Изобретение относится к магниевому комплексу пептида НАЕЕ, который описывается формулой [Mg(HAEE)] _m X _n , где Mg представляет собой двухзарядный катион магния (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, ш = 3 для трехзарядных анионов, НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, X - фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, п = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов. Настоящее изобретение также относится к способу получения магниевого комплекса пептида НАЕЕ, к фармацевтическим композициям на его основе и применению магниевого комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Нейродегенеративные заболевания имеют ряд общих факторов развития и целый ряд других обобщающих механизмов (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modem conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhumal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;l 17(6-2):3-10. (In Russ.), doi: 10.17116/jnevro2017117623-10), что может связывать болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, нейродегенерацию при рассеянном склерозе (PC), болезнь Паркинсона, а также болезнь Альцгеймера в условиях активации системного воспаления (Williams-Gray С.Н., Wijeyekoon R., Yamall A.J. et al. ICICLE-PD study group. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson’s disease cohort (ICICLE- PD). Movement Disorders. 2016;31(7):995-1003. https.7/doi.org/10.1002/mds.26563).

Воспаление относится к типовым патологическим процессам организма человека. Типовой патологический процесс проявляется определенным набором характерных признаков. В настоящее время считается, что нейродегенеративный процесс является вторичным по отношению к воспалительному (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis-associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modem conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhumal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi:

10.17116/jnevro2017117623-10).

Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространённых нейродегенеративных заболеваний среди людей пожилого возраста и характеризуется нейритными бляшками, основным компонентом которых является пептид бета-амилоид (АР). N-концевая область 1-16 бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Си) присоединяются к пептиду А (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamical properties of Cull amyloid- l 6/28 complexes associated with Alzheimer’s disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11(8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-l). Снижение уровня ионов цинка в крови за счет связывания ионов цинка специфическими хелатирующими агентами и/или блокирование взаимодействий пептида Ар с ионами цинка может предотвратить патологии, связанные с этими взаимодействиями (Ayton S., Lei Р., Bush A. Biometals and Their Therapeutic Implications in Alzheimer’s Disease. Neurotherapeutics. 2015. 12(1): p. 109-120). Высокие концентрации цинка вызывают преципитацию пептида Ар и влияют на образование в специфических отделах мозга (гиппокамп, кортекс, таламические ядра) внеклеточных агрегатов АР (амилоидных бляшек), которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера ((Frederickson C.J., Bush A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals, 14(3), 353-366, doi: 10.1023/A: 1012934207456). Поэтому применение цинка и других катионов в фармацевтических препаратах, которые могут взаимодействовать с таргетными мишенями в организме и лечить нейродегенеративные заболевания, в частности болезнь Альцгеймера, является нетривиальной решением.

На сегодняшний день нет действующих эффективных препаратов, которые бы излечивали нейродегенеративные заболевания. Из научной и патентной литературы известны ряд пептидов, которые могли бы применяться при лечении таких заболеваний.

Из WO 2012/056157 и патента РФ № 2679080 известно соединение, представляющее собой Ac-HAEE-NH ₂ (далее - НАЕЕ). В аббревиатуре НАЕЕ буквы означают: Н -гистидин, А - аланин, Е - глутаминовая кислота. НАЕЕ способно ингибировать взаимодействие пептидов Ар с ионами Zn (II), вызывая уменьшение или предотвращение агрегации пептида А в присутствии ионов Zn (И) при физиологических концентрациях ионов Zn (II) 100-400 мкМ. Более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействия между НАЕЕ и 1-16 областью Ар. Было показано, что инкубация агрегатов Ар с НАЕЕ в течение минимум 1 часа при 20, 40, 80, 100 и 150 мкМ НАЕЕ приводит к дезагрегации таких агрегатов. Из патента РФ № 2679059 известно, что несмотря на ингибирование образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов, в частности ИДЕЕ, на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным и существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(II) с пептидом Ар. В качестве альтернативного средства для лечения болезни Альцгеймера было предложено использовать пептид с аминокислотной последовательностью (в стандартных однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH (где isoD обозначает изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты, a pS относится к фосфорилированному остатку серина) с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи.

