BIOFERTILIZANTE LÍQUIDO QUE COMPRENDE CEPAS DE AZOSPIRILLUM BR ASILENSE PANTOEA DISPERSA Y MÉTODO DE OBTENCIÓN DEL MISMO

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere a un producto para la fertilización biológica consistente en una formulación líquida que contiene dos cepas de bacterias de los géneros Azospiríllum y Pantoea, con capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar fosfatos así como otros nutrientes minerales del suelo y producir cantidades elevadas de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal. Dichos microorganismos han sido formulados en forma líquida, lo que garantiza una fácil aplicación y una elevada estabilidad en la viabilidad celular y proporciona nutrientes orgánicos y minerales suficientes para facilitar la colonización de las raíces de las plantas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El uso de fertilizantes resulta imprescindible para el mantenimiento de altos rendimientos en las cosechas. Mediante la fertilización química, son añadidas al suelo cantidades importantes de nitrógeno, fósforo y potasio, así como otros elementos minerales, sin embargo, las disponibilidades de éstos son muy bajas, ya que una fracción queda inmovilizada en el suelo formando compuestos insolubles no asimilables por las plantas y otra es lavada mediante un proceso de lixiviación, lo cual además de pérdidas económicas, genera un importante problema de contaminación ambiental.

En el caso del fósforo, en particular, una parte importante de los fosfatos solubles añadidos es insolubilizada por el hierro y el aluminio en los suelos ácidos y por el calcio en los suelos calcáreos, convirtiéndose progresivamente en formas menos asimilables. Como resultado de los diversos mecanismos de retención, la mayor parte del fósforo aplicado mediante la fertilización no puede ser utilizada por las cosechas y es retenida en el suelo en forma insoluble. Dado este fenómeno y la aplicación cíclica de fertilizantes, la concentración de fósforo en el suelo ha aumentado notablemente, por lo que en muchos suelos podrían establecerse cosechas a largo plazo si estas reservas pudieran ser explotadas económicamente. La adición de fertilizantes inorgánicos en exceso también puede llevar a problemas ambientales como la contaminación de las aguas subterráneas y la eutrofización de las vías navegables. Por lo tanto, es de gran interés investigar estrategias de manejo que sean capaces de mejorar la eficiencia de la fertilización con fósforo, aumentar los rendimientos de los cultivos y reducir la contaminación ambiental causada por la pérdida de fósforo del suelo (Alori y col., 2017).

Es bien conocida la importancia que tienen los microorganismos en el ciclo de los nutrientes en el suelo y su papel en la nutrición de las plantas. Su participación activa en la descomposición y mineralización de la materia orgánica, así como en la fijación y liberación de nutrientes del suelo, es crucial para el mantenimiento de la productividad de las plantas. Las interacciones que se establecen entre los microorganismos del suelo y las raíces de las plantas satisfacen importantes requerimientos nutricionales para ambos. Las raíces están directamente influidas por la composición y densidad de la comunidad microbiana que en ellas se desarrolla, conociéndose esto como “Efecto Rizosfera”, que depende particularmente de la planta y su madurez fisiológica. La práctica de la inoculación de plantas con microorganismos es bien conocida en el estado de la técnica (Vessey 2003).

En la naturaleza son numerosos los microorganismos de la rizosfera capaces de liberar el fósforo del suelo mediante la solubilización y la mineralización (Bhattacharyya y Jha, 2012). Este grupo de microorganismos se conoce como microorganismos solubilizadores de fósforo (PSM). Muchas especies de hongos y bacterias del suelo pueden solubilizar el fósforo in vitro y algunas de ellas aumentan la biodisponibilidad del fósforo insoluble en el suelo para uso por parte de las plantas (Zhu y col., 201 1 ). Solubilizan el fósforo (mineral) inorgánico insoluble y mineralizan el fósforo orgánico insoluble (Sharma y col., 2013).

Un grupo de microorganismos que tiene una notable importancia en este fenómeno es aquel que participa en la solubilización del fósforo de fuentes que de otra forma serían inaccesibles para las plantas.

Los microorganismos solubilizadores de fosfato han sido aislados en prácticamente todos los suelos ensayados, aunque el número y proporción de éstos varía de acuerdo con el tipo de suelo, el clima y otros factores tales como la evolución histórica del suelo. Muchos microorganismos son capaces de asimilar el fósforo insoluble del suelo, liberando una parte de éste en forma de fosfatos solubles que a su vez pueden ser utilizados por las plantas, contribuyendo de esta forma a la nutrición vegetal. En general es aceptado que la solubilización de fosfatos en el suelo es debida a la producción de ácidos orgánicos y oxo ácidos quelantes, a partir de azúcares (Seshachala y Tallapragada, 2012). Se han descrito procedimientos en los que se han empleado microorganismos solubilizadores de fosfatos en la fertilización (Yu y col., 201 1 ).

Los métodos utilizados en el aislamiento de los microorganismos solubilizadores de fosfato se basan fundamentalmente en el empleo de sales inorgánicas insolubles de fósforo, tales como el hidroxiapatito y el fosfato tricálcico, en medios de cultivo agarizados. Para la utilización de dichas sales, el microorganismo produce ácidos orgánicos que, al difundir en el medio, provocan una disminución del pH y como consecuencia la formación de un halo de transparencia en las proximidades de la colonia. Sin embargo, se ha señalado que los medios de cultivo agarizados no siempre detectan a los microorganismos más aptos para la solubilización de fosfatos, se ha planteado como alternativa un esquema y selección de este tipo de microorganismos utilizando cultivos líquidos agitados como alternativa, destacando la importancia de determinados componentes del medio y su concentración en los resultados alcanzados y proponiendo un medio de cultivo para llevar a cabo la selección (Nautiyal 1999). Otros autores, trabajando con medios agarizados, concluyeron que la capacidad amortiguadora de pH del medio de cultivo utilizado en el aislamiento tiene una importancia determinante en la selección de cepas que produzcan cantidades suficientes de ácidos orgánicos para que presenten un interés real en la biofertilización, describieron que el ácido glucónico es el principal componente de los ácidos orgánicos producidos por Enterobacter asburiae y que la enzima glucosa deshidrogenasa, responsable de la producción del ácido glucónico, es regulada por inanición de fosfatos, es decir, que las bajas concentraciones de fosfatos solubles estimulan la producción de ácidos en este tipo de microorganismo (Gyaneshwar y col., 1999).

