipophilen Derivaten, die in Form von Liposomen oder Mycellen hergestellt werden können, sind dem Fachmann gut bekannt.

Beispiele fur Komponenten, die in bildgebenden Verfahren als Kontrastmittel eingesetzt werden können, sind Kontrastmittel fur Ultraschall-, Röntgen-und NMR-Verfahren.

Insbesondere für Röntgen-Verfahren eignen sich Radioisotope oder Verbindungen, die derartige Radioisotope enthalten wie z. B. Jod, Octane, Halogenkohlenwasserstoff und Renografin. Geeignete Kontrastmittel (Gadolinium), die in NMR-Verfahren eingesetzt werden können sind lipidlösliche paramagnetische Verbindungen.

Nahrungsergänzungsmittel, die in das liposomale System gemäß der vorliegenden Erfindung eingearbeitet werden können, sind Aminosauren, Zucker, Proteine, Kohlenhydrate, fettlösliche Vitamine, Fette (Lipide). Kombinationen aus unterschiedlichen Nahrungserganzungsmitteln sind ebenfalls geeignet.

Weitere geeignete Substanzen sind Immunmodulatoren und Vakzine.

Die eingesetzten Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise unter Zusatz von Liposomen verkapselt werden. Um den gewünschten Verkapselungsgrad einzustellen, ist es möglich, den Wirkstoff nur teilweise zu verkapseln. Die teilweise Verkapselung kann durch Verwendung entsprechender Ausgangsmaterialien oder geeigneter Verfahrensbedingungen erfolgen. In einer weiteren Ausführungsform kann ein vollstandig oder nahezu vollstandig liposomal verkapselter Wirkstoff mit der entsprechenden Menge an unverkapseltem Wirkstoff beziehungsweise deren Losungen/Emulsionen vermischt werden, so daß der gewünschte Verkapselungsgrad erhalten wird. Insgesamt läßt sich der Verkapselungsgrad durch einfache Verfahrensanderungen einsteiien.

Das Liposom hat eine geschlossene Struktur, das aus einer Lipid-Doppelschicht, die einen wasserigen inneren Kern umschließt, besteht. Die erfindungsgemäß eingesetzten Liposome sind nicht auf bestimmte Liposome beschränkt, es können sowohl neutrale, negativ oder positiv geladene Liposome eingesetzt werden, die unilamellar, d. h. aus einer Lipid- Doppelschicht, oder polylamellar, d. h. aus mehreren Lipid-Doppelschichten, aufgebaut sein und nach dem Fachmann bekannten Methoden hergestellt werden können.

Die Liposome werden üblicherweise aus Phospholipiden sowie ggf. Cholesterol und Cholesterolderivaten und/oder einer oder mehreren hydrophilen, lipophilen oder amphiphilen Komponente (n) hergestellt.

Als Phospholipide kommen beispielsweise Phosphatidylcholin (PC), Distearoylphsphatidyl- cholin (DSPC), Sojaphosphatidylcholin (Soja-PC), hydriertes Sojaphosphatidylcholin (HSPC), Ei-Phosphatidylcholin (Ei-PC), hydriertes Ei-Phosphatidylcholin (HEPC), Dipal- mitoylphosphatidylcholin (DPPC), Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) sowie deren beliebigen Gemische in Betracht, wobei die Subsanzen synthetische, halbsynthetische oder natürliche Produkte sein können.

Weitere geeignete Phospholipide sind Phosphatidylglyceride (PG) und Phosphatidsäure, wie Dimyristoylphosphatidylglycerid (DMPG), Dilaurylphosphatidylglycerid (DLPG), Dipalmitoyl- phosphatidylglycerid (DPPG), Distearoylphosphatidylglycerid (DSPG), Dimyristoylphos- phatidsaure (DMPA), Dilaurylphosphatidsaure (DLPA), Dipaimitoyiphosphatidsaure (DPPA), Distearoylphosphatidsaure (DSPA), sowie Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinositole und Phosphatidsäure, die Reste der Laurinsaure, Myristinsaure, Stearinsaure und/oder Palmitinsäure enthalten.

Bevorzugte Phospholipide sind HSPC, DSPC und HEPC.

Positiv geladene Liposome können beispielsweise aus einer Lösung, die Phosphatidylcholin, Cholesterol und Stearylamin enthalt, gebildet werden. Negativ geladene Liposome können beispielsweise aus Lösungen, die Phophatidylcholon, Cholesterol und Phosphatidylserin oder bevorzugt Cardiolipin, erhalten werden. Dem Fachmann ist es bekannt, dass auch andere Additive zugegeben werden können, um die Eigenschaften der erhaltenen Liposome zu modifizieren.

