Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится к области получения лекарственных препаратов, и может быть использовано в фармакологии, медицине и ветеринарии.

Предшествующий уровень техники

Способами повышения эффективности лекарственных средств являются оптимизация их фармакокинетики и/или фармакодинамики и/или снижение токсичности посредством химической модификации молекулы лекарственного средства и/или сочетанным использованием с другим химическим соединением или соединениями.

Химическое соединение или соединения, используемые в фармакологических решениях, могут обладать или нет собственной фармакологически значимой активностью, но обязательно должны обеспечить реализацию эффекта лекарства либо посредством увеличения селективности его действия только на свои фармакологические мишени и/или обеспечения необходимых и достаточных концентраций в микроокружении биологических структур-мишеней и/или снижения токсичности.

Так известен ряд фармакологических решений, включая «Aмoкcиклaв», содержащий в своем составе амоксициллин и клавулановую кислоту, «Tиeнaм», содержащий имипенем в сочетании со специфическим ингибитором фермента дигидропептидазы почек - циластатином. Клавулановая кислота препятствует разложению бактериальными ферментами амоксициллина, что способствует достижению терапевтического эффекта меньшим количеством препарата в сравнении с его использованием без клавулановой кислоты. Циластатин тормозит метаболизм имипенема в почках, что приводит к использованию антимикробного потенциала практически всех молекул антибиотика и достижению. терапевтического эффекта меньшим количеством молекул имипенема в сравнении с его использованием без циластатина [1].

Реализация селективности действия лекарственного средства является сложной задачей, обусловленной в числе прочего как природой конкретной связи лекарство-мишень, так и силой этой связи. Доказано, что лекарственные средства селективного действия слабо связываются со своей фармакологической мишенью [1]. Подобное обстоятельство означает необходимость нахождения фармакологической мишени в определенной структурной конфигурации, которая обеспечивает доступность центров взаимодействия для молекулы лекарственного средства. Установлено, что половине белковых молекул присуща полифункциональность [2, 3], которая на структурном уровне выражается в определенной конформации белковой молекулы, адекватной для выполнения физиологически обусловленной функции. Вне выполнения той или иной, физиологической функции молекула пребывает в неструктурированном состоянии. Различные виды химической модификации - фосфорилирование, тиоляция, глутатионелирование, окисление и др., предшествуют формированию определенной структурной конформации и выполнению физиологической функции. В этой связи, возможность достижения эффекта тем или иным лекарством и особенно селективно действующим будет определяться нахождением молекулы- мишени в соответствующей конформации.

Существует, большое количество лекарственных средств, потенциально полезных для лечения заболеваний, однако часто не обеспечивающих желаемого эффекта вследствие особенностей фармакодинамики и/или фармакокинетики. Увеличение дозы препарата решает проблему достижения терапевтического эффекта частично и сопряжено, как правило, с усилением токсичности. В качестве примера показательными являются средства таргетной терапии онкологических заболеваний рецептор опосредованного действия.

Так, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) является одним из объектов, активно изучаемых в качестве противоопухолевой мишени [4, 5, 6].

Существует ряд фармакологических решений, направленных на блокирование реализуемого через EGFR биологического эффекта:

1) использование моноклональных антител, связывающих внеклеточный участок рецептора: «Эpбитyкc» - моноклональные антитела к HER1 , «Гepцeптин» - моноклональные антитела к HER2/neu; 2) применение рекомбинантных пептидных лигандов EGF и/или ТGF-а, конъюгированных с проникающими внутрь клетки цитотоксинами; 3) использование низкомолекулярных ингибиторов, способных воздействовать на внутриклеточный домен EGFR и прерывать процесс тирозинкиназного фосфорилирования сигналпередающих белков - пресса, тирфостины, генистеин, SU6668, ZD6474.

Взаимодействие антител с центром иммунной активности рецептора, ингибиторов с активным центром каталитической активности требует доступности этих центров, которая в свою очередь определяется конформацией белковой молекулы рецептора. Конформация димерной молекулы EGFR делает возможным взаимодействие ингибиторов тирозинкиназной активности и моноклональных антител с сайтами их связывания. Соответствующая конформация димерной молекулы EGFR достигается в числе прочего, посредством окислительной модификации, тиоляции или глутатионелирования сульфгидрильных групп [7].

В этой связи, средства, инициирующие процесс тиоляции или глутатионилирования молекулы EGFR, инициирующие образование димерной молекулы рецептора при их сочетанном применении с лекарственными препаратами, взаимодействующими с EGFR, способны повысить тропность лекарства к рецептору эпидермального фактора роста.

Поэтому до сих пор представляет интерес создание соединений, которые могут воздействовать на EGFR, повышая его сродство к лекарственным средствам.

Еще одной интересной мишенью для воздействия является Р-гликопротеин (Рgр). Рgр представляет собой трансмембранный белок цитоплазматической мембраны, у человека кодируется генами MDR1 и MDR2, выполняет функцию АТФ- зависимого транспортёра из клетки, против градиента концентрации, молекул различных соединений, включая молекулы лекарственных препаратов [4]. Функциональная активность Рgр в той или иной степени определяется практически у всех клеток организма млекопитающих эпидермального и мезенхимального происхождения [4]. Р-гликопротеин защищает клетки от молекул токсических веществ, включая молекулы лекарства, удаляя их из клетки от внутриклеточной мишени. Активность Рgр у эпителиальных клеток, выявляемая только на апикальной мембране, препятствует попаданию молекул токсического вещества, включая молекулы лекарства в организм или ткани отдельного органа. Так благодаря активности Рgр, локализованного на апикальной поверхности эпителия кишечника, ограничивается поступление молекул токсических веществ, включая молекулы лекарства, во внутреннюю среду организма. Р-гликопротеин, локализованный на апикальной поверхности эндотелия сосудистого сплетения мозга, ограничивает поступление в ткани мозга молекул вредных веществ (включая молекулы лекарства), функционируя как компонент гематоэнцефалического барьера. Низкая активность Рgр или ее отсутствие коррелирует с повышенным проникновением молекул чужеродных соединений, включая молекулы лекарства, в ткани мозга и сниженной способностью выведения токсинов в желчь [8]. Активность Рgр регулируется на уровне транскрипции, трансляции и химической модификации белковой молекулы [9]. Транскрипция гена /WDRf/активность Рgр возрастают при действии факторов роста, гормонов, противоопухолевых препаратов, некоторых антибиотиков, ультрафиолетового облучения, агентов, индуцирующих дифференцировку, форболовых эфиров, канцерогенов и других химических, физических и биологических агентов [4]. Множественность инициирующих активность Рgр агентов реализуется через различные сигнальные пути, включая сигнальные пути, зависимые от активации белка p21 (Rаs-белок), фосфатидилинозитолкиназы (РIЗК), протеинкиназы С (PKC) [4]. Ингибиторами активности Рgр, действующими на молекулы белка являются блокаторы ионных каналов - хинидин, верапамил, никардипин; антигистаминные средства - терфенадин; антибиотики - циклоспорин, валиомицин, кетоконазол, винбластин; антагонисты гормонов - тамоксифен [1].

Использование ингибиторов активности Рgр в терапевтической практике нашло практическое применение в лечении злокачественных новообразований для подавления лекарственной устойчивости опухолевых клеток [1]. Столь ограниченное применение подхода для повышения эффективности действия других лекарственных средств, молекулы которых являются субстратом Рgр, обусловлено побочным действием ингибиторов Рgр, более опасным, чем достигаемый положительный эффект от действия лекарства. Злокачественные новообразования составляют исключение, так как резистентность опухолевых клеток при использовании цитостатиков означает отсутствие результата химиотерапии, воздействие больших количеств цитостатиков на нормальные клетки и их токсическое поражения. В этой связи оправдано использование ингибиторов Рgр, позволяющих получить терапевтический эффект от средств химиотерапии, преодолеть лекарственную устойчивость опухолевых клеток обусловленную Рgр.

Таким образом, интерес представляют также новые соединения, подавление активности Рgр которыми является физиологически адекватным, что позволило бы избежать типовых токсических эффектов известных ингибиторов Рgр, в частности таких как гемо-, иммунодепрессия, снижение детоксикационной функции клеток печени, нарушение функции сердечно-сосудистой системы и ряда других.

В этой связи целью настоящего изобретения было создание соединения, способного усиливать эффективность действия лекарственных препаратов, за счет повышения сродства мишени к действию лекарства и/или обеспечивающих терапевтически оптимальные концентрации лекарства в микроокружении мишени и/или способных понижать токсичность лекарственных средств. Раскрытие изобретения

Согласно данному изобретению предложены биядерные координационные соединения d-металлов с алифатическими тиолами общей формулы I или их фармацевтически приемлемые соли (соединения по изобретению), способные усиливать эффективность действия биологически активных веществ вводимых в составе лекарственных препаратов:

I

где:

M обозначает атомы металла, независимо выбранные из группы, состоящей из: Pd, Fe, Mn, Со, Ni, Cu, Zn и Mo;

R ¹ и R ² - независимо друг от друга обозначают протон (-H), амино (-NH ₂ ), гидрокси (-ОН), окси (=0), карбокси (-COOH), циано (-CN), Ci _-12 aлкил (обозначен далее как R), C _2- i ₂ aлкeнил, C _2-12 aлкинил, C _1-12 aлкoкcи (-OR), C _{1- 12} aлкилaминo (-NH-R), Ci _-12 aлкoкcикapбoнил (-COOR), Ci.i ₂ aлкилaмидo (-CO- NH-R), ариламидо, причем алкильные группировки, входящие в состав указанных заместителей, могут быть, в свою очередь, замещены одной или более чем одной из следующих групп: гидрокси, окси, карбокси, амино или амидо (-CO-NH ₂ ).

R ³ -R ¹⁰ независимо друг от друга обозначают водород, либо

NHR ³ R ⁴ и NHR ⁵ R ⁶ , взятые вместе, и(или) NHR ⁷ R ⁸ и NHR ⁹ R ¹⁰ , взятые вместе, представляют собой лиганд, содержащий один или несколько донорных алифатических или ароматических атомов азота и занимающие цис- положение у атомов металлов (M). Целесообразно, когда NHR ³ R ⁴ и NHR ⁵ R ⁶ , взятые вместе, и(или) NHR ⁷ R ⁸ и NHR ⁹ R ¹⁰ , взятые вместе, представляют собой диаминосоединение или арил с двумя ароматическими атомами азота.

Целесообразно, когда диаминосоединение представляет собой C ₂ -C ₆ диаминоалкилен, а арил содержит два пиридильных кольца.

Целесообразно, когда R ³ -R ¹⁰ обозначают водород или NHR ³ R ⁴ и NHR ⁵ R ⁶ , взятые вместе, и(или) NHR ⁷ R ⁸ и NHR ⁹ R ¹⁰ , взятые вместе, представляют собой этилендиамин, 2,2 ^' -бидипиpидил (2,2 ^" -bipy), 1 ,10-фeнaнтpoлин (1 ,10-phen) или их производные.

Предпочтительно когда R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH представляет собой 2- аминоэтантиол (аеt, цистеамин), 2-aцeтaмидoэтaнтиoл, цистеин (Суs), метиловый эфир цистеина, этиловый эфир цистеина, ацетилцистеин (Ассуs), метиловый эфир ацетилцистеина, этиловый эфир ацетилцистеина, нитрил ацетилцистеина, 3-мepкaптoпpoпиoнoвyю кислоту, γ-глутамин-цистеин-глицин, гомоцистеин, тиогликолевую кислоту или их производные.

Более предпочтительно, когда R ³ -R ¹⁰ обозначают водород или NHR ³ R ⁴ и NHR ⁵ R ⁶ , взятые вместе, и(или) NHR ⁷ R ⁸ и NHR ⁹ R ¹⁰ , взятые вместе, представляют собой этилендиамин, 2,2 ^' -бидипиpидил (2,2 ^ч -bipy), 1 ,10-фeнaнтpoлин (1 ,10-phen) или их производные, а R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH представляет собой 2-aминoэтaнтиoл (аеt, цистеамин), 2-aцeтaмидoэтaнтиoл, цистеин (Суs), метиловый эфир цистеина, этиловый эфир цистеина, ацетилцистеин (Ассуs), метиловый эфир ацетилцистеина, этиловый эфир ацетилцистеина, нитрил ацетилцистеина, 3-мepкaптoпpoпиoнoвyю кислоту, γ-глутамин-цистеин-глицин, гомоцистеин, тиогликолевую кислоту или их производные.

Соединение по изобретению может иметь формулу

R1

н. ,R2

CH.

Ia,

В предпочтительном случае соединение по изобретению выбрано из группы, включающей [Pd ₂ (μ-S-L-Cys)(м-S-L-CysH)(2,2 ^' -dipy) ₂ ](NO ₃ )з-4.5H ₂ O, Pd ₂ (aetH) ₂ (phen) ₂ ](NOз) ₄ -H ₂ O, [Pd ₂ (M-S-AcCyS) ₂ CdJPy) ₂ ]CI ₂ H ₂ O, [Pd ₂ (M-S-

Accys) ₂ (NH ₃ ) ₄ ]CI ₂ , [Cu ₂ (μ-S-Cys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ .

В одном из воплощений соединение по изобретению представляет собой [Pd ₂ (м-S-L-Cys)(μ-S-L-CysH)(2,2 ^' -dipy) ₂ ](NO ₃ ) ₃ -4.5H ₂ O, кристаллизующееся в триклинной сингонии с пространственной группой P-1 , с параметрами элементарной ячейки (А): а = 13.86, b = 13.82 , с = 12.17, α = 122.13°, β = 103.61°, γ = 91.40°, V(A ³ ) = 1887.0, Z = 1 , характеризующееся ИК-спектром (таблетки KBr), v _max , см ^"1 : 419, 542, 590, 648, 689, 722, 765, 807, 977, 1022, 1036, 1072, 1107,1164, 1174, 1204, 1226, 1240, 1272, 1312, 1353, 1364, 1384, 1447, 1469, 1563, 1601 , 1666, 1728, 3073, 3108, 3221 , 3283, 3427, 3953.

В одном из воплощений соединение по изобретению представляет собой

Pd ₂ (aetH) ₂ (phen) ₂ ](NOз) ₄ H ₂ O, кристаллизующееся в в моноклинной сингонии с пространственной группой Cc, параметры элементарной ячейки, А: а = 24.53, b = 13.10 , c = 22.65, β = 104.26°, V(A ³ ) = 7052.25, Z = 4.

В одном из воплощений соединение по изобретению представляет собой [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ Η ₂ O, характеризующееся ИК-спектром (таблетки KBr), V _mах , cм ^"1 :507, 640, 692, 774, 815, 879, 946, 1058, 1094, 1212, 1229, 1343, 1381 , 1404, 1427, 1573, 1723, 2655, 2820, 2971 , 3377, 3406, 3480.

В одном из воплощений соединение по изобретению представляет собой [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (NH ₃ ) ₄ ]CI ₂ , характеризующееся ИК-спектром (таблетки KBr), v _max , см ^"1 : 512, 597, 692, 773, 839, 879, 946, 1094, 1212, 1229, 1254, 1343, 1403, 1521 , 1572, 1594, 1723, 2655, 2925, 2971 , 3119, 3460.

В одном из воплощений соединение по изобретению представляет собой [Cu ₂ (м-S-Cys ) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ , характеризующееся ИК-спектром (таблетки KBr), v _max , см ^"1 : 520, 691 , 815, 879, 1058, 1133, 1212, 1229, 1254, 1343, 1404, 1572, 1594, 1627, 2655, 2925, 2940, 2971 , 3119, 3480.

Соединения по изобретению характеризуются тем, что они позволяют (при условии их применения в малых и ультрамалых количествах) ускорять процесс гомогенного селективного, «мягкoгo» окисления тиольных групп тиоаминокислот только до образования дисульфидных связей (сшивок) с помощью вторичных посредников (эндогенных активных форм кислорода, азота и других окислителей), играющих важную роль в трансдукции разнообразных сигналов.

Предложенные соединения по изобретению обладают способностью воздействовать на поверхностно-клеточные и внутриклеточные рецепторы и ферменты, ионные каналы и белки транспортеры цитоплазматической и внутриклеточных мембран, внеклеточные регуляторные и транспортные молекулы пептидной природы, белки цитоскелета, внеклеточного матрикса, другие структурные, функциональные и регуляторные молекулы, имеющие в своем составе остатки серы, способные к обратимой окислительно-восстановительной (редокс) модификации. Одно из состояний остатка серы в молекуле пептидной природы - восстановленное, в котором она связана с протоном и представляет собой тиольную (сульфгидрильную) группу Рерt-SН (Рерt - любая молекула пептидной природы). Другое из состояний остатка серы в молекуле пептидной природы окисленное. В зависимости от природы окислителя и глубины окисления остатка серы, она может подвергаться различным химическим окислительным модификациям. Однако физиологическое значение имеет вариант окисления, при котором остаток серы в составе цистеина одной полипептидной последовательности ковалентно связывается с остатком серы в составе цистеина другой полипептидной последовательности, образуя дисульфидную связь - Рерt- S-S-Рерt. Предложенные соединения по изобретению могут быть использованы для создания лекарственных средств, осуществляющих редокс регуляцию физиологически неадекватной активности молекулы мишени при острых и хронических процессах, что в свою очередь приводит к функциональной согласованности физиологических процессов в клетке (примеры 9 - 14).

Предложенные соединения по изобретению обладают потенциальной способностью выводиться из организма в виде «мaлыx клacтepoв» (наноразмерных частиц), после выполнения своих основных каталитических функций и деградации исходного соединения.

Предложенные соединения по изобретению могут сочетаться с другими биологически активными веществами, вводимыми в составе лекарственных средств (примеры Ns 12-14), обеспечивая возможность их поступления в микроокружение фармакологической мишени (примеры Ns 10) и/или увеличивая к ним тропность фармакологической мишени (пример Ns 9).

Для достижения биологического действия в организм млекопитающего энтерально, парентерально, ингаляционно или иным способом могут быть введены малые (K) ^"3 - 10 ^"6 моль) и ультрамалые (менее 1CГ ⁶ до 10 ^"15 моль) количества координационных соединений d-элементов с алифатическими тиолами определенной структуры. Воздействие соединений по изобретению на молекулы мишени в составе клеток восстанавливает функциональную согласованность клеточных процессов, способность клеток к ситуационно обусловленному ответу как на собственные, то есть синтезируемые в организме, так и на вводимые из вне биологически активные вещества в физиологически оптимальных дозах, что позволяет отказаться от высоких концентраций биологически активных веществ вводимых в составе лекарственных препаратов для достижения терапевтических целей.