Los géneros Enterobacter y Pantoea han sido utilizados en la agricultura como solubilizadores de fosfato y para la protección contra enfermedades de las plantas (Beltrán- Pineda, 2014). Pantoea dispersa es una especie con genes que codifican la enzima para la destoxificación de la albicidina. Dichos genes y enzima han sido empleados para la obtención de plantas transgénicas resistentes a las enfermedades producidas por hongos, lo que demuestra su capacidad para proteger contra enfermedades de plantas de origen fúngico. Existen diferentes documentos del estado de la técnica que señalan a Pantoea dispersa como una especie solubilizadora de fosfatos (Fernández y col., 2008).

Otro aspecto que en la práctica ocupa un lugar muy importante es el empleo de los microorganismos de la rizosfera fijadores de nitrógeno atmosférico. Numerosos microorganismos han sido utilizados para esta función entre los que se encuentran bacterias de géneros tales como Rhizobium, Azotobacter y Azospirillum y hongos de los géneros Saccharomyces, Hansenula y Aspergillus, entre otros.

El nitrógeno es un elemento abundante, que compone casi el 80% de la atmósfera terrestre y una parte nutritiva muy escasa. La paradoja se resuelve fácilmente: el nitrógeno atmosférico es inerte y no pueden aprovecharlo la mayoría de los organismos, pudiendo solamente ser incorporado en la síntesis biológica cuando ha sido "fijado" o combinado con ciertos elementos como el hidrógeno o el oxígeno. Las bacterias son capaces de fijar 1 ,5 x 10 ⁸ toneladas métricas por año, una parte importante de la cual es sintetizada mediante el proceso de Haber-Bosch.

Experimentos realizados en Brasil determinaron la significativa contribución del N ₂ fijado para las plantas por diferentes microorganismos, encontrándose Azospirillum entre los géneros principales. Estudios posteriores de cuantificación de la fijación biológica del nitrógeno (FBN) en caña de azúcar en este mismo país demostraron que, prácticamente el 65% del total del N ₂ acumulado fue derivado de la FBN, lo que representa alrededor de 150 kg N ₂ x ha 1 x año ¹ , lo que condujo a la recomendación de reducir al mínimo el uso de los fertilizantes nitrogenados.

Es sabido que diferentes especies de plantas producen diversos efectos sobre la rizosfera, siendo también conocido que las cepas aisladas en un tipo de especie vegetal, tiene un efecto totalmente distinto sobre la rizosfera de la cual fue aislada con respecto a otros cultivos. Sin embargo, Azospirillum brasiiense es capaz de colonizar plantas de diferentes especies adhiriéndose a las raíces. Existen trabajos que han demostrado la ubicuidad del género Azospirillum llevando a cabo su aislamiento en cultivos variados, así como en regiones con climas muy disímiles (Fukami y col., 2016).

Se ha descrito que al inocular diferentes cultivos de plantas con especies del género Azospirillum aparecían cambios en la morfología de las raíces y se ha determinado que, en las primeras tres semanas después de la germinación, el número de pelos radicales y ramas de las raíces aumenta con la inoculación, lo cual produce un aumento de la superficie de absorción de las raíces.

En estudios de inoculación de plantas de trigo con Azospirillum brasiiense, se ha observado que en la superficie de las raíces inoculadas se formaban pequeños agregados celulares, y al hacer cortes, se ha encontrado que algunas bacterias penetraban las células jóvenes de las raíces, pero existían muchas más en los espacios intercelulares, así como en las capas epidémicas de las células. Se ha encontrado, a su vez, que la adsorción de esta bacteria a las raíces es débil y se realiza mediante procesos de metabolismo dependientes de las bacterias, mediados por factores de reconocimiento. También se ha descrito la capacidad de esta especie de trasladarse en el suelo para colonizar las raíces de las plantas y la capacidad de colonizar además de cereales, diferentes cultivos, produciendo sobre las raíces de éstos, cambios morfológicos análogos a los ocurridos en la familia Graminaceae.

El principal elemento involucrado en la relación Azospiríllum-p\aa\a no es únicamente el nitrógeno, también el fósforo y el potasio juegan un papel fundamental en esta relación. Dependiendo de la cepa utilizada, existe un cambio cuantitativo en la toma de los minerales por la planta, aumentado significativamente algunas cosechas. Según la "teoría de los múltiples mecanismos", la bacteria actúa con un patrón de efectos acumulativos o secuenciales, como resultado de los mecanismos que ocurren de manera simultánea o consecutiva (Bashan y De-Bashan 2010).

En la actualidad es muy común el uso de este género en la producción de fertilizantes biológicos.

Hay que destacar que muchos autores coinciden en señalar que los efectos beneficiosos producidos por la inoculación con microorganismos sobre el crecimiento vegetal no son solo debidos a la solubilización de fosfatos o a la fijación biológica del nitrógeno. Existen mecanismos tales como la producción de fitohormonas y sideróforos o la actividad de la enzima 1 -aminociclopropano 1 -carboxilato desaminasa entre otros, que contribuyen notablemente en este efecto (Fukami y col., 2018).

Entre las relaciones microbianas que tienen lugar en la rizosfera se encuentran las llamadas de cooperación que son las que se establecen entre aquellos grupos microbianos que llevan a cabo metabolismos complementarios, puede ser este el caso de algunas bacterias solubilizadoras de fosfatos que excretan al medio ácidos orgánicos los que a su vez constituyen la fuente principal de carbono en algunos géneros de las bacterias nitrofijadoras, permitiendo esto la convivencia de ambos grupos, a la vez de un doble efecto en el mejoramiento de los cultivos y en la protección contra enfermedades.

El desarrollo asociativo de los géneros Azospiríllum y Pantoea ha sido llevado a cabo exitosamente en la fijación biológica de nitrógeno, demostrándose que no existen incompatibilidades entre ambos géneros y que al mostrar diferencias en los mecanismos de regulación metabólica pueden realizar diferentes funciones en un ecosistema dado (Flores y col., 2010; Del Amor y Cuadra, 201 1 ; Schoebitz y col., 2014; Mengual y col., 2014). Los cultivos mixtos de microorganismos del suelo, con diferentes capacidades metabólicas pueden desarrollar relaciones de cooperación entre sí y con las plantas que hacen más eficiente la adsorción de nutrientes por éstas y además pueden producir sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, aumentando la productividad de las cosechas y protegiéndolas contra los microorganismos patógenos.

