Objet de l'invention

La présente invention repose sur la sensibilisa¬ tion des liposomes à des molécules antigéniques de para¬ sites intracellulaires et ouvre de ce fait des applica- tions nouvelles de tels liposomes sensibilisés, comme moyens de détection d'Ig (lytiques ou non lytiques) con¬ tre ces antigènes infectieux dans des sera ou- autres li¬ quides organiques (pleuraux, péritonéaux,,de lavage bron¬ choalvéolaire) et comme agents de vaccination capables de susciter une immunité (cellulaire, mais aussi humora¬ le) contre l'agent infectant.

A titre d'application particulière illustrée par la présente invention, on vise plus spécifiquement à fournir des moyens de diagnostic -et d'immunisation pour la tuberculose mais l'invention n'est bien entendu pas limitée à cette application, ainsi qu'il apparaîtra ci- après.

Résumé de l'état de la technique

De nombreux travaux ont été consacrés aux liposo¬ mes pour diverses applications pharmacologiques, notam¬ ment comme vecteurs de substances à activité médicamen¬ teuse. Des molécules antigéniques, naturelles ou hapté- niques, ont également été exposées à la surface de lipo¬ somes. Ces liposomes dits sensibilisés ont été utilisés soit pour la détection ' immunoglobulines dans les sera

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d'animaux immunisés soit comme adjuvants d'immunité sus¬ ceptibles d'augmenter l'immunisation humorale, mais aussi cellulaire.

Pour ce qui concerne la tuberculose, il existe des extraits protéiques purifiés de différentes Mycobac- teria et plus particulièrement de Mycobacterium tubercu- losis var. hominis (H37Rv) = PPD H37R.V = Tuberculine H37Rv- Les tuberculines sont capables de révéler une im¬ munité cellulaire préexistante chez un homme ou un ani- mal vacciné ou infecté (Intradermoreaction ou réaction d'hypersensibilité retardée), mais elle est incapable d'immuniser car elle n'est pas immunogène.

Eléments caractéristiques de 1 ' invention

L'invention porte spécifiquement à titre d'agents nouveaux pouvant servir aux fins précitées (immunoessai et vaccination) sur des liposomes sensibilisés à des mo¬ lécules antigéniques spécifiques de parasites intracel- lulaires.

Ces liposomes sont de préférence du type dit "multilamellaires" (MLV) avec ou sans cholestérol.

On accorde la préférence, selon l'invention, gé¬ néralement à des liposomes multilamellaires avec choles- térol présentant des rapports Egg Pc/Ch compris entre 4/1 et 4/4, ce dernier rapport ou des valeurs proches de celui-ci étant tout particulièrement préférés.

L'invention porte également sur des procédés de production de liposomes sensibilisés. Deux variantes opératoires s'offrent à cet effet:

Il est possible de procéder à une encapsulation directe de molécules antigéniques ou ^' de mettre en con¬ tact le liposome préformé avec ces molécules.

Les deux types de liposomes sensibilisés sont ca- pables de fixer des immunoglobulines dressées contre les molécules antigéniques.

On observe généralement dans le premier cas que plus d'immunoglobulines sont liées aux liposomes tandis

que les protéines incorporées par exposition à des vési¬ cules préformées présentent une affinité plus élevée pour les anticorps correspondants. Il en résulte que le type de sensibilisation des liposomes à un mélange d' im- munoglobulines correspond à des quantités variables de molécules antigéniques choisies et exposées à la surface des liposomes et à des différences dans l'exposition et l'affinité de ces antigènes.

L'administration répétée, sous-cutanée ou intra- péritonêale, des deux types de liposomes suscite l'appa¬ rition d'une réaction d'hypersensibilité retardée, té¬ moin d'une immunité de type cellulaire, chez le cobaye.

La liste des applications spécifiques relevant de l'invention figure ci-après dans le mémoire descriptif.

Description détaillée de mode opératoire en référence à l'application particulière du Mycobacterium tuberculosis

Méthode de sensibilisation des liposomes

1. Formation des liposomes

Concentration totale des lipides : 10 ou 20 mg/ml . Rapports molaires 1) Egg Pc (ou Egg Pc = 4/Ch = 0)

2) Egg Pc/Ch 4 : 1 4 : 2

^' 4 : 3 4 : 4 Formation des MLV dans NaCl 0,15 M (= Eau physiologique) stérile avec ou sans PPD. Deux méthodes de sensibilisation sont réalisées : a. Encapsulation directe de la PPD dans les liposo¬ mes. Les liposomes sont formés dans une solution de PPD à 0,75 mg/ml de NaCl 150 mM.

