Diese optisch aktiven a-Hydroxycarbonsäuren lassen sich weiters beispielsweise nach Effenberger et al., Angew. Chem. 95 (1983) Nr. 1, Seite 50, vorteilhaft in ander- weitig nur sehr schwer herzustellende N-substituierte optisch aktive a-Aminosäuren überführen.

Chirale a-Hydroxycarbonsäuren sind heutzutage chemisch, fermentativ oder enzy- matisch zugänglich.

Aus der Literatur ist deshalb eine Reihe verschiedener Synthesemöglichkeiten von chiralen a-Hydroxycarbonsäuren bekannt.

So können racemische Cyanhydrine unter Zusatz geeigneter Mikroorganismen zu den gewünschten chiralen a-Hydroxycarbonsäuren hydrolysiert werden.

Die Herstellung von chiralen a-Hydroxycarbonsäuren, speziell die Herstellung von optisch aktiver Milchsäure oder Mandelsäure aus racemischen Cyanhydrinen mit verschiedenen Mikroorganismen der Gattungen Alicaligenes, Pseudomonas, Acine- tobacter, Rhodococcus, Candida u. s. w. ist beispielsweise in EP 0 449 684, EP 0 527 553, EP 0 610 048, u. s. w. beschrieben.

Aus diesem Stand der Technik ist es auch bekannt, dass wenn ein racemisches Cy- anhydrin enzymatisch unter Verwendung einer Nitrilase zu der korrespondierenden a-Hydroxycarbonsäure hydrolysiert wird, das Problem auftritt, dass das Enzym in- nerhalb kurzer Zeit inaktiviert wird und so die gewünschte a-Hydroxycarbonsäure meist nur in geringen Ausbeuten und Konzentrationen erhalten wird. Dies gilt auch bei der Verwendung von Nitrilhydratasen, die das Cyanhydrin zu dem korrespondie- renden a-Hydroxyamid umwandeln. Die Hydroxyamide können sodann wiederum zu den korrespondierenden a-Hydroxycarbonsäuren umgesetzt werden.

Es ist auch bekannt, beispielsweise aus Angew. Chem. 1994,106, Seite1615f., dass sich optisch aktive Cyanhydrine ohne Racemisierung mit konzentrierter Salzsäure zu den korrespondierenden chiralen a-Hydroxycarbonsäuren hydrolysieren lassen. Die optische Reinheit der so hergestellten chiralen a-Hydroxycarbonsäuren entspricht dabei der optischen Reinheit des eingesetzten chiralen Cyanhydrins, auch wenn die- ses in-situ durch enzymkatalysierte Addition einer Cyanidgruppe an einen entspre- chenden Aldehyd oder ein Keton erhalten und ohne Isolierung bzw. Aufreinigung weiterverarbeitet wird.

Nachteilig bei dieser Reaktion ist, dass empfindliche Substrate zersetzt werden und das Auftreten von Korrosion.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zu finden, bei welchem so polare Nitrile wie chirale Cyanhydrine mit einer milden und effizienten Methode in die korrespondierenden chiralen Hydroxycarbonsäuren überführt werden können, wobei die Hydroxycarbonsäuren in etwa die gleiche enantiomere Reinheit wie die Cyan- hydrine aufweisen.

Unerwarteterweise konnte diese Aufgabe durch die Verwendung eines speziellen Bakteriums aus der Gattung Rhodococcus gelöst werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von chiralen a-Hydroxycarbonsäuren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass (R)- <BR> <BR> oder (S) -Cyanhydrine in Gegenwart von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540<BR> durch enzymatische Hydrolyse in die korrespondierenden (R) -oder (S)-a- Hydroxycarbonsäuren überführt werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden (R)-und (S)-Cyanhydrine in (R)-und (S)-a-Hydroxycarbonsäuren mit einer optischen Reinheit von bis zu > 99% ee über- führt.

Als Ausgangsverbindungen dienen (R)-und (S)-Cyanhydrine, die durch enzymati- sche oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe an die entsprechenden Aldehyde oder Ketone hergestellt werden.

Die enzymatische oder chemisch katalysierte Addition einer Cyanidgruppe an die entsprechenden Aldehyde oder Ketone kann dabei analog dem Stand der Technik, beispielsweise analog EP 0 951 561, EP 0 927 766, EP 0 632 130, EP 0547 655, EP 0 326 063 u. s. w., erfolgen.

Als Ausgangsverbindungen eignen sich die im Stand der Technik zitierten Aldehyde und Ketone.

Beispiele für geeignete Aldehyde sind dabei aliphatische, aromatische oder hetero- aromatische Aldehyde. Unter aliphatischen Aldehyden sind dabei gesättigte oder ungesättigte aliphatische, geradkettige, verzweigte oder cyclische Aldehyde zu ver- stehen. Bevorzugte aliphatische Aldehyde sind geradkettige Aldehyde mit insbeson- dere 2 bis 18 C-Atomen, besonders bevorzugt von 2 bis 12, die gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sind. Der Aldehyd kann dabei sowohl C-C- Doppelbindungen als auch C-C-Dreifachbindungen aufweisen. Der Aldehyd kann unsubstituiert oder ein-oder mehrfach durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Gruppen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl-oder Heteroa- rylgruppen, wie Phenyl-oder Indolylgruppen, durch C1-C6-Alkyl, gegebenenfalls sub- stituierte Cycloalkylgruppen, die ein oder mehrere Heteroatome aus der Gruppe O, S, P, oder N aufweisen können, Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Carbonsäure-, Carbonsäureester-, Nitro-oder Azidogruppen substituiert sein.

Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Aldehyde sind Benzaldezyd bzw. verschieden substituierte Benzaldehyde wie etwa 2-Chlorbenzaldehyd, 3,4- Difluorbenzaldehyd, 4-Methylbenzaldehyd, 3-Phenoxybenzaldehyd, 4-Fluor-3- phenoxybenzaldehyd, weiters Furfural, Anthracen-9-carbaldehyd, Furan-3- carbaldehyd, Indol-3-carbaldehyd, Naphthalin-1-carbaldehyd, Phthaldialdehyd, Pyra- zol-3-carbaldehyd, Pyrrol-2-carbaldehyd, Thiophen-2-carbaldehyd, Isophthalaldehyd oder Pyridinaldehyde u. s. w..