Воздействие на клетки соединений по изобретению приводит к повышению концентрации биологически активных веществ, вводимых в составе лекарства в микроокружении фармакологической внутриклеточной мишени, в числе прочего за счет снижения активности белков, ответственных за множественную лекарственную устойчивость (пример NsЮ). Особенностью биологической активности предлагаемых структур биядерных координационных соединений d- элементов с алифатическими тиолами является способность индуцировать лишь синтез ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, которые мало влияют на инактивацию большинства биологически активных веществ вводимых в составе лекарственных препаратов, однако повышают устойчивость клеток к негативным факторам среды, повышение уровня которых обусловлено болезнью и/или действием лекарства (пример 11).

Таким образом, соединения по изобретению являются перспективными химическими молекулами для создания лекарственных препаратов наружного, ингаляционного, энтерального и парентерального применения, как при сочетанном применении с химическими молекулами с известным биологическим действием и фармакологической активностью, используемыми в составе лекарственных средств этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии, так и с вновь синтезированными химическими молекулами с биологической активностью, востребованной в фармакологических решениях. Соединения по изобретению способствуют проявлению фармакологической активности биологически активных химических молекул в физиологически оптимальных дозах.

В частности, предложенные соединения по изобретению могут воздействовать на EGFR ₁ повышая его сродство к фармакологически активным молекулам (пример Ns9). Соединения по изобретению, подпадающие под приведенную выше общую формулу I, способны также увеличивать концентрацию лекарственного вещества в клетках путем ингибирования Р-гликопротеина (пример Ns11).

Предложенные соединения по изобретению также можно представить формулой Il где M обозначает описанные выше атомы металла, X - остатки алифатических тиолов или их производных, выполняющие мостиковую функцию (μ-Х) через атом серы, N - донорные атомы азота бидентатных азотсодержащих лигандов (L), которые могут быть замещены на две бидентатнокоординированные молекулы этилендиамина или четыре монодентатнокоординированных концевых молекул аммиака.

Мостик по изобретению может быть обозначает формулой (M-(μ- SCH ₂ CHR ¹ R ² )-M).

Алифатические тиолы по изобретению могут быть обозначены формулой R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH, где атом серы связан с sp ³ -гибpидизoвaнным атомом углерода, а R ¹ и R ² независимо друг от друга представляют протон (-H), амино (-NH ₂ ), гидрокси (-ОН), окси (=0), карбокси (-COOH), циано (-CN), C _1-12 aлкил, C _2-12 aлкeнил, C _{2- 12} aлкинил, C _1-12 aлкoкcи (-OR), Смгалкиламино (-NH-R), Ci _-12 aлкoкcикapбoнил (-COOR), Ci_i ₂ aлкилaмидo (-CO-NH-R), ариламидо, причем алкильные группировки, входящие в состав указанных заместителей, могут быть, в свою очередь, замещены одной, или более чем одной из следующих групп: гидрокси, окси, карбокси, амино или амидо (-CO-NH ₂ ), где R обозначает Смгалкильный остаток.

В конкретных воплощениях X может представлять собой

В этих случаях указанные тиолы представляют собой 2-aминoэтaнтиoл (аеt, цистеамин) (1), 2-aцeтaмидoэтaнтиoл (2), цистеин (Суs) (3), метиловый эфир цистеина (4), этиловый эфир цистеина (5), ацетилцистеин (Ассуs) (6), метиловый эфир ацетилцистеина (7), этиловый эфир ацетилцистеина (8), нитрил ацетил цистеина (9), 3-мepкaптoпpoпиoнoвaя кислота (10), γ-глутамин-цистеин- глицин (11 ), гомоцистеин (12), тиогликолевая кислота (13).

Если не указано иное, следующие термины, использованные в приводимой ниже формуле изобретения и описании, имеют данные ниже определения.

Указание на то, что «NHR ³ R ⁴ и NHR ⁵ R ⁶ , взятые вместе, и(или) NHR ⁷ R ⁸ и NHR ⁹ R ¹⁰ , взятые вместе, представляют собой лиганд, содержащий один или несколько донорных алифатических или ароматических атомов азота и занимающие цис-положение у атомов металлов (M)» подразумевает, что R ³ -R ⁶ вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют лиганд, содержащий один или несколько донорных алифатических или ароматических атомов азота, причем лиганды занимают цис-положение у атомов металлов (M), например диаминосоединение или арил (гетероарил), и(или) R ⁷ -R ¹⁰ вместе с атомами азота, к которым они присоединены, образуют лиганд, содержащий один или несколько донорных алифатических или ароматических атомов азота, причем лиганды занимают цис-положение у атомов металлов (M), например диаминосоединение или арил (гетероарил).

Термин «циc-pacпoлoжeнныe лигaнды» соответствует координационным соединениям, у которых оговоренные лиганды занимают соседние положения в плоско-квадратной конфигурации координационного соединения, «тpaнc- расположенные лигaнды» - соответствует расположению лигандов напротив друг- друга у атома металла.

Термин «aлкил» для заместителей R ¹ и R ² в указанной формуле обозначает линейный или разветвленный насыщенный углеводородный остаток с атомами углерода в количестве от 1 до 12, предпочтительно от 1 до 6, например от 1 до 4 такими как метил, этил, н-пропил, шо-пропил, uзо-бутил, mреm-бутил и т.п. Также под указанным термином «aлкил» для заместителей R ¹ и R ² в указанной формуле R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH можно понимать линейный или разветвленный насыщенный углеводородный остаток, содержащий двойную или тройную связь, но связанный с углеродом общей формулы R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH через sр ³ гибридизованный атом углерода (например, аллил (-CH ₂ -CH=CH ₂ ) или пропаргил (- CH ₂ -C=CH)).

Термин «aлкeнил» обозначает линейные или разветвленные ненасыщенные углеводородные остатки с 2 - 12 атомами углерода, содержащие двойную связь, при этом связь заместителей R ¹ и R ² в структуре R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH осуществляется через sр ² гибридизованный атом углерода. R ¹ и R ² предпочтительно содержат от 2 до 4 атомов углерода. Примерами являются этенил (винил (-CH=CH ₂ )) или пропенил (-CH=CH-CH ₃ ).

Термин «aлкинил» обозначает линейные или разветвленные ненасыщенные углеводородные остатки с 2 - 12 атомами углерода, содержащие тройную связь, при этом связь заместителей R ¹ и R ² в структуре R ¹ R ² CH-CH ₂ -SH, осуществляется через sр гибридизованный атом углерода. R ¹ и R ² предпочтительно содержат от 2 до 4 атомов углерода. Примером является пропинил (-C≡C-CH ₃ ).

Термин «aлкoкcи» обозначает остаток алкила в смысле вышеприведенного определения, связанный через атом кислорода. Алкокси может быть представлен формулой R-O-, где R обозначает алкильный остаток. Примеры остатков «aлкoкcи» включают метокси (-OCH ₃ ), этокси (-OC ₂ H ₅ ), изопропокси (-O-(i-Pr))и т.п.

Термин «aлкилaминo» обозначает группу формулы -NH-R.

Термин «aлкoкcикapбoнил» обозначает группу формулы -COOR, например карбоксиэтил (-COOC ₂ H ₅ ), карбоксиметил (-COOCH ₃ ).

Термин «aлкилaмидo» обозначает группу формулы -CO-NH-R.

В приводимых выше определениях R обозначает алкил, в том смысле, как он определен выше.

Термин «apил» обозначает ароматический радикал, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, например: фенил, нафтил, имидазолил. Арил также может содержать гетероатомы, например гетероатомы азота, кислорода и серы

(гетероарил). В частности арил в определении R ¹ и R ² обозначает ароматический радикал, содержащий от 3 до 7 атомов углерода, и возможно включающий гетероатомы. Арил, входящий в состав лиганда, содержащего один или несколько донорных алифатических или ароматических атомов азота, у атомов металлов (M) может быть моноциклическим, а также полициклическим арилом (гетероарилом), причем кольца могут быть конденсированы или соединены мостиковой связью. В этом случае арил может представлять собой фенатролин, пиридин, дипиридил.

Термин «диaминocoeдинeниe» обозначает алифатическую группу с двумя аминогруппами (-NH ₂ ), например C ₂ -C ₁₀ или предпочтительно C _2-6 алифатическую или алкиленовую группу с двумя аминогруппами. В частности, «C ₂ -C ₆ диaминoaлкилeн» обозначает алкилен [(-CH ₂ ) _2-6 ] с двумя аминогруппами, например этилендиамин (H ₂ N(CH ₂ ) ₂ NH ₂ ).

Лиганд или лиганды, содержащие алифатические или ароматические донорные атомы азота и занимающие цис-положение у атомов M в координационном соединении могут представлять собой, например, циклические молекулы этилендиамина (H ₂ N(CH ₂ ) ₂ NH ₂ ), 1 ,10-фeнaтpoлинa (1 ,10-phen), 2,2 - дипиридила (2,2 ^' -dipy) или их производные, а также монодентатнокоординированные молекулы аммиака или пиридина.

В случае, когда лиганд L имеет только один алифатический или ароматический атом азота, способный к координации к атому металла, остов координационного соединения может быть описан эмпирической формулой L ₂ M(μ- X) ₂ ML ₂ H может быть представлен графической формулой На:

Ma

Основной функцией аминов алифатического или ароматического ряда, занимающих цис-положения у атома d-металла, является возможность формирования биядерных соединений с двумя мостиковыми тиолатными лигандами. Именно наличие двух мостиковых лигандов в таком биядерном координационном соединении позволяет осуществить синхронный двухэлектронный процесс окисления тиолатов посредством эндогенных окислителей (активных форм кислорода), присутствующих в организме.

Наличие аминов алифатического или ароматического ряда занимающих цис-положения у атома d-металла обуславливает высокую биологическую активность координационных соединений. Подобная особенность структурной организации координационных соединений, обуславливает их биологическую активность как базовое свойство биологических мишеней взаимодействовать с определенными изомерами молекул лекарственного средства, которые воздействуют на биологические молекулы и определяют терапевтическое действие лекарства. Другие изомеры той же химической молекулы либо малоактивны, либо инертны в отношении биомолекул и не обладают терапевтической активностью.

Именно структурная организация молекул координационных соединений, а не общность их химического состава определяет их биологическую активность.

Лиганд или лиганды, координированные в цис-положениях у атома металла позволяют получить биядерные соединения, содержащие две мостиковые тиолатные группы.

Предложенные соединения могут находиться также в форме солей.

Термин «фapмaцeвтичecки приемлемая coль» относится к любой соли, полученной с неорганической или органической кислотой или основанием, причем эта соль может безопасно применяться в терапии людей или животных.

Фармацевтически приемлемые соли могут быть легко изготовлены согласно известным из уровня техники методам с учетом химических свойств соединения, которое собираются превратить в соль. Неорганические или органические кислоты, такие как, например, соляная, бромоводородная, серная, азотная, фосфорная, лимонная, муравьиная, фумаровая, малеиновая, уксусная, янтарная, винная, метансульфоновая, р-толуолсульфоновая кислоты и т.п., пригодны для образования фармацевтически приемлемых солей основного соединения формулы I, Il или На.

Соединения по изобретению могут быть получены по приведенным ниже схемам, понятным специалистам. Общие схемы получения координационных соединения d-элементов

с алифатическими тиолами I, Il или На

ИЛИ

где HaI обозначает атом галогена (предпочтительно Cl, Br или I), M обозначает описанные выше атомы металла (в составе координационных соединений металлы могут быть не одинаковы), X - описанные выше остатки алифатических тиолов или их производных, выполняющие мостиковую функцию, N - донорные атомы азотсодержащих лигандов (L).

Соединение по изобретению может быть получено способом, который будет ясен специалисту, исходя из предложенного строения координационного соединения и способов, приведенных на общих схемах.

Для получения координационного соединения по изобретению можно взять водный раствор или суспензию соединения цис-галогенидного координационного соединения d-металла и добавить к нему лиганд (алифатический тиол) в сухом виде, либо в виде раствора или суспензии. В полученной системе происходит формирование биядерных координационных соединений, содержащих мостиковые тиолатные лиганды.

Степень разбавления для каждого конкретного соединения может быть подобрана эмпирическим путем. Точное суждение об образовании биядерных координационных соединений можно вынести на основании физико-химических исследований (в частности рентгеноструктурных исследований) и подтверждающих их функционирование в качестве катализаторов окисления данных современных квантово-химических расчетов [11 , 12]. Косвенным критерием наличия такой структуры может служить катализ iп vitrо указанным соединением окислительно- восстановительной реакции, где сера тиолатных групп окисляется с образованием только дисульфидных связей.

Энергии ионизации (ЭИ) тиолатных лигандов -SCH ₂ C(H)R ¹ R ^2" могут служить характеристикой их донорной способности, т.е. способности к комплексообразованию с ионами d-элементов: чем меньше значения ЭИ, тем выше ожидаемые донорные свойства лиганда. Рассчитанные в качестве примеров значения ЭИ анионов -SCH ₂ C(H)R ¹ R ^2' приведены в табл. 1.

Таблица 1

Данные квантово-химических DFT расчетов энергий ионизации (ЭИ, эВ) тиолят-анионов и зарядов на атомах серы q(S) (CC-PVTZ(-F)+ базис)

Расчеты электронной структуры соединений выполнены по программному комплексу Jаguаr 7.5 методом DFT ВЗLYР (CC-PVTZ(-F)+ базис)

В этой же таблице приведены рассчитанные заряды на атоме серы, являющимся комплексообразующим атомом каталитического цикла окисления тиола. Увеличение электронной плотности на атоме серы, т.е. возрастание отрицательного заряда, способствует образованию прочных связей с ионом металла. Таким образом, в рассматриваемом ряду тиолатных анионов SR ^" их донорные способности должны возрастать в ряду: < H ₂ NC ₂ H ₄ S ^" < C ₄ H ₉ S ^" < C ₃ H ₇ S ^" < C ₂ H ₅ S ^" < CH ₃ S ^"

Следует отметить, что информация, получаемая из данных квантово- химических расчетов, может способствовать также выявлению корреляции между геометрическим строением соединений и физиологической активностью получаемых лекарственных препаратов.

Типичный каталитический цикл окисления алифатических тиолов в присутствии координационных соединений является следующим:

Соединение по изобретению может находится в составе препарата, включающего в себя кооординационное соединение и свободные молекулы алифатического тиола (или их производных), несвязанные с координационным соединением. Координационное соединение и свободные молекулы алифатического тиола (или их производных) в составе препарата могут находится как в катионной, так и в анионной форме, или же в форме нейтральных частиц.

Фармацевтически приемлемые формы препарата могут быть изготовлены согласно известным из уровня техники методами с учетом химических свойств координационного соединения, алифатического тиола или его производного и фармацевтически активного соединения. Предпочтительно, когда молярное соотношение координационное соединение : молекула алифатического тиола в составе препарата составляет от 1 :50 до 1 :50000. Соотношение алифатический тиол : фармацевтически активное соединение подбирается эмпирически.

Препарат может представлять собой удобную для применения лекарственную форму (твердую, жидкую, мягкую, ингаляционную и т.д.), позволяющую достигать необходимого лечебного эффекта.

Избыток тиола обеспечивает возможность изготовления и использования малых и ультрамалых доз координационных соединения d-металлов в составе препарата.

Соединения по изобретению используют в форме фармацевтических препаратов (лекарственных форм) для фармакотерапии. Термины фармакотерапия, фармакотерапевтическое воздействие используются в изобретении в общепринятом значении - лечении лекарственными средствами. Фармацевтические препараты соединений по изобретению могут вводиться перорально, то есть это такие лекарственные формы как растворы, эмульсии или суспензии, а также таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, драже, твердые и мягкие желатиновые капсулы. Эффективным также может быть ректальное введение, то есть это такие лекарственные формы как суппозитории. Эффективным является парентеральное введение, то есть формы растворов для подкожных, внутримышечных, внутрисосудистых, внутриполостных инъекций, ингаляций. Соединение по изобретению может также применяться наружно (мази, кремы и т.п.) или вводиться ингаляционно, интраназально и/или перорально или любым другим способом, обеспечивающим поступление фармацевтического препарата в организм пациента.

Для получения фармацевтических препаратов (лекарственных форм) соединений по изобретению сочетаются в единой лекарственной форме с терапевтически инертными, неорганическими или органическими носителями. Лактоза, кукурузный крахмал или его производные, тальк, стеариновая кислота или ее соли и т.п. могут быть использованы, например, в качестве таких носителей для таблеток, таблеток, покрытых оболочкой, драже и твердых желатиновых капсул. Подходящими носителями для мягких желатиновых капсул являются, например, растительные масла, воски, жиры, полутвердые и жидкие полиолы и т.п. Подходящими носителями для получения растворов и сиропов являются, например, вода, полиолы, сахароза, инвертный сахар, глюкоза и т.п. Подходящими носителями для суппозиториев являются, например, природные или отвержденные масла, воски, жиры, полужидкие или жидкие полиолы и т.п.

Кроме того, фармацевтические препараты могут содержать консерванты, солюбилизаторы, стабилизаторы, смачивающие вещества, эмульгаторы, подсластители, красители, корригенты, соли для регулирования осмотического давления, буферы, маскирующие агенты или антиоксиданты и другие, необходимые для приготовления лекарственной формы, компоненты.

Указанные выше вспомогательные вещества, используемые для образования лекарственных форм, будут названы далее «тepaпeвтичecки инертными экcципиeнтaми». Однако лекарственные формы соединеия по изобретению также могут содержать и свободные молекулы алифатических тиолов и/или других терапевтически активных веществ. Соединение по изобретению может находится в составе препарата, включающего в себя координационное соединение и свободные молекулы алифатического тиола (или их производных), несвязанные с координационным соединением. Координационное соединение и свободные молекулы алифатического тиола (или их производных) в составе препарата могут находиться как в катионной, так и в анионной форме, или же в форме нейтральных частиц.

Фармацевтически приемлемые формы препарата могут быть изготовлены согласно известным из уровня техники методами с учетом химических свойств координационного соединения и алифатического тиола (или его производного). Предпочтительно, когда молярное соотношение атом d-метала координационное соединение : молекула алифатического тиола в составе препарата составляет от 1 :50 до 1 :50000.