La préparation est laissée au repos pendant 30 min. à température ambiante.

Puis, 5 rinçages dans NaCl 150 mM. b. Mise en contact de liposomes préformés avec la PPD. Les MLV sont formés dans le NaCl 150 mM,

laissés au repos pend ⁴ ant 30 mm., centrifugés à

3500 g pendant 10 min., mis en contact pendant 30 min avec une solution de PPD à 0,75 mg/ml de NaCl 150 mM et rincés 5 fois dans le même solvant. 5

2. Radioimmunoessais utilisant des liposomes sensibili¬ sés

Des liposomes de différentes compositions et sen¬ sibilisés selon les deux méthodes sont exposés à un an- 0 tiserum de mouton dressé contre H37Rv, radioiodé et non marqué. La préparation et la radioiodation de cet an- tiserum, est décrite dans la demande de brevet de la De¬ manderesse déposée ce même jour pour : "Procédé de dé¬ tection rapide d'infections à germes intracellulaires, 5 en particulier de Mycobacterium tuberculosis ou de Myco- bacterium leprae et trousse convenant à cet effet" . Des courbes de compétition sont obtenues entre une quan¬ tité d'aπtisërum 125χ _e t différentes dilutions de 1'anti- sérum non marqué (de 1/10 à 1/10 000). La proportion de 0 molécules radioiodees fixées aux liposomes-PPD et la constante de dissociation des molécules sont mesurées. La composition liposomiale qui fixe le plus grand nombre de molécules radioiodees avec la plus grande affinité semble être Egg Pc/Ch 4 : 4 avec -encapsulation directe 5 de la PPD.

3 . Radioimmunoessais sur sera humains

Des compétitions ont été effectuées entre l ' antiserum de mouton radioiodé et différentes dilutions de sera humains (1/10 à 1/10 0O0) . Aucune compétition n'est observée pour les sera de patients θ non-tuberculeux. Par contre, 6 sera de patients tuberculeux contenaient des Ig entrant en compétition avec l 'antiserum- 125 I. La présence d' Ig dans les sera de ces patients a été confirmée par test ELISA. Idem pour l ' absence d' Ig dans les sera des patients non-tuberculeux . Liposomes utilisés dans cette étude: Egg -Pc/Ch 4 : 3; encapsulation directe de la 5 PPD ou exposition de la PPD à des liposomes préformés . Ce radio immuno- essai détecte des Ig dans les sera de patients tuberculeux, mais ne

- renseigne pas sur la nature de ces Ig.

4. Mise au point d'un immunoessai avec marqueur fluorescent = Essai de yse Immune des Liposomes .

Un marqueur fluorescent, la calcéine, a été incorporé dans les liposomes Egg Pc/Ch (4 : 3) sensibilisés à la PPD par en- capsulation directe. Tant qu'il est encapsulé, donc "quenché", ce marqueur ne fluoresce pas. Si le loposome est lysé, le marqueur est libéré dans le milieu d ' incubation et une fluo¬ rescence proportionnelle à l'importance de la lyse liposo- miale peut être mesurée. La lyse des liposomes a lieu si des IgG lytiques sont venues se fixer aux antigènes exposés par les. vésicules (ici, des antigènes extraits de la PPD ⁾ en présence de complément. Qualitativemen , cet immunoessai est le seul actuellement à détecter des Ig lytiques.

Les faux positifs sont exclus puisque la lyse liposomiale n'a lieu que si les Ig se sont fixées aux antigènes exposés par les vésicules . En outre, si le radioimmunoessai cité en 3) nécessite 20 mg^de lipides par point de compétition, l'essai de lyse immune avec la calcéine ne nécessite que 0,1 rng pour la même mesure.