Beispiele für Ketone sind aliphatische, aromatische oder heteroaromatische Ketone, bei denen das Carbonylkohlenstoffatom ungleich substituiert ist. Unter aliphatischen Ketonen sind geradkettige, verzweigte oder cyclische Ketone zu verstehen. Die Ke- tone können gesättigt oder ein-oder mehrfach ungesättigt sein. Sie können unsubsti- tuiert oder ein-oder mehrfach durch unter den Reaktionsbedingungen inerte Grup- pen, beispielsweise durch gegebenenfalls substituierte Aryl-oder Heteroarylgruppen wie Phenyl-oder Indolylgruppen, durch Halogen-, Ether-, Alkohol-, Acyl-, Carbonsäu- re-, Carbonsäureester-, Nitro-oder Azidogruppen substituiert sein.

Beispiele für aromatische oder heteroaromatische Ketone sind Acetophenon, Indoly- laceton u. s. w..

Bevorzugt werden (R) -oder (S) -Cyanhydrine der Formel in der R1 und R2 unabhängig voneinander H, einen gegebenenfalls ein-oder mehr- fach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituenten substituierten Ci-Ce- Alkyl-oder Alkenylrest oder einen gegebenenfalls ein-oder mehrfach mit unter den Reaktionsbedingungen inerten Substituenten substituierten Phenylrest bedeuten, mit der Maßgabe, dass R1 und R2 nicht beide H sind.

Bevorzugte unter den Reaktionsbedingungen inerte Substituenten sind beispielswei- se Halogene, wie Fluor, Brom und Chlor, C1-C6-Alkyl oder-Alkoxy, Ether, Ester, Ace- tale oder gegebenenfalls substituiertes Phenyl und Phenyloxy.

Besonders bevorzugt eignen sich für das erfindungsgemäße Verfahren (R) -oder (S)-<BR> Cyanhydrine, wie etwa (R)-oder (S)-2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril, (R) -oder (S)-2-<BR> Chlormandelonitril, (R) -oder (S)-Mandelonitril, (R) -oder (S)-4-Methylmandelonitril,<BR> (R) -oder (S)-3-Phenoxymandelonitril, (R) -oder (S)-2-Hydroxy-2-methyl-heptannitril,<BR> (R) -oder (S)-2-Hydroxy-2-phenyl-propionitril, (R) -oder (S)-2-Hydroxy-3-pentennitril,<BR> (R) -oder (S)-1-Hydroxy-cyclohexannitril, (R) -oder (S)-Acetophenoncynahydrin.

Das entsprechende (R)-oder (S)-Cyanhydrin wird sodann erfindungsgemäß enzy- matisch hydrolysiert.

Die enzymatische Hydrolyse erfolgt erfindungsgemäß in Anwesenheit von Rhodo- coccus erythropolis NCIMB 11540.

Mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 wurde unerwarteterweise ein Mikroor- ganismus gefunden, der sich dadurch auszeichnet, dass er über ein Nitrilhydrata- se/Amidase-Enzymsystem verfügt, das die Nitrilfunktion von derart polaren Nitrilen, wie die oben angeführten Cyanhydrine hydrolysieren kann.

Durch das Nitrilhydratase/Amidase-Enzymsystem von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 werden die chiralen Cyanhydrine im ersten Schritt durch die Nitril- hydratase in das korrespondierende chirale Hydroxyamid hydrolysiert, welches so- dann in einem zweiten Hydrolyseschritt durch die Amidase in die entsprechende chi- rale a-Hydroxycarbonsäure überführt wird.

Der Mikroorganismus kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in jeglicher Form, beispielsweise in Form von gemahlenen Zellen, rohen oder gereinigten Enzymen, rekombinanten Enzymen, immobilisierten Zellen oder Enzymen, lyophilisierten Zellen oder von"resting cells"eingesetzt werden.

Bevorzugt werden rekombinante Enzyme, resting cells oder lyophilisierte Zellen, be- sonders bevorzugt rekombinante Enzyme oder resting cells verwendet.

Neben dem direkten Einsatz der Nitrilhydratase/Amidase-aktiven Präparationen von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Zellen stellt die Verwendung von rekombi- nanten, in einem geeigneten Mikroorganismus, wie etwa E. coli, Pichia pastors, Sac- charomyces, Asperagillus, K. Lactis u. s. w. exprimierten Präparationen eine gute Alternative dar. Dabei werden die entsprechenden Gene mit Hilfe von Plasmid- konstrukten in geeignete Wirtszellen, beispielsweise in E. coli-, Pichia pastoris-, Sac- charomyces-, Asperagillus-, K Lactis-Wirtszellen eingebracht. Durch Wahl eines induzierbaren Promoters können sowohl die Nitrilhydratase als auch die Amidase in aktiver Form überexprimiert werden. Im Falle der Amidase können hierbei weit höhe- re Aktivitätsniveaus erreicht werden als bei entsprechender Fermentation der Rho- dococcus Zellen.

Der Mikroorganismus wird sodann in der gewünschten Form in einem wässrigen Medium, wie Wasser oder einer Pufferlösung, suspendiert. Geeignete Pufferlösun- gen sind beispielsweise Phosphatpuffer, wie etwa l</Na-Phosphatpuffer, PBS-Puffer, Butyratpuffer, Citratlösungen u. s. w..

Der pH-Wert der verwendeten Pufferlösung sollte dabei in einem Bereich von pH 4.5 bis pH 11, bevorzugt von 5.5 bis 8.5 liegen.

Anschließend wird die so erhaltene Suspension mit dem entsprechenden chiralen Cyanhydrin versetzt. Da es sich bei den chiralen Cyanhydrinen um lipophile Verbin- dungen mit beschränkter Wasserlöslichkeit handelt, ist die Verwendung eines Lö- sungsvermittlers als Cosolvens notwendig, um die Cyanhydrine im wässrigen Medi- um in Lösung zu bringen.

Als Lösungsvermittler eignen sich beispielsweise organischen Lösungsmittel, Tensi- de, Phasentransferkatalysatoren, u. s. w..

Organische Lösungsmittel, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren als Cosol- vens eignen sind solche, die erstens das Substrat ausreichend lösen und zweitens die Enzymaktivität so wenig wie möglich beeinträchtigen.

Beispiele dafür sind Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), Ci-Ce- Alkohole, wie etwa Methanol, Ethanol, i-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, t-Butanol oder 1-Pentanol, Toluol oder t.-Butylmethylether (TBME) oder Gemische derselben.

Bevorzugt werden als Cosolvens DMSO, DMF, Ethanol, i-Propanol oder Gemische derselben und besonders bevorzugt DMSO und DMF eingesetzt.

Der Cosolvensanteil sollte zwischen 0,5 und 20 Vol. %, bezogen auf das Gesamtvo- lumen der Reaktionslösung liegen.

