R-a-Liponsäure ist in einer Vielzahl von Pro-und Eukaryonten ein essentieller Cofaktor bestimmter Multienzymkomplexe. Dabei ist die R-a-Liponsäure jeweils mit seiner Carboxylgruppe unter Bildung eines sogenannten Lipoamids kovalent an die s-Amino- gruppe eines spezifischen Lysin-Rests des entsprechenden En- zyms gebunden. Auf diese Weise ist die R-a-Liponsäure ein Teil der E2-Untereinheit der Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) [EC 2.3. 1. 12] bzw. der a-Ketoglutarat-Dehydrogenase (KGDH) [EC 2.3. 1.61] und spielt dort als Redoxpartner und Acylgrup- pen-überträger eine entscheidende Rolle bei der oxidativen De- carboxylierung von a-Ketosäuren. Außerdem fungiert R-a-Lipon- säure als Aminomethyl-Carrier in Glycin-Cleavage Enzymsystemen. a-Liponsäure ist ein optisch aktives Molekül mit einem Chira- litätszentrum am Kohlenstoffatom C6. Dabei stellt die R-Konfi- guration der a-Liponsäure das natürlich vorkommende Enantiomer dar. Nur diese Form zeigt physiologische Aktivität als Cofak- tor der entsprechenden Enzyme. a-Liponsäure kann sowohl in ei- ner oxidierten (5- [1, 2] -Dithiolan-3-yl-Pentansäure) als auch in einer reduzierten Form (6,8-Dimercapto-Oktansäure) vorkom- men. Im Folgenden sind unter der Bezeichnung"a-Liponsäure" beide Formen sowie die jeweiligen Salze der a-Liponsäure, wie z. B. das Calcium-, Kalium-, Magnesium-, Natrium-oder das Am- moniumsalz, zu verstehen.

Die Biosynthese von R-a-Liponsäure wurde besonders an dem Bak- terium Escherichia coli intensiv untersucht (s. Fig. 1). Hier dient Oktansäure, die an das Acyl-Carrier-Protein (ACP) kova- lent gebunden ist, als spezifische Vorstufe bei der Lipon- säure-Synthese. In einer komplexen Reaktion werden zwei Schwefelatome auf die derart aktivierte Oktansäure (Oktanoyl-

ACP) übertragen, wobei R-a-Lipoyl-ACP entsteht. Diese Reaktion wird von der Liponsäure-Synthase [EC 2.8. 1.-], dem lipA-Gen- produkt, katalysiert. Als Schwefeldonor dient dabei letzt- endlich die Aminosäure L-Cystein. Der anschließende Transfer der R-a-Liponsäure von R-a-Lipoyl-ACP auf die E2-Untereinheit der a-Ketosäure-Dehydrogenasen wird von der Lipoyl-Protein- Ligase B [EC 6.-.-.-], dem lipB-Genprodukt, katalysiert, ohne dass dabei jedoch R-a-Lipoyl-ACP oder R-a-Liponsäure als freie Zwischenprodukte auftreten (Miller et al., 2000, Biochemistry 39 : 15166-15178).

E. coli kann aber auch freie R-a-Liponsäure aus dem umgebenden Medium aufnehmen und für die Bildung funktioneller a-Keto- säure-Dehydrogenasen verwenden. Dazu wird R-a-Liponsäure zu- nächst mittels ATP zu R-a-Lipoyl-AMP aktiviert und anschließend auf die entsprechenden Enzym-Untereinheiten über- tragen (s. Fig. 2). Beide Aktivitäten werden von der Lipoyl- Protein-Ligase A [EC 6.-.-.-], dem lplA-Genprodukt, kataly- siert (Morris et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 : 16091-16100).

Diese LplA-Aktivität ist für Wildtypstämme von E. coli aller- dings nicht essentiell, wenn die endogene Liponsäure-Synthese und der Transfer der Lipoyl-Gruppe über den LipA/LipB-Weg er- folgt. So wurden beispielweise lplA-Mutanten beschrieben, die keine nachweisbare Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität mehr be- sitzen, deren Phänotyp aber unter normalen Wachstumsbedingun- gen nicht von einer Wildtyp-Zelle zu unterscheiden ist (Morris et al., 1994, J. Biol. Chem. 269 : 16091-16100 ; Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177 : 1-10).

Über die, Biosynthese von R-a-Liponsäure in Eukaryonten ist we- nig bekannt. Es wird aber vermutet, dass die R-a-Liponsäure- Synthese sowie der Transfer auf die entsprechenden Enzyme in den Mitochondrien eukaryontischer Zellen auf ähnliche Weise wie in Bakterien erfolgt.