Из патента РФ № 2709539 известно, что короткие заряженные пептиды типа НАЕЕ имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия. С целью преодоления этих недостатков авторы патента РФ № 2709539 разработали фармацевтическую композицию для доставки НАЕЕ через ГЭБ для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию Альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера), которая позволяет улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность НАЕЕ.

Данная композиция содержит эффективное количество субстанции в виде комплекса НАЕЕ с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме раствора для введения с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным из круга нейтральных носителей и разбавителей, например, в физиологическом растворе. Полученная фармацевтическая композиция позволяет увеличить в пять раз биодоступность субстанции в мозге, увеличить время полувыведения из организма в два раза; улучшить когнитивные функции экспериментальных животных на 20%.

Изобретение по патенту РФ № 2709539 было выбрано в качестве ближайшего аналога, поскольку только оно представляет собой единственный известный для НАЕЕ комплекс. Из патента РФ № 2709539 известно, что с человеческим альбумином (HSA) пептид НАЕЕ в присутствии ионов цинка образует специфический тройной комплекс (HAEE-Zn-HSA). При этом в отсутствии ионов цинка взаимодействий между НАЕЕ и HSA не наблюдалось. Данный комплекс характеризуется тем, что с помощью иона цинка удалось получить межмолекулярное связывание между молекулами НАЕЕ и HSA. Катион цинка является координирующим катионом между этими двумя молекулами. В твердом виде данный комплекс получен не был. Из патента РФ № 2709539 известно, что фармацевтическая композиция HAEE-Zn- HSA является стабильной в подходящей водной буферной системе, в диапазоне значений pH от 4 до 8, в присутствии или в отсутствии различных солей.

Известно, что заряд альбумина в нейтральной среде равен -1, в щелочной среде равен -2, а в слабокислой среде равен 0 (изоэлектрическое состояние) и альбумин выпадает в осадок (Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. А.И. Глухова, Е.С. Северина. ГЭОТАР-Медиа, Москва. 2019. С.19), поэтому данный комплекс не должен существовать в слабокислой среде при pH 4-5,5.

Из патента РФ № 2709539 известно, что для приготовления фармацевтической композиции HAEE-Zn-HSA, пригодной для проведения доклинических исследований, 5 мг НАЕЕ, 600 мг человеческого альбумина и 0,5 мг хлорида цинка (ZnCb) растворяли в 20 миллилитрах физиологического раствора. В качестве источника НАЕЕ использовался лиофилизированный препарат синтетического пептида НАЕЕ (чистота более 98%). При известной молекулярной массе НАЕЕ равной 525,52 г/моль соотношение компонентов в комплексе HAEE-Zn-HSA составляет примерно НАЕЕ : Zn : HSA ~ 1 : 2,6 : 1 по молям.

Недостатком данного изобретения является высокое содержание человеческого альбумина, которое превышает в 120 раз по массе содержание активного вещества НАЕЕ, а также высокое содержание цинка, которое в 2,6 раза превышает по массе содержание активного вещества НАЕЕ и может привести к образованию комплекса с нестехиометрическим соотношением входящих в него компонентов. Цинк является значительно более токсичным элементом, по сравнению с другими микроэлементами, например с магнием, который принимает участие в энергетическом и электролитном обмене, выступает в качестве регулятора клеточного роста, необходим на всех этапах синтеза белковых молекул.