Bevorzugt liegt der Cosolvensanteil zwischen 1 und 15 Vol% und besonders bevor- zugt zwischen 2 und 10 Vol%.

Die Substratkonzentration in der Reaktionslösung sollte bei dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem Bereich von 1 g/I bis zu 100g/l (bezogen auf das Gesamtvolumen der Reaktionslösung) liegen, wobei die Akzeptanz einer ausreichend hohen Sub- stratkonzentration die Grundvoraussetzung für die Anwendung der erfindungsgemä- ßen enzymatischen Hydrolyse im präparativen Maßstab ist.

Bevorzugt sind Substratkonzentrationen bis zu 50g/l, besonders bevorzugt bis zu 25g/l.

Die mögliche umsetzbare Substratkonzentration hängt von der eingesetzten En- zymmenge ab. Für eine effiziente, quantitative Umsetzung muss der erste Hydroly- seschritt sehr rasch erfolgen, um den Zerfall des Cyanhydrins und die dadurch be- dingte Racemisierung zu vermeiden, sodass relativ hohe Zelldichten erforderlich sind.

Es ist dabei zu beachten, dass eine ausreichende Durchmischung des Reaktionssys- tems gewährleistet ist.

Die Zell-bzw. Enzymmenge hängt von der Aktivität des Mikroorganismus in der ein- gesetzten Form, sowie von der Substratkonzentration und dem Cosolvens ab.

Der pH-Wert des Reaktionsgemisches sollte zwischen 4.5 und 11, bevorzugt zwi- schen 5,5 und 8 liegen.

Gegebenenfalls kann dem Reaktionsgemisch zur Einstellung des pH-Wertes noch eine geeignete Säure bzw. saure Salze, wie etwa Phosphorsäure, Borsäure, Citro- nensäure, u. s. w. zugesetzt werden.

Die erfindungsgemäße enzymatische Hydrolyse wird bei einer Temperatur von 10 bis 60°C, bevorzugt bei 15 bis 50°C und besonders bevorzugt bei 20 bis 45°C durchge- führt.

Nach erfolgter Hydrolyse zu den gewünschten chiralen a-Hydroxycarbonsäuren, er- folgt deren Isolierung aus dem Reaktionsgemisch mittels einer bekannten Technik, wie etwa Abzentrifugieren der Zellen, Extraktion des Produktes nach Ansäuern mit HCI (z. B. : pH 2) und gegebenenfalls weitere Aufreinigung durch Aktivkohlefiltration und Umkristallisation.

Durch die erfindungsgemäße Verwendung von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 werden somit so polare Nitrile, wie chirale Cyanhydrine auf einfache und effi- ziente Weise unter milden Bedingungen in die korrespondierenden chiralen a- Hydroxycarbonsäuren überführt, wobei keinerlei Racemisierung auftritt. Die ge- wünschten a-Hydroxycarbonsäuren werden dabei, in Abhängigkeit vom ee-Wert des eingesetzten Cyanhydrins, in hoher optischer Reinheit von bis zu über 99% und in hohen Ausbeuten von bis zu über 98% erhalten.

Beispiel 1 : Herstellung des Biokatalysators Für die Herstellung der Biomasse von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 wur- de ein komplexes Standardmedium (Medium A, s. Tab. 1) verwendet. Die Stammhal- tung erfolgte auf Agar-Platten mit Medium A (Verfestigung mit 15girl Agar). Die Plat- ten wurden durch seitliches Umwickeln mit Parafilm verschlossen und im Kühl- schrank bei 4° C gelagert.

Das Wachstum der Flüssigkulturen erfolgte in 1000m1 Erlenmeyerkolben mit Schika- nen mit 250m1 Medium A bei 30°C und 130rpm.

Variante) (ohne Vorkultur) : Etwa die Hälfte der Biomasse einer Agarplatte wurde in 5ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je eine Zellsuspension wurde 250m1 Kulturmedium zugesetzt.

Variante II (mit Vorkultur) : Für die Vorkultur wurde etwas Biomasse einer Agarplatte in 5ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Je eine Zellesuspension wurde 100m1 Kulturmedium zugesetzt (= Vorkultur). Nach 20-24h Wachstum wurden 5ml dieser Vorkultur je 250mL Kulturmedium zugesetzt.

Die Zellernte erfolgte mittels Zentrifugation bei ca. 3000rpm für 30min bei 0-4°C. Die Zellen wurden einmal mit K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) gewaschen. Dann wurden die Zellen in frischem Puffer resuspendiert und entweder nach Schockfrieren lyophilisiert (Umsetzungen mit lyophilisierten Zellen, Beispiel 2), oder diese Zellsus- pension (ca. 6-8% des Kulturvolumens) wurde direkt für die biokatalytischen Umset- zungen verwendet (Umsetzungen mit Resting cells, Beispiel 3).

Tabelle1 : Zusammensetzung von Medium A Sterilisationsgruppe Substanz Konzentration [g/l] Na2HPO4 4.97 I KH2P04 2.04 MgSO4. 7H20 0. 2 CaC12. 2H20 0.02 l l l Ammoniumeisen (l ll)-citrat 0.05 Spurenlösung SL-6 1 ml/l Hefeextrakt 1 fiv Fleischpepton 10 Glucose 10 Beispiel 2 : Umsetzungen mit lyophilisierten Zellen im analytischen Maßstab 31.6mg, 52. 6mg bzw. 105.2mg lyophilisierte Zellen wurden in 10m1 Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) ca. 1 Stunde bei 130rpm und 20-25°C rehydratisiert. Je 475p1 dieser Zellsuspension wurden in 1. 5m1 Eppendorf-Reaktionsgefäße überführt und mit 25pl einer ca. 200mM Substratlösung von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril in DMSO ver- setzt (3mg, 5mg bzw. 10mg Zellen/ml, S. -Konz. ca. 10mM, 5% DMSO). Die Umset- zung wurde im Thermomixer bei 30°C und 1000rpm durchgeführt. Nach 0,2, 4,6, 8, 10,15, 20,30, 60 und 120 Minuten wurde jeweils ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 0. 5m1 1N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13. 000rpm) und entsprechender Verdünnung wurden die Konzentrationen von Cyanhydrin, Hydroxyamid und Hydro- xysäure mittels HPLC bestimmt. Tabelle 2 Hydrolyse von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril durch lyophilisierte Rhodo- coccus erythropolis NCIMB 11540 Zellen (10mg Zellen/ml ; Substratkonz. : 10mM) Konzentration (mM) von Substrat, Hydroxyamid und Hydroxycarbonsäure in Ab- hängigkeit von der Zeit (min) 0 min 10min 20min 30min 60min 100min 120min Substrat 10mM 1,9mM 0,7mM 0,25mM OmM OmM OmM Amid OmM 4, 7mM 3, 5mM 3, 2mM 2mM 1, 1 mM 0,5mM Säure OmM 3,3mM 5,4mM 6, 1 mM 7,5mM 8, 2mM 8, 5mM Beispiel 3 : Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von Resting cells und lyophilisierten Zellen Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte analog Beispiel 1, Variante I, 2 Kultur- kolben. Nach 20 Stunden (OD546 = 3.5 bzw. 1.8) wurden Zellen aus je 4 mal 10m1 Fermentationsbrühe abzentrifugiert und einmal mit K/Na-P04 Puffer (pH 6.5, 50mM) gewaschen. Je 2 Zellproben wurden vor Aktivitätsbestimmung lyophilisiert, die ande- ren beiden wurden als Resting cells verwendet.