Neben ihrer Relevanz als essentieller Bestandteil von Enzymen mit einer zentralen Rolle im Stoffwechsel, wurde schon früh

die Bedeutung der a-Liponsäure für die Pharmakotherapie sowie für die Nahrungsmittelergänzung (Nutraceutical) erkannt : a-Liponsäure besitzt aufgrund ihrer beiden Thiolgruppen eine ausgeprägte Wirksamkeit als Antioxidans und kann deshalb den Organismus vor schädlichen Prozessen, die durch oxidativen Stress induziert werden, schützen. Außerdem ist a-Dihydro- liponsäure, die reduzierte Form der a-Liponsäure, aufgrund ih- rer Eigenschaft als starkes Reduktionsmittel in der Lage, andere oxidierte natürliche Antioxidationsmittel im Körper wie Ascorbinsäure oder a-Tocopherol direkt oder indirekt zu rege- nerieren oder bei deren Mangel diese auch zu ersetzen. Ent- sprechend kommt der a-Liponsäure im Zusammenspiel mit Ascorbinsäure, a-Tocopherol und Glutathion, dem sogenannten "Netzwerk der Antioxidantien", eine zentrale Bedeutung zu. a-Liponsäure wird außerdem zur Prävention und Bekämpfung von Diabetes mellitus Typ II und dessen Folgeschäden, wie z. B.

Polyneuropathie, Cataract oder Kardiovaskularleiden, einge- setzt.

Die unterschiedliche biologische Aktivität beider Enantiomere der a-Liponsäure ist derzeit Gegenstand intensiver Untersu- chungen, wobei sich allerdings immer mehr herauskristalli- siert, dass die Applikation des reinen R-Enantiomers der a- Liponsäure deutliche Vorteile gegenüber der S-Form aufweist.

So wurde im in vitro-Versuch gezeigt, dass nur die natürliche R-a-Liponsäure zur Bildung funktioneller a-Ketosäure-Dehydro- genasen führt. Das S-Enantiomer hatte dagegen sogar einen in- hibierenden Effekt auf die Stimulierung der Enzymaktivität durch R-a-Liponsäure. Die Reduktion von a-Liponsäure und damit die Regeneration der antioxidativ wirksamen a-Dihydrolipon- säure in den Mitochondrien ist für die Zelle von essentieller Bedeutung. Die mitochondriale NADH-abhängige Lipoamid- Reduktase von Säugern zeigt mit dem R-Enantiomer eine fast 20- fach höhere Aktivität als mit der S-Form. Des weiteren hat R- a-Liponsäure verglichen mit dem S-Enantiomer einen deutlich stärkeren Effekt auf die insulin-vermittelte Glucose-Aufnahme und den Glucose-Metabolismus von Skelettmuskelzellen insulin- resistenter Ratten. Im Tierversuch zeigte die R-Form außerdem

einen antiphlogistischen Effekt, während die S-Form eher eine analgetische Wirkung hatte. Um unerwünschte Nebeneffekte zu vermeiden, ist es daher äußerst wünschenswert, a-Liponsäure jeweils nur in der enantiomerenreinen Form zu applizieren.

Derzeit erfolgt die großtechnische Herstellung von a-Lipon- säure ausschließlich mittels chemischer Verfahren, wobei immer das Razemat aus R-und S-Form als Endprodukt gebildet wird (Yadav et al., 1990, J. Sci. Ind. Res. 49 : 400-409). Zur Ge- winnung von enantiomerenreiner R-a-Liponsäure wurden verschie- dene Verfahren entwickelt. Beispielsweise kann das Razemat der a-Liponsäure oder eines der Syntheseintermediate entweder che- misch mittels chiraler Hilfssubstanzen (Walton et. al, 1954, J. Amer. Chem. Soc. 76 : 4748 ; DE 4137773) oder enzymatisch (Adger et al., 1995, J. Chem. Soc., Chem. Commun. : 1563-1564) aufgespalten werden. In anderen Verfahren unterbleibt die Ent- stehung eines Razemats aufgrund eines enantioselektiven Syn- theseschritts, wobei das neue Chiralitätszentrum entweder chemisch (DE 3629116 ; DE 19533881 Bringmann et al., 1999, Z.

Naturforsch. 54b : 655-661 ; DE 10036516) oder durch eine ste- reospezifische Biotransformation mittels Mikroorganismen ein- geführt werden kann (Gopalan und Jacobs, 1989, Tetrahedron Lett. 30 : 5705-5708 ; Dasaradhi et al., 1990, J. Chem. Soc., Chem. Commun. : 729-730 ; DE 10056025). Andere Prozesse wiederum starten die chemische Synthese von enantiomerenreiner a-Lipon- säure mit einem natürlich vorkommenden chiralen Edukt wie z.

