II型糖尿病（ Diabetes Mellitus II , DM II , 胰岛素抵抗型糖尿病） 患者占糖尿病患者总数的 90~95% , 且每年以 6%的数量递增。 预计到 2025年， 全球 II型糖尿病患者将达到 3.8亿。 目前， 亚洲已是糖尿病患 者最多的地区， 全球糖尿病增长最快的国家是中国、 印度等发展中国 家。 最近一次中国的大型糖尿病流行病学调查是在 2002年， 在 10万人 中按 WHO 1999年公布的诊断标准， 18岁以上人群患病率在城市和农 村分别为 4.5%和 1.8%。 中国糖尿病患病率在过去 20年中上升了近 4 倍。

对于 II型糖尿病的治疗， 目前主要有胰岛素替代疗法（胰岛素、 胰 岛素类似物）和口服化学类降糖药物（促胰岛 素分泌剂磺脲类和格列奈 类， 可直接刺激胰岛素分泌； 非促胰岛素分泌剂双胍类、 噻唑烷二酮 类和 α -糖苷酶抑制剂， 胍类药物主要减少肝脏葡萄糖的输出， 噻唑 烷二酮类药物可改善胰岛素抵抗， α -糖苷酶抑制剂主要延緩碳水化合 物在肠道内的吸收）等。 以上药物虽然能降低血糖， 但是存在低血糖风 险和体重增加的不良反应， 且会导致胰岛 Ρ细胞功能的进行性丧失 ( Nature.2001;414:821-827 ) 。

GLP-1 ( Glucagon Like Peptide-1 , 胰高血糖素样肽 -1 )作为肠促 胰素之一， 其模拟生理状态降糖作用的 "肠促胰素效应" 针对糖尿病 两大发病机制（胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗 ）， 治疗机理独特， 目前 发达国家已将其列入二线治疗方案（Diabetes Care.2009;32:193-203 ) 。

GLP-1 的促胰岛素分泌和抑制胰高血糖素分泌作用具 有血糖浓度 依赖性， 即当血糖浓度高于正常时， GLP-1 呈现促胰岛素分泌作用， 而当血糖浓度正常时， GLP-1 的促胰岛素分泌作用减弱。 因此， 外源 性 GLP-1 治疗不会由于过量而引起低血糖不良反应的发 生。 这是 GLP-1 类似物优于其它促胰岛素分泌药物和胰岛素及 其类似物的最显 著特征 ( Diabetologia.l986;29:46-52 ) ( J Clin Invest.l993;91 :301-307 ) ( J Clin Endocrinol Metab. 2001;86:3717-3723 ) 。

GLP-1 通过与胰岛 α细胞的受体结合， 可控制餐后胰高血糖素的 分泌； 通过与胰岛 P细胞的作用， 可促进 P细胞增殖、 抑制其凋亡、 增加其对葡萄糖的敏感性， 从而增加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌； 作 用于肝脏， 可减少肝糖原的输出； 作用于胃， 可延緩胃排空， 减少食 物摄入； 作用于下丘脑， 可增加饱胀感， 降低食欲， 从而减轻体重 ( Diabetes Care.2003;26:2929-2940 ) ( Castroenterology.2007;132: 2131-2157 ) ( Proc Natl Acad Sci.l982;79(2): 345-349 ) ( Diabetologia. 1996;39:1546-1553 ) ( Endocrinology.2003;144: 5149-5158 ) ( Diabetes. 2002;51:5434-5442 ) ( Diabetologia.l993;36:741-744 ) ( Lancet.2002;359: 824-830 ) 。

此外， GLP-1 可改善 II型糖尿病患者的病理缺陷， 保护胰岛 P细 胞和心血管系统， 同时具有保护神经的作用。 因此， GLP-1 可降低糖 尿病患者并发症的产生， 其在低血糖、 减轻体重、 胰岛细胞保护和心 血管保护方面的优势和综合作用， 必定会促进其未来在 II型糖尿病治 疗中的地位提升 ( Diabetes Care.1998; 21:1925-1931 ) ( Diabetes Spectrum.2004;17:183-190 ) ( Lancet. 2006;368: 1696-1705 ) ( PLoS ONE.2011;6(8):e23570 ) 。

天然的 GLP-1 在体内很容易被内源性 DPP-4 ( Dipeptidyl peptidase-4, 二肽基肽酶 -4 )去除 N末端组氨酸（ His )和丙氨酸（ Ala ) 残基而失活， 半衰期不足 2 分钟， 不具备成药性。 因此目前研究的药 物都需要采取多种措施来克服这一难题。 目前以 GLP-1 为靶标的已上 市或在研的药物主要有两大类： 一类是可以抑制体内 DPP-4 降解作用 的小分子药物； 另一类则是通过修饰天然 GLP-1结构或寻找 GLP-1类 似物， 在不损失其生物学作用的前提下延长其半衰期 （ J Biol Chem.l992;267:7402-7405 X Drug Dev Res.2001;53:260-267 ) ( Diabetes. 2007;56:1475-1480 ) ( Clin Ther.2008; 30:858-867 ) ( Diabetes Obes Metab.2008; 10:82-90 ) ( Curr Med Res Opin.2008; 24:275-286 ) 。

陆续成功上市或在研的 GLP-1 类似物、 改构体、 长效制剂或

DPP-4 抑制剂， 其初衷都是为了延长活性物质的体内半衰期。 目前国 内外研发的 GLP-1 及其类似物大多疗效相近， 区别主要在于作用时间 和免疫原性。 其中， 第一个上市的 GLP-1 类似物为 Eli lilly 的 Exenatide (艾塞那肽） ， 于 2005年 4月在美国上市， 是美洲毒蜥蜴唾 液来源的 GLP-1 类似物， 需一日两次皮下注射给药。 随后上市的 Liraglutide(利拉鲁肽）， 为 Novo Nordisk开发的人源 GLP-1改构体， 于 2009年 4月在欧洲上市， 2011年 10月正式在中国上市， 需一日一次 皮下注射给药。 而与人免疫球蛋白 IgG Fc部分结合的人源 GLP-1改构 体（如 Eli lilly在研的 Dulaglutide )利用了 IgG长循环半衰期的特点， 可以达到一周一次给药， 是目前同类产品中最理想的产品 （Diabetes Obes Metab.2011;13:302-312 ) 。