Die Zellen wurden in 1. 8m1 K/Na-P04 Puffer (pH 6.5, 50mM) resuspendiert (lyophili- sierte Zellen wurden zur Rehydratation 1h geschüttelt). Die Reaktion wurde durch Zusatz von 200ut einer 200mM Substratlösung in DMSO gestartet (Substrat-Konz. ca. 20mM) und bei 30°C und 130rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min, 60min und 17h wurden 200p1 entnommen und mit 200p11N HCI versetzt. Nach Zen- trifugation (5min, 13. 000rpm) und Verdünnung wurden mittels HPLC die Umsätze bestimmt. Dabei wurden nur das Substrat und die beiden Produkte berücksichtigt Als Substrat wurde (R)-2-Chlormandelonitril (ee >99%) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tab. 3 dargestellt. Tabelle 3 : Ergebnisse der Umsetzungen von Kultur 1 (OD546 3.5), Substrat : (R)-2- Chlormandelonitril OH Resting cells Lyophilisierte Zellen (19mg/mL) Umsatz CH Umsatz HA [%] 2 Umsatz CH U msa z HA % 2 ci/o 30min 100 2 40 <1 60min--4 41 0 17h--42 43 <1 1 : Der Umsatz des Cyanhydrins (CH) bezieht sich auf beide Produkte (Hydroxyamid und Hydroxysäure).

2 : Der Umsatz des Hydroxyamides (HA) bezieht sich auf die Menge an Hydroxysäu- re, die aus dem vorhandenen Hydroxyamid gebildet wurde.

Beispiel 4 : Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung von unterschiedlichen Substratkonzentrationen Versuch 4. 1 : Bei Versuch 4.1 wurde die Reaktion im analytischen Maßstab (Reaktionsvolumen 1 ml) mit 3 Substratkonzentrationen (2. 2g/l, 6. 6g/i, 13. 2g/l) durchgeführt.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II, 21 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 6.1). Die Zellen aus 8 mal 10ml Fermentationslösung wurden in Kulturröhrchen abzentrifugiert. Die erhaltene Zell- masse wurde einmal mit je 2ml K/Na-Phosphatpuffer (pH 6.5, 50mM) gewaschen.

Der Inhalt von 2 Röhrchen wurde zur Bestimmung des Trockengewichtes lyophili- siert.

Auswaage : 1. 37mg Iyophilisierte Zellen/10ml Fermentationslösung 2.30mg (Diese Menge entsprach ca. dem Einsatz an Zellen/ml bei den folgenden Umsetzun- gen.) Der Inhalt der restlichen 6 Röhrchen wurde in 950pu Puffer resuspendiert (OD ca. 40) und in Eppendorfers überführt. Diesen Zellsuspensionen wurden je 50p1 verschieden konzentrierter Substratlösungen (3 Konzentrationen, Parallelansätze, 5% DMSO als Cosolvens) zugesetzt. Die Eppendorfers wurden am Thermomixer bei 30°C und 1000rpm geschüttelt. Zur Umsatzkontrolle wurden jeweils 200p1 entnommen und mit 200p11 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13. 000rpm) und Verdünnung wur- den die Umsätze mit HPLC bestimmt.

Folgende Konzentrationen (R)-2-Chlormandelonitril wurden verwendet : a. Substratlösung : 11 mg (R)-2-Chlormandelonitril in 250p1 DMSO (ca. 260mM) Substratkonzentration im Ansatz : 2. 2g/l (13. 1mM) b. Substratlösung : 33mg (R)-2-Chlormandelonitril in 250p1 DMSO (ca. 290mM) Substratkonzentration im Ansatz : Substratkonzentration : 6. 6g/l (39.4mM) c. Substratlösung : 66mg (R)-2-Chlormandelonitril in 250, u1 DMSO (ca. 1580mM) Substratkonzentration im Ansatz : 13. 2g/l (78. 8mM) Ein Vergleich der Ansätze a-c ist in Tabelle 4.1 anhand der Bildung der 2- Chlormandelsäure (in %) dargestellt. Bei allen Ansätzen wurde die Hydroxysäure quantitativ gebildet. Es zeigte sich, dass auch höhere Substratkonzentrationen prob- lemlos akzeptiert werden.

Tabelle 4.1 : Vergleich der Ansätze a-c anhand der Bildung von (R)-2- Chlormandelsäure in % 10min 20min 30min 40min 50min a 77% 86% 92% 94% 96% b 45% 70% 82% 89% 95% c 58% 85% 96% 98% 100% Versuch 4.2 : Bei Versuch 4.2 wurde die Reaktion mit 2 verschiedenen Substratkonzentrationen (1 Og/l, 20g/l) im 5mi-Maßstab durchgeführt.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II, 21 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 19 Stunden (OD546 8. 4). Die Zellen wurden in ca.

140m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 52). Jeweils 4. 75mut dieser Zellsus- pension wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.

Es wurden 2 verschiedene Konzentrationen von (R)-2-Chlormandelonitril in Parallel- ansätzen untersucht. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 250p1 Substratlösung gestartet und in Kulturröhrchen im Schüttelschrank bei 30°C und 130rpm durchge- führt. Zur Umsatzkontrolle wurden jeweils 200pl entnommen und mit 200u 1N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13. 000rpm) und Verdünnung wurden die Umsät- ze mit HPLC bestimmt. a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250pL DMSO ([S] =60mM, 10g/L, Cosolvens : 5% DMSO) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Hydroxyamid umgesetzt, nach 2h waren ca. 40% Hydroxysäure gebildet. Nach 20h war die Umsetzung quan- titativ. b. 100mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250pL DMSO ( [S] = 120mM, 20g/l, Cosolvens : 5% DMSO) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 18h waren 36% Hydroxysäure gebildet. Nach 43h waren 41% Hydroxysäure gebil- det, danach fand keine weitere Umsetzung mehr statt.