Des liposomes constitués d ' Egg PC et Ch (4 : 3), renfermant de la calcéine et sensibilisés à la PPD selon les deux métho¬ des indiquées plus haut (encapsulation et mise en contact) , ont présenté une lyse immune (libération de calcéine et apparition d'une fluorescence mesurable dans le milieu) en présence de sérum de lapine anti-BCG (Da opatts) ou de sérum de mouton anti Mycobacterium tuberculosis et de complément provenant de sérum de lapin. Cette réaction n'a pas été observée ^' en présence d'un sérum connu comme ne présentant pas d'anticorps antimycobactériens ni en l'absence de complément.

Ces mêmes liposomes sensibilisés à la PPD ont été mis en contact avec des sera humains de patients tuberculeux et non-tuberculeux intradermo-négatif s . Les lyses mesu¬ rées ⁽ L.S. ⁾ après 30 minutes ont été comparées à celles trouvées pour des liposomes non sensibilisés à la PPD ni à aucun autre antigène protéique ( LNS ) . Pour chaque sérum, la différence entre les pourcentages L.S. et LNS .a été calculée ⁽ LILA ⁾ . Les résultats obtenus sont repris dans le tableau suivant .

M 30,4 11,8 18,7 6,6 3 3,6

±SD ±11 ±2,8 ±10 ±3,5 ±1,8 ±2,4

S = statistiquement significatif selon le test de student NS = statistiquement non significatif selon le test de student

De ces résultats, il ressort que la lyse immune des liposomes porteurs de PPD est significativement plus élevée dans les sera de tuberculeux que dans les sera de non-tuberculeux. De même, la lyse des liposomes non por- teurs de PPD est plus grande dans les sera tuberculeux, bien que significativement inférieure à celle des lipo¬ somes PPD. Le sérum des patients tuberculeux contient donc des anticorps dirigés contre les composants de la PPD, mais aussi des agents susceptibles de provoquer une lyse de liposomes mais PPD plus grande que chez les non- -tuberculeux. On peut donc affirmer que, par la présente invention on a élaboré un test de lyse immune de liposo¬ mes sansibilises à la PPD capable de mettre en évidence des anticorps antiseracobactériens dans le sérum de pa- tients tuberculeux. On peut noter également la rapidité de ce test (30 minutes).

Ce test permet .de diagnostiquer toutes les mala¬ dies infectieuses par mise en évidence d'anticorps séri- ques au moyen de liposomes porteurs d'antigènes du mi- croorganisme infectant.

5 . Test d ' immunoréactivité des liposomes in vivo .

On sait que les liposomes sensibilisés par des anti¬ gènes sont susceptibles de jouer un rôle dans les méca¬ nismes cellulaires de l ' immunité in vivo , soit en imitant l ' agent infectieux (bicouche de phosholipide porteuse de molécules immunogènes de cet agent ) et en étant captés par l es macrophages locaux de l 'hôte infecté, soit en imitant ces macrophages qui auraient "processé" l ' agent infectieux et qui au¬ raient exposé certaines de ses molécules antigéniques à leur sur- ace . Dans les deux cas , les molécules antigéniques par lesquelles le liposome a été sensibilisé sont présentées aux lymphocytes , re¬ connues par des récepteurs et les mécanismes d'immunité cellulaire et humorale peuvent être stimulés . A ce titre, le liposome sensibi¬ lisé peut constituer le véhicule d'un nouveau type de vaccination, car il représente un modèle quasi naturel de présentation de molé¬ cules antigéniques au système immunitaire .

Si cette hypothèse est correcte, le liposome-PPD doit pouvoir in¬ duire une réaction positive d'hypersensibilité retardée (intradermo¬ reaction positive) chez des animaux préalablement sensibilisés par le B.C.G.

On a donc injecté dans le derme des liposomes sensibilisés à la PPD (Egg Pc sensibilisés par encapsulation directe de la PPD oupar préformation suivie de mise en contact; EggPc/Ch, 4: 3, sensibilisés selon les deux mêmes méthodes) àdescobayesimmunisés . Les 4 types de liposomes provoquent uneintradermoreactiondont l'intensité et l'é¬ volution sont différentes de celles de la PPD non encapsulée (Voir à ce propos, le projet d'article "Immunological activity of tuber¬ culin sensitized liposomes", notamment p.7 etFig.l t 2, pour les liposomes Egg Pc) . Parcontre, les liposomes non porteurs d'antigè- nés de PPD ne suscitent pas d'intradermoreaction positive chez les mêmes animaux (Ide , Fig.1) .