本发明涉及人源 GLP-1的第 7-37位氨基酸序列与人 IgG Fc相结合 的融合蛋白，其较 Dulaglutide不同之处在于，该融合蛋白中的人 IgG Fc 采用的是 IgG2 Fc。 从安全性角度来看：

1 ) 来自人源的 GLP-1多肽免疫原性低， 长期使用不易产生抗体；

2 )某些亚类的 IgG (如 IgGl )的 Fc段可与巨噬细胞、 NK细胞表 面 Fc 受体结合， 发挥 ADCC 作用 （ Antibody-Dependent Cell Cytotoxicity , 抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用） 和调理作用。 人 IgG2的 Fc段与高亲和力 Fc受体 CD64和低亲和力 Fc受体 CD32和 CD16都没有结合能力， 因此可降低其 ADCC作用。

综合以上两点， 本发明的融合蛋白不仅可降低免疫原性， 还可避免 与 GLP-1治疗作用不相关的 Fc段的效应子功能。

新生儿 Fc受体（ FcRn )能够延长血液中 IgG的半衰期， 维持血液 循环中高水平的 IgG浓度， 保持抗体水平的动态平衡。 FcRn在正常成 人表达于血管内皮细胞， 能与 IgG的 Fc段结合。 血管内皮是 FcRn保 护 IgG不受分解代谢的重要场所。 FcRn依赖细胞内陷作用， 不仅从细 胞外酸性环境中吸收 IgG, 而且在细胞内参与 IgG循环和稳态调节。 生 理状态下， 当血清中 IgG浓度低于正常时， 更多的 FcRn与 Fc结合， IgG降解减少， 使得 IgG浓度得以维持； 当血清中 IgG浓度高于正常 时， 内皮细胞表面的 FcRn已经饱和， 不能继续结合更多的 IgG, 从而 造成 IgG降解加强， 血清 IgG浓度下降。 利用 FcRn与 Fc结合保护含 Fc 蛋白不受降解， 可借以维持融合蛋白在血浆中的较高浓度的动 态平 衡， 从而延长该蛋白的体内半衰期。

本发明利用了免疫球蛋白 IgG 特有的清除緩慢的代谢途径， 采取 将人源 GLP-1多肽与人免疫球蛋白 IgG2的 Fc段融合表达的方法， 制 成融合蛋白， 在保留 GLP-1生物学活性的同时， 使 GLP-1的体内半衰 期接近 IgG的体内半衰期。

该融合蛋白皮下注射可以吸收， 由于较长的体内半衰期 （IgG2 类 型的 Fc段， 其体内半衰期较 IgG4和 IgGl类型的 Fc段更长）（ Nature Biotechnology.2007;25(12):1369-1372 ) , 可支持每 1-2周一次皮下注射 给药， 并长时间维持体内有效血药浓度， 减少了患者必须接受频繁注 射给药的痛苦， 提高了治疗的依从性， 并能降低治疗成本。

尽管此途径对于 GLP-1 疗法是可行的， 但是融合蛋白质长时期反 复使用会产生抗体， 而糖尿病患者一经确诊必须终生接受治疗， 如果 所述融合蛋白的 Fc段保留了不需要的效应子功能， GLP-1-Fc融合蛋白 质疗法可能有安全方面的顾虑。 本发明尝试克服与使用 GLP-1-Fc融合 物相关的关于潜在免疫原性和效应子活性的问 题， 本发明的融合蛋白 质在 GLP-1部分和 Fc部分中具有多个氨基酸残基的替换， 此替换提供 了更大的潜能以增加体内稳定性， 降低免疫原性并消除效应子功能。

发明内容 本发明提供了重组的人源胰高血糖素样肽 -1 ( GLP-1 )的第 7-37位 氨基酸序列与人源免疫球蛋白亚型 （IgG2 ) 的 Fc段融合的蛋白分子及 其制备方法和用途， 所述 GLP-1的 C末端通过富含甘氨酸（Gly )的肽 接头（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly -Gly-Ser, SEQ ID ΝΟ:11 ) 与 IgG2 Fc段连接。 所述融合蛋白质具有 GLP-1的生 物学活性， 同时具有显著延长的体内半衰期。 所述融合蛋白质可以用 于治疗和 /或预防 II型糖尿病、 肥胖， 以及通过降低血清葡萄糖、 抑制 胃肠运动和排空或抑制食物摄入而受益的其它 疾病。

本发明利用基因工程技术构建了 GLP-1与 IgG2 Fc部分融合的融 合蛋白， 具体地， 本发明公开了：

1. 一种融合蛋白， 其由胰高血糖素样肽 -1的 C末端通过肽接头与 IgG2 Fc部分的 N末端融合而成， 所述融合蛋白氨基酸序列如 SEQ ID NO:4或 SEQ ID NO:5或 SEQ ID NO:6所示。

2. 一种编码如 1 所述融合蛋白的基因， 在一个实施方案中， 所述 基因的核苷酸序列如 SEQ ID ΝΟ:1或 SEQ ID NO:2或 SEQ ID NO:3 所示。 3. 一种制备如 1所述融合蛋白的方法， 其包括：

a. 构建如上述 2所述的基因；

b. 将步骤 a 所述基因克隆至真核表达载体， 得到可表达如 上述 1所述融合蛋白的真核表达载体；

c 用步骤 b 所述表达载体转染细胞， 使其表达所述重组融 合蛋白， 然后分离纯化得到所述重组蛋白。

4. 一种制剂， 其含有如 1 所述融合蛋白作为其活性成分， 其还可 以含有一种或多种本领域所熟知的可药用载体 。

5. 如上述 1 所述融合蛋白或含有其的制剂在制备用于治疗 和 /或预 防 II型糖尿病、 肥胖以及通过降低血清葡萄糖、 抑制胃肠运动和排空 或抑制食物摄入而受益的其它疾病的药物中的 用途。