Die Eigenschaften Liposome können beispielsweise durch Zugabe von a-Tocopherol verändert werden. Gute Ergebnisse werden auch mit sog. PEG-Liposomen, d. h. Liposomen mit Polyethylenglykolketten (PEG) in der Lipidschicht, wobei das PEG entweder im Molekül der Phospholipide gebunden oder als freie Substanz vorliegen kann, erhalten. Das Molekulargewicht der PEG-Ketten liegt vorzugsweise zwischen 400 und 20. 000, besonders bevorzugt zwischen 600 und 10. 000 und insbesondere zwischen 600 und 5. 000.

Ferner können als Liposome auch die in der W096/05821 genannten Verkapselungsmittel eingesetzt werden.

Bevorzugt eingesetzte Liposomen werden z. B. aus HSPC, DSPC und/oder HEPC als Phospholipid, Cholesterol und/oder N- (O-methyl-poly (ethylenglykol)-1, 2-distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamin sowie ggf. Polyethylenglykol gebildet.

Das Verhältnis von Lipid zu Wirkstoff kann in weiten Bereichen eingestellt werden und hangt in der Regel vom verwendeten Wirkstoff sowie dem zur Liposomherstellung eingesetztem Lipid und den weiteren Komponenten ab. In einer möglichen Ausführungsform liegen im fertigen verkapselten Produkt Lipid und Wirkstoff in einem Mengenverhältnis von 5 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise von 10 : 1 bis 40 : 1, insbesondere von 15 : 1 bis 25 : 1 vor. Ist auch Cholesterol bzw. ein Cholesterolderivat vorhanden so betragt das molare Verhältnis von Lipid zu Cholesterol vorzugsweise von 3 : 1 bis 1 : 3, vorzugsweise von 2 : 1 bis 1 : 2.

Polyethylenglykol wird vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 50 Mol-%, insbesondere von 5 bis 20 Mol-%, bezogen auf das Lipid, eingesetzt.

Die Größe der erfindungsgemäß liposomal verkapselten Wirkstoffe liegt vorzugsweise unter 200 nm, besonders bevorzugt unter 150 nm.

Die physiologische Verträglichkeit und Wirksamkeit der erfindungsgemäß liposomal verkapselten Wirkstoffe kann durch Kombination mit geeigneten Arzneimittelträgern weiter verbessert werden Beispiele fur besonders gut geeignete Arzneimitteltrager sind zum Beispiel sogenannte Mikrosphären, welche vorzugsweise aus Polysachariden oder Polysacharidderivaten hergestellt werden und besonders bevorzugt abbaubar sind. Die Polysacharide sind vorzugsweise ausgewählt aus Starke und Stärkederivaten, Gelatine, Albomin, Kolagen, Dextran, Dextanderivaten oder ähnlichen Materialien. Besonders bevorzugt sind lyopohilisierte oder abbaubare Starke-oder Gelatinepartikel. Derartige Mikrospharen weisen vorzugsweise ein wasserunlösliches, jedoch hydrophiles, in Wasser quellbares, dreidimensionales Netzwerk von Polysacharidmolekulen oder entsprechenden Derivaten auf. Geeignete Mikrosphären werden in der DE-US-25 24 279, WO 88/09163 und WO 89/03207 beschrieben. Der Durchmesser der Mikrosphären liegt vorzugsweise zwischen 0, 1 und 2001um, insbesondere zwischen 10 und 100 um.

Die erfindungsgemäß hergestellten liposomalen Systeme können direkt in den Blutkreislauf der zu behandelnden Personen gegeben werden, wobei auch die intraperitoneale, subkutane oder inhalative Verabreichung möglich ist.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Liposome können nach einem beliebigen aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum Beispiel können die Liposome in

einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden, üblicherweise in einem unpolaren oder nur schwach polaren Losungsmittel, welches ohne schädliche Substanzen zu hinterlassen, wieder entfernt werden kann, wie Ethanol, Methanol, Chloroform, Butanol oder Aceton.

Wenn Wirkstoffgemische eingesetzt werden, können die einzelnen Lösungen auch miteinander vermischt werden. Auch das lipophile Material wird aufgelöst und mit der Wirkstoff-haltigen Lösung vermischt. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels, beispielsweise durch ein Lyophilisierungsverfahren, verbleibt der Lipidfilm auf dem Wirkstoff.

Das Gemisch kann in dieser Form, gegebenenfalls unter Inertgasatmospare, gelagert werden, wobei niedrige Lagertemperaturen, wie bei-20°C, besonders bevorzugt sind. Die Bildung der Liposome erfolgt in der Regel durch Zugabe einer geeigneten Lösung zum Lipidfilm. Typische Lösungen sind polare Lösungen, vorzugsweise wässerige Satziosungen, wie isotonische Kochsalzlosung. Die Bildung der Liposome erfolgt zum Beispiel durch Mischen wie durch Mischen im Wirbelstrom (Vortexing). Werden kleiner Vesikel, wie unilamellare Vesikel hergestellt, kann die Lösung auch mit Ultraschall behandelt werden.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können auch Gemische aus multilamellaren Vesikeln und unilamellaren Vesikeln eingesetzt werden.