On peut conclure que les liposomes-PPD déposés dans le derme sont phagocytés par les macrophages et que les antigènes dont ces liposomes étaient porteurssont ensuite présentés à et appellentdes lymphocytes sensibilisés, suscitant ainsi 1'apparition de 1'éry- thème et de 1'induration caractéristiques de 1'intradermoreaction oositive.

FEUILLE DE REMPLACEMENT

Cette conclusion permet donc l'utilisation du liposome comme véhicule de vaccination.

6. Apparition d'une immunité cellulaire chez le cobaye sous l'effet de liposomes-PPD 5 Des cobayes non infectés et non sensibilisés par la mycobacterie tuberculeuse (Intradermoreaction négative à la PPD) ont reçu 3 in¬ jections bihebdomadaires de liposomes-PPD, soit sous la peau, soit dans la cavité péritonéale (liposomes Egg Pc en Egg Pc/Ch, 4: 3, for¬ més dans les deux conditions décrites plus haut, voir 1) . Deux se- 0 maines après la dernière injection (ou 6 semaines après lapremière), une intradermoreaction a été pratiquée, avecde la PPD seule, avec des liposomes-PPD, ouavec des liposomes. ^' Tout comme des cobayes qui auraient préalablement été sensibilisés par la mycobacterie (vacci¬ nation au B.C.G. ,parex.), ces animaux présentent une intradermoréac- 5 tion positive à la PPDouauxliposomes-PPD, mais pas aux liposomes non porteurs de PPD. Ces expériences indiquent que les liposomes sensibilisés à la PPD induisent une défense de type immunité cellu¬ laire chez les cobayes. Rappelons que la PPD seule est incapablede susciter la moindre apparition d'une immunité chez un animal (ouun o homme)quin'a pas été préalablementmis encontactaveclamycobacterie. On peut donc estimer que le liposome-PPD constitue un agent de vaccination plus sûr que l'actuel vaccin B.C.G.oùdesmycobactéries atténuées sont administrées, carle liposome-PPD ne comporte que des lipides (EggPc,Ch) et des protéines extraites de Mycobactéries, à 5 l'exclusion de toute mycobacterie et de son matériel génétique. La technique peut s'appliquer autant à la "Old Tuberculin",qui compte les protéines de la bactérie ainsi que ses polysaccharideset glycolipidesdesurfacedontle caractère d'immunogénicité généraleet aspécifique est bien connu,qu'à des molécules antigéniques spécifi- 0 ques de Mycobacterium tuberculosrs .Unliposome sensibilisé à la'Old Tuberculin" imite donc au mieux la bicouche phospholipidique de la membrane mycobactérienne portant les protéines, lespolysaccharides et les lipides de cet agent infectieux intracellulaire. En susci¬ tant une réaction portant sur 1'immunité cellulaire, on dispose 5 ainsi d'un vaccin efficace contre le parasite intracellulairequ'est Mycobacterium tuberculosis .

D'autre part, on sait que le Mycobacterium leprae (lèpre) est très semblable à M.tuberculosis . Il existe une lépro ine, semblable

dans sa composition à la Old Tuberculin. La formation de liposomes- lépromine convient comme moyen d'immunisation contre la lèpre, ma¬ ladie pour laquelle il n'existe,à ce jour, aucun vaccin efficace. La technique de 1'invention trouve également son application comme procédé de vaccination pour les affections résultant des pa¬ rasites intracellulaires repris dans le Tableau I annexé :

I. Mycoses

1. Cryptococcus neoformans : Cryptococcose

- germe opportuniste - porte d'entrée pulmonaire chez l'immunodeprimé avec généralisa¬ tion dans 90 % des cas-méningite grave

2. Candida albicans (essentiellement) : Candidose

- germe surtout opportuniste : patients diabétiques, traités aux corticoïdes, par des antibiotiques à large spectre - atteinte d'abord cutanée ou muqueuse(peau,bouche,oesophage,va¬ gin,tractus respiratoire) ; disséminationpossible au niveau sys- témique (localisationspréférentielles: reins,yeux,méninges, peau et myocarde)