La práctica de inocular plantas con microorganismos utilizando cultivos mixtos (llamados también consorcios) que potencien fenómenos tales como el incremento de la eficiencia de la absorción del fósforo por las raíces, la fijación biológica del nitrógeno, la estimulación del crecimiento vegetal por la producción de sustancias reguladoras del crecimiento vegetal, así como sideróforos y la protección contra enfermedades producidas por microorganismos patógenos entre otros se ha revelado como la más efectiva en la biofertilización (Nuti y Giovannetti, 2015).

La forma física de un biofertilizante es un factor determinante en el resultado práctico que proporciona dicho biofertilizante. La viabilidad de los organismos presentes en un biofertilizante durante la producción, formulación, almacenamiento, transporte/distribución y aplicación en el campo está directamente relacionada con el potencial de crecimiento de las plantas. Esto limita su uso debido a problemas de compatibilidad, estabilidad y supervivencia en diferentes condiciones del suelo. Por lo tanto, una vida útil mejorada podría ser la clave para una mayor generalización de la aplicación de biofertilizantes (Brar y col., 2012).

En un fertilizante biológico, los microorganismos deben permanecer viables, en estado latente o metabólicamente activos. Este factor tiene dos aspectos determinantes, la durabilidad del producto y la capacidad de éste para colonizar las raíces de los cultivos que se quiere estimular o proteger, una vez aplicado en el campo. El empleo de preparaciones de células libres es una práctica común en la biotecnología agrícola y resulta muy efectiva cuando se trabaja con microorganismos capaces de formar estructuras de resistencia, como en el caso de bacterias del género Bacillus. Este problema tiene otro carácter cuando se trata de células que no tienen la capacidad de formar estructuras de resistencia, ya que los cultivos van perdiendo viabilidad con el tiempo y además su capacidad de supervivencia en el suelo es muy baja. Muchos de los fracasos que se han producido en el campo de la biofertilización y la bioprotección están relacionados con este fenómeno. La inoculación de suelos con microorganismos capaces de favorecer la productividad de las plantas es un proceso muy complejo en el cual pueden tener un efecto determinante toda una serie de factores. Por esta razón, es imprescindible que el fertilizante biológico sea capaz de preservar la viabilidad celular en condiciones adversas durante largos periodos de tiempo y garantizar en la medida de lo posible la capacidad de colonización de las raíces una vez aplicado en el campo. Uno de los criterios más importante a tener en cuenta para esto es lograr preparados de fertilizantes biológicos que liberen un número apreciable de células viables consistentemente (Pindi y Satyanarayana, 2012).

En la práctica común, para una mejor vida útil de la formulación del biofertilizante, un portador o una mezcla de tales materiales portadores se seleccionan basándose en la viabilidad de los microorganismos mezclados con ellos. De manera similar, su enriquecimiento con nutrientes es la otra estrategia para mejorar la vida útil al permitir que el microorganismo se mantenga y crezca en un microentorno no competitivo (Yardin y col., 2000).

El documento ES2234417A1 describe un fertilizante biológico que comprende cepas bacterianas de Azospiríllum brasilense y Pantoea dispersa inmovilizadas en un soporte sólido. En concreto, dicho documento describe la cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 y la cepa Pantoea dispersa CECT 5801.

El documento W02009027544A1 describe un fertilizante biológico que comprende un soporte sólido en el que se han inmovilizado las cepas bacterianas Azospiríllum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801 y, adicionalmente, ácido indol-3-acético o un promotor del ácido indol-3-acético.

El cambio de un biofertilizante que comprende microorganismos inmovilizados en un soporte sólido a un biofertilizante en forma líquida está asociado a una reducción significativa en la viabilidad de dichos microorganismos y a una disminución del periodo en el que el producto permanece viable manteniendo la eficacia. La vida útil de un biofertilizante líquido constituye una importante preocupación (Brar y col., 2012).

Sin embargo, los biofertilizantes líquidos tienen ventajas frente a los biofertilizantes en los que los microorganismos contenidos en los mismos están inmovilizados en un soporte sólido, como son las mejoras en el modo de aplicación, pudiéndose aplicar por riego por goteo, pulverización o por medios aéreos. No es posible aplicar biofertilizantes inmovilizados en un soporte sólido por riego por goteo o por pulverización líquida. Es más, los biofertilizantes líquidos permiten su aplicación a otras partes de las plantas distintas de las raíces, al poder pulverizarse sobre las partes aéreas de las plantas (tallos, hojas, frutos, flores, etc.). A diferencia de los biofertilizantes basados en portadores sólidos, las formulaciones líquidas permiten incluir una cantidad suficiente de nutrientes, protectores celulares e inductores de la formación de células para garantizar una vida útil prolongada.

Para que la obtención de un biofertilizante resulte atractiva desde el punto de vista económico, es necesario realizar una selección adecuada del medio en que se va a llevar a cabo su producción. Para esto resulta esencial seleccionar cuidadosamente las materias primas y materiales a utilizar, de manera que se minimicen los costes. Para este fin, es necesario que las materias primas y su concentración en el medio de fermentación permitan obtener una elevada concentración celular o del producto deseado a un coste mínimo. Los productos de origen natural son muy apropiados para este fin, dado su bajo coste y su inocuidad para el medio ambiente. Éstos pueden tener como ventaja adicional, estimular efectos deseados si son incluidos en el preparado final. Los concentrados de tomate han sido utilizados en la producción de giberelinas, como fuente de nitrógeno y como fuente de carbono para el crecimiento y la producción de metabolitos de origen microbiano debido a su elevado contenido en carbono orgánico. Por otra parte, el hidrolizado de colágeno de uso en la agricultura es una fuente de nitrógeno orgánico muy adecuada y barata, incluso para microorganismos incapaces de producir enzimas proteolíticas. La combinación de estas dos fuentes ofrece un medio de cultivo universal, de muy bajo coste y por tanto muy atractivo para la realización de procesos fermentativos a gran escala. Además, su origen natural permite una agricultura más ecológica que la sociedad actual demanda.