在一个实施方案中， 将编码本发明所述融合蛋白的基因克隆到真 核表达载体 293。

在一个实施方案中，用包含编码本发明所述融 合蛋白的基因的真核 表达载体转染 FreeStyle 293F细胞，从而使其表达本发明所述融合蛋白� �

附图说明 图 1 显示了用于本发明所述融合蛋白表达的重组真 核表达载体 293-GLP -l-Fc (IgG2)的结构，三种融合蛋白（GLP-1-Fc-1、 GLP-l-Fc-2 和 GLP- l-Fc-3 ) 重组真核表达载体结构在基因插入位点上相同 。

图 2A显示了表达载体 293经 EcoR I、 BamH I双酶消化线性化后 的片段和编码所述融合蛋白 GLP-1-Fc-l的基因片段自 pGEM-T质粒载 体（由捷瑞合成）上酶切后的 DNA琼脂糖电泳图； 图 2B显示了经聚合 酶链反应（PCR )获得的编码所述融合蛋白 GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3 的基因片段； 图 2C和图 2D分别显示了构建完成的编码三种所述融合 蛋白的 293表达载体经 EcoR I、 BamH I双酶消化后鉴定的 DNA琼脂 糖电泳图。

图 3A 显示了所述三种融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电 泳 （SDS- PAGE ) 图； 图 3B显示了所述三种融合蛋白的免疫印迹 (Western-blot) 检测结果图。

图 4 显示了所述三种融合蛋白在 P-TC-6 细胞上的结合实验结果 图。

图 5 显示了所述三种融合蛋白促进 P-TC-6 细胞内 cAMP (腺苷 -3'，5'-环化一磷酸）释放的实验结果图。

图 6显示了所述三种融合蛋白促进 P-TC-6细胞分泌胰岛素的实验 结果图。

图 7A和图 7B分别显示了所述三种融合蛋白在高葡萄糖灌� ��大鼠 模型中升高血清胰岛素水平的实验结果图。

图 8显示了所述三种融合蛋白与 FcRn蛋白结合的实验结果图。 图 9显示了所述三种融合蛋白与 FcyRIIIa(CD16a)蛋白结合的实验 结果图。

具体实施方式 除非另有说明， 本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属 领域 普通技术人员的通常理解具有相同的含义。

在一个实施方案中， 产生本发明所述融合蛋白的具体技术解决方 案如下：

一、 构建编码本发明融合蛋白的表达载体

才艮据文献公开的 GLP-l(7-37)序列 （ Diabetes Metab Res Rev. 2010; 26: 287-296. )和 Pubmed上公开的 IgG2型 Fc序列 （ AJ250170 ) , 本 发明人合成了编码人 GLP-l(7-37)、 编码 15个氨基酸肽接头以及编码 IgG2型 Fc的 cDNA序列。 将所述 cDNA中对应于所述人 GLP-l(7-37) C末端的基因序列通过所述肽接头基因序列与� �码人 IgG2型 Fc部分的 基因相连接， 从而得到编码本发明所述融合蛋白的融合基因 序列。发明 人对所述 GLP-l(7-37)氨基酸序列进行了修饰， 其中第 8位氨基酸由丙 氨酸（Ala )替换为甘氨酸（Gly ), 第 22位氨基酸由甘氨酸（ Gly )替 换为谷氨酸（ Glu ),第 36位氨基酸由精氨酸（ Arg )替换为甘氨酸（ Gly )。

本发明所述融合蛋白中人 IgG2型 Fc部分的氨基酸序列有三种不同 修饰形式， 从而对应三个不同序列的融合蛋白， 本文中分别称为 GLP-l-Fc-1. GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3, 其对应的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO:4. SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6所示， 其对应的基因序 列分别如 SEQ ID NO:l , 8£0 0) ]\0:2和8£(3 0) ]\0:3所示。 其中在 GLP-l-Fc-1的氨基酸序列 （SEQ ID NO:4 ) 中， 第 1-19位为分泌信号 肽序列 （分泌信号肽指通常出现在较大多肽 N末端区域的氨基酸序列， 其功能是启动所述多肽与细胞内质网的结合以 及该多肽通过质膜分 泌），第 20-50位为 GLP-l(7-37)序列，第 51-65位为肽接头序列，第 66-288 位为 IgG2的 Fc序列 （其铰链区为 VECPPCP, SEQ ID NO:12 ); 在 GLP-l-Fc-2的氨基酸序列 （ SEQ ID NO:5 ) 中， 第 1-19位为信号肽序 列，第 20-50位为 GLP-l(7-37)序列，第 51-65位为肽接头序列，第 66-292 位为 IgG2 的 Fc 序列 （其铰链区为 ERKCCVECPPCP ( SEQ ID NO:13 )，且 C端去除 K );在 GLP-l-Fc-3的氨基酸序列（ SEQ ID NO:6 ) 中，第 1-19位为信号肽序列，第 20-50位为 GLP-l(7-37)序列，第 51-65 位为肽接头序列，第 66-287位为 IgG2的 Fc序列（其铰链区为 VECPPCP ( SEQ ID NO:12 )， 且 C端去除 K )。在 GLP-1-Fc-l的基因序列（ SEQ ID NO:l )中，第 1-57位为信号肽基因序列，第 58-150位为 GLP-l(7-37) 基因序列， 第 151-195位为肽接头基因序列， 第 196-864位为 IgG2 Fc 基因序列； 在 GLP-l-Fc-2的基因序列 （ SEQ ID NO:2 ) 中， 第 1-57位 为信号肽基因序列， 第 58-150位为 GLP-l(7-37)基因序列， 第 151-195 位为肽接头基因序列，第 196-876位为 IgG2 Fc基因序列；在 GLP-l-Fc-3 的基因序列（SEQ ID NO:3 )中，第 1-57位为信号肽基因序列，第 58-150 位为 GLP-l(7-37) 基因序列， 第 151-195 位为肽接头基因序列， 第 196-861位为 IgG2的 Fc基因序列。

在获得如上编码所述融合蛋白的三个融合基因 后， 采用分子克隆 技术， 进一步将上述融合基因克隆至真核表达载体 293, 构建真核表达 载体 293-GLP-l-Fc(IgG2)。

对于本发明， 可以使用任何合适的真核表达载体。

二、 表达本发明融合蛋白的一般方法

用如上所述获得的表达载体 293-GLP-l-Fc(IgG2)转染宿主真核细 胞 FreeStyle 293F, 使其产生融合蛋白。 用重组 DNA转染宿主细胞的 技术是本领域熟知的。

