[0001] 本发明涉及生物化学领域， 特别是涉及了一种去除微生物污染的液体及使 用方 法。

背景技术

[0002] 聚维酮碘 （PVP-I） 是聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） 与碘的复合物， 不但保留了碘 的强大的杀菌性能， 无细菌和病毒的耐药性， 而且克服了游离碘难溶于水、 不 稳定、 对皮肤刺激性大和黄染等缺点。 这种分子间的络合有效降低了碘的腐蚀 性和刺激性。 聚维酮碘溶液中碘以低毒性的络合碘存在， 其中有 80%-90%的络 合碘可解聚成游离碘而发挥杀菌效力， 是一种广谱的强力杀菌消毒剂， 对革兰 氏阴性、 阳性菌、 真菌和病毒具有广谱杀灭作用， 适用于手术前洗手、 手术术 野及注射部位的清洗消毒， 阴道粘膜冲洗， 感染部位消毒以及医疗器械和环境 消毒等。 研究还发现， 低浓度的 PVP-I对细胞没有毒害作用。

[0003] 微生物污染是细胞培养工作的大敌， 其中以细菌污染最为常见也最难预防。 如 何尽早发现污染并成功挽救珍稀细胞系， 是许多实验室遇到的难题。 对于培养 物发生细菌污染的处理， 一向被认为应该弃之， 但是对独一无二的、 无可替代 的细胞系还应尽力考虑去除污染和挽救， 方法有抗生素除菌法、 巨噬细胞吞噬 法和动物接种除菌法， 其中较常使用的是抗生素冲击法。 但抗生素的作用主要 是通过抑制细菌细胞壁的合成达到抑制细菌生 长的效果， 并不能直接杀死细菌 ， 而且抗生素对培养细胞的形态和性状都有一定 的影响。 还可以往细胞中添加 巨噬细胞吞噬细菌， 但是巨噬细胞在体外没有其他免疫细胞和抗体 等因素的参 与下， 其吞噬功能是有限的。 动物体内接种除菌法是利用动物的免疫系统来 消 灭污染微生物的方法。 但是动物体内接种法容易带入动物体内的病毒 。

发明概述

技术问题

问题的解决方案 技术解决方案

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供了一种去除 微生物污染的液体， 从而简便快 捷地去除生物样本存放、 细胞培养等弓 I起的微生物污染问题。

[0005] 本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案 予以实现：

[0006] 一种去除微生物污染的液体， 所述液体中含有聚维酮碘、 PEG 8000。

[0007] 在本发明中， 按质量百分比计， 所述聚维酮碘的含量为 0.01%-0.08%。

[0008] 在本发明中， 按质量百分比计， 所述 ?£0 8000的含量为0.02%-0.1%。

[0009] 在本发明中， 所述液体的 pH在 6.0-8.0之间。

[0010] 在本发明中， 所述液体中还含有 DMSO。 按质量百分比计， 所述 DMSO的含量 为 3%-5%。

[0011] 在本发明中， 所述液体还含有碘酸根离子。

[0012] 在本发明中， 所述液体还含有硫酸镁。 所述硫酸镁的浓度为 15-25mM。

[0013] 一种去除微生物污染的液体的使用方法， 按照 1份如任一上述去除微生物污染 的液体兑 2份水， 使用于被污染的细胞中 2小时 - 12小时。

发明的有益效果

有益效果

[0014] 本发明具有如下有益效果： 本发明所提供的去除微生物污染的液体可以广 谱杀 灭真菌、 细菌、 病毒、 支原体等微生物污染， 而且对细胞没有明显毒害作用； 再者， 该液体制备简单， 制作成本低廉， 易于推广同时简便快捷地去除生物样 本存放、 细胞培养等引起的微生物污染问题。

发明实施例

本发明的实施方式

[0015] 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。 下述实施例中的实 验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无 特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0016] 实施例 1去除 SP2/0骨髓瘤细胞中的细菌污染

[0017] 1. 去除微生物污染的液体的配制： 取聚维碘酮 （阿拉丁试剂） 、 PEG 8000

， 加入超纯水溶解， 调节 PH至 7.0, 定容， 用 0.22—滤膜过滤除菌、 除杂质， 备 用。

[0018] 2. 往被污染的 SP2/0骨髓瘤细胞中加入 1/2体积的上述液体， 置于 5%二氧化碳 细胞培养箱中 37°C作用 2小时； 去除上清， 加入 1640培养基洗涤细胞一次； 去掉 液体， 加入完全培养基继续培养细胞即可。

[0019] 3. 表 1为单独采用聚维酮碘作为杀菌剂作用于受污� �的 SP2/0细胞的实效效果

。 当聚维酮碘浓度为 0.03%（特别说明： 本发明中涉及所有百分数如无特别说明， 则均为质量百分比）时， 杀菌效果适中， 而且细胞活性最佳。

[0020] 表 1聚维酮碘浓度对于杀菌及细胞的影响

[] [表 1]

[0021] 代表无效； “+”代表有效， “+”越多代表效果越明显。

[0022] 4. 在 0.03%的聚维酮碘中添加 PEG 8000， 评估杀菌效果， 结果如表 2所示。

可见 0.14%以下的 PEG 8000对于细胞活性没有明显影响， 但是添加 PEG 8000浓度 在 0.06%-0.1%时， 杀菌效果具有明显提升。

[0023] 表 2 PEG 8000浓度对于杀菌及细胞的影响

[] [表 2]

[0024]