De todo lo expuesto anteriormente, se deriva el interés que suscita el desarrollo de un biofertilizante líquido que comprenda cepas bacterianas, en el que dichas cepas bacterianas mantengan su viabilidad durante un tiempo prolongado manteniendo su eficacia, obteniendo así las ventajas, anteriormente mencionadas, que aportan los biofertilizantes líquidos frente a los biofertilizantes inmovilizados en soportes sólidos.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

El objeto de la invención es un producto para la fertilización biológica consistente en una formulación líquida que contiene dos cepas de bacterias de los géneros Azospiríllum y Pantoea, con capacidad de fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar fosfatos así como otros nutrientes minerales del suelo y producir cantidades elevadas de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal. Dichos microorganismos han sido formulados en forma líquida, lo cual garantiza una fácil aplicación y una elevada estabilidad en la viabilidad celular y proporciona nutrientes orgánicos y minerales suficientes para facilitar la colonización de las raíces de las plantas. También es objeto de invención un método de estimulación del crecimiento de una planta, que comprende aplicar el biofertilizante líquido de la invención a dicha planta, un método de obtención del biofertilizante líquido de la invención y un biofertilizante líquido obtenible según dicho método de obtención.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un biofertilizante líquido que comprende una cepa de Azospiríllum brasilense depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 5802, una cepa de Pantoea dispersa depositada en la CECT con número de depósito CECT 5801 , al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza.

La presente invención se diferencia del estado de la técnica en que es un biofertilizante formulado en forma líquida, preferiblemente en un medio acuoso adecuado para mantener la viabilidad de las cepas del biofertilizante, manteniendo entre un 60% y un 70% de viabilidad celular de ambas cepas al cabo de un año de conservación, a temperaturas no mayores de 30 ^e C.

Dicho medio acuoso adecuado es responsable del mantenimiento de la viabilidad de las cepas en la formulación líquida. Sin dicho medio acuoso adecuado, las cepas perderían su viabilidad en muy poco tiempo.

La presente invención proporciona dicho medio acuoso adecuado para el mantenimiento de las cepas en el biofertilizante líquido. Dicho medio líquido debe comprender al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza para mantener la viabilidad de las cepas del biofertilizante un tiempo prolongado. Dicho medio líquido puede comprender agentes reguladores del pH y uno o más agentes antiespumantes.

La dosis de aplicación se reduce significativamente en el biofertilizante líquido de la invención, que comprende las cepas bacterianas Azospiríllum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801 , respecto a un biofertilizante que comprende las mismas cepas, inmovilizadas en un soporte sólido, debido a que dicho biofertilizante líquido puede poner a disposición de las plantas las bacterias de forma más rápida que en forma de inmovilizado en un soporte sólido. Esta reducción en la dosis es de aproximadamente 20 veces, pasando de una aplicación de biofertilizante inmovilizado en un soporte sólido de 300 kg/ha a una aplicación de dicho biofertilizante líquido de 15 L/ha. Adicionalmente, las cepas bacterianas presentes en el biofertilizante líquido de la invención permanecen viables, en dicho biofertilizante líquido, al menos durante un año manteniendo su eficacia.

El problema técnico complejo a resolver consistiría, por tanto, en proporcionar un biofertilizante que comprende cepas bacterianas, formulado en forma líquida, que permita su aplicación en plantas con una dosis reducida y en el que dichas cepas bacterianas permanecen viables al menos durante un año, manteniendo su eficacia.

La presente invención, definida por el objeto de las reivindicaciones, proporciona una solución a dicho problema técnico.

Las ventajas de dicho biofertilizante líquido sobre los biofertilizantes inmovilizados en un soporte sólido se basan en la propia forma de formulación líquida. Dicho biofertilizante líquido, al tratarse de un producto líquido donde las bacterias permanecen viables al menos durante un año, favorece el modo de aplicación del mismo, pudiéndose aplicar por riego por goteo, pulverización o por medios aéreos. La aplicación por riego por goteo y pulverización líquida no es posible con biofertilizantes inmovilizados en un soporte sólido.

En una realización preferida, dicho biofertilizante es una suspensión acuosa.

En otra realización preferida, dicho biofertilizante tiene un pH entre 6 y 8. Para ello se utilizan agentes reguladores de pH adecuados.

En otra realización preferida, dicho biofertilizante comprende además al menos un agente regulador del pH y al menos un agente antiespumante. Aún más preferiblemente, dicho biofertilizante comprende los agentes reguladores del pH ácido málico y KOH. Aún más preferiblemente, dicho agente antiespumante es polipropilenglicol.

En una realización más preferida, dicha sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste en (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , K ₂ HP0 ₄ , ZnS0 ₄ , MnS0 ₄ , CuS0 ₄ , MgS0 ₄ y CaCI ₂ . En una realización aún más preferida, dicho biofertilizante comprende las sales inorgánicas (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , K ₂ HP0 ₄ , ZnS0 ₄ , MnS0 ₄ , CuS0 ₄ , MgS0 ₄ y CaCI ₂ .

Las sales inorgánicas y el concentrado soluble de melaza son ingredientes utilizados como fuentes de nutrientes en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención, necesarios para mantener la viabilidad de los microorganismos presentes en el biofertilizante.

En otra realización preferida, dichos agentes reguladores del pH son ácido málico y KOH.