三、 收获并纯化重组产生的融合蛋白

三个亚类的 IgG UgGl , IgG2和 IgG4 )的非抗原结合部分， 即 Fc 段， 可与葡萄球菌蛋白 A ( Staphylococci Protein A, SPA )结合， 借此 可纯化上述亚类的抗体或含相应亚类 Fc段的融合蛋白， 为其工业化制 备提供便利纯化方法。 用 Protein A亲和柱分离纯化得到 Fc融合蛋白。 通过 SDS-PAGE及 Western-blot鉴定融合蛋白。

四、 本发明所述融合蛋白的体内外活性检测

(一 )本发明所述融合蛋白在体外与小鼠 P胰腺瘤细胞结合活性检 测

用融合蛋白与 GLP-1受体（GLP-1R ) 阳性的小鼠 P胰腺瘤细胞 P

-TC-6 进行直接结合活性的检测 （方法参考 PLoS ONE.2010;5(9): el2734 ) , 结果显示本发明的融合蛋白与细胞上 GLP-1R的结合呈现特 异性的浓度梯度依赖性的增加。 本结果提示， 本发明所述与 Fc融合的 GLP-1可与细胞表面的相应受体特异性地结合。

(二） 本发明所述融合蛋白在体外对 cAMP水平的影响

将本发明的融合蛋白加入到 P -TC-6 细胞中， 按文献所述方法 ( Diabetes. 2004;53:2492-2500 ) 测定 cAMP水平， 结果显示本发明的 融合蛋白在体外引起 cAMP 水平升高， 效果与利拉鲁肽相当。 本结果 提示， 在与细胞表面相应受体结合以后， 本发明所述与 Fc 融合的 GLP-1可激活该受体介导的细胞内信号传递。

(三）本发明所述融合蛋白在体外对小鼠 P胰腺瘤细胞胰岛素分泌 水平的影响

将本发明的融合蛋白加入到 P -TC-6 细胞中， 按文献所述方法 ( Shi-Ying Ding, et al. JBC.2011;286(19):16768-16774 , PLoS ONE. 2010;5(9):el2734 ) 测定细胞分泌胰岛素的水平， 结果显示在低浓度葡 萄糖的培养基中，本发明所述的三种融合蛋白 或利拉鲁肽对小鼠 β胰腺 瘤细胞 P -TC-6的促胰岛素分泌作用不明显； 而在含高浓度葡萄糖的培 养基中， 浓度为 3、 30、 300和 1000ηΜ的三种融合蛋白均可不同程度 地显著增加 P -TC-6细胞的胰岛素分泌水平， 其效果与利拉鲁肽相当， 均呈现出浓度梯度依赖性的增加。

(四）本发明所述融合蛋白对高糖灌注下大鼠� �清中胰岛素水平的 影响

才艮据文献所述（ Diabetes Metab Res Rev.2010;26:287-296 )( Diabetes. 2004;53:2492-2500 ), 用正常 SD ( Sprague-Dawley )大鼠建立高糖灌注 模型以测定药物促进血清中胰岛素水平升高的 方法， 为检测 GLP-1 类 促胰岛素药物常用的药效检测方法。 本发明即利用该模型， 给 SD大鼠 皮下注射本发明的融合蛋白 （3 nM/kg )或利拉鲁肽（3nM/kg, 阳性对 照）或生理盐水（阴性对照） ， 禁食过夜（ 16-18 h )后依次静脉持续灌 注生理盐水 20分钟、 低浓度葡萄糖 （50 mg/kg/min ) 30分钟、 高浓度 葡萄糖 （150 mg/kg/min ) 30分钟。 以生理盐水灌注结束的时间点为 0 点， 分别在 -20、 0、 30和 60分钟时采血。 结果显示， 在皮下注射生理 盐水的健康大鼠组中，静脉灌注生理盐水或低 浓度葡萄糖后， 与无静脉 灌注组相比，血清胰岛素水平无明显升高， 而在静脉灌注高浓度葡萄糖 后， 血清胰岛素水平显著升高。 在给予皮下注射本发明的三种融合蛋 白或利拉鲁肽的健康大鼠组中， 对其静脉灌注生理盐水依然不能诱导 血清胰岛素水平升高， 而在低浓度和高浓度葡萄糖静脉灌注后， 血清 胰岛素水平均比皮下注射生理盐水组相应浓度 葡萄糖灌注所诱导的胰 岛素水平有不同程度的升高。 实验动物体内这种葡萄糖浓度依赖性的 促胰岛素分泌作用， 提示本发明的 GLP-1 ( 7-37 ) 与 Fc融合的蛋白皮 下注射可吸收， 且能够发挥与利拉鲁肽相同的药理作用。

(五）本发明所述融合蛋白与新生儿受体（ FcRn )蛋白结合能力的 检测

按文献所述方法（ The Journal of Biological Chemistry.2001; 276(9): 6591-6604 ) , 将本发明的融合蛋白包被于酶标板上， 加入 His标记的 FcRn蛋白， 在酸性 （pH=6.0 ) 条件下孵育， 用鼠源抗 His单抗和辣根 过氧化酶（HRP )标记的羊抗鼠抗体 ( Goat anti-human IgG-HRP )检 测结合于所述融合蛋白上的 FcRn。 结果显示， 与 IgGl 型对照抗体的 Fc段相比， 本发明融合蛋白的 Fc段具有与 IgGl相当的结合 FcRn的 能力。 由于在血管内皮细胞上 FcRn介导的含 Fc段蛋白的细胞内吞和 循环能维持血清中该蛋白浓度的稳态， 本实验结果提示所述 GLP-1-Fc 融合蛋白的体内半衰期可能与 IgGl型抗体相当， 远高于利拉鲁肽（需 一天注射一次）， 将达到 1-2周注射一次的频率。

(六） 本发明所述融合蛋白的效应子活性检测

按文献所述方法 （ Angiogenesis.2004;7:335-345, Cancer Res.2010: 4481-4489 ) , 将 FcyRIIIa(CD16a)蛋白包被于酶标板上， 将本发明的融 合蛋白加入板中， 检测其与 FcyRIIIa(CD16a)蛋白的结合能力。 结果显 示， 与 IgGl 型对照抗体的 Fc 段相比， 本发明融合蛋白的 Fc 段与 FcyRIIIa(CD16a)蛋白的结合能力极低， 从而可避免其 Fc段的效应子功 能 （如 ADCC ) 。