Препарат может представлять собой удобную для применения лекарственную форму (твердую, жидкую, мягкую, ингаляционную и т.д.), позволяющую достигать необходимого лечебного эффекта.

Избыток тиола обеспечивает возможность изготовления и использования малых и ультрамалых доз координационных соединения d-металлов в составе препарата. Такой препарат обеспечивает более точное дозирование, что является важным, когда соединение по изобретению вводится в малых и ультрамалых количествах.

Согласно изобретению предложенное средство может быть использовано для усиления терапевтической активности некоторого фармакологически активного вещества.

В контексте данного описания повышение терапевтической эффективности фармакологически активного вещества представляет собой снижение разовой или курсовой дозы, вследствие повышения сродства мишени к лекарству и/или увеличения концентрации лекарства в области фармакологической мишени и, как следствие, снижение общей токсичности при принятой терапевтической дозе этого фармакологически активного вещества.

Под фармакологически активным веществом подразумевается любое вещество, которое используется с фармакотерапевтическими целями.

Когда соединение по изобретению используется для усиления фармакотерапевтической эффективности некоторого фармакологически активного вещества, это фармакологически активное вещество может быть введено во внутреннюю сферу координационного соединения по изобретению в качестве лиганда. Оно также может находиться во внешней сфере (например, в качестве противоиона). Фармакологически активное вещество также может содержаться в избытке относительно средства по изобретению в фармацевтически приемлемой лекарственной форме

Фармацевтически приемлемые формы препарата могут быть изготовлены согласно известным из уровня техники методами с учетом химических свойств координационного соединения и фармацевтически активного соединения.

Соотношение алифатический тиол : фармацевтически активное соединение подбирается эмпирически.

Лекарственные формы (твердые, жидкие, мягкие, ингаляционные и т.д.), могут быть легко изготовлены согласно известным из уровня техники методами с учетом природы фармакологически активного вещества, которое берется в избытке относительно соединения по изобретению.

В перечисленных случаях соединение по изобретению и фармакологически активные вещества, эффективность которых они усиливают, находятся в одной лекарственной форме. Этот случай, естественно, обеспечивает их одновременное введение.

Соединение по изобретению и фармакологически активное вещество, эффективность которого должна быть усилена с его помощью, могут находиться в отдельных лекарственных формах.

Введение в отдельных лекарственных формах может быть осуществлено одновременно (одновременный прием двух твердых дозированных лекарственных форм, например таблеток, одновременная инъекция, в частности в одном шприце), либо последовательно, когда пациенту дают или вводят сначала первую лекарственную форму, а затем вторую лекарственную форму. Интервал между введением предпочтительно составляет не более 1 часа, однако может быть увеличен до тех пор, пока наблюдается синергический эффект.

Следует отметить, что лиганд в предлагаемом координационном соединении является физиологически (биологически, фармакологически) и фармацевтически приемлемым соединением.

Под физиологически (биологически, фармакологически) приемлемым подразумевается соединение, которое не вызывает токсических или иным образом нежелательных эффектов при введении в организм пациента. Термины физиологически приемлемый, биологически приемлемый и фармакологически приемлемый в контексте данного описания считаются синонимами. Подразумевается также, что все используемые вещества являются также фармацевтически приемлемыми, то есть они могут использоваться в качестве ингредиентов в лекарственных формах.

В контексте данного изобретения пациентом обозначается человек или другое млекопитающее, птицы, земноводные или рыбы, в организм которых тем или иным способом вводится лекарственная форма.

Лиганд и d-металл также могут обладать собственной фармакологической активностью.

Количество вводимого координационного соединения алифатических тиолов с d-металлами, относящимися к биометаллам, определяется массовой долей биометалла в составе координационного соединения, которое может соответствовать или быть ниже суточной потребности в используемом биометалле, в противном случае количество вводимого d-металла в составе координационного соединения определяется необходимостью достижения результата лечения. Количество вводимого координационного соединения d-металлов не относящихся к биометаллам, определяется массовой долей d-металла в составе координационного соединения и должно быть ниже их предельно допустимых величин, в противном случае количество вводимого d-металла в составе координационного соединения определяется необходимостью достижения результата лечения.

В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения млекопитающего (например, человека), страдающего онкологическим заболеванием (раком), при котором млекопитающему вводят эффективное количество координационного соединения (комплекса), раскрытого здесь, и эффективного количества ингибитора EGFR (например: пресса, тирфостины, генистеин, SU6668, ZD6474). Примеры онкологических заболеваний, которые можно лечить этим способом, включают рак легких, молочной железы, головы и шеи, желудочно-кишечного тракта, яичников, почек, кожи, нервной системы, костного мозга, соединительной ткани.

В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения млекопитающего (например, человека), страдающего от метаболического синдрома, сахарного диабета первого и второго типов, диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом второго типа, синдрома диабетической стопы у больных сахарным диабетом второго типа, трофических язв нижних конечностей у больных сахарным диабетом второго типа, диабетической нейропатии у больных сахарным диабетом второго типа, диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом второго типа, при котором млекопитающему вводят эффективное количество координационного соединения (комплекса), раскрытого здесь, и эффективное количество тиоктовой кислоты.

В одном из воплощений изобретение относится к способу профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания, при котором млекопитающему вводят эффективное количество координационного соединения (комплекса), раскрытого здесь, и эффективное количество аденозина. Примерами сердечно-сосудистых заболеваний являются, в частности, острая и хроническая ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, стенокардия.

В одном из воплощений изобретение относится к способу профилактики или лечения сердечно-сосудистого заболевания, при котором млекопитающему вводят эффективное количество координационного соединения (комплекса), раскрытого здесь, и эффективное количество аденозина. Примерами сердечно-сосудистых заболеваний являются, в частности, острая и хроническая ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, стенокардия.

В одном из воплощений изобретение относится к способу лечения постлучевой гемодерессии, токсической гемодерессии и посттравматической гемодерессии, расстройствах психики по типу маниакально-депрессивного или меланхолического психоза, артритов различного генеза, при котором млекопитающему вводят эффективное количество координационного соединения (комплекса), раскрытого здесь, и эффективное количество лития.

ПРИМЕРЫ

Далее изобретение поясняется конкретными примерами. Пример Na 1. Получение координационного соединения Pd(II) с цистеином

(в водном растворе - катион [Pd ₂ (μ-S-L-Cys)(μ-S-L-CysH)(2,2 ^' -dipy) ₂ ] ³⁺ )

K суспензии 300 мг (0.904 ммоль) Pd(2,2 ^' -dipy)CI ₂ в 15 мл воды добавили 221 мг (1.811 ммоль) AgNO ₃ , растворенного в минимальном количестве воды. Смесь подкислили 0.5 мл концентрированной HNO ₃ , гомогенизировали в ультразвуковой ванне в течениее 15 мин и отфильтровали. К фильтрату добавили 96 мг (0.905 ммоль) L-цистеина (суs), растворенного в минимальном количестве воды. Реакционную смесь упаривали на воздухе при комнатной температуре. Выпавшие темно-оранжевые кристаллы [Pd ₂ (μ-S-L-CysXμ-S-L-CysH)(2,2 ^' -dipy) ₂ ](NO ₃ ) ₃ -4.5H ₂ O хорошо растворимы в воде, хуже в этаноле, практически не растворимы в ацетоне, дихлорметане. Выход 70-75%.

Элементный анализ: найдено, %: С 21.85, N 11.13, Pd 24.02, S 7.23.

Для C ₁₆ H ₃₂ N ₇ O ₁₇₅ Pd ₂ S ₂ ([Pd ₂ (μ-cys)(μ-cysH)(dipy) ₂ ](NO ₃ ) ₃ -4.5H ₂ O, Mr 1034.1 г/моль) вычислено, %: С 21.87, N 11.17, Pd 24.13, S 7.28.

Кристаллизуется в триклинной сингонии с пространственной группой P-1 , параметры элементарной ячейки, А: а = 13.86, b = 13.82 , с = 12.17, α = 122.13°, β = 103.61°, γ = 91.40°, V(A ³ ) = 1887.0, Z = I ₁ R = 7.02%.

В твердом состоянии молекулы [Pd ₂ (μ-cys)(μ-cysH)(dipy) ₂ ](NO ₃ )з попарно связываются через атомы палладия за счет слабых нековалентных взаимодействий.

В общем виде происходит «cтpyктypиpoвaниe» молекул комплексного соединения за счет Pd-Pd взаимодействий между ионами металла, системы водородных связей и межлигандных π-π взаимодействий, что приводит к возникновению «цeпeй» внутри кристаллической структуры.

Формирование 1 D цепей, направленных вдоль [100], и 2D слоев в плоскости (010). Стрелками показаны π-π стековые взаимодействия между дипиридильными фрагментами соседних 1 D цепей.

Координаты и тепловые параметры атомов размещены в Кембриджском банке структурных данных (CCDC) под номером 705745.

ИК спектр (таблетки KBr), v _max , см ^"1 : 419, 542, 590, 648, 689, 722, 765, 807, 977, 1022, 1036, 1072, 1107,1164, 1174, 1204, 1226, 1240, 1272, 1312, 1353, 1364, 1384, 1447, 1469, 1563, 1601 , 1666, 1728, 3073, 3108, 3221 , 3283, 3427, 3953.

Координационное соединение вносили в избыток лиганда, для чего 0.1 г комплекса [Pd ₂ (μ-S-L-Cys)(μ-S-L-CysH)(2,2 ^' -dipy) ₂ ](NOз)з-4.5H ₂ O добавляли к раствору, содержащему 9.97 г L-цистеина, растворенного в 100 мл воды, тщательно перемешивали и проводили вакуумно-сублимационную сушку полученного раствора, в ходе которой образуется светло-желтая субстанция, в которой соотношение координационное соединение/органическая молекула составляет 1/1000. По окончании вакуумно-сублимационной сушки вещество готово к использованию.

Пример Ns 2. Получение координационного соединения Pd(II) с цистеамином

Координационное соединение в водном растворе представляет собой катион [Pd ₂ (μ-SCH ₂ CH ₂ NH ₃ ) ₂ (1, W-рhепjг] ⁴ *.

К подкисленной до pH=3 1M азотной кислотой суспензии 571 мг (1.49 ммоль)

Pd(1 ,10-phen)CI ₂ в 20 мл воды прилили раствор, содержащий 0.509 г (2,99 ммоль) нитрата серебра (в минимальном количестве воды). Полученный творожистый осадок хлорида серебра коагулировали осторожным нагреванием на водяной бане и отцентрифугировали. После отделения осадка в центрифугате растворили 170 мг

2-aминoэтaнтиoлa (аеt, цистеамина) гидрохлорида. При медленном упаривании оранжевого раствора на воздухе в течении нескольких недель выпадают пластинчатые оранжево-красные кристаллы. Выход 0,25 г (35%).

Элементный анализ: найдено, %: С 33.5, N 14.0, Pd 21.2, S 6.60.

Для C ₂₈ H ₃₂ N ₁₀ Oi ₃ Pd ₂ S ₂ ([Pd ₂ (aetH) ₂ (phen) ₂ ](NO ₃ ) ₄ Η ₂ O, Mr 993.59 г/моль) вычислено, %: С 33.85, N 14.10, Pd 21.42, S 6.45.

Кристаллизуется [Pd ₂ (μ-S-CystH) ₂ (1 ,10-phen) ₂ ](NO ₃ ) ₄ H ₂ O - в моноклинной сингонии с пространственной группой Cc, параметры элементарной ячейки, А: а = 24.53, b = 13.10 , с = 22.65, β = 104.26°, V(A ³ ) = 7052.25, Z = 4, R = 3.16%

Для приготовления препарата координационное соединение переводили в избыток лиганда, для чего 0.1 г комплекса [Рdгtø-SСНгСНгNНзЬСUО- phen) ₂ ](NOз) ₄ Η ₂ O добавляли к раствору, содержащему 11.43 г цистеамина (аминоэтантиола) гидрохлорида, растворенного в 100 мл воды, тщательно перемешивали и проводили вакуумно-сублимационную сушку полученной реакционного раствора, в ходе которой образуется светло-желтая субстанция, в которой соотношение координационное соединение/органическая молекула составляет 1/1000.

По окончании вакуумно-сублимационной сушки вещество готово к использованию.

Пример Ns 3. Получение координационного соединения Pd(II) с ацетилцистеином

Координационное соединение в водном растворе представляет собой катион

К суспензии 0,160 г Pd(2,2 ^' -dipy)CI ₂ (0,476 ммоль) в 10 мл воды, при перемешивании, добавляли 77,8 мг ацетилцистеина (0,476 ммоль) и приливали 0,5 M раствор KOH до рН = 11. Раствор выдерживали на водяной бане при 50 ⁰ C в течение часа. В полученный раствор приливали ~ 70 мл ацетона, перемешивали, а затем еще, дополнительно ~ 80 мл диэтилового эфира. При выдерживании реакционной смеси в течении нескольких часов выпадают желтые игольчатые кристаллы комплекса [Pd ₂ (M-S-AcCyS) ₂ (CUPy) ₂ ]CI ₂ - H ₂ O.

Элементный анализ: найдено, %: С 38.6, N 9.0, Pd 22.29, S 6.65.

Для C ₃₀ H ₃₄ CI ₂ N ₆ O ₇ Pd ₂ S ₂ [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ -H ₂ O, Mr 938.5 г/моль) вычислено, %: С 38.39, N 8.95, Pd 22.68, S 6.83.

ИК-спектром (таблетки KBr), v _max , cм ^~1 :507, 640, 692, 774, 815, 879, 946, 1058, 1094, 1212, 1229, 1343, 1381 , 1404, 1427, 1573, 1723, 2655, 2820, 2971 , 3377, 3406, 3480.

Для приготовления препарата координационное соединение переводили в избыток лиганда, для чего 0.1 г комплекса [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ H ₂ O добавляли к раствору, содержащему 17.39 г ацетилцистеина, растворенного в 1000 мл воды, тщательно перемешивали и проводили вакуумно-сублимационную сушку полученной раствора, в ходе которой образуется светло-желтая субстанция, в которой соотношение координационное соединение/органическая молекула составляет 1/1000.

По окончании вакуумно-сублимационной сушки вещество готово к использованию.

Пример Ns 4. Получение препарата, включающего ионы лития, ацетилцистеин и биядерное координационное соединение палладия с ацетилцистеином

Координационное соединение в водном растворе представляет собой катион [Pd ₂ (μ-S-Accys)2(NHз) ₄ f ⁺

К суспензии циc-[Pd(NH ₃ ) ₂ CI ₂ ] (0.5 г, 2,36 ммоль) на холоду, при перемешивании прибавляли 0,386 г ацетилцистеина (2,36 ммоль) и приливали 0,5 M раствор KOH до рН = 11. Раствор выдерживали на водяной бане при 50 ⁰ C в течение часа. В полученный раствор приливали ~ 50 мл ацетона, перемешивали, а затем еще, дополнительно ~ 50 мл диэтилового эфира. Выпавший светло-желтый осадок комплекса [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (NH ₃ ) ₄ ]CI ₂ отфильтровывали и высушивали в вакуум-эксикаторе.

Элементный анализ: найдено, %: С 17.6, N 12.2, Pd 30.0, S 10.0.

Для C ₁₀ H ₂₈ CI ₂ N ₆ O ₆ Pd ₂ S ₂ [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (NHз) ₄ ]CI ₂ , Mr 676,24 г/моль) вычислено, %: С 17.76, N 12.43, Pd 31.47, S 9.48.

ИК спектр (таблетки KBr), v _max , см ^"1 : 512, 597, 692, 773, 839, 879, 946, 1094, 1212, 1229, 1254, 1343, 1403, 1521 , 1572, 1594, 1723, 2655, 2925, 2971 , 3119, 3460.

0.1 г комплекса [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (NH ₃ ) ₄ ]CI ₂ вносили в 150 мл раствора, содержащего 24,13 г безводного ацетилцистеина, перемешивали и небольшими порциями добавляли 6,2 г моногидрата гидроксида лития LiOH- H ₂ O, перемешивали до его полного растворения. Образовавшийся раствор оттитровывали до рН 7.2-7.4 насыщенным водным раствором гидроксида лития.

Препарат может быть синтезирован без стадии выделения координационного соединения в твердую фазу. В этом случае в водный раствор расчитаного количества ацетилцистеина вносят навеску циc-[Pd(NH ₃ ) ₂ CI ₂ ], раствор перемешивают до его полного растворения, после чего в него вносят расчитанное количество безводного или моногидрата гидроксида лития. После его полного растворения раствор оттитровывают до рН = 7,0-7,4 насыщенным раствором гидроксида лития.

После вакуумно-сублимационной сушки вещество готово к использованию.

Пример NQ 5. Получение координационного соединения меди с цистеином

Координационное соединение представляет собой в водном растворе катион [(2,2 ^' -dipy)Cu(μ-Cys) ₂ Cu(2,2 ^< -dipy)] ²⁺

K этанольному раствору Cu(2,2'-dipy)CI ₂ (1 г, 3,44 ммоль) добавляют этанольный раствор цистеина (0,94 г, 7.7 ммоль, мольное соотношение Cu:Cys - 1 :2,25). Реакционную смесь в течении нескольких минут нагревали, при медленном охлаждении смеси выпадает мелкокристаллический осадок комплекса, который отделяют от раствора фильтрованием, промывают диэтиловым эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе.

Элементный анализ: найдено, %: С 41.5, N 11.0, Cu 16.5, S 8.3.

Для C ₂₆ H ₂₈ CI ₂ Cu ₂ N ₆ O ₄ S ₂ [Cu ₂ (μ-S-Cys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ , Mr 750.67 г/моль) вычислено, %: С 41.60, N 11.19, Cu 16.93, S 8.54.

ИК спектр (таблетки KBr), v _max , см ^"1 : 520, 691 , 815, 879, 1058, 1133, 1212, 1229, 1254, 1343, 1404, 1572, 1594, 1627, 2655, 2925, 2940, 2971 , 3119, 3480.