En otra realización preferida, dicho biofertilizante de la invención comprende (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , K ₂ HP0 ₄ , ZnS0 ₄ , MnS0 ₄ , CuS0 ₄ , MgS0 ₄ , CaCI ₂ , concentrado soluble de melaza, ácido málico, KOH y polipropilenglicol. Más preferiblemente, dicho biofertilizante de la invención comprende (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 0,5-3, 5% (p/p), K ₂ HP0 ₄ 0,1 -1% (p/p), ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 0,005-0,1 % (p/p), MnS0 ₄ -H ₂ 0 0,005-0,1 % (p/p), CuS0 ₄ -5H ₂ 0 0,001 -0,01% (p/p), MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0,001 -0,01% (p/p), CaCI ₂ -2H ₂ 0 0,001 -0,01% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,05-2% (p/p), ácido málico 0,01 -0,1 % (p/p), KOH 0,005-1% (p/p) y polipropilenglicol 0,001 -0,1 % (p/p). Aún más preferiblemente, dicho biofertilizante de la invención comprende (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 1 ,5-2,5% (p/p), K ₂ HP0 ₄ 0,18-0,20% (p/p), ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 0,01 -0,02% (p/p), MnS0 ₄ -H ₂ 0 0,01 -0,02% (p/p), CUS0 ₄ -5H ₂ 0 0,001 -0,002% (p/p), MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0,003-0,004% (p/p), CaCI ₂ -2H ₂ 0 0,001 - 0,002% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,25-0,75% (p/p), ácido málico 0,035-0,045% (p/p), KOH 0,02-0,1% (p/p) y polipropilenglicol 0,005-0,01% (p/p).

En otra realización preferida, dicho biofertilizante comprende además KH ₂ P0 ₄ y/o NH ₄ CI.

En otra realización preferida, dicho biofertilizante comprende además uno o más ingredientes seleccionados del grupo que consiste en pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. En otra realización aún más preferida, dicho biofertilizante comprende pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura.

La pasta de tomate es un producto natural utilizado como fuente de carbono en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención.

El hidrolizado de colágeno es un producto natural utilizado como fuente de nitrógeno en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención. El extracto de levadura natural es un producto natural rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento. Es utilizado como fuente de nutrientes en el medio de cultivo líquido en el que crecen las cepas de la invención.

En otra realización preferida, dicho biofertilizante además comprende KH ₂ P0 ₄ , NH ₄ CI, pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. Más preferiblemente, dicho biofertilizante comprende KH ₂ P0 ₄ 0,05-0,3% (p/p), NH ₄ CI 0,01 -2% (p/p), pasta de tomate 0,5-3% (p/p), hidrolizado de colágeno 0,01 -2% (p/p) y extracto de levadura 0,01 -2% (p/p).

La presente invención se refiere también a un método de estimulación del crecimiento de una planta, que comprende aplicar dicho biofertilizante líquido a dicha planta.

En una realización preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, la aplicación de dicho biofertilizante líquido se selecciona del grupo que consiste en fertirrigación, pulverización y riego por goteo.

En otra realización preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, la dosis de aplicación de dicho biofertilizante líquido es entre 5 y 30 L/ha. En una realización más preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, dicha dosis de aplicación es entre 10 y 20 L/ha.

En otra realización preferida de dicho método de estimulación del crecimiento de una planta, dicha planta se selecciona del grupo que consiste en lechuga, brócoli y tomate.

La presente invención se refiere también a un método de obtención de un biofertilizante líquido, que comprende:

(a) cultivar una cepa de Azospiríllum brasilense depositada en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con número de depósito CECT 5802 y una cepa de Pantoea dispersa depositada en la CECT con número de depósito CECT 5801 en unos primeros medios líquidos de fermentación separados y apropiados para cada cepa, a una temperatura entre 25 ^e C y 35 ^e C, bajo agitación y aireación y

(b) añadir en frío los caldos de fermentación obtenidos en la etapa anterior a un segundo medio fresco líquido, previamente esterilizado.

En una realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, dicho biofertilizante es acuoso, más en concreto una suspensión acuosa. En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden al menos uno de los ingredientes seleccionados del grupo que consiste en pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. En otra realización más preferida de dicho método de obtención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. La adición de estos productos de origen natural es especialmente apropiada para utilizar estos biofertilizantes en agricultura ecológica.

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación además comprenden al menos una sal inorgánica seleccionadas del grupo que consiste en K ₂ HP0 ₄ KH ₂ P0 ₄ y NH ₄ CI. En otra realización más preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden las sales inorgánicas K ₂ HP0 _4, KH ₂ P0 ₄ y NH ₄ CI.

En otra realización de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden K ₂ HP0 ₄ , KH ₂ P0 ₄ , NH ₄ CI, pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. Más preferiblemente, los primeros medios líquidos de fermentación comprenden K ₂ HP0 ₄ 1 -6% (p/p), KH ₂ P0 ₄ 0,01 -0,6% (p/p), NH ₄ CI 0,02-4% (p/p), pasta de tomate 1 -6% (p/p), hidrolizado de colágeno 0,02-4% (p/p) y extracto de levadura 0,02-4% (p/p).

En otra realización de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende al menos una sal inorgánica, un concentrado soluble de melaza, al menos un agente regulador del pH y al menos un agente antiespumante.

En una realización más preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, dicha sal inorgánica se selecciona del grupo que consiste en (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , K ₂ HP0 ₄ , ZnS0 ₄ , MnS0 ₄ , CuS0 ₄ , MgS0 ₄ y CaCI ₂ . En una realización más preferida del método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende las sales inorgánicas (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , K ₂ HP0 ₄ , ZnS0 ₄ , MnS0 ₄ , CuS0 ₄ , MgS0 ₄ y CaCI ₂ . En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende los agentes reguladores del pH ácido málico y KOH.

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, dicho agente antiespumante es polipropilenglicol.

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, el segundo medio fresco líquido comprende (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ , K ₂ HP0 ₄ , ZnS0 ₄ , MnS0 ₄ , CuS0 ₄ , MgS0 ₄ , CaCI ₂ , un concentrado soluble de melaza, ácido málico, KOH y polipropilenglicol. Más preferiblemente, el segundo medio fresco líquido comprende (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 1 -7% (p/p), K ₂ HP0 ₄ 0,001 -0,2% (p/p), ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 0,001 -0,2% (p/p), MnS0 ₄ -H ₂ 0 0,001 -0,2% (p/p), CUS0 ₄ -5H ₂ 0 0,001 -0,02% (p/p), MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0,001 -0,02% (p/p), CaCI ₂ -2H ₂ 0 0,001 -0,02% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,1 -2% (p/p), ácido málico 0,02-0,2% (p/p), KOH 0,01 - 2% (p/p) y polipropilenglicol 0,001 -0,2% (p/p). Más preferiblemente, el segundo medio fresco líquido comprende (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 3-5% (p/p), K ₂ HP0 ₄ 0,04-0,06% (p/p), ZnS0 ₄ -7H ₂ 0 0,02- 0,04% (p/p), MnS0 ₄ -H ₂ 0 0,02-0,04% (p/p), CuS0 ₄ -5H ₂ 0 0,002-0,004% (p/p), MgS0 ₄ -7H ₂ 0 0,006-0,008% (p/p), CaCI ₂ -2H ₂ 0 0,002-0,004% (p/p), concentrado soluble de melaza 0,5- 1 ,5% (p/p), ácido málico 0,07-0,09% (p/p), KOH 0,04-0,2% (p/p) y polipropilenglicol 0,01 -

0,02% (p/p).