[0025] 实施例 2 293T细胞真菌污染的去除

[0026] 1. 去除微生物污染的液体的配制： 取聚维碘酮、 PEG 8000， 加出超纯水溶 解， 调节 pH至 8.0， 添加不同体积的 DMSO （二甲基亚砜） ， 定容， 用 0.22 im滤 膜过滤除菌、 除杂质； 备用。

[0027] 2. 往被污染的 293T细胞中加入 1/2体积的上述液体， 置于 5%二氧化碳细胞培 养箱中 37°C作用 12小时； 去除上清， 加入 PBS （磷酸盐缓冲液， pH=7.4） 洗涤细 胞一次； 去掉液体， 加入完全培养基继续培养细胞即可。

[0028] 3. 实验结果如表 3所示， 添加 DMSO （3%-5%） 可以提高杀菌效果。 但是继 续增大 DMSO的浓度， 细胞的活性受到抑制。

[0029] 表 3添加 DMSO杀灭真菌效果评价

[] [表 3]

[0030]

[0031] 实施例 3小鼠原代成纤维细胞支原体污染的去除

[0032] 1. 去除微生物污染的液体的配制： 取聚维碘酮、 PEG 8000， 加出超纯水溶 解， 调节 PH至 7.0, 添加硫酸镁， 溶解定容， 用 0.22—滤膜过滤除菌、 除杂质。 备用。

[0033] 2. 往被污染的小鼠原代成纤维细胞中加入 1/2体积的上述液体， 置于 5%二氧 化碳细胞培养箱中 37°C作用 5小时； 去除上清， 加入 PBS （磷酸盐缓冲液， pH7.4 ） 洗涤细胞一次； 去掉液体， 加入完全培养基继续培养细胞即可。

[0034] 3. 实验结果如表 4所示， 添加硫酸镁浓度在 15mM-25mM （mM表示毫摩尔每 升） 可以提高杀菌效果。

[0035] 表 4添加硫酸镁杀灭真菌效果评价

[] [表 4]

[0036]

[0037] 实施例 4 PH对于杀菌效果的影响

[0038] PH是影响聚维酮碘杀菌效果的重要因素， 一般情况下， pH在 4.0左右聚维酮碘 具有良好的杀菌效果， 而碱性范围内杀菌效果大幅度降低。 但本发明人发现， 添加了 PEG 8000的聚维酮碘溶液的最佳杀菌 pH在 6.0-8.0范围内。 不同 pH值的去 除微生物污染的液体 （0.03%聚维酮碘、 0.06%PEG 8000） 添加到预先添加了大 肠杆菌、 金黄色葡萄球菌、 酵母菌、 支原体的完全培养基中， 按照每毫升完全 培养基添加 0.5毫升去除微生物污染的液体， 混匀， 置于 37°C作用 2h; 取作用完 毕后的液体， 用生理盐水稀释， 取稀释后的液体进行生化培养检测。 从评价结 果 （表 5） 来看， pH在 6.0以上时杀菌效果较佳， 7.0-8.0范围最佳。

[0039] 表 5不同 pH的去除微生物污染的液体的杀菌效果

[] [表 5]

[0040]

[0041] 实施例 5保质期的确定

[0042] 聚维酮碘随着时间的推移， 效能会逐渐降低， 添加碘酸根离子有利于延长其的 保质期。 本发明同样比较了不同浓度下的碘酸根离子的 浓度。 通过比较， 本发 明所述去除微生物污染的液体中碘酸根离子浓 度在 10mM以上时， 该液体保质期 可达一年以上， 但是碘酸根离子浓度超过 80mM时， 对细胞活性会产生不利影响

[0043] 实施例 6作用温度对于杀菌效果的影响

[0044] 温度将会影响聚维酮碘中碘的释放， 进而影响到杀菌效果。 本发明人往被细菌 污染的贴壁细胞 （SP2/0） 中添加去除微生物污染的液体 （0.03%聚维酮碘、 0.06 %PEG 8000） , 按照每毫升完全培养基添加 0.5毫升去除微生物污染的液体进行 添加， 混匀， 置于不同温度下作用 2h; 吸掉上清， 用 1640培养基洗涤微孔两次 ， 加入完全培养基， 置于 37°C 5%二氧化碳培养箱中培养， 观察细胞生长及污染 情况。 从评价结果 （表 6） 来看， 低温有助于杀灭细菌， 随着温度的升高， 杀菌 效果降低。

[0045] 表 6温度对于杀菌效果的影响

[] [表 6]

[0046]

[0047] 实施例 7 PEG分子量对于杀菌效果的影响

[0048] PEG对细胞有一定毒性， 如何在保证细胞活性的前提下， 有效杀菌将会影响聚 维酮碘中碘的释放， 进而影响到杀菌效果。 本发明往被细菌污染的贴壁细胞 （S P2/0） 中添加去除微生物污染的液体 （0.03%聚维酮碘、 0.06%PEG） ， 按照每毫 升完全培养基添加 0.5毫升去除微生物污染的液体进行添加， 混匀， 置于 15°C下 作用 2h; 吸掉上清， 用 1640培养基洗涤微孔两次， 加入完全培养基， 置于 37°C 5%二氧化碳培养箱中培养， 观察细胞生长及污染情况。 从评价结果 （表 7） 来看 ， 低分子量的 PEG杀菌效果更佳， 但是对于细胞的杀伤也会增加。 PEG分子量为 8000时， 综合效果最佳。

[0049] 表 7温度对于杀菌效果的影响

[] [表 7]

[0050]

[0051] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并不 能因此而理解为对本发明专利范围的限制， 但凡采用等同替换或等效变换的形 式所获得的技术方案， 均应落在本发明的保护范围之内。