Die hergestellten Liposome können unmittelbar dem Patienten verabreicht werden oder bei geeigneten Bedingungen gelagert werden. Vorzugsweise werden die lipophilen Wirkstoffe als mit Lipidfilmen beaufschlagte trockene Substanzen bei etwa-20°C gelagert. Nach der Hydratisierung können Liposomsuspensionen, denen eine geeignete Menge an unverkapseltem Wirkstoff zugesetzt worden ist, in gepufferten oder neutralen Kochsalzlosungen in Abhangigkeit von der Temperatur und den Inhaltsstoffen Ober einen Zeitraum von einigen Stunden bis zu Monaten aufbewahrt werden. Das liposomale Wirkstoffsystem gemäß der vorliegenden Erfindung kann in Mengen von etwa 5 bis 150 mg Wirkstoff/kg Körpergewicht des Patienten innerhalb eines Zeitraums von 1 Minute bis 5 Stunden verabreicht werden.

Weitere Gegenstande der vorliegenden Erfindung sind die Verwendung eines wie oben beschriebenen liposomal verkapselten Wirkstoffs zur Herstellung eines Medikaments zur Be- handlung von Tumoren, als Nahrungsergänzungsmittel, zur Herstellung eines Kontrastmittels fur bildgebende Verfahren und zur Herstellung eines Diagnostikmittels fur Krankheiten.

Beispiele Herstellung der Liposomen : Hydriertes Ei-Phosphatidylcholin (HEPC, 50 mg/ml ; Nattermann Phospholipid GmbH, Kiln, Deutschland), Cholesterol (CH, 24, 8 g/ml ; Merck, Darmstadt, Deutschland) und Polyethylenglykol (MPEG-DSPE, 3000, 5, 4 mg/ml ; Sygena LTD, Liestal, Schweiz) werden im molaren Verhältnis 1 : 1 : 0, 1 in Chloroform gelost. Die organische Phase wird am Rotationsverdampfer entfernt und der entstandene, gut getrocknete Lipidfilm mit einer Wirkstofflösung sowie einer Gd-DTPA-FS-Losung resuspendiert. Diese Liposomendispersion wird 24 h bei Raumtemperatur geschüttelt, die dabei entstandenen Multischichtvesikel (MLV) einer Beschallung unterworfen (Russelbeschaller, 6x4 min mit 50 % Intensität, Branson B225 sonifer ; Branson, Carouge-Geheve, Schweiz) und anschließend zentrifugiert (3000 U/min uber 20 min), um von der Liposomendispersion den Titanabrieb zu entfernen.

Als Wirkstoffe wurden 5-Fluorouracil (Riboluors 1000 ; 50 mg/ml Infusionslösung, Ribosepharm GmbH, Munchen, Deutschland) und Carboplatin (Ribocaraboe 50 mg/ml Infusionslösung, Ribosepharm GmbH, München, Deutschland) verwendet.

Die Vesikelgröße wurde mit einem Photonenkorrelationsspektrometer (Coulter Counter N4 MD modell and the AccuComp@System, Coulter Electronics Inc., Hialeah, US) bestimmt und bewegte sich fur beide Wirkstoffe in einer Größenordnung von 100 50 nm.

Die 5-Fluorouracil-Liposome wurden ferner mittel Kernresonanzsprektroskopie, namlich H1- NMR-und NOESY-Spektroskopie, untersucht (NOE = Nuklear Overhauser Effekt). Das H1- NMR-Spektrum des liposomal verkapselten 5-Fluorouracil (c = 50 mg/ml) zeigte neben dem H6-Proton des 5-FU bei 7. 5 ppm zwischen 2. 5 und 4. 0 ppm Signale der liposomalen PEG- Matrix. Im 1D-NOE-Spektrum (Selektive Anregung des H6-Protons bei 7. 5 ppm) ergab eine positive NOE-Resonanz bei 3. 5 ppm, was eine räumliche Nahe des Wirkstoffs zum Liposom, d. h. eine partielle Verkapselung des Wirkstoffs, bedeutet.

Die Wirkstoffe wurden jeweils in freier Form intravenös und intraarteriell sowie in verkapselter Form mit und ohne Starkemikrospharen (Spherex, Pharmacia Upjohn) i. a. zur Tumorbehandlung bei Lebertumoren verabreicht.

In dem antitumoralen System erfolgte das Tumortargeting durch liposomale Verkapselung der Zytostatika und Zusatz von Starkemikrosspharen. Die verwendeten SUV-PEG-

Liposomen haben eine Partikelgröße von 113 nm 25 nm, die Starkemikrospharen im Mittel 45 µm.

Die Wirkstoffkonzentrationen wurden im Tumor und in der Leber wurden gemessen in AUC (Area under the Curve). Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1 Leber Tumor Carboplatin (CPT) 147. 980 87. 950 erfindungsgemä# 50. 060 434. 200 verkapseltes CPT 5-Fluorouracil 27. 822 62. 655 (5-FU) erfindungsgemäß 35. 842 272. 886 verkapseltes 5-FU