Versuch 4.3 : Beim Versuch 4.3 wurden Umsetzungen mit 10g/l und 15gel (R)-2-Chlormandelonitril durchgeführt. Weiters wurde nach vollständigem Umsatz der ee der gebildeten Hydroxysäure bestimmt.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1 Variante II, 2. 751 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden. Die Zellen wurden in ca. 200m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 44). Jeweils 4. 85mi dieser Zellsuspension wur- den für die enzymatischen Umsetzungen verwendet.

Es wurden 2 verschiedene Konzentrationen von (R)-2-Chlormandelonitril in Parallel- ansätzen untersucht. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 150p1 Substratlösung gestartet und in Kulturröhrchen im Schütteischrank bei 40°C und 150rpm durchge- führt. Die Umsatzkontrolle erfolgte mittels HPLC. Bei vollständigem Umsatz wurde die Hydroxysäure nach Ansäuern extrahiert und der ee bestimmt. a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 150ut DMSO ( [S] = 60mM, 1 Ogll, Co- so ! vens : 3% DMSO) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 80% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). b. 75mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 150ut DMSO ( [S] = 90mM, 15g/l, Co- solvens : 3% DMSO).

Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren ca. 60% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäu- re vollständig (Produkt-ee = 99%).

Beispiel 5 : Enzymatische Hydrolyse unter Verwendung unterschiedlicher Co- solventien Versuch 5. 1 : Bei Umsetzungen im 50mi-Maßstab wurde DMSO mit EtOH als Cosolvens vergli- chen. Es wurde 5% Cosolvens verwendet, die Substratkonzentration betrug jedoch nur 4g/l (R)-2-Chlormandelonitril.

Biomasse aus 8 mal 250m1 (abzüglich 80m1, s. Versuch 4.1) Fermentationsmedium (OD ~ 6. 1) wurde nach 20h geerntet. Die Zellen wurden in 100m1 K/Na-Phosphatpuf- fer (pH 6. 5, 50mM) suspendiert. Diese Zellsuspension (OD 60) wurde für die enzy- matischen Umsetzungen verwendet. Die Umsetzungen von (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in DMSO oder EtOH wurden in 100ml Schlifferlenmeyerkolben bei 150rpm und 30°C durchgeführt. Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200p1 Pro- be mit 200p1 1 N HCI versetzt, zentrifugiert (5min, 13. 000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. 50mL Zellsuspension wurden mit 200mg (R)-2-Chlormandelonitril (>99%) ge- löst in 2300p1 DMSO und 200pl 0. 1 % H3P04, versetzt.

Substratkonzentration : 4g/L (24mM), 5% DMSO als Cosolvens Produkt-ee von (R)-2-Chlormandelsäure : 97% b. 50mL Zellsuspension werden mit 200mg (R)-2-Chlormandelonitril (>99%) ge- löst in 2300p1 EtOH und 200pl 0. 1% H3P04, versetzt.

Substratkonzentration : 4g/l (24mM), 5% EtOH als Cosolvens Produkt-ee von (R)-2-Chlormandelsäure : >99% Versuch 5. 2 : Hier wurden die Lösungsmittel DMSO, EtOH und'PrOH wieder mit einem Anteil von 5% verwendet, die Substratkonzentration betrug 10g/ (R)-2-Chlormandelonitril. Die Reaktion wurde im 5ml-Maßstab durchgeführt.

Die Herstellung des Biokatalysators Beispiel 4, Versuch 4. 2 (OD546 8.4). Jeweils 4. 75m1 der Zellsuspension (Resting cells, OD546 52) wurden für die enzymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von (R)-2-Chlormandelonitril (>99%) gelöst in DMSO, EtOH und i-PrOH wurden in Kulturröhrchen bei 150rpm und 30°C durchge- führt (Parallelansätze).

Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200p1 Probe mit 200, u1 1 N HCI ver- setzt, zentrifugiert (5min, 13. 000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollstän- digem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250, u1 OMSO ( [S] = 60mM, 10g/l, Co- solvens : 5% DMSO) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Hydroxyamid umgesetzt, nach 2h waren ca. 40% Hydroxysäure gebildet. Nach 20h war die Umsetzung quanti- tativ (Produkt-ee = 95%). b. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250pl EtOH, ( [S] = 60mM, 10g/l, Co- solvens : 5% EtOH) Bereits nach 30 Minuten ist das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 3h sind 35% Hydroxysäure gebildet, nach 19h ist die Hydrolyse zur Hydroxysäure zu 94% abgeschlossen, nach 28h ist die Umsetzung praktisch vollständig (Produkt-ee = 97%). c. 50mg (R)-2-Chlormandelonitril, gelöst in 250, u1 i-PrOH, ([S] =60mM, 10g/l, Cosolvens : 5% i-PrOH) Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 3h waren 8% Hydroxysäure gebildet, nach 44h waren 64 % Hydroxysäure gebildet (Produkt-ee = 92.3) Beispiel 6 : Enzymatische Hydrolyse bei unterschiedlichen Temperaturen Versuch 6. 1 : Bei Versuch 6.1 wurde der Reaktionsverlauf bei Reaktionstemperaturen von 30°C, 35°C, und 40°C verglichen. Die Ansätze wurden im 5ml-Maßstab mit einer Substrat- konzentration von 10g/l (R)-2-Chlormandelonitril durchgeführt. Nach vollständigem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 4, Versuch 4.2, (OD546 8.4). Jeweils 4. 75mut der Zellsuspension (Resting cells, OD546 52) wurden für die en- zymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von 50mg (R) -2- Chlormandelonitril (>99%) ( [S] = 60mM, 10g11), gelöst in 250p1 DMSO (5%) wurden bei 3 verschiedenen Temperaturen (30°C, 35°C, 40°C) in Kulturröhrchen bei 150rpm durchgeführt (Parallelansätze).

Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200p1 Probe mit 200pl 1 N HCI ver- setzt, zentrifugiert (5min, 13. 000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollstän- digem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. T = 30°C Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid. umgesetzt, nach 2h waren 42% Hydroxysäure gebildet, nach ca. 20h war die Hydrolyse zur (R)-2- Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 95%). b. T = 35°C Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 65% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur (R)-2- Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 96.5%). c. T = 40°C Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 86% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur (R)-2- Chlormandelsäure vollständig (Produkt-ee = 97.9%).