Препарат может быть синтезирован минуя стадию выделения координационного соединения в твердую фазу: в водный раствор, содержащий двух- или более избыточное количество цистеина вносят расчитанное количество

Cu(2,2 ^' -dipy)CI ₂ . Полученный раствор может быть использован для получения препаратов. Пример Nsб Получение препарата, включающего ионы лития и биядерное координационное соединение меди с цистеином

0,1 г [Cu ₂ (μ-S-Cys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ (пример N°5) вносили в водный раствор (~ 150 мл), содержащий 16,14 г цистеина (мольное соотношение координационное coeдинeниe:тиoл - 1 :1000) и тщательно перемешивали. Далее в полученый раствор небольшими порциями вносили моногидрат гидроксида лития LiOH-H ₂ O и продолжали перемешивать до его полного растворения, после рН полученного раствора доводили до 7 ^' ,2-7 ,4 насыщенным раствором LiOH.

После вакуумно-сублимационной сушки вещество готово к использованию. Пример Na7 Получение препарата, включающего тиоктовую кислоту и биядерное координационное соединение палладия с ацетилцистеином

Препарат готовят смешением водных растворов, содержащих расчитанные количества [Pd ₂ (μ-S-Accys) ₂ (dipy) ₂ ]CI ₂ H ₂ O (пример N°3) и липоевой (тиооктовой) кислоты в мольном соотношении 1 :1000.

После вакуумно-сублимационной сушки раствора вещество готово к использованию.

Пример Ns8 Получение препарата, включающего аденозин и биядерное

координационное соединение палладия с ацетилцистеином Препарат готовят смешением водных растворов, содержащих расчитанные количества [Pd ₂ (M-S-AcCyS) ₂ (CIiPy) ₂ ]CI ₂ IH ₂ O (пример N°3), ацетил цистеина и аденозина в мольном соотношении 1 :1000:1.

После вакуумно-сублимационной сушки раствора вещество готово к использованию.

Пример Ns9 Повышение тропности фармакологической мишени - рецептора эпидермального фактора роста к действию ингибиторов тирозинкиназной активности посредством координационного соединения

Клинически доказана причинная связь повышенной активности HER1 и HER2/neu со злокачественным ростом опухолевых клеток при раке молочной железы, легких, яичника, кости, пищевода. В этой связи рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) является одним из объектов, активно изучаемых в качестве противоопухолевой мишени [5, 7].

Существует ряд фармакологических решений, направленных на блокирование реализуемого через EGFR биологического эффекта:

1) использование моноклональных антител, связывающих внеклеточный участок рецептора: «Эpбитyкc» - моноклональные антитела к HER1 , «Гepцeптин» - это моноклональные антитела к HER2/neu; 2) применение рекомбинантных пептидных лигандов EGF и/или ТGF-а, конъюгированных с проникающими внутрь клетки цитотоксинами; 3) использование низкомолекулярных ингибиторов, способных воздействовать на внутриклеточный домен EGFR и прервать процесс тирозинкиназного фосфорилирования сигналпередающих белков- пресса, тирфостины, генистеин, SU6668, ZD6474.

Взаимодействие антител с центром иммунной активности рецептора, ингибиторов с активным центром каталитической активности требует доступности этих центров, которая в свою очередь определяется конформацией белковой молекулы. Конформация димерной молекулы EGFR делает возможным взаимодействие ингибиторов тирозинкиназной активности и моноклональных антител с сайтами их связывания.

Цель работы. Изучение влияния координационного соединения на тропность фармакологической мишени - рецептора эпидермального фактора роста к действию ингибитора тирозинкиназной активности.

В качестве исследуемых соединений использовались координационное соединения цистеина и палладия (C-Pd) ₁ цистеин (С), координационное соединение C-Pd с избытком цистеина (C-Pd:C, соотношение координационное соединение: цистеин - 1 :1000), физиологический высокотропный лиганд рецептора ЭФР- эпидермальный фактор роста, ингибитор тирозинкиназы рецептора ЭФР тирфостин AG1478 (Sigmа, США).

Приготовление препаратов для проведения исследования.

Исследуемые соединения хранили при +4 ^° C; непосредственно перед началом эксперимента вещества растворяли в деионизированной воде (suрег Q).

Концентрация исходного раствора в 1000 и более раз превышает концентрации, используемые в эксперименте. Приготовленный концентрированный раствор хранится не более 5 часов при +4 ⁰ C.

Путь введения.

Соединения добавляли в среду культивирования клеток до исследуемой конечной концентрации.

Число доз.

Препарат добавляется к клеткам однократно на указанный период времени.

Концентрации.

Цистеин (С) 0,015 и 0,15 мкмоль/мл;

Координационное соединение цистеина - C-Pd 0,015 и 0,15 нмоль/мл;

Координационное соединение цистеина: цистеин (C-Pd:C) 1 :1000 0,015 и 0,15 мкмоль/мл (в мкмоль/мл дана концентрация лиганда).

Эпидермальный фактор роста 200 нг/мл.

Ингибитор тирозинкиназы рецептора ЭФР - тирфостин AG1478 в концентрациях 0.1мкг/мл, 0.25мкг/мл, 0.5мкг/мл, 0.75мкг/мл, 1.0 мкг/мл, 2.5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 7.5 мкг/мл, 10мкг/мл.

Препараты вносились однократно.

Время определения тирозинкиназной активности рецептора эпидермального фактора роста: 0 мин, 5 мин, 10 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч.

Количество живых и погибших клеток в культуре определялось через 24 и 48 часов.

Использованная линия клеток.

Клетки эпидермоидной карциномы человека линии A431, полученные из Всероссийской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, С. Петербург).

Условия культивирования клеток .

Клетки культивируются в CO ₂ -инкyбaтope (Nеw Вruпswiсk Sсiепtifiс) при +37 ^° C и при содержании CO ₂ 5 %. В этих условиях клетки выращиваются до монослойной культуры и подвергаются действию исследуемых соединений.

Среда для культивирования клеток.

Для культивирования клеток используется среда DMEM (ООО "ПанЭко",

Москва) с добавлением гентамицина К (80 мг/л), L-глутамина (300 мг/л) и фетальной сыворотки (PAA, Австрия) до конечной концентрации 10 %. За сутки до начала эксперимента клетки переводят в среду с пониженным содержанием сыворотки - 0,5 %.

Динамика роста клеток.

Клетки A431 высевали на пластиковые чашки Петри (Nuпс) в концентрации 10000/cм ² , через сутки при достижении ими 10-15% монослоя подвергали действию исследуемых препаратов.

Подготовка клеток для окраски.

Среду культивирования клеток A431 собирали в пробирки (Fаlkоп) для полного анализа открепившихся мертвых клеток, а клетки на чашках Петри промывали PBS (который объединяли с собранной средой) и обрабатывали раствором трипсина 0,25% в Версене (Панэко) около 10 мин при комнатной температуре до открепления клеток. Далее клетки суспендировали пипетированием автоматической пипеткой и объединяли с собранной ранее средой. Пробы центрифугировали 5 мин 400 g при комнатной температуре, супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере

PBS рН 7,4.

Окраска клеток иодидом пропидия

Иодид пропидия добавляли к суспензии клеток до концентрации 50 мкг/мл за 5-10 мин до измерения на проточном цитофлуориметре Вrukеr ACR 1000. Этот краситель способен проникать через поврежденную клеточную мембрану, и окрашенные клетки являются мертвыми.

Метод лизирования клеток.

После окончания стимуляции клетки промывают фосфатно-солевым буфером

(рН 7.4) на льду. Для получения тотального лизата клетки соскребают в буфере, содержащем 20 мМ Триса, рН 7.4, 150 мМ NaCI, 1 мМ Na ₃ VO ₄ , 1 мМ ЭДТА, 1 мМ

ЭГТА, 0,5 мМ PMSF, по 1 мкг/мл лейпептина, апротинина и пепстатина, 0,5 % нонидета P-40, 1 % Тритона X-100, и инкубируют в течение 10 мин при 4 ⁰ C.

Полученный материал пропускают 5 раз через иглу 26G и центрифугируют 5 мин при ЮООО g. К супернатанту добавляют 1/4 объёма буфера для электрофоретических проб (40 мМ Трис, рН 6,8, 10% SDS, 20% 2-мepкaптoэтaнoл,

40% глицерин, бромфеноловый синий 0,05%), перемешивают и прогревают 5 мин при 100DC.

Определение концентрации белка.

Определение концентрации белка в пробах перед нанесением на электрофорез производится с помощью реагентов набора RC-DC Рrоtеiп Аssау (ВiоRаd) на спектрофотометре ВiоМаtе 3 (Тhеrmо Еlесtrоп Соrроrаtiоп).

Электрофорез и электроперенос.

Электрофоретическое разделение белков производится в 7,5%-нoм полиакриламидном геле для анализа рецептора эпидермального фактора роста и в 12%-нoм геле для анализа МАР-киназ ERK1.2 по стандартной методике. На гель наносятся пробы, содержащие равное количество белка. Последующий электроперенос разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану (Нуbопd ECL, Аmеrshаm) проводится в буфере, содержащем трис 0,58%, глицин 0,29%, додецилсульфат Na 0,035% и метанол 20%. Для визуализации белковых полос используется Ponceau S (Sigmа).

Иммуноблотинг.

Иммуноблотинг проводят в соответствии с методикой ECL Wеstеrп blоttiпg рrоtосоls (Аmеrshаm). Все процедуры осуществляют при комнатной температуре. Нитроцеллюлозную мембрану промывают в растворе, содержащем 10 мМ трис, рН 7,6, 100 мМ NaCI и 0,1 % Твина 20 (TBS-T) в течение 10 мин. Далее мембрану инкубируют в 1 %-нoм растворе BSA (Sigmа) или 5 % растворе обезжиренного молока (Vаliо) на буфере TBS-T в течение 1 ч, а затем в растворе первичных антител в буфере TBS-T в течение 1-1 ,5 ч. Затем мембрану 5 раз по 5 мин промывают в TBS-T, помещают в раствор вторичных антител в буфере TBS-T ₁ содержащем 5 % обезжиренного молока, и инкубируют в течение 1 ч. После промывки мембраны (5 раз по 5 мин TBS-T) белки, связавшиеся с антителами, выявляют с помощью метода усиленной хемилюминисценции (ECL). Нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в растворе ECL (Аmеrshаm) из расчета 0.125 мл/см ² в течение 1 мин и регистрируют хемилюминисцентное свечение экспонированием на рентгеновскую пленку Коdаk X-OMAT AR.

Антитела.

Для специфического выявления белков на мембране используются первичные моноклональные антитела против фосфотирозина (PY20, Тrапsduсtiоп Lаbоrаtоriеs, США), поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированного по тирозину ERK1.2 (CeII Sigпаliпg Тесhпоlоgу, США). Для дополнительной идентификации выявленных активных форм исследуемых белков в процессе работы используются поликлональные кроличьи антитела против рецептора ЭФР, поликпональные кроличьи антитела против ERK1 ,2 (CeII Sigпаliпg Тесhпоlоgу, США). В качестве вторичных антител при иммуноблотинге используются козьи антитела, полученные против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой (GAM-HRP) (Sigmа, США) и козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, CeII Sigпаliпg Тесhпоlоgу, США). Для специфического выявления гемоксигеназы используются первичные поликлональные кроличьи антитела против гемоксигеназы 1 (Sапtа Сruz, США). В качестве вторичных антител при иммуноблотинге используются антитела, полученные против иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой (GAR-HRP) (Sапtа Сruz, США).

Метод удаления антител с мембраны (striррiп).

Для удаления связавшихся с нитроцеллюлозной мембраной антител и повторной окраски её другими антителами мембрану инкубируют в растворе, содержащем 60 мМ Трис-НСL (рН 6.8), 2% SDS и 100 мМ 2-мepкaптoэтaнoл, в течение 30 мин при 50 ⁰ C при покачивании.

Методы денситометрии и статистической обработки результатов.

Рентгеновские пленки с результатами сканировали используя программу Рhоtоshор 6.0, денситометрию полос проводили с использованием программы Sсiоп Imаgе 4.0.2. , полученные значения делили на величину контрольного значения, и усредняли для трех аналогичных экспериментов (повторов). Графики строили в программе Мiсгоsоft Ехсеl 2000 9.0, откладывая по оси абсцисс время, а по оси ординат - отношение экспериментальных величин к контрольному значению.

Результаты влияния исследуемых соединений на пролиферативную активность и гибель клеток

Согласно полученным данным цистеин в используемых концентрациях вызывает активацию рецептора ЭФР при длительных сроках воздействия - от 1 часа до 4-8 часов - 8-10 раз относительно значений контрольной серии.

Координационное соединение C-Pd в используемых концентрациях оказывает более выраженное влияние на тирозинкиназную активность рецептора эпидермального фактора роста 5-8 раз в течение первого часа и на длительных сроках воздействия - от 1 часа до 4-8 часов - 15-20 раз относительно значений контрольной серии.

Профиль тирозинкиназной активности рецептора эпидермального фактора роста в анализируемые периоды времени при сочеτанном действии цистеина и координационного соединения и цистеина - C-Pd:C - 1 :1000 в используемых концентрациях был подобен профилю тирозинкиназной активности рецептора ЭФР при действии координационного соединения. Уровень тирозинкиназной активности рецептора ЭФР при действии C-Pd:C имел небольшой прирост на длительных сроках воздействия - от 1 часа до 4-8 часов в среднем около 20 % к уровню активирующего влияния на рецептор только координационного соединения.

Тирозинкиназная активность рецептора ЭФР наибольший прирост имела при действии высокотропного лиганда рецептора ЭФР - эпидермального фактора роста в насыщающей концентрации, 2-3 кратно превышая тирозинкиназную активность рецептора ЭФР при действии координационного соединения в ранние сроки (до 1 часа) и в 4 -5 раз от 1 часа до 4-8 часов.

Ингибитор тирозинкиназы рецептора ЭФР - тирфостин AG1478 полностью ингибирует тирозинкиназную активность рецептора ЭФР на культуре клеток A431 в концентрациях от 3 до 7 мкг/мл, привнесении за 10 - 25 мин до воздействия высокотропного лиганда эпидермального фактора роста. При определении оптимального времени внесения ингибитора использовали его концентрацию 7,5мкг/мл. Ингибитор вносили за 1 , 5, 10, 15, 20, 25, 30 мин до введения в среду инкубации эпидермального фактора роста (200 нг/мл). Ингибитор полностью отменял стимуляцию тирозинкиназной активности рецептора ЭФР эпидермальным фактором роста во всех сериях опытов в ранние и поздние сроки при воздействии за 15, 20, 25, 30 мин до воздействия лиганда рецептора эпидермального. При воздействии ингибитора AG 1478 в течении 10 мин до действия эпидермального фактора роста, рецепторы сохраняли 10-15% тирозинкиназной активности в поздние сроки ее определения (1 час, 4 и 8 часов). В этой связи выбрано минимальное время воздействия ингибитора - тирфостина AG 1478 до воздействия эпидермального фактора роста 15 мин. При определении дозы ингибитора тирфостин AG 1478, оказывающих и не оказывающих ингибирующее действие на тирозинкиназную активность рецептора ЭФР, его использовали в концентрациях 0.1 мкг/мл, 0.25 мкг/мл, 0.5 мкг/мл, 0.75 мкг/мл, 1 мкг/мл, 2.5 мкг/мл, 5 мкг/мл, 7.5 мкг/мл. AG1478 отменял тирозинкиназную активность рецептора ЭФР на 30% в концентрации 2.5 мкг/мл, а при действии в концентрации 5 мкг/мл и 7.5 мкг/мл тирозинкиназная активность рецептора ЭФР не определялась. При действии ингибитора тирозинкиназной активности рецептора ЭФР AG 1478 в концентрациях 0.1 мкг/мл, 0.25 мкг/мл, 0.5 мкг/мл, 0.75 мкг/мл он не влиял на проявление тирозинкиназной активности рецептора ЭФР, индуцируемой высокотропным лигандом - эпидермальным фактором роста. При действии ингибитора тирозинкиназной активности рецептора ЭФР AG1478 в концентрации 1 мкг/мл обнаружено недостоверное повышение тирозинкиназной активности рецептора ЭФР на поздние сроки инкубации (1 , 4 и 8 часов)

Полученные результаты экспериментов свидетельствуют о формировании димера рецептора ЭФР под воздействием координационного соединения в используемых концентрациях, усиление эффекта координационного соединения при его сочетании с избытком лиганда, так как известно, что только димер рецептора ЭФР обладает тирозинкиназной активностью. Усиление активности координационного соединения при его сочетании с избытком лиганда может быть обусловлено попаданием в инкубационную среду большего количества координационного соединения. Работа с малыми концентрациями опасна тем, что часть вещества может теряться вследствие сорбции на стенках сосудов, пипеток. Подобные потери незначительны, однако при использовании веществ в ультрамалых количествах могут привести к практически полной потере вещества до внесения в среду инкубации клеток. Избыток органической молекулы в таком случае способствует попаданию в инкубационную среду планируемой концентрации исследуемого вещества. Подобное обоснование не отменяет экспериментального факта собственного влияния цистеина на тирозинкиназную активность рецептора ЭФР, но не дает ответа на вопрос: значимо ли для клетки такое изменение активности клеточных реакций, контролируемых посредством воздействия на рецептор ЭФР, или является следствием трансактивации рецептора ЭФР, что имеет место при действии многих веществ на клетки и не связано с его непосредственной физиологической функцией. Известно, что отражением специфичности ингибирующего или активирующего воздействия на рецептор ЭФР является изменение пролиферативной активности. В этой связи оценивалось изменение пролиферативной активности при воздействии исследуемых соединений (табл.2). Таблица 2.

Влияние исследуемых соединений а на пролиферативную активность клеток A431.

Исследуемое Возраст Всего клеток Доля погибших соединение/концентрация культуры (час) ( ^χ Ю ³ /мл) клеток (%)

0 10.0 -

Контроль (без добавления

24 14.3 12 исследуемых соединений)

48 21.1 19

0 10.0 .

Цистеин - 0.015 мкмоль/мл

24 14.7 11 48 23.5 22

Координационное О 10.0 - соединение цистеина - C- 24 32.3 8

Pd 0,015 нмоль/мл 48 36.1 12 Координационное О 10.0 - соединение 24 34.3 11 циcтeинa:циcтeин (C-Pd:C) 48 39.1 10 1 :1000 0,015 мкмоль/мл

Эпидермальный фактор О 10.0 _ роста 200 н г/мл. 24 47.3 19

48 68.8 23

Эпидермальный фактор О 10.0 - роста 200 нг/мл + AG 1478 ^* 24 48.1 20 0.75мкг/мл 48 70.8 25

Эпидермальный фактор О 10.0 - роста 200 нг/мл + AG 1478 24 47.1 23 1.0 мкг/мл 48 65.7 23

Эпидермальный фактор О 10.0 - роста 200 нг/мл + AG1478 24 39.4 27 2.5 мкг/мл 48 61.1 30

Эпидермальный фактор О 10.0 - роста 200 нг/мл + AG1478 24 6.4 29 5.0 мкг/мл 48 2.1 41

^* - AG 1478 вносили за 15 мин до воздействия эпидермального фактора роста.