如上所述， 体外及体内生物学活性的检测结果表明， 本发明制备 的三种融合蛋白不仅具有 GLP-1 ( 7-37 )多肽正常的生物学活性， 其生 物半衰期较 GLP-1 ( 7-37 ) 多肽明显延长， 而且其 Fc段的效应子功能 低， 不会发生与治疗目的不相关的效应子功能， 使药物的使用更安 全。

本发明的积极效果在于： 融合蛋白中 GLP-1 ( 7-37 )可保持其天然 功能， 人 IgG2型 Fc部分则能够延长其半衰期， 而且有利于融合蛋白的 纯化， 同时不引起与治疗作用不相关的效应子作用。

本发明中融合蛋白半衰期延长的原因如下：

1) GLP-l(7-37)部分的第 8位氨基酸由丙氨酸（Ala )替换为甘氨酸 ( Gly ) , 可降低 DPP-4对其的降解， 从而延长半衰期。

2)所述融合蛋白的 Fc部分可与 FcRn结合， 从而使该融合蛋白的半 衰期与 IgGl型和 IgG2型抗体相当。 下列实施例用于帮助描述如何实施本发明的各 实施方案。 这些实 施例是为了举例说明， 而不是以任何方式限制本发明的范围。

实施例 1 本发明所述融合蛋白表达载体的构建

编码本发明所述融合蛋白 GLP-1-Fc-l的基因 （SEQ ID ΝΟ:1 ) 由 上海捷瑞生物工程有限公司合成并克隆至 pGEM-T质粒载体， 该基因 5， 端含有 EcoR I、 Not I、 Hind III酶切位点， 3， 端含有 TGA终止密 码子和 Pme I、 Xho I、 BamH I酶切位点， 将所述 pGEM-T质粒载体 命名为 GLP-1-Fc-1-T。

用 EcoR I和 BamH I (购自 NEB公司）按照说明书对 GLP-1-Fc-l-T 进行双酶消化（37Ό , 4小时）， 1%琼脂糖凝胶电泳（图 2A )显示， 双 酶消化后产生长度为 950 bp左右的编码 GLP-1-Fc-l融合蛋白的基因片 段和长度为 3000 bp左右的 pGEM-T质粒载体片段。 使用胶回收试剂 盒按照说明书说明回收基因片段 GLP-1-Fc-l (胶回收试剂盒购自 Axygen公司） 。 同时将 293表达载体 （ FreeStyle MAX293 Expression System, K900-20, 购自 Invitrogen公司）用 EcoR I和 BamH I双酶消 化 （37Ό , 4小时）。 图 2A示出了双酶消化后长度为 4300 bp左右的 293-EcoR I/BamH I片段， 使用上述胶回收试剂盒回收该片段。

将上述酶切获得的两个基因片段 GLP-1-Fc-l和 293-EcoRI/BamHI 用 T4 DNA连接酶（购自 NEB公司）进行连接（ 16Ό , 16小时） ， 连 接产物使用热休克法转化到大肠杆菌中（ 42Ό , 90秒），铺板（ Amp+ LB 培养基， 即氨苄抗性的 Luria-Bertani培养基）， 挑取克隆并提取质粒。 将质粒用 EcoR I/BamH I双酶消化（37"C , 2小时）进行鉴定筛选， 筛 选得到的阳性克隆即含有构建成功的真核表达 载体 293-GLP-l-Fc- 如 图 2C所示） 。

以 GLP-1-Fc-l-T质粒为模板， 分别以 1,2和 3,4为引物， 经聚合酶 链反应 （PCR )扩增获得 GLP-l-Fc-2对应基因的两段中间产物； 再以 所述两段中间产物为模板， 1,4为引物， 经 overlap-PCR (重叠 PCR ) 扩增获得 GLP-l-Fc-2的基因片段。

以 GLP-1-Fc-l-T 质粒为模板， 1,4 为引物， 经 PCR 扩增获得 GLP-l-Fc-3的基因片段。

PCR引物如下：

1. 5'-GCGGCCGCGAATTCATGGAGTTGGGACTGTCTTG-3' ( SEQ ID NO:7 )

2. 5'-CCACCGCCACCGTCGCTCGCGTTTACAACACAGCTC-3' ( SEQ ID NO:8 )

3. 5' GGTGGCGGTGGCAGCGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTG C-3' ( SEQ ID NO:9 )

4. 5'-GTTTAAACGGATCCTCAACCCGGAGACAGGGAGAG-3' ( SEQ ID NO:10 ) 图 2B显示的分别是长度均为 950 bp左右的编码 GLP-l-Fc-2和

GLP-l-Fc-3 融合蛋白的基因片段。 使用上述方法回收基因片段 GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3, 用 EcoR I和 BamH I双酶消化 ( 37Ό , 4 小时）， 与同样用 EcoR I和 BamH I双酶消化（37Ό , 4小时）后的 293-EcoR I/BamH I片段用 T4 DNA连接酶连接（ 16Ό , 16小时）， 将 连接产物使用热休克法转化大肠杆菌 （42Ό , 90秒）， 铺板（Amp+ LB 培养基）， 挑取克隆并提取质粒。 将质粒用 EcoR I/BamH I 双酶消化 ( 37Ό , 2小时）进行鉴定筛选， 筛选得到的阳性克隆即分别含有构建 成功的真核表达载体 293-GLP-1-FC-2和 293-GLP-l-Fc-3 (如图 2D所 示） 。

图 1 为构建成功的融合蛋白表达载体 293-GLP-l-Fc(IgG2)的基因 结构图。 293-GLP-l-Fc-l、 293-GLP-l-Fc-2和 293-GLP-l-Fc-3三种表 达载体的基因结构相同， 不同的是在 EcoR I和 BamH I酶切位点之间 950bp左右的基因分别编码 GLP-1-Fc-1、 GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3 融合蛋白， 其核苷酸序列分别如 SEQ ID NO:l , SEQ ID NO:2和 SEQ ID NO:3所示， 其编码的氨基酸序列分别如 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6所示。 图 2C和图 2D的结果则分别显示了真核 表达载体 293-GLP-l-Fc-l、293-GLP-l-Fc-2和 293-GLP-l-Fc-3经 EcoR I/BamH I双酶消化后鉴定的结果， 其在 950bp和 4300bp左右处分别有 正确的融合蛋白基因片段和 293-EcoR I/ BamH I片段。