Высокие концентрации человеческого альбумина могут оказывать различные негативные эффекты на организм как экспериментальных животных, так и человека (Gales

B.J., Erstad B.L. (1993). Adverse reactions to human serum albumin. Annals of Pharmacotherapy, 27(1), 87-94, doi: 10.1177/106002809302700119; Kremer H., Baron-Menguy

C., Tesse A. et al. (2011). Human serum albumin improves endothelial dysfunction and survival during experimental endotoxemia: concentration-dependent properties. Critical care medicine, 39(6), 1414-1422, doi: 10.1097/CCM.0b013e31821 lff6e). Некоторые образцы HSA, в отличие от бычьего сывороточного альбумина (BSA), при культивировании мышиных эмбрионов не доводили их до стадии бластоцисты (Leveille М.С., Carnegie J., Tanphaichitr N. (1992). Effects of human sera and human serum albumin on mouse embryo culture. Journal of assisted reproduction and genetics, 9(1), 45-52, doi: 10.1007/BF01204114). HSA может вызывать иммунный ответ у мышей после его введения (Favoretto В. С., Ricardi R., Silva, S.R. et al. (2011). Immunomodulatory effects of crotoxin isolated from Crotalus durissus terrificus venom in mice immunised with human serum albumin. Toxicon, 57(4), 600-607, doi: 10.1016/j.toxicon.2010.12.023).

Известно, что HSA может быть использован для улучшения когнитивных функций при лечении болезни Альцгеймера, однако только при интрацеребровентрикулярном (внутричерепном) введении. Введение HSA в плазму крови может снижать его эффективность (Ezra, A., Rabinovich-Nikitin, I., Rabinovich-Toidman, Р., & Solomon, В. (2016). Multifunctional effect of human serum albumin reduces Alzheimer’s disease related pathologies in the 3xTg mouse model. Journal of Alzheimer's Disease, 50(1), 175-188, doi: 10.3233/J AD-150694).

Поэтому уменьшение количества человеческого альбумина или возможность полностью отказаться от него в лекарственном препарате, замена сложного и травмоопасного интрацеребровентрикулярного введения на внутривенное, при одновременном усилении терапевтического эффекта является важной медицинской задачей при лечении нейродегенеративных заболеваний.

Ранее НАЕЕ и комплекс HAEE-Zn-HSA не характеризовались в твердой фазе и их свойства в твердой фазе неизвестны.

Таким образом, задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в получении эффективного средства для лечения нейродегенеративных заболеваний в виде неизвестного ранее магниевого комплекса пептида НАЕЕ, в том числе в твердой форме, разработке фармацевтических композиций на его основе и его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний.

В соответствии с настоящим изобретением рпскрывается магниевый комплекс пептида НАЕЕ, который описывается формулой [Mg(HAEE)] _m X _n , где Mg представляет собой двухзарядный катион магния (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 2 для трехзарядных анионов, НАЕЕ представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по С-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, X - фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, п = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов.

В описываемом комплексе мольное содержание катиона магния (II) и пептида НАЕЕ является эквимолярным (1:1). Таким образом, если X является однозарядным анионом, то заявляемый магниевый комплекс пептида НАЕЕ описывается формулой [Mg(HAEE)]X2. Если X является двухзарядным анионом, то заявляемый магниевый комплекс пептида НАЕЕ описывается формулой [Mg(HAEE)]X. Если X является трёхзарядным анионом, то заявляемый магниевый комплекс пептида НАЕЕ описывается формулой [Mg(HAEE)]sX2.

Взаимодействие пептида НАЕЕ с ионом магния наблюдалось и при других молярных соотношениях НАЕЕ : Mg, а именно, в диапазоне от 1:0,1 до 1:10, что связано с наличием множества донорно-акцепторных центров (азот, кислород) в молекуле НАЕЕ и взаимодействие между НАЕЕ и Mg может быть нестехиометрическим. Использование более высокого содержания магния (>1:10) приводили к получению в твердой форме смеси из магниевого комплекса пептида НАЕЕ и соответствующей соли магния, при использование малого количества магния (<1:0,1) его взаимодействие с пептидом НАЕЕ не фиксировали физико-химическими методами.