Результаты экспериментов показывают практически одинаковую пролиферативную активность клеток в контроле и при действии цистеина, что указывает на отсутствие влияния цистеина на стимуляцию пролиферативной активности. Напротив, координационное соединение цистеина и палладия независимо от способа использования, самостоятельно или в избытке лиганда, стимулирует пролиферативную активность клеток A431. Полученный результат указывает на то, что координационное соединение d-металла и серосодержащей органической молекулы обладает собственным биологическим действием, которое может не совпадать с собственным действием лиганда. Такое различие может быть обусловлено появлением нового свойства или свойств координационного соединения, не присущих лиганду. Эпидермальный фактор роста оказывал максимальное стимулирующее воздействие на пролиферативную активность клеток A431. Результаты сочетанного использования с ингибитором тирозинкиназной активности позволили выявить концентрации, в которых его ингибирующая активность является недостаточной. Известно, что сродство ингибитора к сайту связывания максимально при димерной форме молекулы рецептора ЭФР, можно полагать, что преинкубация с ингибитором приводит к связыванию AG 1478 с теми молекулами рецептора ЭФР, которые находятся в димерной форме, но оставшихся молекул ингибитора недостаточно, чтобы при димеризации рецептора, обусловленной действием эпидермального фактора роста, связаться с центром тирозинкиназной активности до осуществления им фосфорилирования специфических тирозинов. В этой связи логично проверить результат действия неэффективных концентраций ингибитора AG1478 (1.0 мкг/мл, 2.5 мкг/мл) в случае, когда димеризация рецептора инициирована воздействием координационного соединения (координационное соединение использовано в избытке лиганда, учитывая отсутствие действия последнего на пролиферативную активность клеток, и возможной точного дозирования координационного соединения в таком сочетании). В этом случае молекулы ингибитора смогут максимально связаться с димеризованными рецепторами и устранить последующую тирозинкиназную активность рецептора ЭФР при воздействии эпидермального фактора роста. Время прединкубации до внесения ингибитора выбрано 30 мин с учетом максимального стимулирующего воздействия координационного соединения в избытке лиганда на тирозинкиназную активность рецептора ЭФР в ранние сроки, инкубация с концентрациями ингибитора AG1478 - 1.0 мкг/мл, 2.5 мкг/мл, составила 15 мин до воздействия эпидермального фактора роста. Результаты эксперимента приведены в таблице 3.

Таблица 3. Влияние координационного соединения на эффективность действия ингибитора рецептора ЭФР AG 1478

Возраст Всего Доля

Исследуемое соединение/концентрация культуры клеток погибших

(час) ( ^χ 10 ³ /мл) клеток (%)

0 10.0 -

Контроль (без добавления исследуемых

24 15.2 11 соединений)

48 23.3 17

0 10.0 -

Эпидермальный фактор роста 200 нг/мл. 24 52.0 22

48 71.7 29

Координационное соединение 0 10.0 - циcтeинa:циcтeин (C-Pd:C) 1 :1000 0,015 24 27.4 24 мкмоль/мл

+ AG1478 1.0 мкг/мл + ЭФР 48 29.1 31

Координационное соединение 0 10.0 _ циcтeинa:циcтeин (C-Pd:C) 1 :1000 0,015 24 8.1 26 мкмоль/мл

48 5.4 29

+ AG1478 2.5 мкг/мл + ЭФР

Как следует из полученных результатов, воздействие координационного соединения на рецептор ЭФР позволяет повысить эффективность действия ингибитора тирозинкиназной активности AG1478 и при их сочетанном применении использовать последний в более низких концентрациях.

Зная, что рецептор ЭФР является мишенью фармакологического воздействия, и учитывая способность биядерных координационных соединений d-элементов с алифатическими тиолами соединений повышать сродство рецептора ЭФР к средству фармакологического воздействия ингибитору тирозинкиназной активности, можно полагать, что использование биядерных координационных соединений d-элементов с алифатическими тиолами позволяет перейти к терапии заболеваний, где значимы повышение чувствительности фармакологической мишени к действию лекарства для использования последнего в физиологически адекватных дозах.

Пример NsЮ Повышение концентрации лекарства в микроокружении фармакологической мишени посредством ингибирования фактора множественной лекарственной устойчивости - Р-гликопротеина воздействием координационного соединения.

Р-гликопротеин (Рgр) защищает клетки от молекул токсических веществ, включая молекулы лекарства, удаляя их из клетки от внутриклеточной мишени. Многие виды опухолей характеризует выраженная устойчивость к действию цитостатиков вследствие выраженной активности Рgр у клеток, образующих эти опухоли. В этой связи использование ингибиторов активности Рgр в химиотерапевтической практике нашло практическое применение в лечении злокачественных новообразований для подавления лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Применение ингибиторов Рgр ограничивается преимущественно злокачественными новообразованиями, что обусловлено побочным действием ингибиторов Рgр, более опасным, чем достигаемый положительный эффект от действия лекарства. Злокачественные новообразования составляют исключение, так как резистентность опухолевых клеток при использовании цитостатиков означает отсутствие результата химиотерапии, воздействие больших количеств цитостатиков на нормальные клетки и их токсическое поражения. В этой связи оправдано использование ингибиторов Рgр, позволяющих получить терапевтический эффект от средств химиотерапии, преодолеть лекарственную устойчивость опухолевых клеток обусловленную Рgр. Поиск новых, мало токсичных, но эффективных ингибиторов Р-гликопротеина является актуальной задачей, решение которой позволит повысить эффективность действия фармпрепаратов при различных заболеваниях, включая злокачественные новообразования.

Цель работы: Изучение способности координационного соединения повышать количество лекарства в микроокружении мишени посредством ингибирования активности Р-гликопротеина.

В качестве исследуемых соединений использовались координационное соединения цистеамина и палладия (Ц-Рd) (пример N22); цистеамин (Ц); координационное соединение Ц-Рd с избытком цистеамина (Ц-Pd:Ц; соотношение координационное соединение: цистеамин - 1 :1000); доксорубицин, использовали в трех концентрациях: максимальной - 5x10 ^"7 M, а также в 5 и 10 раз меньше

Приготовление препаратов для проведения исследования

Исследуемые соединения хранили при +4 ^° C; непосредственно перед началом эксперимента вещества растворяли в деионизированной воде (suрег Q).

Концентрация исходного раствора в 1000 и более раз превышает концентрации, используемые в эксперименте. Приготовленный концентрированный раствор хранится не более 5 часов при +4°C.

Путь введения

Соединения добавляли в среду культивирования клеток до исследуемой конечной концентрации.

Число доз.

Препарат добавляется к клеткам однократно на указанный период времени.

Концентраиии

Цистеамин (Ц) 0,015 и 0,15 мкмоль/мл;

Координационное соединение цистеамина - Ц-Рd 0,015 и 0,15 нмоль/мл; Координационное соединение цистеамина: цистеамин (Ц-Pd:Ц) 1 :1000 - 0,015 и 0,15 мкмоль/мл (в мкмоль/мл дана концентрация лиганда).

Препараты вносились однократно.

Использованная линия клеток.

Культура клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkаt

Условия культивирования клеток.

Клетки культивируются в CO ₂ -инкyбaтope (Nеw Вruпswiсk Sсiепtifiс) при +37 ^° C и при содержании CO ₂ 5 %. В этих условиях клетки выращиваются до монослойной культуры и подвергаются действию исследуемых соединений.

Условия культивирования клеток, порядок определения влияния исследуемых соединений на активность РQР. Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки. В день опыта суспензию клеток центрифугировали в течение 10 минут при 1 ,5 тыс. об/мин и осадок ресуспендировали в фосфатном буферном растворе рН 7,4. Количество клеток в полученной суспензии подсчитывали в камереТоряева и, в случае необходимости, центрифугировали и ресуспендировали в соответствующем объеме фосфатного буферного раствора до достижения конечной концентрации клеток 1 млн. в мл.

Непосредственно перед проведением эксперимента по изучению влияния исследуемых соединений на взаимодействие моноклональных антител с маркерами множественной лекарственной резистентности готовили необходимые разведения коммерческих антител, используя раствор фосфатного буфера рН 7,4. В пластиковые пробирки для проточного цитофлуориметра к 100 мкл суспензии исследуемых клеток с определенной концентрацией добавляли соответствующие разведения антител и инкубировали на холоду при 4°C в течение 30 минут. После окончания инкубации для отмывания свободных (не связанных с Рgр) антител в каждую пробирку добавляли по 2 мл фосфатного буферного раствора рН 7,4 и центрифугировали при 1 ,5 тыс об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отбирали вакуумным насосом и процедуру отмывки проводили повторно. Осадок ресуспендировали в 300 мкл фосфатного буферного раствора рН 7,4.

В работе использованы мышиные моноклональные антитела фирмы BD

Рhаrmiпgеп, меченые FITC, клон 17F9. Данные антитела характеризуются специфичностью к внешнему эпитопу трансмембранного белка Рgр человека. В исследовании использованы девять концентраций антител, выраженные в объемных единицах неразведенного коммерческого раствора: 40; 20; 10; 5; 2,5; 1 ; 0,5; 0,25 и 0,1 мкл на 100 мкл клеточной суспензии. За максимальную принята концентрация 40 мкл, так как при дальнейшем увеличении количества антител происходило лишь незначительное изменение интенсивности флуоресценции и процента окрашенных клеток.

В качестве изотипического контроля использованы мышиные моноклональные антитела lgG ₂ ь, k, меченые FITC, в эквивалентных специфическим антителам концентрациях.

Оценка функциональной активности РQР в суспензионной культуре клеток с помощью метода проточной цитофлюориметрии.

Клетки отмывают от питательной среды путем центрифугирования при 2 тыс оборотах, осадок ресуспендируют в растворе Хенкса с глюкозой без фенолового красного и клеточную суспензию разливают по пробиркам. Далее к суспензии клеток добавляют ингибитор тpaнcпopтepa(oв) и инкубируют в течение 20 мин (в контрольный образец добавляют раствор Хенкса с 5 мМ глюкозы). Затем следует инкубация в течение 5 мин при 37 ⁰ C с доксорубицином, после чего клетки фиксируют 10% формалином. На следующем этапе приготовленные пробы анализируют методом цитофлюориметрии в потоке.

Метод проточной цитофлюориметрии.

Измерение флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре FАСSСаlibur (Весtоп Diсkiпsоп) при длине возбуждения, равной 488 нм, и длине испускания - 576 нм, при значении шторки 100, со скоростью 200 клеток/сек. Число анализируемых событий - от 5 до 10 тысяч. Анализ гистограмм распределения клеток, в соответствии с интенсивностью флуоресценции, проводили с помощью программы WiпМDI по показателям средней флуоресценции совокупно по всей суспензии клеток, раздельно - в области флуоресценции изотипического контроля (под маркером M2) и специфического связывания антител к Рgр (под маркером M1), а также по количеству клеток под маркером M1 в области специфического связывания моноклональных антител, которую определяли методом Колмогорова- Смирнова.

Результаты влияния исследуемых соединений на пролиферативную активность и гибель клеток.

Перед началом основного этапа исследований охарактеризована экспрессия маркера множественной лекарственной резистентности Рgр в культуре клеток T- лимфобластного лейкоза человека линии Jurkаt при окрашивании клеток специфическими антителами к внеклеточному эпитопу Рgр в диапазоне концентраций антител 0,1 ; 0,25; 0,5; 1 ,0; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0 мкл. Исследуемые соединения в используемых концентрациях не влияли на взаимодействие с клетками изотипических антител, используемых при окраске Рgр, в диапазоне концентраций антител 0,1 ; 0,25; 0,5; 1 ,0; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0; 40,0 мкл.

Преинкубация клеток с координационным соединением, с координационным соединением в избытке лиганда в используемых концентрациях уменьшила среднюю флуоресценцию клеток, окрашенных специфическими антителами к Рgр, в 1 ,4-1 ,7-2,0 раза при концентрациях специфических антител к Рgр 2,5-5,0-10,0 мкл соответственно при концентрациях 0.15 нмоль/мл и 0.15 мкмоль/мл, и в 1 ,8- 1 ,7-1 ,9 раз при концентрациях 0.015 нмоль/мл и 0.015 мкмоль/мл во втором эксперименте. Цистеамин на влиял на среднюю флюоресценцию клеток ни в одной из используемых концентраций.

Таким образом, активность Рgр подавлялась только при воздействии координационного соединения используемого обособленно или в избытке лиганда.

Воздействие координационного соединения в концентрациях 0.015 и 0.15 мкмоль/мл на внутриклеточное накопление и распределение между цитоплазмой и ядром модельного препарата и флуоресцентного зонда доксорубицина, примененного в трех концентрациях: максимальной - 5x10 ^-7 M, а также в 5 и 10 раз меньше, привело к выраженному увеличению внутриклеточного накопления доксорубицина после преинкубации клеток с координационным соединением в обеих исследованных концентрациях. Это зарегистрировано как увеличение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина при разных концентрационных соотношениях доксорубицин. При соотношении координационное соединение 0.15 мкмоль/мл : доксорубицин 1/10 - в 1 ,3 раза , при соотношении координационное соединение 0.015 мкмоль/мл : доксорубицин 1 , 1/5 и 1/10 - в1 , 4-2, 0-2, 2 раза соответственно.

Более того, при концентрации доксорубицина 1 и 1/5 и при воздействии координационного соединения в концентрации 0.15 мкмоль/мл отмечено увеличение ядерного накопления доксорубицина и его связывания с ДНК, результатом чего явилось значительное (в 1 ,4 и 1 ,7 раза соответственно) снижение внутриклеточной флуоресценции доксорубицина.

Таким образом, воздействием координационного соединения на фактор множественной лекарственной устойчивости - Р-гликопротеин достигается повышение концентрации лекарства в микроокружении фармакологической мишени, что позволяет рассматривать координационные соединения как перспективные средства для повышения терапевтической эффективности лекарства и его использования в терапевтически оптимальных дозах.

Пример 11. Влияние координационного соединения меди на активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков в клетках печени животного.

Цель работы. Изучение влияния координационных соединений на активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков в клетках печени животного. В качестве исследуемых соединений использовались цистеин (С), координационные соединения цистеина с медью (C-Cu) с избытком цистеина (см. пример 5).

Исследование было проведено на белых рандомбредных крысах-самцах массой 140-160 г, из питомника РАМН «Paппoлoвo», гепатотоксическое действие у которых вызывалось ежедневным, в течении 10 суток, введением циклофосфана (ЦФ) в дозе 20 мг/кг подкожно в физиологическом растворе.

Было сформировано 4 группы экспериментальных животных.

N°1 - интактные животные, получавшие инъекции растворителя изучаемых соединений (физиологический pacтвop)(кoнтpoль растворителя);

Ne2 - животные, получившие ЦФ, которым в дальнейшем в качестве лечебного средства вводили физиологический раствор (контроль);

Опытные группы:

NsЗ - животные, получившие исследуемое соединение цистеин (С) в физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг в течение 10 дней через 30 мин после введения токсиканта ЦФ.

N°4 - животные, получившие получившие цистеин (С) в сочетании с координационным соединением цистеина и меди (C-Cu:C, соотношение цистеинжоординационное соединение 1000:1) в физиологическом растворе внутрибрюшинно в дозе 10 мг/кг (количество координационного соединения 8,3x10 ^"

⁸ M/кг) в течение 10 дней через 30 мин после введения токсиканта ЦФ.

Исследовались ферменты второй фазы детоксикации ксенобиотиков в цитозольной фракции клеток печени: глутатион-S-трансфераза (КФ 2.5.1.18), глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9), глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) глюкoзo-6- фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49.)

Исследуемый материал.

Цитозольная фракция клеток печени

Исследуемые ферменты.

Глутатион-S-трансфераза (КФ 2.5.1.18), глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9), глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2) глюкoзo-6-фocфaтдeгидpoгeнaзa (КФ

1.1.1.49.).

Метод получения цитозольной фракции клеток печени.

С целью получения материала для исследований лабораторных животных декапитировали под эфирным наркозом. Печень извлекали после полного удаления из нее крови перфузией через верхнюю полую вену охлажденного 0,15

M раствора KCI (рН 7,8). Клетки печени отделяли от стромы и гомогенизировали в гомогенизаторе типа Даунса с тефлоновым пестиком при соотношении массы ткани к объему раствора (0.15 M KCI, рН 7.8) - 1 : 10. Гомогенат центрифугировали при 12x10 ³ g, температуре 4° С в течение 25 мин. Постмитохондриальный супернатант центрифугировали при 105x10 ³ g, температуре 4° С в течение 60 мин с использованием ротора Туре 50 3.Ti на ультрацентрифуге L8-M («Beckman», США). Цитозольную фракцию использовали для определения активности ферментов.

Концентрацию восстановленного глутатиона в гомогенате клеток печени определяли с использованием 5,5'-ди-тиo-биc(-2-нитpoбeнзoйнoй) кислоты (ДТНБ) по методике G.LЕIImап с применением раствора сульфосалициловой кислоты для осаждения белка в пробах, что в отличие от использования метафосфорной или трихлоруксусной кислот исключало спонтанный переход восстановленной формы глутатиона в окисленную.

Принцип метода основан на образовании при взаимодействии ДТНБ (реактива Эллмана) с кислоторастворимыми тиоловыми группами окрашенного продукта -

5-тиo,2-нитpoбeнзoйнoй кислоты (THB) ₁ имеющего максимум поглощения на длине волны 412 нм.