实施例 2 本发明所述融合蛋白的表达

实施例 1 中 所构建的重组表达载体 293-GLP-l-Fc-l 、 293-GLP-l-Fc-2和 293-GLP-l-Fc-3的表达， 可采用瞬时转染 FreeStyle 293F细胞（ R790-07, 购自 Invitrogen公司）的方法。 转染前 24小时， 将 FreeStyle 293F细胞按 6 10 ⁵ 个细胞 /毫升 （ ml )传代， 于恒温摇床 135 转， 37Ό , 8% C0 ₂ 条件下培养， 使得转染当天的细胞密度约为 1.2-1.5 10 ⁶ /ml。 用 FreeStyle 293F培养基（ 12338-018,购自 Invitrogen 公司）稀释细胞， 至密度为 l x l0 ⁶ /ml。 为确保最佳转染效果， 细胞活 力应大于 95%。

将转染用试剂 FreeStyle Max Reagent ( 16447-500, 购自 Invitrogen 公司）轻度颠倒混匀 4次。 在转染用培养液 OptiPRO SFM( 12309-050, 购自 Invitrogen公司）中分别加入 625 293-GLP-l-Fc-l或 293-GLP-1- Fc-2 或 293-GLP-l-Fc-3 载体质粒， 并用 OptiPRO SFM 补充体积至 10ml, 混匀。 另取一支离心管， 用 OptiPRO SFM稀释 625μ1 FreeStyle Max Reagent 至 10 ml , 轻度颠倒混匀。 将稀释的质粒和稀释的 FreeStyle Max Reagent混匀， 室温孵育 15分钟。 緩慢将 20 ml 混合液 加入装有 500 ml FreeStyle 293F培养基的摇瓶中。 摇瓶于恒温摇床培养 7天（135转， 37Ό , 8% C0 ₂ ) 。

7天后， 将分别表达 GLP-1-Fc-l或 GLP-l-Fc-2或 GLP-l-Fc-3三 种融合蛋白的细胞用冷冻离心机以 9000转 /分的速度离心 20分钟， 收 集上清液进行下一步蛋白纯化。

实施例 3 本发明所述融合蛋白的纯化

将上述实施例 2获得的分别含本发明的三种融合蛋白的 FreeStyle 293F细胞上清液， 在 AKTA仪器 （购自 GE Healthcare Bio-Sciences 公司） 上过 Protein A柱 （71-5000-09 AD, 购自 GE Healthcare Bio- Sciences公司 )，分别捕获三种融合蛋白， 用 50 mM拧檬酸 -拧檬酸钠緩 冲液（PH=3.3 ) 洗脱， 分别收集洗脱物 （各约 0.5 ml ) , 在其中加入 100 μΙ ΙΜ三羟曱基氨基曱烷 -盐酸（Tris-HCL )緩冲液（ΡΗ=11·0 ) 中 和至中性。 经 OD280nm测定各自的蛋白含量后， 分别经 10K透析膜在 碑酸盐緩冲液 PBS ( 0.01M Na ₂ HP0 ₄ 12H ₂ 0 + 0.002M KH ₂ P0 ₄ P + 0.14M NaCl + 0.002M KC1, PH=7.2 ) 中透析， 经 0·22μιη滤器 （购自 Millipore公司） 过滤除菌后 -80Ό保存。

实施例 4 本发明所述融合蛋白的 SDS-PAGE和 Western-blot检测 纯化后的三种融合蛋白经 50mM DTT (二硫苏糖醇， DL- Dithiothreitol )还原后用 10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯度和分子量 大小， 同时通过 Western-blot 进一步鉴定其性质和分子量。 将电泳后 的胶通过电转移方法（ 300mA, 80分钟）转移至 PVDF ( Polyvinylidene Fluoride,聚偏氟乙烯）膜上， 将膜用 10%脱脂奶粉封闭后加入 1 μ _§ /ιη1 抗人 GLP- 7-37 )鼠单抗（购自 BioPorto公司）， 4°C孵育过夜， PBST (含 0.02%吐温 -20的 PBS緩冲液） 洗两遍， 加入 HRP标记的羊抗鼠 IgG ( H+L ) 抗体（ l g/ml, 购自 R&D公司） ， 室温孵育 45分钟后再 用 PBST 洗两遍， 最后用电化学发光法 （Electrochemiluminescence, ECL ) 显色。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（图 3A ) 和 Western-blot (图 3B ) 的结果均显示， 在还原条件下， 所述的三种融合蛋白 GLP-1-Fc-1、 GLP-l-Fc-2. GLP-l-Fc-3均呈现分子量为约 40 KDa的条带， 与所述融 合蛋白的理论分子量一致。 这些结果表明， 本发明所构建的三种融合 蛋白， 其结构和性质均正确。

实施例 5本发明所述融合蛋白体外结合 P -TC-6细胞的活性测定 收集小鼠 β胰腺瘤细胞 P -TC-6 (购自 ATCC ) 8.5 x 10 ⁶ 个， 离心后 用 8.5ml固定液（ IC Fixation buffer,购自 Invitrogen公司）固定（ 4Ό , 10分钟） 。 再次离心后用 3.4 ml PBS重悬， 以 2.5 x 10 ⁵ /孔（ 100 μΐ ) 接种于 96孔 U型板。 同时分别将本发明的三种融合蛋白各从 500 μ _§ /ιη1 开始， 用 PBS进行 4倍比稀释共 10个梯度。