B. S-Maleinsäure oder D-Mannitol (Brookes und Golding, 1988, J. Chem. Soc. Perkin Trans. I : 9-12 ; Rama Rao et al., 1987, Tetrahedron Lett. 28,2183-2186). Wegen z. T. aufwendiger Syn- theseschritte, geringer Ausbeuten und hoher Materialkosten sind alle bekannten Methoden zur Herstellung von enantiomeren- reiner R-a-Liponsäure derzeit nicht wirtschaftlich.

Die großtechnische Herstellung vieler niedermolekularer Natur- stoffe, wie z. B. Antibiotika, Vitamine oder Aminosäuren er- folgt heute oftmals mittels eines fermentativen Verfahrens unter Verwendung verschiedener Stämme von Mikroorganismen.

Die Anmeldungen am Deutschen Patent-und Markenamt mit den Ak- tenzeichen 10235270.4 und 10245993.2 beschreiben ein Verfah- ren, bei dem die Produktion von enantiomerenreiner R-a-Lipon- säure ausschließlich in einem Fermentationsprozeß erfolgt.

Dabei werden Zellen eingesetzt, die ein Liponsäure-Synthase- Gen bzw. ein Lipoyl-Protein-Ligase B-Gen einzeln oder auch in Kombination überexprimieren. Die Produktion von enantiomeren- reiner R-a-Liponsäure erfolgt allerdings in noch sehr be- schränktem Ausmaß, so dass diese fermentativen Verfahren derzeit-noch nicht mit der chemischen Synthese konkurrieren können.

Nur in seltenen Fällen führt jedoch eine einzige genetische Manipulation im Zuge des sogenannten"metabolic engineering" eines Wildtypstammes-zur Überproduktion der gewünschten Ver- bindung in ausreichendem Umfang. Vielmehr ist dazu eine Kombi- nation von gezielten genetischen Manipulationen notwendig, oftmals noch ergänzt durch klassische Mutagenese/Screening-An- sätze.

Entsprechend ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein leistungsfähigeres Verfahren zur fermentativen Herstellung von enantiomerenreiner R-a-Liponsäure bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine Zelle, die eine abgeschwächte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweist, in einem Kulturme- dium kultiviert wird, wobei die Zelle enantiomerenreine R-a- Liponsäure in freier Form in das Kulturmedium ausscheidet und die enantiomerenreine R-a-Liponsäure vom Kulturmedium abge- trennt wird.

Unter einer abgeschwächten Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität ist im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise zu ver- stehen, dass die intrazelluläre Aktivität des LplA-Proteins in der Zelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Zelle um 25 bis 100 %, besonders bevorzugt um 75 bis 100 %, verringert ist. Ganz be-

sonders bevorzugt ist die intrazelluläre Aktivität des LplA- Proteins völlig ausgeschaltet.

Aus physiologischen und biochemischen Daten geht hervor, dass Liponsäure in Wildtyp-Zellen nahezu ausschließlich in gebunde- ner Form vorkommt, da bereits die Synthese der R-a-Liponsäure vollständig proteingebunden erfolgt (vgl. Fig. 1) (Herbert und Guest, 1975, Arch. Microbiol. 106 : 259-266 ; Miller et al., 2000, Biochemistry 39 : 15166-15178). Die Lipoyl-Protein-Ligase A ist nicht an der de novo-Synthese von R-a-Liponsäure betei- ligt, vielmehr besteht die Aktivität dieses Enzyms in der Kopplung von freier R-a-Liponsäure an die E2-Untereinheiten von a-Ketosäure-Dehydrogenasen. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass eine Verringerung oder die vollständige Aus- schaltung der Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität in einem Wild- typ-Stamm zur Anhäufung freier, enantiomerenreiner R-a- Liponsäure im Kulturmedium dieser Zellen führt, obwohl sowohl in einem E. coli Wildtyp-Stamm als auch in einer lplA-Mutante alle Lipoyl-Bindestellen der E2-Untereinheiten mit R-a- Liponsäure abgesättigt sind (Packman et al., 1991, Biochem. J.

277 : 153-158 ; Morris et al., 1995, J. Bacteriol. 177 : 1-10) und somit das Substrat des LplA-Proteins (eine unbeladene E2- Untereinheit) fehlt. Darüber hinaus ist die Expression des lplA-Gens in einem E. coli Wildtyp-Stamm ohnehin nur äußerst schwach. Entsprechend kommen nur wenige Moleküle (< 10) der Lipoyl-Protein-Ligase A in einer Zelle vor (Green et al., 1995, Biochem. J. 309 : 853-862). Es ist daher umso erstaunli- cher, dass nun eine Verringerung oder vollständige Ausschal- tung der Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität die Exkretion von R-a-Liponsäure zur Folge hat.

Die Ausscheidung freier R-a-Liponsäure aus den Zellen erlaubt eine einfache Isolierung des Produkts aus dem Kulturmedium nach Abtrennung der Biomasse, ohne dass die Zellen zuvor auf- gebrochen werden müssen bzw. ohne dass die R-a-Liponsäure durch einen aufwendigen und verlustreichen Hydrolyseschritt vom daran gebundenen Trägerprotein (ACP oder die E2-Unterein- heit der a-Ketosäure-Dehydrogenasen) abgespalten werden muss.