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, se añade entre un 20% y 30% (p/p) de los caldos de fermentación obtenidos en la etapa (a) a dicho segundo medio fresco líquido.

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, los cultivos de la etapa (a) se llevan a cabo durante un tiempo entre 8 y 20 horas.

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, la velocidad de agitación en la etapa (a) es entre 400 y 800 r.p.m.

En otra realización preferida de dicho método de obtención del biofertilizante de la invención, la aireación en la etapa (a) es entre 0,5 y 2 L/min.

La presente invención se refiere también a un biofertilizante líquido obtenible según dicho método de obtención de la invención. Se han llevado a cabo ensayos de campo en condiciones de producción al aire libre y en invernadero con dicho biofertilizante líquido, con resultados muy satisfactorios. Dichos ensayos de campo se describen en los ejemplos 3-5.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos tienen el mismo significado que los comúnmente entendidos por un experto en el campo de la invención. Se pueden usar métodos y materiales similares y equivalentes a los descritos aquí en la práctica de la presente invención.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, el término "comprende", "que comprende" y sus variantes no son de naturaleza limitativa y, por lo tanto, no pretenden excluir otras características técnicas. El término "comprende", "que comprende" y sus variantes, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, incluye, específicamente, el término "consiste en", "que consiste en" y sus variantes.

Definiciones

En la presente memoria, el término“viabilidad” hace referencia a que los microorganismos del biofertilizante líquido mantienen su capacidad de reproducción, de colonización de las raíces y, por tanto, mantienen su capacidad de ejercer su función biofertilizante. Esta viabilidad significa que el biofertilizante es estable y funcional durante su almacenamiento en condiciones adecuadas. De forma particular, ambas cepas del biofertilizante líquido mantienen entre un 60% y un 70% de viabilidad celular al cabo de un año de conservación, a temperaturas no mayores de 30 ^e C. Los términos“viabilidad”,“viable” y similares tienen, a efectos de la presente memoria, el mismo significado que los términos “estabilidad”, “estable” y similares.

En la presente memoria, el término“biofertilizante líquido acuoso” hace referencia a un biofertilizante líquido en el que el disolvente mayoritario es agua. Dicho biofertilizante líquido acuoso comprende al menos una sal inorgánica y un concentrado soluble de melaza y puede comprender ácidos, hidróxidos, polipropilenglicol y otros ingredientes. Ejemplos de otros ingredientes son: pasta de tomate, hidrolizado de colágeno y extracto de levadura. Dicho biofertilizante líquido puede consistir en una formulación tamponada. En la presente memoria, el término“concentrado soluble de melaza” hace referencia a un producto obtenido de los procesos de fermentación industrial para la producción de levadura, alcohol y ácidos orgánicos sobre sustrato de melaza. La melaza se obtiene de los procedimientos de cristalización del azúcar y es un residuo de dicho proceso del cual no se puede obtener más azúcar por métodos físicos. La melaza se puede obtener de la caña de azúcar.

En la presente memoria, el término “agentes reguladores del pH” hace referencia a productos químicos que ajustan el pH de una disolución hasta un valor deseado o que son capaces de mantener el pH de una disolución dentro de un intervalo reducido. Ejemplos de agentes reguladores son los ácidos carboxílicos, ácidos dicarboxílicos, ácido málico, hidróxidos metálicos, tales como KOH, NaOH, etc.

En la presente memoria, el término“agente antiespumante” hace referencia a un producto químico que previene la formación de espuma en una disolución.

En la presente memoria, el término“hidrolizado de colágeno” hace referencia a un producto obtenido a partir de tejidos biológicos animales, como piel, huesos, espinas, escamas, de origen porcino, vacuno, de pollo, de pescado, etc. El colágeno presente en estos tejidos se somete a un proceso de hidrólisis que separa las cadenas polipeptídicas del colágeno. Después, estas cadenas son fragmentadas en segmentos más pequeños, utilizando productos químicos (hidrólisis química) o enzimas proteolíticos (hidrólisis enzimática). Es un producto utilizado en la preparación de medios de cultivo para microorganismos como fuente de nitrógeno.

En la presente memoria, el término“extracto de levadura” hace referencia a un extracto soluble en agua formado por el autolisado de células de levaduras. Es un producto rico en vitaminas especialmente del complejo B, aminoácidos y otros factores de crecimiento. Es utilizado en la preparación de medios de cultivo para microorganismos como fuente de nutrientes.

En la presente memoria, el término “fertirrigación” hace referencia a una técnica de aplicación de fertilizantes que permite la aplicación simultánea de agua y fertilizantes a través del sistema de riego. En la presente memoria, el término “pulverización” hace referencia a una técnica de aplicación de fertilizantes que distribuye un líquido en partículas.

DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓN Ejemplo 1. Obtención del biofertilizante líquido

Obtención de caldos de fermentación de las cepas

Se preparó un medio de cultivo tomate, un medio de cultivo que comprende pasta de tomate como fuente de carbono, hidrolizado de colágeno de piel de origen animal de uso fertilizante como fuente de nitrógeno orgánico y cuya composición es la que se describe en la Tabla 1.