96孔 U型板的细胞经离心后弃上清， 按照 ΙΟΟμΙ/孔加入稀释后的 融合蛋白， 4Ό孵育 1小时。 再次将细胞离心，弃上清， 用 200 μ1/孔 PBS 洗涤两次， 加入 l g/ml ( 100 μΐ/孔 ) HRP标记的羊抗人抗体 IgG (购 自 Bethyl laboratories公司） ， 并在 4Ό孵育 45分钟。 细胞离心后， 用 200 μΐ/孔 PBS洗涤三次， 加入 100 μΐ/孔显色液（底物緩冲液 9ml +底物 显色液 1ml +0.3% H ₂ 0 ₂ 溶液 ΙΟμΙ, 其中底物緩冲液为 0.02Μ杵檬酸 +0.01M Na ₂ HP0 ₄ . 12H ₂ 0,底物显色液为 2mg/ml的 TMB, 即 3，3'，5，5'- 四曱基联苯胺 ) , 室温孵育 15分钟显色后加入 50 μΐ/孔终止液（ 1M硫 酸） ， 在 Μ5多功能酶标仪 (购自 Molecular Devices公司） 450/570nm 波长下读出吸光值， 结果在图 4示出。

如图 4所示， 本发明的三种融合蛋白 GLP-1-Fc-1、 GLP-l-Fc-2和 GLP-l-Fc-3 均与 P -TC-6 细胞表面的 GLP-1R 呈现特异性的结合活 性。

实施例 6 本发明所述融合蛋白在体外对 P -TC-6细胞 cAMP水平 的影响

β -TC-6 细胞以 Ι χ ΙΟ ⁴ /孔 （5μ1/孔， 无血清不含葡萄糖的 DMEM 培养基， 购自 Gibco公司）接种于 384孔板， 加入含 5000μΜ cAMP抑 制剂 IBMX ( 3-isobutyl-l-methylxanthine, 3-异丁基 -1-曱基黄嘌呤， 购 自 Sigma公司）的无血清不含葡萄糖的 DMEM培养基 5 使 IBMX 终浓度为 2500 μΜ ) , 使所述细胞在 37Ό孵箱饥饿 4-5小时。

将 384孔板以 800转 /分钟离心 1分钟， 弃 5 μ1/孔上清后， 加入 250 mM 葡萄糖及 25 mM IBMX各 1 μΐ/孔， 再分别加入本发明的三种融合 蛋白和对照药物利拉鲁肽（购自 Novo Nordisk公司）各 1 μΐ/孔， 使三 种融合蛋白和利拉鲁肽的终浓度均为 2、 10、 50和 250ηΜ四个浓度， 以不加蛋白或加入利拉鲁肽的组 （0 ηΜ ) 为对照， 最后加入 1 μΐ/孔无 血清不含葡萄糖的 DMEM培养基， 轻摇 384孔板混匀， 室温作用 30 分钟。

根据 cAMP检测试剂盒（ dynamic2 Kit, 购自 Cisbio公司）的实验 步骤设立对照及标准曲线， M5 多功能酶标仪读数（Flu668/620nm ), 结果在图 5示出。

图 5的结果显示， 不同浓度的本发明的三种序列的融合蛋白在体 外 均可不同程度地升高小鼠 β胰腺瘤细胞 P -TC-6内的 cAMP水平， 其效 果与利拉鲁肽相当，均呈现出浓度梯度依赖性 的增加。 本结果提示， 继 与细胞表面相应受体结合以后， 与 Fc融合的 GLP-1可激活该受体介导 的细胞内信号传递。

实施例 7 本发明所述融合蛋白在体外对 P -TC-6 细胞胰岛素分泌 水平的影响

将培养在含 10% FBS (胎牛血清， 购自 Gibco公司）的 DMEM培 养基中的 β -TC-6细胞以 2.5 10 ⁵ /孔 ( 500μ1 )接种于 24孔板， 37Ό培 养过夜。 弃上清， 用 Krebs-Ringer Buffer( KRB緩冲液，125mM NaCl+ 5.9mM KC1 + 1.28mM CaCl ₂ + 1.2mM MgCl ₂ + 25mM HEPES + 0.1 % BSA, pH7.4 )洗涤一次后再加入 KRB緩冲液， 37"C饥饿细胞 2小时。 弃上清， 分别加入不同浓度的所述三种融合蛋白和对照 药物利拉鲁 肽， 使四种样品的终浓度均为 0、 3、 30、 300、 ΙΟΟΟηΜ四种 （稀释液 均为 KRB緩冲液 +16.8mM葡萄糖）， 以不加所述四种样品的低浓度葡 萄糖组（含 KRB緩冲液 +2.8mM葡萄糖）作为阴性对照组（ neg ) , 37°C 作用 1小时。

根据胰岛素检测试剂盒（Insulin Kit, 购自 Cisbio公司） 的实验步 骤设立对照及标准曲线。 胰岛素标准品的初始浓度为 20ng/ml, 以二倍 比稀释 7个梯度，同时用 KRB緩冲液稀释样品（所述细胞上清）至 0~20 ng/ml (稀释 10倍）， 分别取 ΙΟμΙ的 KRB緩冲液、 稀释的标准品、 稀 释的样品加至 384孔板中， 再分别加入 5μ1/孔两种荧光标记的抗体抗胰 岛素 Ab-cryptate和抗胰岛素 Ab-XL665(均来自 Insulin Kit,购自 Cisbio 公司） ， 轻摇 384孔板混勾， 室温孵育 2小时。 M5多功能酶标仪读数 ( 波长 1 : 激发 /发射 =314nm/668nm； 波长 2 : 激发 /发射 = 314nm/620nm ) 。

数据处理如下： 比值（ Ratio ) =A668nm / A620nm 104 , Deta F = (标准品或样品比值 ― KRB比值） I KRB比值， 绘制标准曲线， 并计算 出样品胰岛素的值。

图 6的结果显示， 在体外普通细胞培养基（结果未显示）或含低 浓 度葡萄糖（2.8mM )的培养基中 （neg ), 本发明所述的三种融合蛋白或 利拉鲁肽对小鼠 β胰腺瘤细胞 β -TC-6的促胰岛素分泌作用不明显（以 此为对照）； 而在含高浓度葡萄糖（16.8mM )的培养基中， 不含样品的 阴性对照组 （0.0 )对 P -TC-6 细胞的促胰岛素分泌作用有所增加， 3、 30、 300、 1000nM的三种融合蛋白则均可不同程度地显著升 高 P -TC-6 细胞的胰岛素分泌水平， 其效果与利拉鲁肽相当，均呈现出浓度梯度依 赖性的增加。 本结果提示， 与 Fc融合的 GLP-1激活细胞表面相应受体 的最终效应为葡萄糖浓度依赖性地促进胰岛素 的分泌。