Unter der vom lplA-Gen codierten Lipoyl-Protein-Ligase A- Aktivität ist diejenige Lipoyl-Protein-Ligase-Aktivität einer Zelle zu verstehen, welche eine deutliche Substratpräferenz für freie R-a-Liponsäure im Vergleich zu R-a-Lipoyl-ACP auf- weist. Das LplA-Protein hat mit freier R-a-Liponsäure etwa ei- ne 100-fach höhere Aktivität, als mit R-a-Lipoyl-ACP. Damit unterscheidet sich die Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität einer Zelle eindeutig von der Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität, welche R-a-Lipoyl-ACP gegenüber freier R-a-Liponsäure. als Sub- strat bevorzugt (s. Fig. 1 und 2).

Vorzugsweise handelt es sich bei dem Lipoyl-Protein-Ligase A- Gen um ein Gen mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 oder um eine funk- tionelle Variante dieses Gens.

Unter einer funktionellen Variante ist im Sinne der vorliegen- den Erfindung eine DNA-Sequenz zu verstehen, die sich durch Deletion, Insertion oder Substitution von Nukleotiden aus der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Sequenz ableitet, wobei die en- zymatische Aktivität und Spezifität der durch das Gen codier- ten Lipoyl-Protein-Ligase A erhalten bleibt.

Das Lipoyl-Protein-Ligase A-Gen codiert für ein Protein umfas- send die Sequenz ID NO : 2 oder funktionelle Varianten mit ei- ner Sequenzhomologie zu SEQ ID NO : 2 größer 35 %.

Vorzugsweise ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO : 2 größer 60 %, besonders bevorzugt ist die Sequenzhomologie zu SEQ ID NO : 2 größer 80 %.

In der vorliegenden Erfindung beziehen sich alle erwähnten Ho- mologiewerte auf Ergebnisse, die mit dem Algorithmus GAP (GCG Wisconsin Package, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wis- consin) erhalten werden.

Dem Fachmann sind zur Abschwächung einer Enzymaktivität in ei- ner Zelle eine Reihe von Möglichkeiten bekannt. Eine Abschwä-

chung kann beispielsweise durch Verminderung der Expression des entsprechenden Gens erzielt werden oder durch Austausch des chromosomalen Wildtyp-Gens gegen ein mutiertes Allel, das für ein Enzym mit einer verminderten Aktivität codiert. Im Ex- tremfall kann die Enzymaktivität auch völlig ausgeschaltet werden.

Die Expression eines Gens kann zum Beispiel durch folgende Maßnahmen verringert oder verhindert werden : - Abschwächung des Promotors durch geeignete Basensubstitutio- nen - Inaktivierung/Veränderung eines für die Expression nötigen Transkriptionsaktivators - Abschwächung von Translationsstartsignalen (z. B. Ribosomen- bindestelle, Startcodon) durch geeignete Basensubstitutionen - Entfernung von mRNA-stabilisierenden Regionen des Gens - Überexpression von für spezifische Antisense-RNA codierenden DNA-Bereichen - Deletion des gesamten Gens oder zumindest eines wichtigen Teils davon - Zerstörung des Gens durch Insertion von beispielsweise einer Antibiotikumsresistenzkassette Mutierte Allele eines Gens, die für ein Enzym mit einer ver- minderten Aktivität codieren, können beispielsweise durch fol- gende Maßnahmen erzeugt werden : - Einführung von Leserasterverschiebungen in das entsprechende Gen aufgrund von Nukleotid-Deletionen oder-Insertionen - Einführung spezifischer Basensubstitutionen im Gen, welche den Austausch von konservierten oder von für die Aktivität essentiellen Aminosäuren zur Folge haben Mutierte Allele des lplA-Gens können mit Standardmethoden der Molekularbiologie erzeugt werden. Eine bevorzugte Möglichkeit dafür besteht in der Einführung spezifischer Basensubstitutio- nen in das Gen. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass während der Amplifikation des lplA-Gens mittels der Poly- merase-Kettenreaktion (PCR) durch Verwendung von speziellen

mutagenen Primern die Basensequenz des Gens oder seines Promo- tors an einer oder mehreren Positionen spezifisch verändert werden (ortspezifische Mutagenese).