В настоящем изобретении было обнаружено, что для усиления терапевтического действия пептида НАЕЕ для лечения нейроденегеративных заболеваний, в частности опосредованно вызываемых воспалительными причинами, нет необходимости использования цинка и человеческого альбумина. Для улучшения когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний, достаточным является использование только пептида НАЕЕ и магния в одном комплексе без необходимости использования высоких количеств человеческого альбумина. Также, если использование HAEE-Zn-HSA улучшает фармакокинетические параметры пептида НАЕЕ, то в настоящем изобретении использование магниевого комплекса пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний изменяет механизм действия пептида НАЕЕ, связанный с конформационной структурой пептида НАЕЕ, что приводит к неожиданно высокому терапевтическому эффекту.

Это подтверждается экспериментальным введением нативного пептида НАЕЕ и полученного по данному изобретению магниевого комплекса пептида НАЕЕ в организм экспериментальных животных. Было обнаружено, что 3D -структура нативного пептида НАЕЕ, который в виде водного раствора был помещён на 2 минуты в плазму крови мышей дикого типа, отличается от 3 D-структуры нативного НАЕЕ в исходном водном растворе, что подтверждается методом ВЭЖХ по изменению времени выхода с хроматографической колонки пробы НАЕЕ, экстрагированной из плазмы крови, относительно времени выхода пробы НАЕЕ, экстрагированной из исходного водного раствора. В то же время 3 D-структура магниевого комплекса пептида НАЕЕ оставалась неизменной в аналогичных экспериментальных условиях (то есть после экстрагирования из исходного водного раствора магниевого комплекса пептида НАЕЕ и после экстрагирования данного комплекса из плазмы крови мышей дикого типа после 2-х минутной экспозиции) и соответствовала 3 D-структуре нативного пептида НАЕЕ, экстрагированного из исходного водного раствора. По данным масс-спектрометрии химическая структура пептида НАЕЕ во всех экспериментальных пробах сохранялась неизменной как для нативного пептида, так и для пептида в составе магниевого комплекса. Изменение времени выхода нативного пептида НАЕЕ или магниевого комплекса пептида НАЕЕ с хроматографической колонки связано в основном с различиями в гидрофобных взаимодействиях пептида НАЕЕ с материалом колонки, а эти взаимодействия в свою очередь определяются превалирующей 3 D-структурой пептида НАЕЕ в конкретной пробе. Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что 3 D-структура пептида НАЕЕ, которая соответствует «развёрнутой» конформации пептида и является превалирующей для нативного пептида НАЕЕ в исходном водном растворе, соответствует 3 D-структуре магниевого комплекса пептида НАЕЕ в водном растворе и остаётся неизменной в случае экспозиции магниевого комплекса пептида НАЕЕ в плазме крови, в то время как нативный пептид НАЕЕ в плазме крови утрачивает «развёрнутую» конформацию.

В данном случае термин 3 D-структура используется как синоним пространственной структуры или взаимного расположения атомов в молекуле НАЕЕ в трехмерном пространстве. Метод ВЭЖХ основан на преимущественно межмолекулярных взаимодействиях на границе раздела фаз. Изменение времени выхода НАЕЕ с хроматографической колонки отражает изменение межмолекулярных взаимодействий НАЕЕ с сорбентом, что является следствием различий пространственной структуры молекул НАЕЕ в нативном состоянии и в виде магниевого комплекса.

Известно, что нарушение 3 D-структуры олигопептидов может приводить к снижению их функций и уменьшению терапевтического действия (Sikora, К., Jaskiewicz, М., Neubauer, D., Migon, D., & Kamysz, W. (2020). The role of counter-ions in peptides — an overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442.). Ранее было показано, что для оптимального взаимодействия с партнёрами белковой природы пептид НАЕЕ должен находиться в «развёрнутой» конформации (Barykin Е. Р., Garifulina A. I., Tolstova А. Р., Anashkina А. А., Adzhubei A. A., Mezentsev Y. V., Shelukhina I. V., Kozin S. A., Tsetlin V. I., Makarov A. A. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects a402 nAChR from Inhibition by Ap // International journal of molecular sciences. - 2020. - T. 21, № 17. - C. 6272; Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram SI, Adzhubei AA, Tolstova AP, Talibov OB, Dadayan AK, Myasoyedov NF, Makarov AA, Kozin SA. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRa4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jun 18;11(6):909). В нативном пептиде НАЕЕ имидазольная группа аминокислотного остатка гистидина может образовывать стабильные полярные связи с карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков глутаминовой кислоты, что не способствует поддержанию биологически значимой «развёрнутой» конформации данного пептида и, как следствие, снижает полезные терапевтические эффекты НАЕЕ.

Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является повышение терапевтической эффективности магниевого комплекса пептида НАЕЕ вследствие сохранения 3 D-структуры данного комплекса в «развернутой» конформации.

Также было обнаружено, что введение в плазму крови мышей комплекса HAEE-Zn- HSA, полученного по описанному в патенте РФ № 2709539 способу, приводит к их стрессу, изменению внешнего вида и даже гибели, что может быть связано с высокой массовой концентрацией HSA в этом комплексе. Напротив, введение в плазму крови здоровых мышей магниевого комплекса пептида НАЕЕ не приводило к каким-либо нарушениям в поведении и в физическом состоянии животных по сравнению с животными контрольной группы, которым вводился физиологический раствор, что указывает на отсутствие побочных эффектов магниевого комплекса пептида НАЕЕ и является дополнительным преимуществом настоящего изобретения.

Таким образом, отличием настоящего изобретения от ближайшего аналога, патента РФ № 2709539, состоит в том, что заявляемый магниевый комплекс не содержит HSA и цинка, который имеет сниженную молярную концентрацию ионов по сравнению с комплексом HAEE-Zn-HSA с 2,6, как описано в примере патента РФ № 2709539, до 1 (эквимолярное количество), как описано в настоящем изобретении.

Изобретение также имеет отношение к применению магниевого комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также патологий, сопровождающихся нейровоспалительными процессами. Заявляемый магниевый комплекс может эффективно влиять на нейродегенеративные заболевания, в частности, вызванные воспалительными причинами, восстанавливая нарушенные когнитивные функции.

Магниевый комплекс может быть использован как в твердой, так и в жидкой форме, сохраняя свою стабильность в течение по меньшей мере 2 лет.

Техническим результатом изобретения является:

- возможность использования заявляемого магниевого комплекса при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванных опосредованно воспалительными причинами, которое приводит к эффективному восстановлению когнитивных функций;

- повышенная стабильность заявляемого магниевого комплекса по сравнению с

НАЕЕ; - устойчивость «развернутой» конформации 3 D-структуры заявляемого магниевого комплекса в плазме крови по сравнению с НАЕЕ;

- отсутствие побочных эффектов у заявляемого магниевого комплекса по сравнению с HAEE-Zn-HSA.

Заявляемый в настоящем изобретении магниевый комплекс в соответствии с используемым способом получения может быть получен в аморфной форме, что подтверждается рентгенофазовым анализом (Фиг. 1).

Сравнение данных рентгенофазового анализа комплекса HAEE-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE ~ 120 на дифрактограмме будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ будет представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на дифрактограмме.

Магниевый комплекс характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с термогравиометрией (ТГ) (ДСК-ТГА). Молекула НАЕЕ на ДСК- кривой характеризуется: широким пиком с началом при 62 °C и максимумом при 89 °C; двойным пиком плавления при температуре 203 и 227,5 °C с началом при 188 °C (Фиг. 2). Погрешность при многократном измерении оценивается в ± 3 °C. Заявляемый магниевый комплекс на ДСК-кривой характеризуется двумя максимумами: первый широкий эндотермический максимум начинается от 62 °C и имеет максимум при 120 °C; второй эндотермический максимум имеет температуру плавления при 267 °C (Фиг. 3).

ДСК-кривые показывают, что термическое поведение магниевого комплекса (Фиг. 3) отличается от поведения НАЕЕ (Фиг. 2), температура плавления комплекса выше по сравнению с температурой плавления НАЕЕ, что обеспечивает более высокую стабильность комплекса, что подтверждается результатами теста ускоренного хранения.