Versuch 6. 2 : Bei Versuch 6.2 wurde die Temperatur bis auf 50°C erhöht.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 4, Versuch 4. 3 (OD546 44). Jeweils 4. 85m ! der Zellsuspension (Resting cells, OD546 44) wurden für die en- <BR> <BR> zymatischen Umsetzungen verwendet. Umsetzungen von 50mg (R) -2- Chlormandelonitril (>99%) ( [S] = 60mM, 10g/I), gelöst in 150p1 DMSO (3%) wurden bei 3 verschiedenen Temperaturen (30°C, 40°C, 50°C) in Kulturröhrchen bei 150rpm durchgeführt (Parallelansätze).

Zur Umsatzkontrolle mittels HPLC wurden jeweils 200p1 Probe mit 200p1 1 N HCI ver- setzt, zentrifugiert (5min, 13. 000rpm) und vor der Messung verdünnt. Nach vollstän- digem Umsatz wurde der ee des Produktes bestimmt. a. T = 30°C Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 42% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). b. T = 40°C Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 80% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%). c. T = 50°C Bereits nach 30 Minuten war das gesamte Cyanhydrin zum Amid umgesetzt, nach 2h waren 92% Hydroxysäure gebildet, nach 19h war die Hydrolyse zur Hydroxysäure vollständig (Produkt-ee > 99%).

Beispiel 7 : Umsetzungen von Cyanhydrinen von Aldehyden mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 im halb-präparativen Maßstab Für alle Umsetzungen wurde K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) verwendet. Die Reaktionsverfolgung erfolgte mit HPLC. Nach Probenahme wurde zum Abstoppen der biokatalytischen Reaktion mit Probenvolumen 1N HCI versetzt (Parallelproben).

Nach Zentrifugation (5min, 13. 000rpm) wurde mit HPLC-Laufmittel verdünnt.

Zur Aufarbeitung wurde die Biomasse 30min bei 4°C und 3000rpm abzentrifugiert und einmal mit H20 dest. gewaschen. Nach Ansäuern des Überstandes mit 1N HCI auf pH 2 wurde 3-4 mal mit TBME extrahiert.

Versuch 7. 1 : Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II. 31 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 5.9). Die Zellen wurden zu ca.

180m1 in Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 80).

0.6g (R)-2-Chlormandelonitril (ee > 99%), gelöst in 1. 5m1 DMSO wurden 60moi dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 30°C und 150rpm im Schüttel- schrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 17 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 0.73g (109%) Produkt-ee : >99% Versuch 7. 2 : In Versuch 7.2 wurden einige Reaktionsparameter variiert. Als Standardbedingungen galten 10g/l Substrat und DMSO als Cosolvens (hier 2.5%). Ein zweiter Ansatz wur- de mit 15g/l Substrat durchgeführt, ein weiterer mit 10g/l Substrat und DMF als Co- solvens.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II. 31 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 6. 8). Die Zellen wurden zu ca.

190m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 69). Drei Umsetzungen wurden durchgeführt.

Ansatz A : 0.3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 750ut DMSO wurden 30m1 dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydroly- siert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 0. 31g (93%) Produkt-ee : >99% Ansatz B : 0.3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 750p1 DMF wurden 30m1 dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydroly- siert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 0.30g (90%) Produkt-ee : 98.5% Ansatz C : 0. 45g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 750u ! DMSO wurden 30m1 dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydroly- siert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure praktisch voll- ständig.

Rohausbeute : 0.45g (90%) Produkt-ee : >99% Versuch 7. 3 : Hier wurden 2 Ansätze mit verschieden großer Substratkonzentration (Ansatz A 10g/l, Ansatz B 15g/l) durchgeführt. Beide Umsetzungen verliefen nahezu gleich rasch und waren nach 2 Stunden vollständig.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II. 31 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 1.2). Die Zellen wurden in ca.

180m1 Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 70). Zwei Umsetzungen wurden durchgeführt.

Ansatz A : 0,8g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 1. 6m1 DMSO wurden der Zellsuspension (80m1) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 50°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydroly- siert, nach 2 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 0.85g (95%) Produkt-ee : >99% Ansatz B : 1.2g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 1. 6m ! DMSO wurden der Zellsuspension (80m1) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 50°C und 150rpm im Schüttelschrank durchgeführt. Nach 30min war das Cyanhydrin vollständig hydroly- siert, nach 2 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 1.26g (94%) Produkt-ee : 98.9% Versuch 7.4 : Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II, 2. 51 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 6.9). Die Zellen wurden in ca.

160moi Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 63).

1.3g (R)-2-Chlormandelonitril (ee>99%), gelöst in 2. 5m1 DMSO wurden 140m1 dieser Zellsuspension zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttel- schrank durchgeführt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 3 Stunden war die Umsetzung zur (R)-2-Chlormandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 1.43g (98%) Produkt-ee : >99% Versuch 7.5 : Bei dieser Umsetzung wurde 1g Mandelonitril bei einer Substratkonzentration von 8g/l zur entsprechenden Hydroxysäure hydrolysiert.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgte gemäß Beispiel 1, Variante II, 21 Fer- mentationsmedium, Ernte nach 20 Stunden (OD546 8.4). Die Zellen wurden in ca.

120moi Puffer resuspendiert (Resting cells, OD546 74). Die Umsetzung wurde nach Tieffrieren des Biokatalysators über Nacht durchgeführt.

1. 0g (R)- (+)-Mandelonitril, gelöst in 2. 4m1 DMSO wurde der Zellsuspension (120m1) zugesetzt. Die Hydrolyse wurde bei 40°C und 150rpm im Schüttelschrank durchge- führt. Nach 15min war das Cyanhydrin vollständig hydrolysiert, nach 5 Stunden war die Umsetzung zur (R)-Mandelsäure vollständig.

Rohausbeute : 1.16g (100%) Produkt-ee : 93% Beispiel 8 : Umsetzungen von Cyanhydrinen von Ketonen mit Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 im halb-präparativen Maßstab Es wurde en K/Na-Phosphatpuffer (50mM, pH 6.5) verwendet. Die Reaktionsverfol- gung erfolgte mit DC.

Zur Aufarbeitung wurde die Biomasse 20min bei 4°C und 6000rpm abzentrifugiert und einmal mit H20 dest. gewaschen. Nach Ansäuern des Überstandes mit 1N HCI auf pH 2 wurde 3-4 mal mit TBME extrahiert.