La pasta de tomate era un producto estéril obtenido de tomates ( Solanum Lycopersicum L./Lycopersicum Sculentum “Mili’) enteros, triturados, tamizados, homogeneizados, concentrados, pasteurizados y envasados asépticamente (producto comercial“Concentrado de tomate 28/30 ^e Brix” de Mensajero Alimentación, S.L.). Este producto tenía 28-30 ^e Brix, contenía extracto seco 30-32% (p/p), pH 4, 0-4, 4, acidez (ácido cítrico) 1 ,6-2, 2, viscosidad Bostwick (20 ^e C) 6-1 1 cm/30 segundos, luz de malla 0,6 mm y recuento Howard inferior a 60%. Los valores medios por 100 g de este producto eran: valor energético 92 Kcal/387 Kj, grasas totales 0,2 g, ácidos grasos saturados inferior a 0,1 g, hidratos de carbono 22 g, azúcares 12 g, fibra alimentaria 7 g, proteínas 5 g y sal inferior a 0,1 g.

El hidrolizado de colágeno era un producto en polvo constituido por una mezcla en polvo de aminoácidos y péptidos obtenida por hidrólisis química (producto comercial“Protifert P N 142 de Sicit 2000 S.p.A.). El producto era un polvo blanco-marfil, contenía materia seca 95% (p/p), nitrógeno total 14% (p/p), masa volumétrica 300 g/L, pH 6, 0-7, 5 en solución al 10% (p/p), estabilidad térmica superior a 200 ^e C oxidación en aire estático y superior a 300 ^e C en atmósfera inerte.

El extracto de levadura utilizado es un producto en polvo (producto comercial“Polvo del extracto de levadura” de Oxoid Ltd). El producto era un polvo beige pálido.

Tabla 1. Composición del medio de cultivo tomate

El pH del medio de cultivo tomate fue 7,0. El medio de cultivo tomate se esterilizó a 121 ^e C durante 30 minutos.

Con el medio de cultivo tomate se alcanzaron elevados conteos celulares en 12-14 horas de fermentación para ambas cepas. El medio de cultivo resulta muy económico y lo que es más importante, se alcanzan elevados conteos celulares del orden de 10 ⁹ -10 ¹⁰ células/mL en ambos casos.

Se comprobó la pureza de un aislado de la cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 tomando una ampolla de dicho aislado, sembrando una muestra de dicha ampolla en placas de medio Rojo Congo e incubando a 30°C durante 72 horas. Se tomó una porción del cultivo de esta placa con un asa, se inoculó en un matraz Erlenmeyer de 1000 ml_, con 100 ml_ del medio de cultivo tomate y se incubó en agitación a 30°C durante 16 horas. Al cabo de este tiempo, se inoculó el contenido del matraz, que se encontraba en fase exponencial, en un termentador Braun Biotech BIOSTAT ^® B de 3 L con 1 ,9 L del medio de cultivo tomate. Se llevó a cabo la fermentación durante 16 horas a una velocidad de agitación de 600 r.p.m., una aireación de 2 L/min (1 v.v.m. (volumen de aire por volumen de medio por minuto)) y una temperatura de 30°C. Se dejó variar el pH libremente y alcanzó un valor de 6,8. Se alcanzó una concentración de 8,9x10 ^® células/mL. La velocidad específica de crecimiento en fase exponencial (m) fue de 0,25 h ¹ .

Para la cepa Pantoea dispersa CECT 5801 , se siguió el mismo esquema de fermentación, con pequeñas modificaciones, que se describen a continuación. La pureza del aislado de la cepa se comprobó en medio de cultivo MacConkey, incubando un inoculo de dicha cepa en agitador orbital durante 12 horas. El cultivo en el termentador BIOSTAT ^® B se llevó a cabo durante 12 horas a una velocidad de agitación de 600 r.p.m., una aireación de 3 L/min (1 ,5 v.v.m.) y una temperatura de 30°C. Se dejó variar el pH libremente y alcanzó un valor de 6,9. Se alcanzó una concentración de 9,5x10 ^® células/mL. La velocidad específica de crecimiento en fase exponencial para esta cepa fue de m = 0,57 h ¹ .

Se preparó un medio fresco. Los ingredientes que componen el medio fresco se describen en la Tabla 2. La concentración de los ingredientes en este ejemplo era el valor medio del rango indicado en la Tabla 2. El concentrado soluble de melaza era un producto líquido concentrado obtenido de los procesos de fermentación industrial para la producción de levadura, alcohol y ácidos orgánicos sobre sustrato de melaza y otros licores de tiraje, fuente de nitrógeno y sales minerales (producto comercial“Fluido abono nitrogenado orgánico” de ED&F Man Liquid Products Italia Srl). El producto era un líquido espeso de color marrón oscuro o negro, tenía una viscosidad de 200-2000 cp a 20 ^e C, gravedad específica 1.15-1.35, punto de inflamación superior a 200 ^e C, miscible en agua y temperatura de descomposición superior a 45 ^e C y pH entre 5, 5-8, 5.

El polipropilenglicol era un polímero, un producto líquido (producto comercial “VORANOL ^* 2000 L Polyol” de The Dow Chemical Company). El producto era un líquido incoloro, con punto de inflamación de 230 ^e C COC, densidad de vapor (aire = 1 ) superior a 1 , peso específico (agua = 1 ) 1 ,01 , densidad 1 ,0 g/cm ³ , viscosidad dinámica 305-335 mPa-s a 25 ^e C.

Tabla 2. Componentes del medio fresco

Se cargó un reactor de fermentación con agitación y control de temperatura con la cantidad de agua necesaria para obtener el volumen final de producto deseado. Dicha cantidad de agua necesaria fue aproximadamente 44% p/p. Se puso en marcha el agitador y se añadieron las sales, siguiendo el orden en el que dichas sales aparecen en la Tabla 2, hasta su completa disolución.

A continuación, se incorporaron el concentrado de melaza, el ácido málico y, por último, el polipropilenglicol, manteniéndose la agitación. Una vez obtenida una mezcla totalmente homogénea, se ajustó el pH del medio a 7,00, mediante la adición de potasa (KOH).

Por último, se esterilizó el medio fresco a 121 ^e C durante 20 minutos.

Obtención del biofertilizante líquido

Se dejó enfriar el medio fresco. Seguidamente, se añadieron los caldos de fermentación de las cepas Azospiríllum brasilense CECT 5802 (25% p/p) y Pantoea dispersa CECT 5801 (25% p/p), obtenidos según el procedimiento descrito en el apartado Obtención de caldos de fermentación de las cepas” de este ejemplo. Se añadieron dichos caldos de fermentación agitando lentamente hasta conseguir una mezcla homogénea.