Сравнение данных ДСК-анализа комплекса HAEE-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE > 120 на ДСК-кривой будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на ДСК-кривой.

ИК-спектр с Фурье преобразованием заявляемого магниевого комплекса представлен на Фиг. 4. ИК-спектр комплекса повторяет все основные линии ИК-спектра НАЕЕ. Отличие ИК-спектра комплекса от исходного НААЕ заключается в смещении максимума при 1395 в область 1410 см’ ¹ (СНз деф.). Таким образом после образования комплекса в ИК-спектре произошли небольшие изменения колебаний связи в молекуле НАЕЕ, указывающие на слабые взаимодействие с ионом магния.

Сравнение ИК-спектра комплекса HAEE-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE > 120 на ИК-спектре будет представлен только HSA, а вещество HAEE представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на ИК- спектре.

Заявляемый магниевый комплекс может быть получен в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной (лиофильной) сушки.

Получение магниевого комплекса заключается в смешивании водных растворов НАЕЕ и водорастворимой соли магния в эквимолярных соотношениях при комнатной температуре, перемешивании в течение 10-60 мин, замораживании раствора и лиофильном высушивании.

Водорастворимые магниевые соли (до нескольких % масс.) представляют собой нитрат, ацетат, хлорид, сульфат, салицилат, лактат, глюконат, цитрат, глицинат и другие фармацевтически приемлемые соли с растворимостью около 1% масс, и более. Анионы могут быть одно-, дву- или трехзарядными. Наличие анионов разной природы в составе комплекса в жидкой или в твердой фазе не влияет на терапевтическую эффективность магниевого комплекса. Предполагается, что только внутренняя сфера магниевого комплекса проявляет терапевтическую эффективность независимо от природы аниона.

Также анионы для магниевого комплекса выбираются из группы, трифторацетата, пирувата, галактуроната, бромида, глутарата, сукцината, малеата, фумарата, бензолсульфоната, тозилата и других фармацевтически приемлемых анионов.

Использование каждого из вышеперечисленных анионов для получения магниевого комплекса в твердой фазе методом сублимационной сушки показало, что в таком комплексе может частично оставаться гидратированная или связанная вода, однако, данный комплекс не набирает дополнительную воду при хранении и стабилен в течение длительного времени.

Еще одним объектом изобретения является фармацевтические композиции с эффективным количеством магниевого комплекса и наличием вспомогательных веществ. В качестве лекарственного средства магниевый комплекс может быть использован без вспомогательных веществ в виде лиофилизированной субстанции.

Эффективное количество магниевого комплекса зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, более желательно от 5 до 50 мг.

Фармацевтическая композиция магниевого комплекса может быть в твердом виде или в виде водного раствора. Твердые композиции магниевого комплекса содержат его эффективное количество и необязательно вспомогательные вещества. Твердая фармацевтическая композиция может быть получена лиофилизацией магниевого комплекса и набором вспомогательных компонентов или добавлением вспомогательных веществ к лиофилизированному магниевому комплексу.

Лиофилизированной магниевый комплекс может быть в аморфной форме, которая соответствует дифрактограмме на Фиг. 1.

Вспомогательные вещества выбираются из фармацевтически приемлемых добавок. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.

Фармацевтическая композиция магниевого комплекса в виде водного раствора содержат эффективное количество магниевого комплекса, воду, а также набор фармацевтически приемлемых добавок и солей. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.

Еще одним объектом изобретения является применение магниевого комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний, которое заключается во введении магниевого комплекса в составе описанных фармацевтических композиций пациенту в эффективном количестве. Эффективное количество магниевого комплекса зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг.

Введение магниевого комплекса пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении магниевого комплекса в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении магниевого комплекса в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный и интраназальный.