К 0,6 мл гомогената клеток печени добавляли 0,2мл 20 % раствора сульфосалициловой кислоты. Пробы центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об./мин при температуре +2°C. 0,2 мл полученного супернатанта переносили в пробирки, содержащие 2,55 мл 0.1 M ТРИС-НСI буфера с 0,01 % этилендиаминтетраацетатом (ЭДТА) рН 8,5. К полученной смеси добавляли 25 мкл раствора ДТНБ (4 мг коммерческого препарата ДТНБ («Boehringer Mannheim», Германия) в 1 мл абсолютного метанола). После развития окраски пробы фотометрировали на спектрофотометре DU 650 («Beckman»,CUJA) против раствора сравнения на длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Расчет содержания восстановленного глутатиона проводили по калибровочной кривой. Для чего из коммерческого препарата ВГ («Sigma», США) готовили растворы ВГ с концентрациями от 0,02 до 2,0 ммоль/л, из них отбирали пробы для определения содержания восстановленного глутатиона по описанной выше методике и по полученным значениям экстинкции строили калибровочную кривую. По калибровочной кривой рассчитывали концентрацию восстановленного глутатиона.

Определение активности ферментов.

Определение активности глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9). Активность глутатионпероксидазы определяли использованием в качестве субстрата гидроперекиси трет-бутила (ГПТБ).

Принцип метода заключается в утилизации восстановленного глутатиона глютатионпероксидазой при инкубации цитозоля клеток с ГПТБ. Содержание восстановленного глутатиона (ВГ) в пробах до и после инкубации определяли в цветной реакции с использованием 5,5'-ди-тиo-биc(-2-нитpoбeнзoйнoй) кислоты

(ДТНБ) по методике G.LЕIImап.

Для осуществления ферментативной реакции цитозольную фракцию клеток печени дополнительно разводили 0,1 M калий-фосфатным буфером с рН 7,4 в 40 раз, В опытную и контрольную пробы вносили 0,2 мл разведенного цитозоля и добавляли 0,73 мл 0,1 M ТРИС-НСI буфера рН 8,5 (в 1 мл буфера содержалось 0,1 мг ЭДТА, 0,78 мг NaN ₃ («Sigma», США) и 1 мг ВГ («Sigma», США). Пробы инкубировали в термостате при +37°C в течение 10 мин. Реакцию запускали внесением 70 мкл раствора ГПТБ, приготовленного разведением 70 % коммерческого препарата ("ICN", США) в дистиллированной воде в 500 раз. В контрольные пробы вместо раствора ГПТБ вносили 70 мкл H ₂ O. После инкубации в течение 5 мин при +37°C реакцию останавливали внесением в пробирки по 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин, супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона аналогично вышеописанной методике. Расчет активности фермента производили по калибровочной кривой на основании разницы количества ВГ в опытной и контрольной пробах и выражали в ммoль/(минт белка).

Определение активности глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2).

Активность глутатионредуктазы определяли методом, основанным на каталитической НАДФ Н-зависимой реакции восстановления окисленной формы глутатиона в восстановленную, интенсивность которой может быть оценена по скорости снижения экстинкции проб на длине волны 340 нм, на которой раствор НАДФ Н имеет максимум светопоглощения:

Глутатионредуктаза

НАДФ Н + H ⁺ + ОГ → → → HAДФ ⁺ + 2 ВГ

Для осуществления ферментативной реакции цитозольную фракцию клеток печени дополнительно разводили 0,1 M калий-фосфатным буфером рН 7,4 в соотношении 1 :9, Реакцию проводили в термостатируемой кювете при температуре +37°C. В кювету вносили 1 ,8 мл 0,1 M калий-фосфатного буфера рН 7,0 с 1 мМ ЭДТА, 0,1 мл 20 мМ водного раствора окисленного глутатиона («Boehringer Mannheim», Германия) и 100 мкл разведенной цитозольной фракции. После 3 - 5 мин уравновешивания температур запускали реакцию добавлением 0,1 мл 2мM раствора НАДФ Н («F.Hoffmann - La Roche», Швейцария), растворенного в 10 мМ ТРИС-НСI буфере с рН 7,0. Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на длине волны 340 нм против пробы сравнения сразу же после перемешивания содержимого втечении 5 мин в кювете с длиной оптического пути 10 мм в спектрофотометре DU 650. В качестве контроля использовали измерение оптической плотности реакционной смеси, в которую вместо цитозоля вносили в том же объеме 0,1 M калий-фосфатный буфер с рН 7,4. Расчет активности глутатион-редуктазы осуществляли используя молярный коэффициент светопоглощения для НАДФ Н на длине волны 340 нм, равный ε=6200 M ^"1 cм ^'1 . Активность выражали в мкмoль/(мин т белка).

Определение активности глутатион-S-трансферазы (КФ 2.5.1.18.).

Определение активности глутатион-S-трансферазы проводили по методу W.Н.Наbig и W.В.Jаkоbу.

Метод основан на способности восстановленного глутатиона взаимодействать с 1-xлop-2,4-динитpoбeнзoлoм в присутствии глутатион-S- трансферазы с образованием продукта, имеющего максимум светопоглощения при длине волны 340 нм.

Для осуществления ферментативной реакции цитозольную фракцию клеток печени дополнительно разводили 0,1 M калий-фосфатным буфером с рН 7,4 в соотношении 1 :9. Реакцию осуществляли в термостатируемой кювете при температуре +37°C. В кювету вносили 1 ,2 мл 2 мМ раствора восстановленного глутатиона («Sigma», США) на 0,1 M калий-фосфатном буфере с рН 6,5 и 0,1 мл разведенной цитозольной фракции. После уравновешивания температур реакцию запускали внесением в среду 1 ,2 мл 2 мМ раствора 1-xлop-2,4-динитpoбeнзoлa (10 мг коммерческого препарата («ICN», США) растворяли в 1 мл абсолютного метанола, а затем к полученному спиртовому раствору добавляли 23 мл 0,1 M калий-фосфатного буфера с рН 6,5). Измерение оптической плотности исследуемых растворов проводили на длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания содержимого и через 5 мин в кювете с длиной оптического пути 10 мм в спектрофотометре DU 650. В качестве контроля использовали измерение оптической плотности смеси, куда вместо цитозоля вносили такой же объем 0,1 M калий-фосфатного буфера с рН 7,4. Расчет активности глутатион S- транс-феразы осуществляли используя молярный коэффициент светопоглощения для образующегося продукта на длине волны 340 нм, равного ε=9600 M ^"1 -см ^'1 . Активность выражали в мкмoль/(мин -г белка)..

Определение активности глюкoзo-6-фocфamдeгuдpoгeнaзы (КФ 1.1.1.49..)

Активность глюкoзo-6-фocфaтдeгидpoгeнaзы определяли по методу А.Коrпbеrg и соавт.

Метод основан на способности глюкoзo-6-фocфaт-дeгидpoгeнaзы осуществлять восстановление HAДФ ⁺ до НАДФ Н при окислении глюкoзo-6- фосфата. Количества образующегося НАДФ Н пропорциональны активности фермента.

Ферментативную реакцию проводили в термостатируемой кювете при температуре при +37°C. В кювету вносили 3,0 мл 50 мМ ТРИС-НСI буфера рН 7,6 с 5 мМ ЭДТА, 0,1 мл 10 мМ раствора НАДФ («Merck», Германия) и 50 мкл цитозольной фракции печени. После уравновешивания температур реакцию инициировали добавлением к исследуемой среде 0,1 мл 5 мМ раствора глюкoзo-6- фосфата натрия («Boehringer Mannheim», Германия). Пробы фотометрировали на длине волны 340 нм против контроля без субстрата в течении 5 мин в кювете с длиной оптического пути 10 мм на спектрофотометре DU 650. Расчет активности проводили используя молярный коэффициент светопоглощения для образующегося НАДФ Н на длине волны 340 нм, равный ε=6200 M ^"1 -см ^"1 . Активность выражали в мкмoль/(мин т белка).

Определение концентрации белка.

Содержание белка определяли методом Лоури в модификации

G.L.Реtеrsоп.

Принцип метода заключается в осуществлении двух последовательных реакций, специфических для определения белка: с тартратом-карбонатом меди, взаимодействующим в щелочной среде с пептидной связью, и реагентом Фолина- Чикольте, взаимодействующим с ароматическими аминокислотами. В результате происходит образование окрашенных комплексов, имеющих максимум светопоглощения на длине волны 750 нм, при этом интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в пробе.

К 0,99 мл дистиллированной воды последовательно добавляли 10 мкл цитозольной фракции печени, 0,1 мл 0,15 % раствора дезоксихолата натрия («Sigma», США). Пробы инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, затем белок в пробах осаждали 0,1 мл 72 % раствора трихлоруксусной кислоты. Далее пробы центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об./мин. Супернатант удаляли, к осадку добавляли 1 мл воды и 1 мл реагента, приготовленного из равных объемов 10 % раствора додецил-сульфата натрия, 0,8 M раствора NaOH, дистиллированной воды и раствора тартрата- карбоната меди (0,1% сульфат меди, 0,2% тартрат калия-натрия и 10% карбонат натрия). После добавления к осадку реагента происходило растворение осадка. Полученный раствор инкубировали при температуре +30 ⁰ C в течение 10 мин. Затем в раствор вносили 0,5 мл 0,33 M реагента Фолина-Чикольте («Serva», Германия) и после встряхивания пробы оставляли в темном месте на 30 мин. Затем пробы фотометрировали на спектрофотометре DU 650 против дистиллированной воды на длине волны 750 нм в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Для определения содержания белка строили калибровочную кривую, для чего готовили водные растворы бычьего сывороточного альбумина с концентрацией от 0,1 до 10,0 г/л, из них отбирали пробы для определения содержания белка по описанной методике и получали значения экстинкции, соответствующие конкретным концентрациям. По калибровочной кривой рассчитывали содержание белка в цитозольной фракции и выражали в г/л.

Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6,0». В каждой группе рассчитывали средние значения и ошибку среднего. Достоверность различий с соответствующей контрольной группой оценивали по t- критерию Стьюдента. Приведенные в тексте и таблицах значения представляли в виде Х _е р ± m _x .

Результаты исследования.

Результаты изучения комплекса молекулярных реакций обеспечивающих толерантность к действию токсических веществ свидетельствуют о способности цистеина (С), и его координационного соединения (C-Cu) индуцировать активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков - глутатионредуктазы (КФ 1.6.4.2), глутатионпероксидазы (КФ 1.11.1.9), глутатион-S-трансферазы (КФ 2.5.1.18) а также сопряженного с ними обмена восстановленного глутатиона (тaбл.4). Таблица 4 Влияние координационного соединения цистеина и меди (см. пример N°5) на способность цистеина индуцировать активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков в клетках печени белых беспородных крыс при повторном введении циклофосфана в дозе 20 мг/кг в течение 10 суток (Активность ферментов в мкмoль/(мин ^• г белка, восстановленного глутатиона- мкмоль/г белка)

^* - достоверность отличия p<0,05 по сравнению с группой контроля

- достоверность отличия p<0,05 по сравнению с группой отравленных животных без коррекции

GR - глутатионредуктаза (КФ 1.6.4.2)

GP -глутатионпероксидаза (КФ 1.11.1.9)

GST- глутатион-S-трансфераза (КФ 2.5.1.18)

G6PDG- глюкoзo-6-фocфaтдeгидpoгeнaзa (КФ 1.1.1.49.)

GSН-восстановленный глутатион

Ультрамалые количества координационного соединения усиливали способность цистеина индуцировать активность ферментов второй фазы детоксикации ксенобиотиков, увеличивали интенсивность обмена ключевого сопряженного с ними метаболита восстановленного глутатиона.

Таким образом, сочетанное использование биядерного координационного соединения d-металла с алифатическим тиолом с другими средствами этиотропной, патогенетической и симптоматической терапии, позволит избежать побочных эффектов сочетаемого лекарственного препарата, делая терапию физиологически более адекватной.

Пример Ns12. Влияние координационного соединения меди и ацетилцистеина на гемостимулирующую активность литиевой соли ацецетилцистеина.

Исследовали препарат, содержащий литиевую соль ацетилцистеина (аС-Li) и координационное соединение меди (см. пример N°6).

Приготовление растворов исследуемых соединений для проведения исследования. Кристаллические вещества хранили при 4 ^° C; непосредственно перед началом эксперимента вещество растворяли в физиологическом растворе. Раствор стерилизовали пропусканием через фильтры 0,22 мкм Мillех-GS (Мilliроrе) в стерильном ламинарном боксе.

Модель исследования.

Исследование было проведено на белых рандомбредных крысах-самцах массой 140-160 г, которым однократно вводили циклофосфан в дозе 100 мг/кг подкожно в физиологическом растворе.

Было сформировано 4 группы экспериментальных животных.

Ns1 - интактные животные, получавшие инъекции растворителя изучаемых соединений (физиологический pacтвop)(кoнтpoль растворителя);

N°2 - животные, получившие инъекцию ЦФ, которым в дальнейшем в качестве лечебного средства вводили физиологический раствор (контроль);

Опытные группы:

NsЗ - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили Cu-aC-Li:aC-Li в физиологическом растворе в дозе 10 мг/кг (количество координационного соединения У.βхЮ^М/кг);

N°4 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили аС-Li в физиологическом растворе в дозе 10 мг/кг ;

Ns5 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили карбонат лития в физиологическом растворе в дозе 3 мг/кг (количество карбоната лития, рассчитывали исходя из массовой доли иона лития (0.55) в 10 мг литиевой соли цистеина, аналогичное количество лития содержится в 3 мг карбоната лития);

N°6 - животные, получившие инъекцию циклофосфана, которым, в дальнейшем, в качестве лечебного средства вводили ацетилцистеин в физиологическом растворе в дозе 9.5 мг/кг (количество ацетилцистеина, рассчитывали исходя из массовой доли ацетилцистеина (-0.95) в 10 мг ацетилцистеина, что соответствует 9.5 мг гидрированной формы ацетилцистеина );

Исследуемые препараты вводили на третий день после введения циклофосфана.

Исследуемый материал.

Забор крови для гематологических исследований проводили из хвостовой вены через 3, 7, 14 суток после введения ЦФ. В конце каждой серии (3, 7 и 14 сут) экспериментальных животных подвергали эвтаназии передозировкой эфира и получали кровь из хвостовой вены и костный мозг из бедренной кости.

Анализируемые показатели.

В данном исследовании оценивали клеточность крови (число эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, а также СОЭ) и костного мозга при 7-дневном введении исследуемых соединений гемодепрессированным животным.

Результаты исследования

Результаты проведенных исследований клеточности крови представлены в таблицах 1-3.

Циклофосфан в дозе 100 мг/кг вызывает достаточно выраженную цитопению по всем форменным элементам крови с абсолютной и относительной лимфопенией, максимально выраженную на 14-й день (1-3).

Координационное соединение Cu-aC-l_i:aC-l_i оказывает выраженный гемостимулирующий эффект, что проявилось в практически полном восстановлении клеточности крови. Действие ацетилцистеина, и литиевой соли ацетилцистеина, карбоната лития, в отличие от координационного соединения меди с литиевой солью ацетилцистеина, вводимого в избытке литиевой соли ацетилцистеина, проявляется в виде позитивных тенденций, которые в целом можно оценить как гемостимулирующий эффект (табл.5-7).

Таблица 5

Общий анализ крови самцов крыс с цитопенией на 3 сут после введения циклофосфана (100 мг/кr); не получавших лечение (вводили физраствор), получавших лечение rемостимулятором (Li ₂ HCO ₃ ), литиевой солью ацетилцистеина (аС-Li) и литиевой солью ацетилцистеина в сочетании с координационным соединением ацетилцистеина с медью (аС-L±Сu-аС-Li, пример Nаб)

Цикло- Циtсло-

Интакт- Цикло- Цикло- Цикло-

Исследуемые фосфан фосфан

ω ные (физфосфан фосфан + фосфан +Cu- показатели (физ(ацетилци

> раствор) (Li ₂ HCO ₃ ) аG-Li aC-Li:aC-Li

раствор) стеин)

m Гемоглобин, (г/л) 15.2±0.16 13.0±0.2 13.2+0.21 13.1+0.19 12.9±0.22 12.5±0.25

Эритроциты, 6.7±0.1б 3,5±0.19 3,0+0.29 3,7+0.21 4.0±0.23 4.8+0.15

5 10 ¹² /л

СОЭ, мм/ч 2.5+.0.85 2±0.37 2.2±0.30 2.4±0.42 З.З±О.δО 3.2±0.54

Тромбоциты, 10 ⁹ /л 374±28.5 231±35.3 220±45.3 256±4δ.З 387+.17.4 502±36.4**

.3

О Ретикулоциты, % 1.8±0.2 0.08±0.005* О.ОЭ±О.ОО 0.118+0.01* 0.1±0.1** 0,5±0,1* ^*

6*

Лейкоциты, 10 ⁹ /л 9.2±0.35 3.58±0.26* 3.26±0.31* 3.75±0.46* 4.38±0.31 ^* 4.49±0.29*

>

ГО

Сеrментоядерные 16±2.5 18.7+2.4 * 17.6±2.1 * 19.7±3.4 ^* 42±1.6 ** 38±1.6 **

О нейтрофилы, %

N)

σ> Лимфоциты, % 75.5±1.4 71±1.8 ^* 68±2.8 * 62±3.8 * 45±1.6 * 51.3±0. **

- р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем;

* - р 0,05 - по сравнению с циклофосфановым контролем

10

Таблица 6

Общий анализ крови самцов крыс с цитопенией на 7 сут после введения циклофосфана (100 мг/кг); не получавших лечение (вводили физраствор), получавших лечение гемостимулятором (Li ₂ HCO ₃ ), литиевой солью ацетилцистеина (аС-Li) и литиевой солью ацетилцистеина в сочетании с координационным соединением ацетилцистеина с медью (аС-Li :Cu-aC-Li, пример Nаб)

цикле- Цикло- Цикло- ^° _aн

Исследуемые Интактные Цикло- показатели (физраствор) фосфан фосфан фосфан фосфан + JQ TJ ₀

(ацеталцистеин) (Li ₂ HCO ₃ ) аС-Li . .. ^ , .