3. Histoplasma capsulatum : Histoplasmose (USA) - atteinte pulmonaire avec signes généraux importants ^"

- dissémination systémique possible

4. Coccidioïdes immitis : Coccidioidomycose

- atteinte pulmonaire (kyste - abcès )

II. Bactéries 5. Salmonella : Salmonellose

-gastroentérite,atteintes secondaires : ostéomyélite,anévrysme

6. Listeria monocytogenes : Listériose

-septicémie-méningite, affectiongravechezles immunodéprimés

7. Brucella (suis, melitensis, abortus) : Brucellose -maladie granulo ateuse chronique généralisée (rate, os..)

8. Francisella tularensis : Tularémie

-porte d'entrée cutanée ou pulmonaire, abcédation locale, adéno- pathies régionales III.Chlamydiae 9.Chlamydiae (Bedsoniae) Psittacose

- Pneumonie (rarement hépatite, encéphalite)

IV . Rickettsiae

10. Rickettsiae ( pro azekii ... ) Rickettsiose - température , céphalées , rash

11. Coxiella burnetii Fièvre Q ^' - température, fièvre, pneumonie, hépatite

V . Mycobacterioses

12. Mycobacteria : - tuberculosis , bovis : tuberculose

- leprae : lèpre

Dans tous les cas , il convient dé noter que le même liposome sensibilisé par les antigènes d'un parasite donné peut servir tant à la vaccination qu ' à la détection d ' Ig ( lytiques ou non lytiques ) dans le sérum humain .

7. Vaccin et diagnostic pour le SIDA

L' encapsulation d 'un extrait de virus de SIDA (HTLV3) peut se faire au moyen d ' octylglucoside . Le mode de pré¬ paration ci-après est donné à simple titre d'exemple non limitatif .

La préparation des liposomes est effectuée ici en deux temps : a) préparation de liposomes monolamellaires par la mé¬ thode d'injection, b ⁾ fixation dans la bicouche liposomiale de l'extrait d'HTLV3 par ses molécules à composante hydrophobe après formation d'un complexe glycoprotéine - déter- gent et "f luidif ication" des liposomes, a ) Préparation des liposomes

Les lipides sont solubilisés dans 1 ' octylglucoside ⁽ octyl-# -D-glucopyranoside ) à 20°C, dans un tampon tris-HCl pH=7,2 contenant 100 mM d 'octylglucoside afin d'obtenir les concentrations suivantes :

1, 5 ju /ml Chol . 21 uM/rnl Egg Pc. On mélange ensuite 0,375 uM de cholestérol et 3 m d ' Egg Pc. Le tout est ensuite injecté doucement dans 3 ml de tampon phosphate ( TP ) pH=7,4 (NaCl=0,137 M,

KC1=8,7 mM, KH ₂ P0 ₄ =1,47 mM, Na ₂ HP0 ₄ =8,l m ) refroidi à 4°C, puis dialyse contre le même tampon ( TP ) . Les

liposomes sont ensuite séparés des liquides planaires par filtration sur une colonne Sephadex-G75 préala¬ blement équilibrée avec le tampon (TP) . - Fixation de l'extrait d'HTLV34 sur les liposomes L'HTLV3 a été extrait par 1 'octylglucoside (concen¬ tration finale 7,5 mM) . Les liposomes sont fluidifiés par 1 'octylglucoside 1 mM . Les deux solutions sont ensuite mélangées dans des proportions de 500 ug d'extrait dé HTLV3/ιM de lipides. Cela signifie que 0,375 um de lipides sont ajoutés à 137 ug d'extrait d 'HTLVS.

Le complexe extrait-détergent et les liposomes flui¬ difiés sont dialyses, d'abord contre un gradient de concentration décroissante en octylglucoside (de 7,5 à 0 M) pour former des liposomes porteurs de molé¬ cules d'HTL 3, puis contre le tampon (TP) contenant 1 mM de NaN.,.

Les liposomes ainsi obtenus, sensibilisés à des molé¬ cules extraites du virus du SIDA, ont été injectés I.V. à des souris. Après 3 injections de cette pré¬ paration, effectuées à 3 semaines d'intervalle, la présence d'anticorps anti-HTLV3 a été mise en évi¬ dence dans leur sérum . On peut en conclure que cette technique constitue un moyen de vaccination anti-SIDA et de diagnostic de cette maladie, tout comme dans le cas de la tuberculose.

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