Возможность терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний была показана на примере болезни Альцгеймера, смоделированной на трансгенных мышах линии APPswe/PSENldE9 (APP/PS1) (Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, doi: 10.1016/S 1389-0344(01)00067-3), которые проявляют характерные когнитивные признаки патологии. Данная модель может считаться моделью опосредованного воспалительного действия при нарушении когнитивных функций. В настоящем изобретении магниевый комплекс [Mg(HAEE)]C12, вводили шестикратно внутривенно в дозе 0,05 мг/кг, после чего проводили валидный тест на когнитивные способности «Закапывание шариков» (англ. Marble Burying Test) [Santana- Santana M., Bayascas J.R., Gimenez-Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), определяя количество более чем на 2/3 закопанных шариков в процентах от общего количества шариков. Чем больше количество закопанных шариков (КЗШ), тем выше когнитивные способности у мышей.

По результатам тестирования у контрольной группы мышей дикого типа, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ равнялось 50,6 ±13,3 %. Это значение принималось в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей линии APP/PS1, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ = 12,6 ±4,2 %, что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов трансгенных мышей линии APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверэкспрессии человеческого бета-амилоида, ассоциированное с нейроваоспалением и образования амилоидных бляшек, на процессы нервной деятельности. Трансгенные мыши линии APP/PS1, инъецированные препаратами НАЕЕ или магниевого комплекса, показали значения КЗШ = 20,6±7,3(%) или КЗШ = 42,7 ±9,8(%), соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что использование магниевого комплекса существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS 1 , а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для НАЕЕ.

Таким образом, заявляемый магниевый комплекс может эффективно применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванными воспалительными осложнениями, восстанавливая когнитивные функции до нормального состояния.

Гистохимический анализ области гиппокампа головного мозга экспериментальных мышей показал, что число бляшек (ЧБ) на один срез мозга у контрольной группы диких мышей равно нулю, у контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение ЧБ оказалось равным 31,7 ± 4,9, в группе получавших НАЕЕ значение ЧБ составило 24,7 ± 3,4, в группе получавших магниевый комплекс значение ЧБ составило 8,1 ± 2,8.

Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции магниевого комплекса приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность магниевого комплекса примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE. Для ближайшего аналога HAEE-Zn-BSA данный тест не проводился из-за гибели мышей в группе и нарушения их функционального состояния на ранних этапах исследования.

В качестве одного из механизмов действия магниевого комплекса на возможность лечения нейродегенеративных заболеваний может являться его связывание с бета- амилоидом. Были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия магниевого комплекса и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны коп = (1,29±0,06) х 10 ³ Поскольку значение KD < 10 ^-4 М, то такое взаимодействие является биологически значимым. В отличие от магниевого комплекса, пептид НАЕЕ не связывался с бета-амилоидом в аналогичных экспериментальных условиях.

Это различие между нативным НАЕЕ и магниевым комплексом может влиять на фармакологические свойства, что подтвердили различающиеся тесты восстановления когнитивных функций - эффективность НАЕЕ была значительно ниже эффективности заявляемого магниевого комплекса. Этот эффект можно связать с вышеупомянутыми данными ВЭЖХ-МС, которые показали изменения в 3D структуре нативного НАЕЕ после его введения в плазму крови, тогда как магниевый комплекс до и после его введения в плазму крови имеет одно и то же время удерживания на хроматограмме ВЭЖХ и, соответственно, устойчивую 3D структуру. Это означает, что ион магния в магниевом комплексе играет защитную роль для сохранения «развёрнутой» конформации пептида НАЕЕ в данном комплексе, что, возможно, также предотвращает взаимодействия магниевого комплекса с элементами плазмы крови, поскольку известно, что введение нативного НАЕЕ в периферическую кровеносную систему мышей, крыс и кроликов приводит к образованию стабильных комплексов НАЕЕ с транспортными и рецепторными белками (Zolotarev Y.A., Mitkevich V.A., Shram S.L et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRa4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood- Brain Barrier. Biomolecules. 2021. 11(6): p. 909, doi: 10.3390/bioml 1060909).