ω

> Гемоглобин (r/л) 15.2±0.16 13.8±0.56 13.4±0.76 12.8±0.44 13.2+0.68 13.9+0.31

ЭpитpoцитыЮ ^1z /л 6.7±0.16 3,5+0.25 3,1+0.33 3,6+0.29 3.2+0.18 6.1±0.08**

m [СОЭ, мм/ч 2.5±0.85 1.8+0.31 1.9+0.39 2.0+0.36 3.2+0.80 2.0+0.37

Тромбоциты, 10 ³ /л 374+28.5 126+10.0** 124+11.0** 119±12.0 ^* * 164+10.0** 228±13.8 ^**

5

Ретикулоциты, % 1.8±0.2 1.0±0.1 0.9.0±0.2 1.1±0.1 1,2+0.2 1,63+0.2**

Лейкоциты, 10 ⁹ /л 9.2±0.35 3,41±0,09* 3,47±0,08* 3,22±0,11* 4,8±0.18** 6,88±0.18** О)

.3

О Сегментоядерные 16±2.5 32±1.9 * 30+1.8 * 33+1.7 ^* 50.4±0.6 ^* * бЗ.З±lб ^'

нейтрофилы, %

Лимфоциты, % 75.5+1.4 57.7+1.1 * 51.5+1.3 * 50.7+1.6 * 22+0.9 * 61±0.9) *

>

ГО * - р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем;

** - р 0,05 - по сравнению с циклофосфановым контролем

О

N)

σ> 10

15

Таблица 7.

Общий анализ крови самцов крыс с цитопенией на 14 сут после введения циклофосфана (100 мг/кг); не получавших лечение (вводили физраствор), получавших лечение гемостимулятором (Li ₂ HCO ₃ ), литиевой солью ацетилцистеина (аС-Li) и литиевой солью ацетилцистеина в сочетании с координационным соединением ацетилцистеина с медью (аС-Li :Cu-aC-Li) взятыми в соотношении 1000:1

Цикло- ЦИКЛО-

Цикло- Цикло-

Исследуемые Интакгные Цикло- фосфан фосфан

фосфан фосфан

показатели (физраствор) фосфан (ацетилц +Cu-aC- ω (Li ₂ HCO ₃ ) + аС-Li

> истеин) Li:aC-Li

Гемоглобин, (г/л) 15.2± 0.16 12.3± .68 12.5+ 0.5 13.1±0.57 13.6±0.63 13.7± 0.64

m Эритроциты, 10 ¹² /л 6.7± 0.16 4,4± 0.17 4,7± 0.21 4,9± 0.27 5.2± 0.26 6.0± 0.12

СОЭ, мм/ч 2.5± 0.85 2.3+ 0.61 2.1 ± 0.73 2.4± 0.65 2.7± 0.49 2.8± 0.70

5 Тромбоциты, 10 ³ /л 368±21.5 393±56.9 387±54.9 401±59.9 390±38.3 598±72.9**

Ретикулоциты, % 1.8±0.2 1.2±0.2 1.1±0.4 1.4±0.3 1,3±0.3 2,0±0.2**

Лейкоциты, 10 ^э /л 9.2+0.35 4.6±0.19** 5.7±0.22** 5.9±0.26** 5.6±0.22** 10,7+0.19**

Сегментоядерные 16±2.5 ** 14.3±1.6 ^* * 13.3±1.9** 14.9±2.6 ^* * 20.3±2.4 ** 2 _6± 2.2**

.3 нейтрофилы, %

О Лимфоциты, % 75.5±1.4 73.4±1.8 72.1±1.6 69.3±0.9 72.5±1.4 73.4±1.1

- р 0,05 - по сравнению с биологическим контролем;

* - р 0,05 - по сравнению с циклофосфановым контролем

>

ГО

О

N)

σ>

Таким образом, сочетанное использование биядерного координационного соединения d-металла с алифатическим тиолом и гемостимулирующего средства позволяет получать терапевтический эффект последнего в физиологически более адекватных дозах.

Пример Ns13. Влияние координационного соединения палладия с ацетилцистеином на гипогликемизирующее действие препарата тиоктовой кислоты с ацетилцистеином (см. пример N°7)

В качестве исследуемого препарата использовалась композиция ацетил цистеин - тиооктовая кислота (пример N°7)

Приготовление растворов исследуемых соединений для проведения исследования.

Белые кристаллические вещества хранили при 4 ^° C; непосредственно перед началом эксперимента вещество растворяли в физиологическом растворе. Раствор стерилизовали пропусканием через фильтры 0,22 мкм Мillех-GS (Мilliроrе) в стерильном ламинарном боксе. Для изучения гипогликемического действия исследуемые вещества вводили мышам натощак внутривенно в физиологическом растворе тиоктовая кислота в дозе 100 мг/кг, 200 мг/кг, тиоктовая кислота в сочетании с координационным соединением в избытке лиганда (эквимолярное соотношение: тиоктовая кислота - избыток лиганда), 10 и 20 мг/кг.

Проведение исследования.

Для оценки сахаропонижающей активности препарата использовали официально рекомендованные тесты [13, 14]:

гипогликемический тест (снижение содержания сахара в крови у интактных животных);

тест нагрузки глюкозой (снижение содержания сахара у животных с гипергликемией, вызванной введение глюкозы натощак);

модель аллоксанового диабета (снижение содержания сахара в условиях экспериментальной хронической инсулиновой недостаточности).

Кровь получали через 1 час пункцией хвостовой вены и определяли уровень глюкозы в сыворотке ортотолуидиновым методом

Эксперименты по изучению влияния исследуемых веществ на уровень глюкозы в крови выполнялись на белых мышах массой 17-18 г. С вечера накануне эксперимента животные лишались корма. Утром натощак мышам подкожно вводили 10% раствор глюкозы из расчета 1 r/кг (0.1 мл/10 г массы тела) [4]. Сразу после введения глюкозы экспериментальным животным подкожно вводили препараты сравнения (инсулин в дозе 0.3 ЕД/кг). Исследуемые вещества вводили внутримышечно: тиоктовую к-ту 5.5, 11 , 100 и 200 мг/кг (две первые дозы соответствуют содержанию тиоктовой кислоты в составе композита с координационным соединением); тиоктовая кислота в сочетании с координационным соединением в избытке лиганда - тиоктовая к-та + КС - 10 и 20 мг/кг. Уровни глюкозы в крови определяли на протяжении 4 часов с интервалом

1 час.

В другой серии экспериментов использовалась модель аллоксанового диабета. Аллоксановый диабет вызывали однократным подкожным введением аллоксангидрата (фирма «Xeмaпoл», Чехия) в дозе 100 мг/кг голодавшим в течение суток крысам массой 180-200 г. Исследовались следующие группы животных: интактные крысы, нелеченные крысы с диабетом, животные с диабетом, получавшие ежедневно в течение 1 месяца тиоктовую кислоту в дозе 100 мг/кг и тиоктовую кислоту в сочетании с координационным соединением в дозе 10 мг/кг внутрижелудочно 1 раз в день. Введение препаратов начинали через 7 дней, когда уровень глюкозы крови повышался, по сравнению с контролем, приблизительно в

2 раза. Каждая группа содержала по 20 животных обоего пола. В ходе эксперимента фиксировали общее состояние животных, потребление корма и воды, массу тела, уровни глюкозы, общих липидов, триглицеридов, липопротеидов и холестерина сыворотки крови.

Результаты исследования.

Влияние исследуемых соединений на уровень глюкозы в крови животных после нагрузки глюкозой приведены в таблице 8.

Таблица 8 Уровень сахара в крови мышей (ммоль/л, M ± m) в тесте нагрузки глюкозой

Результаты исследования показывают сопоставимость эффектов тиоктовой кислоты на уровень сахара в крови в дозе 100 и 200 мг/кг и тиоктовой кислоты в составе композита в дозе 5.5 и 11 мг/кг. Без координационного соединения тиоктовая кислота в дозах 5.5 и 11 мг/кг гипогликемизирующим действием не обладала.

Экстраполируя на крыс, можно предположить, что эффективной однократной дозой будет 20 мг/кг композита тиоктовой кислоты и координационного соединения и 200 мг/кг тиоктовой кислоты, вводимой обособленно. Эти дозы и была выбрана для лечения экспериментального диабета у крыс, результаты которого приведены в таблице 9.

Таблица 9

Интегральные показатели, показатели углеводного и липидного обмена у белых крыс с экспериментальным диабетом (M ± m)

Полученные результаты свидетельствуют о том, что композит тиоктовой кислоты и координационного соединения оказывает хорошее лечебное действие при диабете средней тяжести, причем, эффект препарата сопоставим с эффектом тиоктовой кислоты, вводимой самостоятельно в дозе двадцатикратно превышающей ее количество в составе композита. У всех животных, получавших композит тиоктовой кислоты, отмечалось снижение уровня глюкозы в крови и нормализация показателей липидного обмена. Эти животные нормально набирали вес, а потребление ими воды не отличалось от контрольной группы.

Следовательно, композит тиоктовой кислоты и координационного соединения обладает достаточной антидиабетической активностью, нормализует показатели углеводного и липидного обмена, что проявляется в достоверном снижении уровня холестерина в крови экспериментальных животных.

Использование тиоктовой кислоты в сочетании с координационным соединением палладия с ацетилцистеином в избытке ацетилцистеина (пример N°7) в котором координационного соединения палладия с ацетилцистеином вводилось в ультрамалых количествах, способствовал проявлению гипогликемизирующего эффекта тиоктовой кислоты, используемой в дозе, не обладающей каким либо значимым гипогликемизирующим действием. Таким образом, сочетанное использование биядерного координационного соединения d-металла с алифатическим тиолом и гипогликемизирующего средства позволяет получать терапевтический эффект последнего в физиологически адекватных дозах.

Пример Ns 14. Влияние координационного соединения палладия с ацетилцистеином на кардиопротекторную активность аденозина

В качестве исследуемого препарата использовалась композиция координационного соединения палладия в избытке ацетилцистеина и аденозин (ацетилцистеин - аденозин (эквимолярное соотношение) (см. пример N°8).

Аденозин является одним из соединений, способных оказывать выраженное кардиопротективное действие при ишемии миокарда, что продемонстрировано на различных экспериментальных моделях. Аденозин - это естественный метаболит организма - эндогенный пуриновый нуклеозид. Аденозин модулирует многие физиологические процессы, особенно в сердце и коронарных сосудах, но используется в качестве лекарственного препарата для лечения некоторых видов аритмий [1]. Широкое использование аденозина в лечении заболеваний сердца с ишемией миокарда затрудняется в числе прочего, вследствие неустойчивости эффекта, быстрого формирования толерантности к действию вещества [15]. При ишемии миокарда введение аденозина вызывает наступление тахифилаксии т.е. быстрое прогрессирующее снижение лечебного эффекта, в отношении кардиопротективного эффекта аденозина [16]. Однако, при наличии кардиопротекторного эффекта аденозина резистентность к ишемии сохранялась несколько недель. Попытки добиться контролируемого стабильного продолжительного эффекта аденозина до настоящего времени не увенчались успехом, что ограничивает его широкое использование в качестве средства профилактики и лечения поражений миокарда при хронической ишемии и оставляет в ряду перспективных средств для соответствующих фармакологических решений [17, 18].

Приготовление растворов исследуемых соединений для проведения исследования

Белые кристаллические вещества хранили при 4°C; непосредственно перед началом эксперимента вещество растворяли в физиологическом растворе. Раствор стерилизовали пропусканием через фильтры 0,22 мкм Мillех-GS (Мilliроrе) в стерильном ламинарном боксе. Для изучения кардиопротективного действия исследуемые вещества вводили крысам в физиологическом растворе аденозин в дозе не вызывающей кардиопртективного эффекта, установленной в ходе экспериментов; аденозин в сочетании с координационным соединением в избытке лиганда (эквимолярное соотношение: аденозин - избыток лиганда), количество аденозина соответствовало значению, установленному эмпирически, в ходе экспериментов.

Моделирование регионарной ишемии-реперфузии миокарда на анестезрованных животных iп vivо

Эксперименты проводили на самцах крыс линии Вистар массой 200-300 г (питомник «Paппoлoвo» РАМН, Санкт-Петербург) и самцах мышей линии C57B массой 25-30 г (В&К, Соллентуна, Швеция). Животные содержались в условиях 12/12-часового светового режима и получали стандартный корм и питьевую воду аd libitum. Все эксперименты проведены в соответствии с «Pyкoвoдcтвoм по уходу и использованию лабораторных живoтныx» (публикация Национального Института Здоровья США Ne 85-23) и «Pyкoвoдcтвoм по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических вeщecтв»

Вводную анестезию у крыс осуществляли внутрибрюшинным введением этаминала натрия (нембутала) в дозе 7 мг/100 г однократно. Эксперименты проводили при искусственной вентиляции легких (ИВЛ) через трахеостому (частота дыхания - 60/мин, дыхательный объем - 3 мл/100 г массы тела). ИВЛ осуществляли комнатным воздухом с помощью аппарата «Bитa-1 » (ПО «Kpacнorвapдeeц», Санкт-Петербург). Применяли дыхательный клапан для мелких лабораторных животных, позволяющий сократить объем мертвого пространства аппарата и ограничить накопление углекислого газа в контуре аппарата. Артериальное давление (АД) в течение эксперимента измеряли миниатюрным датчиком давления (Вахtеr, США) через гепаринизированный катетер, введенный в левую общую сонную артерию. Для доступа к трахее и сонной артерии осуществляли срединный кожный разрез на шее с последующим тупым разделением тканей пинцетами. В ходе эксперимента регистрировали электрокардиограмму (ЭКГ) (Kapдиoтexникa-ЭKГ-8, ЗАО «Инкapт», Санкт- Петербург) в стандартных отведениях, используя подкожные игольчатые электроды диаметром 2 мм и длиной 25 мм. В начале эксперимента катетеризировали левую бедренную вену для внутривенной инфузии нембутала с целью поддержания анестезии, а также введения тестируемых препаратов и, в конце опыта, синего Эванса.

Для моделирования ишемии-реперфузии миокарда использовали ранее описанную методику [19]. Доступ к сердцу производили путем торакотомии в четвертом межреберье слева. Вначале осуществляли L - образный кожный разрез, затем послойно электрокоагулятором отделяли большую и малую грудные мышцы, после чего разделяли межреберные мышцы и вскрывали плевру. Затем тупым способом вскрывали перикард и, ориентируясь на медиальный край ушка левого предсердия слева и конус легочной артерии справа, определяли локализацию общего ствола JlKA, под который с помощью атравматической иглы (6-0, Саrdiороiпt, CV-301) подводили полипропиленовую лигатуру. Выведения сердца из раны избегали, так как данная манипуляция, помимо причинения механической травмы сердцу, неизбежно приводит к серьезным расстройствам гемодинамики.

Для создания обратимой ишемии миокарда формировали окклюдер: концы лигатуры, охватывающей коронарную артерию, проводили в просвет полиэтиленовой трубки диаметром 1 мм и длиной 5-6 см (PE 40), после чего путем смещения трубки к сердцу добивались окклюзии левой коронарной артерии (JlKA), а в противоположном направлении - реперфузии. С целью поддержания окклюзии в течение 30 минут на трубку накладывали зажим. В течение эксперимента животные находились на термостатируемом операционном столике; при этом температура тела животного поддерживалась в пределах 37,5±0,5°C.

Наступление ишемии миокарда подтверждали по наличию транзиторного снижения артериального давления (АД), а также возникновению регионарного цианоза, ишемических изменений на ЭКГ (элевации сегмента ST) и, иногда, систолического выбухания стенки левого желудочка (ЛЖ).

Для создания необратимого ишемически-реперфузионного повреждения миокарда, являвшегося тестовым при оценке кардиопротективных воздействий, использовали 30-минутную окклюзию JlKA с последующей 90-минутной реперфузией.

Методика определения размера экспериментального инфаркта миокарда.

Для определения размера ИМ в экспериментах с регионарной ишемией iп vivо использовали общепринятый дифференциальный индикаторный метод, позволяющий на макроскопическом уровне отграничить необратимо поврежденную (некротизированную) ткань миокарда от ткани, сохранившей жизнеспособность, в пределах зоны сердца, подвергшейся ишемии. Сущность указанного метода заключается в следующем. На первом этапе окраски после завершения физиологической части эксперимента вокруг коронарной артерии вновь затягивали лигатуру и внутривенно болюсно вводили 0,5 мл 5% раствора синего Эванса (MP Вiоmеdiсаls, США). Поступая в снабжаемые кровью участки сердца, васкуляризируемые преимущественно правой коронарной артерией, краситель окрашивал их в темно-синий цвет; бассейн окклюзированной JlKA оставался неокрашенным. После визуализации границы между кровоснабжаемыми и ишемизированными отделами сердце быстро вырезали, тщательно промывали физиологическим раствором и, после удаления крупных сосудов и предсердий, разрезали в поперечном направлении на пять фрагментов (срезов) одинаковой толщины (2 мм). Базальные поверхности срезов сердца фотографировали цифровой камерой Оlimрus 2020, совмещенной со стереомикроскопом (MБC-10, «ЛOMO», Санкт-Петербург) посредством микрофотографического устройства (МФУ). Во избежание образования световых бликов, срезы для фотографирования помещали в низкий бюкс, заполненный физиологическим раствором так, чтобы жидкость покрывала базальную поверхность среза.

Компьютерную обработку изображений осуществляли с помощью специально разработанного программного обеспечения («Aвтoмaтизaция микроскопического анализа в области медицины (LittleMed)», свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ N° 2003611599). Относительный размер анатомической зоны риска для данного сердца получали путем вычисления среднего арифметического величин, сосчитанных для каждого из 5 срезов. Для данного среза размер зоны риска выражали в процентах путем деления площади Эванс-негативных участков на общую площадь среза и умножения на 100. Эксперименты, в которых относительный объем зоны риска составлял менее 15% от общего объема сердца, из серии исключали.

На втором этапе окраски срезы миокарда помещали в 1%-й раствор 1 ,2,3 - трифенилтетразолия хлорида (TTC, MP Вiоmеdiсаls, США), окрашивающий жизнеспособную ткань с сохраненной активностью НАД-зависимых ферментов в ярко-красный (кирпичный) цвет. Инкубацию срезов осуществляли в течение 15 минут при температуре 37°C и рН 7,4. После инкубации срезов с TTC в пределах анатомической зоны риска определялись участки кирпичного цвета и участки нативного цвета миокарда. Базальные поверхности срезов фотографировали повторно и, обрабатывая полученные изображения вышеуказанным способом, вычисляли относительный размер инфаркта, представляющий собой отношение размера зоны риска к размеру зоны инфаркта (в процентах). Для лучшего отграничения зоны инфаркта от сохранившей жизнеспособность ткани после окраски срезов TTC в ряде случаев перед фотографированием применяли дополнительную инкубацию срезов в 10%-oм растворе нейтрального формалина. Компьютерная обработка данных и методы статистического анализа.