Ejemplo 2. Evaluación de la viabilidad celular del biofertilizante líquido

Se comprobó periódicamente la viabilidad celular del biofertilizante líquido. Se comprobó la viabilidad celular de las cepas Azospiríllum brasilense CECT 5802 y Pantoea dispersa CECT 5801 en medio Rojo Congo y en medio MacConkey, respectivamente. El biofertilizante líquido conservó más del 60% de viabilidad celular al cabo de un año de conservación, a temperaturas no mayores de 30°C, de ambas cepas.

Ejemplo 3. Ensayo con el biofertilizante líquido en lechuga

Este ensayo se realizó al aire libre entre noviembre de 2018 y febrero de 2018 en Santomera, Murcia.

En algunos tratamientos de este ejemplo y de los ejemplos siguientes se utilizó el biofertilizante líquido obtenido en el Ejemplo 1.

En las Tablas 3 y 4 se muestran los resultados de producción obtenidos en el ensayo.

Tabla 3. Producción de lechuga por Tesis (tratamiento)

Tabla 4. Peso medio de lechugas por Tesis

Como se puede observar en las Tablas 3 y 4, el biofertilizante líquido de la invención, a 2,5 y 5 L/ha, obtiene rendimientos superiores tanto con respecto al testigo sin tratar como a la tesis con el abonado recomendado de acuerdo con las normas de producción integrada de la Región de Murcia (B.O.R.M., Orden 8024).

El biofertilizante líquido de la invención es eficaz para disminuir las necesidades de aporte de fertilización química ya que obtiene resultados similares o superiores a la fertilización química 100%.

Ejemplo 4. Ensayo con el biofertilizante líquido en brócoli

Este ensayo se realizó al aire libre entre noviembre de 2018 y febrero de 2019 en Santomera, Murcia. En las Tablas 5 y 6 se muestran los resultados de producción obtenidos en el ensayo.

Tabla 5. Producción de brócoli por Tesis

Tabla 6. Peso medio de brócolis por Tesis

Biofertilizante líquido 5 L/ha 346,6 15,0 %

Como se puede observar en las Tablas 5 y 6, el biofertilizante líquido de la invención, a 2,5 y 5 L/ha, obtiene rendimientos superiores con respecto al testigo sin tratar.

El biofertilizante líquido de la invención es eficaz para disminuir las necesidades de aporte de fertilización química ya que obtiene resultados superiores a la fertilización química 100%.

Ejemplo 5. Ensayo con el biofertilizante líquido en tomate

Este ensayo se realizó en invernadero entre septiembre de 2017 y mayo de 2018 en Mazarrón, Murcia. En la Tabla 7 se muestran los resultados de producción obtenidos en el ensayo.

Tabla 7. Producción de tomates por Tesis

Tabla 8. Fertilizantes químicos usados por tratamiento

El biofertilizante líquido de la invención, a 5 L/ha, obtiene un aumento de producción anual en kg/ha de un 12% en la tesis aplicada con el biofertilizante líquido de la invención sólo sin ningún tipo de aporte químico. En la tesis que se mantiene un 50% de la fertilización química, el aumento alcanza el 20%.

Para el tratamiento con abono químico convencional, el consumo de productos fertilizantes ha ascendido a 730 kg/ha (Tabla 8), que en la tesis de producto solo, sin aportes químicos, se sustituye totalmente por tan sólo 20 L/ha de biofertilizante líquido. En la tesis en la que se ha mantenido la mitad de la fertilización habitual, el ahorro ha sido de 365 kg/ha de fertilizantes, logrando un notable aumento productivo del 20%, aportando nada más que 10 L/ha de biofertilizante líquido.

REFERENCIA AL MATERIAL BIOLÓGICO DEPOSITADO

Las cepas de Azospiríllum brasilense y de Pantoea dispersa se depositaron el 9 de junio de 2003, según el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes, en la Autoridad Internacional de Depósito (IDA) Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), por el depositante Probelte, S.A. El depositante identificó las cepas como“Azospiríllum brasilense M ₃ ” y“Pantoea dispersa C ₃ ”. Tras completar con éxito los ensayos de viabilidad de las cepas, la IDA aceptó las cepas, confirmó la fecha, anteriormente indicada, en la que la IDA recibió el depósito y asignó el número de depósito CECT 5802 y CECT 5801 , respectivamente, a dichas cepas.

La cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 se aisló de raíces de plantas de guisantes ( Pisum sativum) colectadas en la región de Murcia. Se comprobó, mediante bioensayos en laboratorio e invernadero, la capacidad de la cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 para estimular el crecimiento vegetal. La cepa Azospiríllum brasilense CECT 5802 fue la que mayor efecto estimulador del crecimiento produjo de los más de 50 aislados de bacterias fijadoras de nitrógeno ensayados. Se verificó la producción de ácido-3-indol acético y otras sustancias promotoras del crecimiento vegetal. Se detectó la presencia de otras fitohormonas del tipo citoquininas. En la producción de ácido-3-indol acético, se lograron valores de más del 95% de transformación del triptófano en medio tomate con 150 mg x L ¹ de este aminoácido. Se comprobó también la actividad del enzima 1 -aminociclopropano 1 - carboxilato desaminasa presente en esta cepa, a través del crecimiento en medios con ácido 1 -aminociclopropano 1 -carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno.

La cepa Pantoea dispersa CECT 5801 se aisló de la rizosfera de plantas de Shorgum halepense colectadas en la región de Murcia. Se llevó a cabo la caracterización de los ácidos orgánicos producidos por la cepa Pantoea dispersa CECT 5801 y se comprobó que produce ácido glucónico mayoritariamente, así como otros ácidos orgánicos en pequeñas cantidades. La selección se efectuó a través su capacidad para estimular el crecimiento vegetal y de producir auxinas. Se determinó su capacidad para producir sideróforos. Se comprobó, mediante bioensayos en laboratorio e invernadero, la capacidad para estimular el crecimiento vegetal. Se comprobó también la actividad del enzima 1 -aminociclopropano 1 - carboxilato desaminasa presente en esta cepa, a través del crecimiento en medios con ácido 1 -aminociclopropano 1 -carboxílico (ACC) como única fuente de nitrógeno.

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