Die Herstellung des Biokatalysators erfolgt gemäß Beispiel 1, Variante II, 2L Fermen- tationsmedium, Ernte nach 20 Stunden. Die Zellen wurden in ca. 60mL Puffer re- suspendiert (Resting cells, OD546 60).

300mg (S) -Acetophenoncyanhydrin (25% Acetophenon, ee 94%), gelöst in 1mL DMSO wurden der Zellsuspension zugesetzt. Nach 20h war die Umsetzung It. DC vollständig und das Produkt (enthält 1-Phenylethanol und Spuren anderer Verunrei- nigungen) wurde extrahiert. Die Umsetzung verlief ohne Verlust an Enantiomeren- reinheit.

Rohausbeute : 357mg Beispiel 9 : Erzeugung von Enzympräparationen von Nitrilhydratase und Ami- dase zur Hydrolyse substituierter Cyanhydrine mittels rekombinanter Expres- sion in E. coli Zur Expression der Nitrilhydratase, sowie zur Expression der Amidase wurde das pMS470-Plasmidsystem herangezogen. Dieses Plasmid verfügt neben den replikati- ven Elementen, einer selektionierbaren Ampicillin-Resistenz und dem Lac- Repressor-Gen lacl über einen induzierbaren tac-Promotor, welcher eine gesteuerte Überexpression der einklonierten offenen Leserahmen erlaubt.

Expressionsplasmid für die Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 Nitril- hydratase : Die Plasmidkarte ist in Abbildung 1 zu sehen. Das Plasmid trägt die Bezeichnung pMS470Nhse7. 3. Es enthält neben den beiden Genabschnitten der Nitrilhydratase (a-und ß-Untereinheit) noch einen dritten offenen Leserahmen, welcher für ein Akti- vatorprotein codiert.

Expressionsplasmid für die Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 A- midase : Anders als bei der Nitrilhydratase ist für die Expression der Amidase von Rhodococ- cus erythropolis NCIMB 11540 nur ein einziger Leserahmen notwendig und dieser wurde im Plasmid pMS470-33/3/1/11 hinter dem tac-Promotor einkloniert. Die Abbil- dung 2 zeigt die Plasmidkarte dieses Konstruktes.

Fermentation der rekombinanten Nitrilhydratase und Amidase Die Fermentation der beiden Enzyme erfolgte grundsätzlich nach dem allgemeinen Protokoll, ausgearbeitet für die Überexpression von Enzymen im pMS470 System.

Dabei wurde : - aus einer Über-Nacht-Kultur (ONC) in eine Hauptkultur mit LB-Medium und Antibio- tikum im Schüttelkolben überimpft.

-bis in die exponentielle Phase anwachsen gelassen -bei OD600 (Optische Dichte bei 600nm) 0.8 bis 1.5 mit IPTG (Isopropylthiogalactopy- ranosid) induziert - für 18h weiter induziert (Proteinexpression) - geerntet (Zentrifugation) und aufgeschlossen (Ultraschall) Expression der Nitrilhydratase Die mit pMS470Nhase7. 3 (bzw. pMSNhasetactac7.3) transformierten E. coli B BL21 Zellen wurden auf LB-Ampicillin-Platten vereinzelt und eine ONC von 100m1 LB- Ampicillin Medium mit einer Einzelkolonie beimpft. Am nächsten Morgen wurde eine Hauptkultur bestehend aus 250m1 LB-Ampicillin Medium in einem 1000m ! Schika- nenkolben auf eine OD600 von 0.01 bis 0.03 (Beckmann Photometer) beimpft. Die Wachstumstemperatur wurde auf 25°C eingeregelt, da bei höheren Temperaturen ausschließlich die Bildung von unlöslichen Einschlußkörperchen erfolgt. Nach Errei- chen der Induktionsdichte (OD6oo=1 Beckmann Photometer) wurden die Kulturen durch Zusatz von IPTG zu einer Konzentration von 0. 1mM induziert. Zusätzlich wur- den die Medien mit 0. 1 mM Ammoniumeisen (lit) citrat supplementiert. Nach Erreichen einer OD600>4 wurden die Kulturen geerntet (Zentrifugation bei ca. 3000*g für 15min) und einmal mit ca. 100m1 PBS-Puffer gewaschen. Das Zellpellet wurde im Anschluß in PBS-Puffer resuspendiert (ca. 5ml Gesamtvolumen) und mit einer Ultraschallson- de (BRANSON Sonifier 250,60% Leistungseinstellung, Konstantbeschallung ; 5 mal 30s mit je 1 min Pause zur Kühlung) aufgeschlossen (Visuelle Kontrolle der Vollstän- digkeit unter dem Mikroskop). Die so erhaltenen Rohlysate besaßen eine typische Aktivität von ca. 100-250 U/ml (ca. 350-500U/ml für pMSNhasetactac7.3), analysiert mit Methacrylonitril als Substrat unter den nachfolgend angeführten Bedingungen.

Zur Konservierung wurden die Lysate bei-20°C gelagert. Lagerung bei Raumtempe- ratur ist mit einem schnellen Verlust an Aktivität verbunden.

Aktivitätsbestimmung : Rohlysate wurden unmittelbar vor der Aktivitätsbestimmung 1 : 10 mit PBS-Puffer verdünnt. 1. 4m1 einer 40mM Methacrylonitril Lösung in PBS- Puffer wurden mit 20 ul des verdünnten Lysats versetzt und bei 28°C inkubiert (Ep- pendorf Thermomixer 5436). Zum Zeitpunkt 0,1, 2,5, 10 und 15 Minuten wurden 200p1 Proben entnommen und unmittelbar mit 800nul 0.17% Phosphorsäure die En- zymreaktion in diesen Proben gestoppt. Nach Zentrifugation (16000*g, 10 Minuten) wurden die Proben spektrophotometrisch (Perkin Eimer UVNIS-Spekrometer Lambda Bio) bei 224nm vermessen. Der Anstieg der Extinktion wurde mit der Zu- nahme der Konzentration an Methacrylamid korreliert, wobei ein s-Wert von 0,57 I*mmol~1*cm~1 herangezogen wurde.