Besonders bevorzugt ist die Einführung einer Deletion in das lplA-Gen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass das Gen nach der Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von spezifischen Primern, die das komplette lplA-Gen erfassen, zunächst in ei- nen Plasmid-Vektor (z. B. pUC18, pBR322, pACYC184) kloniert wird. Durch Restriktion des so erhaltenen Plasmids mit geeig- neten Restriktionsendonukleasen, die nur im Bereich des lplA- Gens schneiden, können interne Regionen des Gens entfernt wer- den. Auf diese Weise kann nach Religation des restringierten Plasmids eine interne Deletion in das lplA-Gen eingeführt wer- den. Alternativ zur Religation des im lplA-Gen restringierten Plasmids kann auch eine Antibiotikumsresistenzkassette in das lplA-Gen kloniert werden.

Methoden zum Austausch einer beliebigen chromosomalen DNA- Sequenz gegen eine zwar homologe, aber durch Baseninsertionen, -deletionen oder-substitutionen veränderte Sequenz sind dem Fachmann bekannt. So kann in Escherichia coli beispielsweise das von Link et al. (1997, J. Bacteriol. 179 : 6228-6237) be- schriebene System verwendet werden, um mittels integrativer Plasmide über den Mechanismus der homologen Rekombination die chromosomale Wildtyp-Sequenz des lplA-Gens gegen ein mutiertes lplA-Allel auszutauschen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfin- dung werden Zellen eingesetzt, die enantiomerenreine R-a- Liponsäure in ein Kulturmedium sekretieren und eine abge- schwächte Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität aufweisen, wobei sie anstelle eines Wildtyp lplA-Gens ein lplA-Allel besitzen, das eine Basensubstitution im Bereich der Basenpaare 367-465 aufweist, welche dazu führt, dass das LplA-Protein eine um mindestens 50 % verminderte Aktivität hat, oder eine Deletion im lplA-Gen aufweisen.

Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch eine Zelle mit vorgenannten Eigenschaften.

Vorzugsweise ist die Aktivität des LplA-Proteins um 50 bis 100%, besonders bevorzugt um 75% bis 100%, vermindert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungs- gemäßen Zellen führt eine Basensubstitution in dem genannten Genbereich dazu, dass keine Aktivität des LplA-Proteins mehr nachweisbar ist.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen Zellen befindet sich auf dem Chromosom des Wirts- organismus nur noch ein durch eine interne Deletion erzeugtes Fragment des lplA-Gens, welches nicht mehr für eine funktio- nelle Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität codieren kann.

Zellen mit abgeschwächter Lipoyl-Protein-Ligase A-Aktivität lassen sich dadurch herstellen, dass in eine Ausgangszelle an- stelle des lplA-Wildtyp-Gens ein lplA-Allel codierend für ein LplA-Protein mit einer um mindestens 50 % im Vergleich zum Wildtyp-Protein verminderten Aktivität eingebracht wird.

In einer Vielzahl von pro-und eukaryontischen Zellen bzw. Or- ganismen konnten Gene, die für eine Lipoyl-Protein-Ligase A codieren, sowie Gene, die für die de novo-Synthese von R-a- Liponsäure benötigt werden (z. B. lipA, lipB), identifiziert werden. Erfindungsgemäße Zellen lassen sich somit vorzugsweise aus Zellen von pro-oder eukaryontischen Organismen herstel- len, die in der Lage sind, R-a-Liponsäure selbst zu syntheti- sieren (Ausgangszelle), die rekombinanten Verfahren zugänglich sind und die durch Fermentation kultivierbar sind. Auch pflanzliche oder tierische Zellen, die in Zellkultur züchtbar sind, sind somit zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen ge- eignet.

Zur Herstellung erfindungsgemäßer Zellen können Ausgangszellen verwendet werden, die bisher noch keinerlei Manipulation un- terzogen wurden.

Des weiteren ist es jedoch möglich, die erfindungsgemäßen Zel- len auch mit Maßnahmen zu kombinieren, die bereits zu einer verbesserten Produktion von R-a-Liponsäure führen. So sind beispielsweise solche Zellen besonders geeignet, die durch ei- ne im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Expression des lipA- Gens bereits eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Liponsäure- Synthase-Aktiviät aufweisen und/oder durch eine im Vergleich zum Wildtyp verstärkte Expression des lipB-Gens bereits über eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B- Aktivität verfügen. Die Herstellung von Zellen mit einer im Vergleich zum Wildtyp verstärkten Liponsäure-Synthase- Aktivität und/oder einer im Vergleich zum Wildtyp verstärkten Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktiviät sind in den Patentanmeldungen DE 10235270 und DE 10245993 beschrieben.

Die Erfindung betrifft somit insbesondere auch Zellen, die zu- sätzlich zur um mindestens 50 % verminderten oder fehlenden Aktivität des LplA-Proteins durch eine verstärkte Expression des lipA-Gens über eine erhöhte Liponsäure-Synthase-Aktivität oder durch eine verstärkte Expression des lipB-Gens bereits über eine erhöhte Lipoyl-Protein-Ligase B-Aktivität verfügen.