Статистическая достоверность различий размеров анатомической зоны риска и зоны инфаркта оценивалась с помощью программного пакета SPSS (ANOVA, тест Шеффе). Результаты выражались в виде «cpeднee ± стандартное отклонение)). Значения P менее чем 0,05 рассматривались как достоверные.

Результаты определения эффективности зашиты миокарда от некроза исследуемым препаратом

Фармакологическую защиту миокарда от некроза осуществляли композицией ацетилцистеин (аС) - аденозин (эквимолярное соотношение ), содержащее координационное соединение палладия с алифатическим тиолом - ацетилцистеином, соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 :1000.

Для определения минимальных эффективных концентраций исследуемой композиции были поставлены эксперименты, позволившие определить концентрации аденозина в которых он не оказывал кардиопртекторного действия, или проявлял его в незначительной степени, соответствующей минимальному уроню защиты миокарда от некроза соответствующим режимом кратковременной ишемии с последующей реперфузией. В другой серии экспериментов определялось кардиопротекторное влияние ацетилцистеина, содержащего координационное соединение палладия. Вводимые животным концентрации ацетилцистеина были эквимолярны концентрациям аденозина, в которых он не оказывал кардиопротекторного действия. Композиция ацетилцистеин (аС) - аденозин (эквимолярное соотношение), содержащее координационное соединение палладия, в последующих экспериментах использовалась в концентрации, при которой образующие ее вещества не оказывали кардиопротекторного действия и концентрации при которой оно проявлялось.

Для определения дозы аденозина, не оказывающей кардиопротекторного действия т.е. не защищающей миокард от некроза при проведении ишемии и последующей реперфузии были взяты следующие группы: 1. Контроль (n=12). В данной группе выполнялась окклюзия Л KA в течение 30 минут с последующей 90-минутной реперфузией без дополнительных вмешательств. За 30 минут до коронароокклюзии осуществлялось внутривенное введение физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида в дистиллированной воде) в объеме 2 мл со скоростью 0,5 мл/мин;

2. Группа N°1 (n=10). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе О.iмкмоль /кг (в группах 1-9 объем инфузии составлял в среднем 2 мл, скорость инфузии - 0,5 мл/мин, введение осуществлялось за 30 минут до коронароокклюзии);

3. Группа 2 (n=14). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 0.25мкмoль /кг ;

4. Группа 3 (n=9). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 0.5мкмoль/кг;

5. Группа 4 (n=8). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 1.0 мкмоль/кг;

6. Группа 5 (n=8). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 2.5 мкмоль/кг;

7. Группа 6 (n=10). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 5.0 мкмоль/кг;

8. Группа 7 (n=11). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 10.0 мкмоль/кг;

9. Группа 8 (n=11). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 25.0 мкмоль/кг;

10. Группа 9 (n=10). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия аденозина в дозе 50.0 мкмоль/кг.

Размер зоны инфаркта в группе Ns 1 (контроль) составлял 63,8±3,32% от размера анатомической зоны риска). В группах 1-5 каких либо отличий в размере зоны инфаркта в сравнении с контролем выявлено не было - 64,7±3,47%, 63,1±4,31%, 62,7±4,11%, 65,1±4,84%, 60,9±5,10% соответственно порядковому номеру группы, тогда как в группах 6-9 размер зоны инфаркта снижался в сравнении с контролем в примерно в 1.5-2,5 раза и составлял 35,9±3,59%, 32,7±3,21%, 28,2±3,43%, 26,5±2,87% соответственно. Таким образом, в ходе проведенных экспериментов установлены дозы аденозина, действие которых не приводит к защите миокарда от ишемии и действие которых сопровождается уменьшением зоны некроза в 1.5-2,5 раза. Прирост эффекта с увеличением концентрации аденозина указывает на наличие кардиопротекторного действия препарата. Суммарное кардиопртектерное действие складывается из рецепторопосредованного влияния аденозина на отдельные клетки. Наличие достаточного числа рецепторов у каждой клетки, способных инициировать клеточный сигнал определенной силы и длительности будет определять способность аденозина иницировать комплекс цитопротекторных реакций. Полученные результаты относительно слабого прироста кардиопртекторного эффекта аденозина при кратном увеличении его вводимой концентрации могут означать неспособность аденозиновых рецепторов значительной части клеток реагировать со своим лигандом. Учитывая способность координационных соединений переводить поверхностно клеточные рецепторы в конформацию, способную реагировать с лигандом, следует ожидать возможность потенцирования кардиопротекторного эффекта аденозина при его сочетанном введении с координационными соединениями. При проведении экспериментов учитывали наличие эндогенного аденозина, цитопротекторные эффекты которго также имеют место при неблагоприятных воздействиях. При этом возможности его кардиопротекторного эффекта также ограничены наличием на клетка количества взаимодействующих рецепторов. В этой связи определялись концентрации координационного соединения при которых отсутствовал кардиопротекторный эффект.

В серии экспериментов определялась способность координационного соединения палладия, вводимого в избытке ацетилцистеина, соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 :1000 оказывать кардиопротекторное действие. Концентрации ацетилцистеина в эксперименте соответствовали таковым аденозина при которых у последнего отсутствовало кардиопротекторное влияние.

В исследовании были взяты следующие группы:

1. Контроль (n=14). В данной группе выполнялась окклюзия JlKA в течение 30 минут с последующей 90-минутной реперфузией без дополнительных вмешательств. За 30 минут до коронароокклюзии осуществлялось внутривенное введение физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида в дистиллированной воде) в объеме 2 мл со скоростью 0,5 мл/мин; 2. Группа N°1 (n=9). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия ацетилцистеина, содержащего координационное соединение палладия с ацетилцистеином в соотношении: координационное соединение : ацетил цистеин 1 :1000 ( далее по тексту средство) . Средство вводили в количестве О.i мкмоль /кг (в группах 1-5 объем инфузии составлял в среднем 2 мл, скорость инфузии - 0,5 мл/мин, введение осуществлялось за 30 минут до коронароокклюзии);

3. Группа 2 (n=10). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия средства, которое вводили в количестве 0.25мкмoль /кг ;

4. Группа 3 (n=9). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия средства, которое вводили в количестве 0.5мкмoль/кг;

5. Группа 4 (n=11). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия средства, которое вводили в количестве 1.0 мкмоль/кг;

6. Группа 5 (n=7). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия средства, котороет вводили в количестве 2.5 мкмоль/кг;

7. Группа 6 (n=10). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия средства, которое вводили в количестве 5.0 мкмоль/кг.

Размер зоны инфаркта в контроле составлял 71 ,8±6,17% от размера анатомической зоны риска. В группах N ^Q 1-4 каких либо отличий в размере зоны инфаркта в сравнении с контролем выявлено не было - 74,2±6,94%, 74,2±6,61%,

72,6±7,01%, 70,1 ±6, 34%. В группах N°5 и Nsб кардиопртекторное действие вводимого средства проявилось уменьшением зоны инфаркта в сравнении с контролем примерно в 2,0 раза - 41 ,7±3,12% и 34,4±4,65% соответственно порядковому номеру группы.

Таким образом в ходе проведенных экспериментов определены количества средства оказывающие кардиопротекторное действие, что выразилось в двукратном уменьшении зоны инфаркта и, напротив, не защищающие миокард от ишемии. В следующей серии экспериментов оценивалась способность препарата, включающего эквимолярное соотношение - аденозин : ацетилцистеин и координационное соединение палладия с ацетилцистеином (соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1:1000) оказывать кардиопртекторное действие. В соответствии с результатами предыдущих экспериментов исследовались препараты содержащие аденозин и ацетилцистеин + координационное соединение палладия с ацетилцистеином (соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 :1000) и вводимые в количествах, когда не прявлялось кардиопртекторного эффекта - препарат Ns1в котором вводимые количества аденозина и ацетил цистеина + координационное соединение палладия с ацетилцистеином (соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 :1000) по 0.5мкмoль/кг каждого и препарат N°2 в котором вводимые количества аденозина и ацетилцистеина + координационное соединение палладия с ацетилцистеином (соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 : 1000) по 1.0 мкмоль/кг каждого. Препарат NеЗ в котором вводимые количества аденозина и ацетилцистеина + координационное соединение палладия с ацетилцистеином (соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 :1000) по 2.5 мкмоль/кг каждого. Препарат N°4 в котором вводимые количества аденозина и ацетилцистеина + координационное соединение палладия с ацетилцистеином (соотношение координационное соединение - ацетилцистеин составляло 1 :1000) по 5.0 мкмоль/кг каждого.

1. Контроль (n=14). В данной группе выполнялась окклюзия JlKA в течение 30 минут с последующей 90-минутной реперфузией без дополнительных вмешательств. За 30 минут до коронароокклюзии осуществлялось внутривенное введение физиологического раствора (0,9% раствор натрия хлорида в дистиллированной воде) в объеме 2 мл со скоростью 0,5 мл/мин;

2. Группа 1 (n=14). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия препарата N°1 (В группах 1-4 объем инфузии составлял в среднем 2 мл, скорость инфузии - 0,5 мл/мин, введение осуществлялось за 30 минут до коронароокклюзии);

3. Группа 2 (n=11). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия препарата N°2; 4. Группа 3 (n=15). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия препарата N°3;

5. Группа 4 (n=12). Моделированию инфаркта миокарда предшествовала внутривенная инфузия препарата N°4.

Размер зоны инфаркта в контроле составлял 79, З± 6,22% от размера анатомической зоны риска. В группе N°1 каких либо достоверных отличий в размере зоны инфаркта в сравнении с контролем выявлено не было - 75,6±6,85%. В группе N°2, N°3 и Ns4 размер зоны инфаркта в сравнении с контролем составил 46,3±4,71%; 29,76±2,97%, 11 ,8±3,12% соответственно (P<0,05). Сочетанное введение координационного соединения палладия с ацетилцистеином в составе препарата N°2 позволило проявиться кардиопротекторному действию аденозина, что привело к уменьшению зоны инфаркта при ишемии практически в два раза в сравнении с контролем. Увеличение водимых количеств аденозина и координационного соединения палладия с ацетилцистеином способствовало большей выраженности кардиопротекторного эффекта. Препарат NаЗ обеспечил уменьшение зоны инфаркта в 2.5 раза в сравнении с контролем. Наиболее выраженные кардиопртекторный эффект отмечен у препарата N°4, его действие обеспечило уменьшение зоны инфаркта в 6,5 раз в сравнении с контролем. Препарат Ns4 включал в себя количества аденозина и координационного соединения палладия с ацетилцистеином у которых при обособленном примененении отмечался менее значимый кардиопртективный эффект. Механизм развития устойчивости каждой отдельной клетки миокакрда к ишемии одинаков и запускается после формирования регуляторного сигнала определенной силы и длительности [15, 16]. в этой связи снижение зоны инфаркта свидетельствует об увеличении количества клеток, устойчивых к продолжительной ишемии. Обособленное использование аденозина в значительно больших количества давало менее выраженный кардиопртективный эффект к продолжительной ишемии. Подобный результат, в числе прочего, свидетельствует о том, что количества аденозина были достаточны для обеспечения более выраженного кардиопротективного действия, однако способность аденозиновых рецепторов взаимодействовать с ним по каким либо причинам была ограничена, что в итоге обеспечило полученный результат. Совместное введение аденозина и координационного соединения палладия с ацетилцистеином способствовало реализации кардиопртекторного действия меньших количеств препарата, увеличив его терапевтическую эффективность. В ходе экспериментов при введении аденозина не отмечено нарушений сердечного ритма или остановки сердца, наиболее неприятных осложнений в ходе работы с препаратом. Необходимо отметитить, что вводимые количества аденозина были близки к тем значениям, которые выявляются при защите миокарда от продолжительной ишемии кратковременными воздействиями ишемии и реперфузии и считаются физиологическими [15, 16].

Таким образом совместное применение ультрамалых концентраций координационного соединения алифатического тиола в избытке лиганда и физиологически приемлемых концентраций фармакологически активного вещества - аденозина, проявилось терапевтическим эффектом аденозина в физиологически адекватных дозах.

Литература

1. "Ваsiс & Сliпiсаl Рhаrmасоlоgу". Еdditеd bу Вегtrаm G. Каtzuпg, MD ₁ PhD, 1995. 2. Воgаtуrеvа N. S., Fiпkеlstеiп A.V., Gаlsitskауа О.V. Тrепd оf аmiпо асid соmроsitiопsоf diffеrепt taxa//J. Вiоiпf. Соmрut. Вiоl. 2006. V4. P.597-608

3. Jеffгу CJ Моопlightiпg proteins/ГПBS.1999. P.8-11.

4. Ставровская A.A., Стромская Т.П. Транспортные белки семейства ABC и множественная лекарственная устойчивость опухолевых клeтoк//Биoxимия. 2008.T.73. вып.5. c.735-750.

5. Вridgеs AJ. Тhе rаtiопаlе апd strаtеgу usеd tо dеvеlор а sеriеs оf highlу роtепt, irrеvеrsiblе, iпhibitоrs оf thе ерidеrmаl grоwth fасtоr rесерtоr fаmilу оf tуrоsiпе kiпаsеs// Сurr Меd Сhеm, 1999; 6: 825-843.

6. Моdjtаhеdi H., Dean Ch. Тhе rесерtоr fоr ерidеrmаl grоwth fасtоr апd ligапds: ехрrеssiоп, рrоgпоstiс vаluе апd tаrgеt fоr thеrару iп сапсеr // Iпtеrп. J. Опсоl.—

1995.— VoI. 4. - P. 277—296.

7. Тоwпsепd D. M., Не L. Нutсhепs S.аt аl. NOV-002, а Glutаthiопе Disulfidе Мimеtiс, аs а Моdulаtоr оf Сеllulаr Rеdох Ваlапсе// Сапсеr Rеs. - 2008.- VoI. 68.- P.2870-2877.

8. Stеiпbеrg Т.Н. Сеllulаr trапsроrt оf drugs//Cliп.lпfect.Dis.1994.V.19.N°5. P.916- 921.

9. Sсоttо К.W. Тrапsсriрtiопаl rедulаtiоп оf ABC drад trапsроrtеrs // Опсодепе.

2003. V. 22. N2 47. P. 7496-7511.

10. Аlbеtrs В., Jоhпsоп А., Lеwis J., Rаff M., Rоbеrts К., Wаltеr P Моlесulаr biоlоду оf thе сеll ", 4th еd. N.Y., Gаrlапd Sсiепсе, Тауlоr апd Frапсis дrоuр. 2002.1616 р 11. KeIIy С. Р., Сrаmеr С. J., Тruhlаr D. G. Аddiпg Ехрliсit Sоlvепt Моlесulеs tо Сопtiпuum Sоlvепt Саlсulаtiопs fоr thе Саlсulаtiоп оf Аquеоus Асid Dissосiаtiоп Сопstапts// J. Рhуs. Сhеm. А. 2006, 110(7), 2493-2499.

12. Sаrасiпо G.A., lmprota R., Barone V. Аbsоlutе рКа dеtеrплiпаtiоп fоr саrbохуliс асids usiпg dепsitу fuпсtiопаl thеоrу апd thе роlаrizаblе сопtiпuum mоdеl // Сhеm.

Рhуs. Lеtt. 2003, 373(3-4), 411-415.

13. Методические рекомендации по экспериментальному изучению новых пероральных гипогликемических фармацевтических средств. В сб. «Pyкoвoдящиe методические материалы по экспериментальному и клиническому изучению лекарственных средств. Часть 6», M., 1986, с. 202

14. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. Хабриева P. У. 2-изд. -M.: Изд. «Meдицинa». 2005. 832 С.

15. Yellon D. M., Dоwпеу J. M. Рrесопditiопiпg thе mуосаrdium: frоm сеllulаr рhуsiоlоgу tо сliпiсаl саrdiоlоgу // Рhуsiоl. Rеv. - 2003. - VoI. 83. - N° 4. - P.

1113-1151.

16. Тsuсhidа A., Thompson R., Olsson R. А., Dоwпеу J. M. Thе апti— iпfаrсt еffесt оf ап аdепоsiпе A ₁ -SeIeCtJVe аgопist is dimiпishеd аftеr рrоlопgеd iпfusiоп аs is thе саrdiорrоtесtivе еffесt оf isсhеmiс рrесопditiопiпg iп rаbbit hеаrt // J. MoI. CeII. Саrdiоl. - 1994. - VoI. 26. - Ns 3. - P. 303-311.

17. Dапа А., Вахtеr G., Wаlkеr J. M., Yellon D. M. Рrоlопgiпg thе dеlауеd рhаsе оf mуосаrdiаl рrоtесtiоп: rереtitivе аdепоsiпе A ₁ rесерtоr асtivаtiоп mаiпtаiпs rаbbit mуосаrdium iп а рrесопditiопеd stаtе // J. Am. CoII. Саrdiоl. - 1998. - VoI. 31. - Ns 5. - P. 1142-1149.

18. Dоwпеу J. M., Соhеп M. V. Rеduсiпg iпfаrсt sizе iп thе sеttiпg оf асutе mуосаrdiаl iпfаrсtiоп // Рrоg. Саrdiоvаsс. Dis. - 2006. - VoI. 48. - Ns 5. - P. 363- 371.

19. Sеlуе H., Ваjusz E., Grаssо S., Мепdеll P. Simрlе tесhпiquеs fоr thе surgiсаl оссlusiоп оf соrопаrу vеssеls iп thе rаt // Апgiоlоgу. - 1960. - VoI. 11. - Ns 5. - P. 398-407.

20. Lеiris J., Наrdiпg D. Р., Реstrе S. Thе isоlаtеd rаt hеаrt: а mоdеl fоr studуiпg mуосаrdiаl hурохiа оr isсhеmiа // Ваsiс Rеs. Саrdiоl. - 1984. - VoI. 79. - Ns 3. - P. 315-323.

21. Нimоrу N., Маtsuurа А. А simрlе tесhпiquе fоr оссlusiоп апd rереrfusiоп оf соrопаrу аrtеrу iп сопsсiоus rаts // Am. J. Рhуsiоl. - 1989. - VoI. 256. - P. H1719-

H 1725.

22. Suthеrlапd F. J., Неаrsе D. J. Thе isоlаtеd Ыооd апd реrfusiоп fluid реrfusеd hеаrt // Рhаrmасоl. Rеs. - 2000. - VoI. 41. - Ns 6. - P. 613-627.