实施例 8 本发明所述融合蛋白对高糖灌注下大鼠血清中 胰岛素水 平的影响

给 SD ( Sprague-Dawley ) 大鼠皮下注射本发明的三种融合蛋白 （3 nM/kg )或利拉鲁肽（ 3nM/kg )或生理盐水（阴性对照）， 禁食过夜（ 16-18 h )后依次静脉持续灌注生理盐水 20分钟、低浓度葡萄糖（ 50 mg/kg/min ) 30分钟、 高浓度葡萄糖（150 mg/kg/min ) 30分钟。 以生理盐水灌注结 束的时间点为 0点，分别在 -20、 0、 30和 60分钟时采血。 将血液以 4000 转 /分钟离心 10 分钟， 分离血清， 用文献 （Diabetes Metab Res Rev.2010;26: 287-296 ) ( Diabetes. 2004;53:2492- 2500 )所述方法测定血 清中胰岛素水平。

图 7A和图 7B的结果显示， 在皮下注射生理盐水的健康大鼠组（阴 性对照组）中， 静脉灌注生理盐水或低浓度葡萄糖后， 与无静脉灌注组 ( 0 )相比， 血清胰岛素水平无明显升高； 而在静脉灌注高浓度葡萄糖 后， 血清胰岛素水平显著升高。 在给予皮下注射本发明的三种融合蛋 白或利拉鲁肽的健康大鼠组中， 对其静脉灌注生理盐水依然不能诱导 血清胰岛素水平的升高；而在低浓度和高浓度 葡萄糖静脉灌注后， 血清 胰岛素水平均比皮下注射生理盐水组相应浓度 葡萄糖灌注所诱导的胰 岛素水平有不同程度的显著升高。 实验动物体内这种葡萄糖浓度依赖 性的促胰岛素分泌作用， 提示本发明所述的融合蛋白皮下注射可吸 收， 且能够发挥与利拉鲁肽相同的药理作用。

实施例 9 本发明所述融合蛋白与 FcRn结合能力的检测

将本发明的三种融合蛋白和 IgGl型对照抗体 ( Remicade, 购自西 安杨森公司）分别用 PBS稀释至 5μ _§ /ιη1, 按照 ΙΟΟμΙ/孔加入酶标板中， 4 °C包被过夜。 PBST洗板 4次后加入 1% BSA (牛血清白蛋白） 300μ1/ 孔， 室温封闭 1小时。 PBST(PH=6.0)洗板 4次后， 将 FcRn蛋白（购自 Sino Biological公司）用 PBS緩冲液从 5 g/ml开始二倍比稀释共 7个 梯度， 按照 ΙΟΟμΙ/孔加入酶标板中， 在酸性（ ρΗ=6.0 )条件下室温孵育 1小时。 PBST(PH=6.0)洗板 4次， 将抗 His的鼠单抗（购自 R&D公司） 用 PBS緩冲液稀释至 l g/ml,按照 ΙΟΟμΙ/孔加入酶标板中， 室温孵育 1 小时。 PBST(PH=6.0)洗板 4次， 将 HRP标记的羊抗鼠抗体（ Goat anti- mouse IgG-HRP , 购自 R&D公司）用 PBS緩冲液稀释至 l g/ml, 按照 ΙΟΟμΙ/孔加入酶标板中， 室温孵育 1小时。 PBST(PH=6.0)洗板 4次， 加 入 ΙΟΟμΙ/孔 ΤΜΒ显色液， 室温孵育 15分钟显色， 加入 50μ1/孔终止 液， 在 Μ5多功能酶标仪上 450/570nm波长下读出吸光值， 结果在图 8 示出。

图 8 的结果显示， 本发明的三个序列融合蛋白的 Fc段均具有与 IgGl型对照抗体的 Fc段相当的结合 FcRn的能力。 由于在血管内皮细 胞上 FcRn介导的含 Fc段蛋白的细胞内吞和循环能维持血清中该蛋� �� 浓度的稳态， 本实验结果提示 GLP-1-Fc融合蛋白的体内半衰期可能与 IgGl型抗体相当， 远高于利拉鲁肽（需一天注射一次）， 将达到 1-2周 注射一次的频率。

实施例 10 本发明所述融合蛋白的 Fc段效应子活性检测

将 FcyRIIIa(CD16a)蛋白 （购自 Sino Biological公司）用 PBS緩冲 液稀释至 0.25μ _§ /ιη1 , 按照 ΙΟΟμΙ/孔加入酶标板中， 4 Ό包被过夜。

PBST洗板 4次后加入 1% BSA 300μ1/孔， 室温封闭 1小时。 本发明的 三种融合蛋白和对照品 IgGl型抗体（ Herceptin, 购自 Roche公司）从 200μ _§ /ιη1开始 4倍比稀释共 7个梯度， 分别与从 100μ _§ /ιη1开始 4倍比 稀释的兔抗人 κ链抗体（Rabbit Anti-Human κ , 购自 R&D公司， 共 7个梯度）按 1:1混匀， 室温孵育 1小时。 PBST洗板 4次后， 将孵育 后的混合溶液以 ΙΟΟμΙ/孔加入所述包被有 FcyRIIIa(CD16a)蛋白的酶标 板中， 室温孵育 2小时。 PBST洗板 4次后， 以 ΙΟΟμΙ/孔加入 PBS稀释 的 l g/ml HRP标记的羊抗人 IgG H&L链的 F(ab，) ₂ 抗体片段（ Goat anti-Human IgG H&L chain F(ab') ₂ Fragment-HRP, 购自 CalBiochem 公司） ， 室温孵育 1小时。 PBST洗板 4次， 加入 ΙΟΟμΙ/孔 ΤΜΒ显色 液， 室温孵育 15分钟显色后加入 50μ1/孔终止液， 在 Μ5多功能酶标仪 上 450/570nm波长下读出吸光值， 结果在图 9示出。

图 9的结果显示， 与 IgGl型对照抗体的 Fc段相比， 本发明的三种 融合蛋白的 Fc段与 FcyRIIIa(CD16a)蛋白的结合能力均很低， 从而可 避免其 Fc段的效应子功能 （如 ADCC ) , 降低药物的副作用。