Bevorzugt handelt es sich bei den Zellen um Mikroorganismen, wie zum Beispiel Hefe-oder Bakterienstämme. Besonders bevor- zugt handelt es sich um Bakterienstämme aus der Familie der Enterobacteriaceae, ganz besonders bevorzugt um Stämme der Art Escherichia coli.

Die Gewinnung von R-a-Liponsäure aus dem Kulturmedium kann nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie beispielsweise Zentrifugation des zellhaltigen Kulturmediums zur Abtrennung der Zellen und durch anschließende Extraktion und/oder Präzi- pitation des Produkts, erfolgen.

Die Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen zur Produktion von R-a-Liponsäure erfolgt vorzugsweise in einem aus der Lite- ratur bekannten Minimalsalzmedium (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol. 18A, 269-272).

Als Kohlenstoffquelle können prinzipiell alle verwertbaren Zu- cker, Zuckeralkohole oder organische Säuren bzw. deren Salze verwendet werden. Dabei werden bevorzugt Asparaginsäure, Ap- felsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Fumarsäure, Glu- taminsäure, Glucose, Glycerin oder Oxalessigsäure eingesetzt.

Besonders bevorzugt sind Bernsteinsäure und Oxalessigsäure.

Auch ist eine kombinierte Fütterung mehrerer verschiedener Kohlenstoffquellen möglich. Des weiteren können kurzkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von C2-C8, bevorzugt mit ei- ner Kettenlänge von C6-C8 (Hexan-bzw. Oktansäure), als spezi- fische Vorstufen für die a-Liponsäure-Synthese dem Medium zugesetzt werden. Dabei beträgt die Konzentration der zuge- setzten Kohlenstoffquelle vorzugsweise 0,1-30 g/l.

Die Inkubation der erfindungsgemäßen Zellen erfolgt vorzugs- weise unter aeroben Kultivierungsbedingungen über einen Zeit- raum von 16-150 h und im Bereich der für die jeweiligen Zellen optimalen Wachtumstemperatur.

Als optimaler Temperaturbereich werden 15-55 °C bevorzugt.

Besonders bevorzugt ist eine Temperatur zwischen 30 und 37 °C.

Der Nachweis und die Quantifizierung der im erfindungsgemäßen Verfahren produzierten R-a-Liponsäure erfolgt beispielsweise mittels eines Bioassays unter Verwendung eines liponsäure- auxotrophen Indikatorstammes (lipA-Mutante). Diese Art der turbidimetrischen Quantifizierung von R-a-Liponsäure ist aus der Literatur bekannt (Herbert und Guest, 1970, Meth. Enzymol.

18A, 269-272). Der im Rahmen der vorliegenden Erfindung ver- wendete Indikatorstamm W14851ip2 (ATCC 25645) würde allerdings auch ohne supplementierte R-a-Liponsäure wachsen, wenn das Me- dium neben Glucose auch noch Acetat und Succinat enthält. Um ein falschpositives Wachstum des Indikatorstammes im Bioassay bei der Bestimmung der produzierten R-a-Liponsäure zu vermei-

den-beispielsweise verursacht durch einen Eintrag von Gluco- se und den vom Produktionsstamm zusätzlich zur R-a-Liponsäure ausgeschiedenen Säuren Acetat und Succinat-erfolgt bereits die Anzucht des R-a-Liponsäure-Produzenten bevorzugt mit Suc- cinat als einziger Kohlenstoffquelle. Dieser Stamm wird mit dem Kulturüberstand einer erfindungsgemäßen Zellanzucht supplementiert ; anhand des Wachstums des Indikatorstammes kann dann der Liponsäure-Gehalt im Kulturmedium bestimmt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Der Bakterienstamm Escherichia coli W3110A1plA, der für die Ausführung der Beispiele verwendet wurde, wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultu- ren GmbH, D-38142 Braunschweig) unter der Nummer DSM 15299 ge- mäß Budapester Vertrag hinterlegt. Die Plasmide pKP477 und pBAD-lipB sind in der Patentanmeldung DE 10245993 beschrieben.

Beispiel 1 : Konstruktion einer chromosomalen Mutation im lplA- Gen des Wirtsorganismus A) Amplifikation des lplA-Gens Das lplA-Gen aus E. coli wurde mittels der Polymerase-Ketten- reaktion (PCR) unter Verwendung der Pwo-DNA-Polymerase nach gängiger, dem Fachmann bekannter Praxis amplifiziert. Als Mat- rize diente die chromosomale DNA des E. coli-Wildtypstammes W3110 (ATCC 27325). Als Primer wurden die 3'-phosphorothioat- geschützten Oligonukleotide lplA-fwd und lplA-rev mit folgen- den Sequenzen verwendet : lplA-fwd : (SEQ ID NO : 3) 5'-CGG GAT CCC TAT CTG CGC CTG ACA CTC GAC-3' BamHI lplA-rev : (SEQ ID NO : 4) 5'-CGG GAT CCT TTA TCT GAA CCG CCA TTT GCG CTG-3' BamHI Das bei der PCR erhaltene DNA-Fragment mit einer Länge von ca.