Expression der Amidase Die mit pMS470-33/3/1/11 transformierten E. coli B BL21 Zellen wurden auf LB- Ampicillin-Platten vereinzelt und eine ONC von 100m1 LB-Ampicillin Medium mit einer Einzelkolonie beimpft. Am nächsten Morgen wurde eine Hauptkultur bestehend aus 250m1 SOC-Ampicillin Medium in einem 1000m1 Schikanenkolben auf eine OD6oo von 0.01 bis 0.03 (Beckmann Photometer) beimpft. Die Wachstumstemperatur wurde auf 30°C eingeregelt, da die Fermentation bei 37°C ausschließlich zur Bildung von unlös- lichem und inaktiven Protein führt. Nach Erreichen der Induktionsdichte (OD600=1 Beckmann Photometer) wurden die Kulturen durch Zusatz von IPTG zu einer Kon- zentration von 0.3mM induziert. Nach einer Induktionszeit von 16h wurden die Zellen geerntet (Zentrifugation 3000*g, 10min) und mit Natriumphospatpuffer (0. 1 M, pH=7) gewaschen. Das gewonnene Pellett wurde auf ca. 5ml Gesamtvolumen im Wasch- puffer resuspendiert und mit einer Ultraschallsonde (BRANSON Sonifier 250,60% Leistungseinstellung, Konstantbeschallung ; 5 mal 30s mit je 1 min Pause zur Küh- lung) unter ständiger Kühlung bis zur Vollständigkeit aufgeschlossen (Visuelle Kon- trolle der Vollständigkeit unter dem Mikroskop). Die derart gewonnenen Rohlysate wurden zur Konservierung bei-20°C eingefroren. Die Lysate besaßen eine Aktivität von ca. 75 U/ml, bestimmt mit Acetamid (40mM) als Substrat in PBS-Puffer bei 37°C (Bestimmung von freigesetztem Ammonium nach der Indophenolblau-Methode).

Bestimmung der Amidaseaktivität : Folgende Lösungen wurden verwendet : Substratlösung : 40 mM Acetamid in PBS Lösung A : 10% (w/v) Phenol in Ethanol (95%) Lösung B : 0.5% (w/v) Nitroprussidnatrium in ddH20 Lösung C : 100g tri-Natriumcitrat and 5g of Natriumydroxid in 550 ml Wasser Lösung D : 600m1 handelsübliche Natriumhypochlorit-Lösung verdünnt auf 1000mi Ammoniumstandards : 0, 80,120, 200,280, 400, ug/l Ammoniumsulfat in Wasser 1. 4m1 Substratlösung wurden mit 10, u1 Enzymverdünnung (1 : 10 in PBS) bei 30°C in- kubiert (Eppendorf Thermomixer 5436). In 100pu Proben wurden nach 0,1, 2,5, 10 und 15 Minuten mit20pl Lösung A die Enzymreaktion gestoppt. Nach Entnahme der letzten Probe wurden die so erhaltenen Lösungen mit 400pl Wasser verdünnt. Zur Kalibrierung wurden weiters Ammoniumstandard-Lösungen (je 500m1) mit 20p1 Lö- sung A vesetzt. Zu Proben sowie Standards wurden darauf 20p1 der Lösung B und 50p1 eines Gemisches von 4 Teilen Lösung C mit 1 Teil Lösung D zupippettiert. Gute Durchmischung wurde durch Vortexen sichergestellt. Die so behandelten Proben und Standards wurden bei 37°C für 15min belassen. Die entstandene Blaufärbung wurde nach Verdünnung aller Proben und Standards 1 : 10 mit Wasser im Spektrophotome- ter (Perkin Elmer UVNIS-Spektrometer Lambda Bio) bei 640nm quantifiziert. Durch Korrelation der Zunahme der Blaufärbung über die Zeit mit den Extinktionswerten der Standards konnte auf die Aktivität (pmoi freigesetztes Ammonium pro Minute) rück- gerechnet werden.

Beispiel 10 : Hydrolyse unter Verwendung des rekombinanten Enzyms Bei diesen Umsetzungen wurde klonierte Nitrilhydratase von Rhodococcus erythro- polis NCIMB 11540 als Rohlysat des E. coli Klons 7.3 (hergestellt gemäß Beispiel 9) verwendet.

Durchführung : 50pL Rohlysat wurden mit 425pL Puffer (K/Na-P04-Puffer, pH 7,50mM) verdünnt und mit 25pL einer ca. 200mM Substratlösung in DMSO versetzt (5mg Protein/mL <BR> <BR> S. -Konz. ca. 10mM, 5% DMSO). Die Umsetzung wurde im Thermomixer bei 30°C und 1000rpm durchgeführt. Nach 0,2, 4,6, 8,10, 15,20, 30,60 und 120 Minuten wurde jeweils ein Eppendorfer mit 0.5mL 1 N HCI versetzt. Nach Zentrifugation (5min, 13. 000rpm) und entsprechender Verdünnung wurden die Konzentrationen von Cy- anhydrin und Hydroxyamid mittels HPLC bestimmt. Die Aktivität der Nitrilhydratase wurde anhand der Geschwindigkeit der Bildung des Hydroxyamides ermittelt (Stei- gung im Anfangsbereich). Als Standardsubstrat (100% Aktivität) wurde 2-Hydroxy-4- phenyl-butyronitril verwendet. Die Aktivität bei der Hydrolyse der anderen Substrate wurde mit der Aktivität an 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril verglichen (Tab. 5).

Ergebnisse : Die Aktivität der Nitrilhydratase im Rohlysat des E. coli Klons 7.3 bei der Hydrolyse von 2-Hydroxy-4-phenyl-butyronitril betrug ca. 0. 3umol'ma'*min'. In Tabelle 5 ist ein Aktivitätsvergleich an den verschiedenen Substraten dargestellt.

Tabelle 5 : Vergleich der Aktivität der Nitrilhydratase aus dem E. coli on 7.3 an den verschiedenen Substraten. Substrat Aktivität der Nitrilhydratase [%] OH 1 con 100 OH eCN 100 OH - 1 CN 60 Umsetzung von (R)-2-Chlormandelonitril im halb-präparativen Maßstab 50mL eines Rohlysates der klonierten Nitrilhydratase von Rhodococcus erythropolis NCIMB 11540 (E. coli Klon 7.3, hergestellt gemäß Beispiel 9) wurden mit 100mL Puf- fer (K/Na-P04-Puffer, 50mM, pH 6.5) verdünnt. Nach Zusatz von 1. Og (R) -2- Chlormandelonitril (ee>99%) in 1.5mL DMSO wurde die Suspension bei 150rpm und 30°C geschüttelt. Nach vollständigem Umsatz wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert und das Produkt wurde 4 Tage mit CH2C12 kontinuierlich extrahiert. ee des Rohproduktes : >99% Ausbeute nach Reinigung : 0. 91g (82%)