1,6 kb wurde anschließend mittels eines DNA-Adsorptions-

säulchens des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen, Hilden) nach Herstellerangaben gereinigt.

B) Konstruktion des Plasmids pK03-AlplA In das PCR-Fragment wurden über die Primer-Sequenzen Schnitt- stellen für die Restriktionsendonuklease BamHI (Erkennungsse- quenz in den Oligonukleotiden unterstrichen) eingeführt. Das gereinigte PCR-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease BamHI unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen ge- schnitten, anschließend über ein Agarosegel aufgetrennt und dann mittels des GENECLEAN Kits (BIO 101 Inc., La Jolla, Kali- fornien, USA) nach Herstellerangaben aus dem Agarosegel iso- liert.

Zur Klonierung des lplA-Gens wurde der Vektor pUC18 (Amersham Biosciences GmbH, Freiburg, Deutschland) mit dem Restriktions- enzym BamHI unter den vom Hersteller angegebenen Bedingungen geschnitten, anschließend durch Behandlung mit Alkalischer Phosphatase an den 5'-Enden dephosphoryliert und dann wie das PCR-Fragment mittels der GENECLEAN-Methode gereinigt.

Die Ligation des PCR-Fragments mit dem geschnittenen und dephosphorylierten Vektor erfolgte nach Herstellerangaben un- ter Verwendung der T4-DNA-Ligase. Die Transformation von E. coli-Zellen des Stammes DH5a mit dem Ligationsansatz wurde mittels Elektroporation in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise durchgeführt. Der Transformationsansatz wurde auf LB-Ampicillin-Agarplatten (10 g/1 Trypton, 5 g/1 Hefeextrakt, 10 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar, 100 mg/1 Ampicillin) ausgebracht und über Nacht bei 37 °C inkubiert.

Die gewünschten Transformanden wurden nach einer Plasmidiso- lierung mittels eines QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hil- den) durch eine Restriktionsanalyse identifiziert.

Das auf diese Weise erhaltene Plasmid trägt die Bezeichnung pUCl8-lplA.

Um nun eine interne Deletion in das lplA-Gen einzuführen, wur- de der Vektor pUCl8-lplA mit den Restriktionsenzymen NruI und StuI, die jeweils einmal innerhalb des lplA-Gens schneiden, verdaut und der Vektor wie oben beschrieben mittels T4-DNA-

Ligase religiert, anschließend transformiert und überprüft.

Dadurch wurde ein zentraler Bereich des lplA-Gens um 197 Ba- senpaare deletiert und gleichzeitig eine Leserasterverschie- bung eingeführt, wodurch das Gen inaktiviert wurde. Das resultierende Plasmid pUC18-AlplA, das nun den verkürzten Le- serahmen"AlplA"enthält, wurde mit dem Enzym BamHI geschnit- ten und das 1,4 kb DNA-Fragment, welches das AlplA-Genfragment beinhaltet, wurde in den ebenfalls mit BamHI geschnittenen Vektor pK03 (Link et al., 1997, J. Bacteriol. 179 : 6228-6237) kloniert. Das auf diese Weise erhaltene Plasmid trägt die Be- zeichnung pK03-AlplA.

C) Austausch des chromosomalen lplA-Wildtyp-Gens gegen das de- letierte lplA-Allel aus pK03-AlplA Das Plasmid pK03-AlplA wurde wie oben beschrieben mittels Transformation in den Stamm W3110 eingebracht, wobei plas- midtragende Klone über die dadurch erworbene Chloramphenicol- Resistenz (20 mg/1 Chloramphenicol) selektiert werden konnten.

Der Austausch des chromosomalen lplA-Wildtyp-Gens gegen das deletierte AlplA-Allel aus pK03-AlplA erfolgte mittels homolo- ger Rekombination entsprechend der Prozedur von Link et al.

(1997, J. Bacteriol. 179 : 6228-6237), wobei durch Ausplattie- ren der Zellen auf LB-Saccharose-Agarplatten gleichzeitig auf Auflösung der Cointegrate sowie auf Verlust des Plasmids, wel- ches nun das lplA-Wildtyp-Gen enthielt, selektiert werden konnte. Saccharose-resistente Einzelkolonien wurden mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide lplA-fwd (SEQ ID NO : 3) und lplA-rev (SEQ ID NO : 4) überprüft, ob der chromosomale Austausch des lplA-Wildtyp-Gens gegen die deletierte Variante AlplA erfolgreich war. Der auf diese Weise erzeugte Stamm trägt die Bezeichnung W3110A1plA.

Beispiel 2 : Herstellung von R-a-Liponsäure-Produzenten Das lipB-Überexpressionsplasmid pBAD-lipB wurde mittels Elektroporation in die E. coli-Stämme W3110A1p1A und W3110 transformiert und nach Selektion auf LB-Agarplatten mit 100 mg/1 Ampicillin wurde das Plasmid aus jeweils einer der Trans- formanden reisoliert, mit Restriktionsendonukleasen gespalten

und überprüft. Mit dem Kontrollplasmid pKP477, das neben dem Ampicillin-Resistenzgen nur die Regulationssequenzen des Ara- binose-Operons von E. coli (araC-Gen, araBAD-Promotorregion) enthält, wurde in analoger Weise verfahren.

Beispiel 3 : Fermentative Produktion von R-a-Liponsäure Für die fermentative Produktion von R-a-Liponsäure wurden die in Beispiel 2 genannten Stämme sowohl mit als auch ohne Plas- mid verwendet. Als Vorkultur für die Produktionsanzucht wurden zunächst 5 ml LB-Flüssigmedium, das 100 mg/1 Ampicillin ent- hielt, mit dem jeweiligen Stamm beimpft und für 16 h bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und zweimal mit dem entsprechenden Volumen steriler Saline (0,9 % NaCl) gewaschen.

Mit den auf diese Weise vorbereiteten Zellen wurden schließ- lich 15 ml BS-Medium (7 g/1 K2HPO4 ; 3 g/l KH2PO4 ; 1 g/l (NH4) 2S04 ; 0, 1 g/1 MgS04 x 7 H20 ; 0,5 g/1 Na3Citrat x 3 H20 ; 0, 2% säurehydrolysiertes Casein (vitaminfrei) ; 13,5 g/1 Na2Succinat x 6 H20 ; pH 6,8 mit HCl eingestellt), das außerdem 100 mg/1 Ampicillin enthielt, im Verhältnis 1 : 100 angeimpft.

Die Inkubation der Produktionskulturen erfolgte bei 37 °C und 160 rpm auf einem Schüttler. Die Expression des Lipoyl- Protein-Ligase B-Gens auf dem Plasmid pBAD-lipB wurde durch Zugabe von 0,2 g/1 L-Arabinose nach ca. 4 h Inkubation indu- ziert. Nach 24 h Inkubation wurden Proben entnommen und die Zellen durch Zentrifugation vom Kulturmedium abgetrennt. Die darin enthaltene R-a-Liponsäure wurde mittels des bekannten turbidimetrischen Bioassays (Herbert und Guest, 1970, Meth.

Enzymol. 18A : 269-272) quantifiziert. Tabelle 1 zeigt die er- zielten Gehalte freier R-a-Liponsäure im jeweiligen Kultur- überstand nach 24 h Inkubation : Tabelle 1 : Stamm R-a-Liponsäure [pg/l] W3110 0 W311OAlplA 25 W3110 pKP477 0 W3110#1p1A pKP477 27 W3110 pBAD-lipB 25 W311OAlplA pBAD-lipB 191 PCT Co10227 Original (für EINREICHUNG)-gedruckt am 13. 11. 2003 12 : 31 : 59 PM 0-1 Formular-PCT/RO/134 (EASY) Angaben zu einem hinterlegten Mikroorganismus und/oder anderem hinterlegten biologischen Material 0-1-1 erstellt durch Benutzung von PCT-EASY Version 2. 92 (aktualisiert 01. 07. 2003) 0-2 Internationales Aktenzeichen. 0-3 Aktenzeichen des Anmelders oder CO 10227 Anwalts 1 Die nachstehenden Angaben betreffen den Mikroorganismus und/oder anderes biologisches Material, der/das in der Beschreibung genannt ist 1-1 Seite 13 1-2 Zeile 7-11 1-3 Angaben betr. Hinterlegung 1-3-1 Name der Hinterlegungsstelle DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 1-3-2 AnschriftderHinterlegungsstelle Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Germany 1-3-3 Datum der Hinterlegung 15 November 2002 (15. 11. 2002) 1-3-4 Eingangsnummer DSMZ 15299 1-4 Weitere Angaben KEINE 1-5 Bestimmungsstaaten, für die alle Bestimmungsstaaten besondere Angaben gemacht werden 1-6 Gesondert eingereichte Angaben KEINE Diese Angaben werden dem Internationalen Büro später übermittelt VOM ANMELDEAMT AUSZUFÜLLEN 0-4 Dieses Formular ist mit der internationalen Anmeldung eingegangen (j der nein) V 0-4-1 Bevollmächtigter Bediensteter VOM INTERNATIONALEN BÜRO AUSZUFÜLLEN 0-5 Dieses Formular ist an folgendem Datum beim internationalen Büro eingegangen 0-5-1 Bevollmächtigter Bediensteter