В совокупности можно сделать вывод о том, что магниевый комплекс имеет намного большую терапевтическую эффективность по сравнению с НАЕЕ и эти вещества между собой бионеэквивалентны, поскольку магниевый комплекс существует в растворе плазмы крови в «развернутой» конформации и имеет отличный от НАЕЕ механизм действия.

Описание фигур.

Фиг. 1. Дифрактограмма магниевого комплекса [Mg(HAEE)]C12-

Фиг. 2. ДСК-ТГА кривая НАЕЕ. 1 - ДСК-кривая; 2 - ТГ-кривая. Фиг. 3. ДСК-ТГА кривая магниевого комплекса [Mg(HAEE)]Cl ₂ ; 1 - ДСК-кривая; 2 - ТГ-кривая.

Фиг. 4. ИК-спектр с Фурье преобразованием НАЕЕ (1) и магниевого комплекса [Mg(HAEE)]Cl ₂ (2).

Фиг. 5. Расположение атомов в молекуле НАЕЕ для ¹ Н-ЯМР -анализа.

Фиг. 6. Фиг. 'Н-ЯМР спектр НАЕЕ.

Фиг. 7. ¹ Н-ЯМР спектр [Mg(HAEE)]Cl ₂ .

Описание приборов.

Порошковый рентгенофазовый анализ (РФА) выполнялся на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония), напряжение на трубке - 40 кВ, ток трубки - 30 мА, материал анода трубки - Си. Гониометр: 0/0 вертикального типа, образец неподвижен. Радиус гониометра - 185 мм /285 мм. Максимумы на дифрактограмме накапливались в течение 1 ч. Угол 20 составил от 3 до 70 градусов.

Исследование температуры плавления, термического поведения и потери массы выполняли методом дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрии (ДСК-ТГА) на приборе NETZSCH STA 449 С (Германия) в инертной атмосфере при скорости нагрева 10 град/мин.

Элементный анализ выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с приставкой EDXA на микроскопе TESCAN MIRA3 (Чехия). Площадь измеряемого участка 0,04 мм ² , количество измерений - 3.

Спектры инфракрасного излучения (ИК-спектры) получали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum Two (Perkin Elmer, США) с приставкой диффузного отражения в диапазоне 4000-600 см’ ¹ с разрешением 2 см’ ¹ , количество сканов - 10.

'Н-спектры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance IIIHD 500, рабочая частота 500,13 Mhz для ядер ¹ Н.

Характеризация магниевого комплекса [Mg(HAEE)]Cl ₂ в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием масс- спектрометра LTQ FT Ultra (Thermo Scientific, Германия), который сочетает в себе технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и ионной ловушки. Ионизацию электрораспылением (ESI) проводили с использованием источника Ion Max (Thermo Scientific, Германия) с металлическим капилляром для распыления. Использовались следующие параметры источника lonMax: скорость потока составляла 3 мкл/мин; температура нагретого капилляра составляла 200°С; распыляемый газ был отключен; напряжение на капилляре электрораспыления составляло +3,8 кВ в положительной моде и -2,5кВ в отрицательно моде. Идентификация молекулярных ионов проводилась с помощью специализированного программного обеспечения Qual Browser (Thermo Corp., Germany). Возможность характеризации катионных комплексов пептидов с помощью метода масс-спектрометрии была ранее описана (Zirah S., Rebuffat S., Kozin, S.A. et al (2003). Zinc binding properties of the amyloid fragment AP(1-16) studied by electrospray-ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry, 228(2- 3), 999-101.

Образование комплекса фиксировали биосенсором на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. БППР эксперименты были проведены на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) с использованием оптического чипа СМ4 в соответствии с протоколами компании-производителя. Синтетический аналог 42-членного человеческого бета- амилоида (Ар42). на С-конце которого добавлен тетраглицилцистеиновый пептидный фрагмент (-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys), был использован в качестве лиганда. Лиганд (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAGGGGC) иммобилизовали на поверхности оптического чипа через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали магниевый комплекс или НАЕЕ.

Высушивание замороженных образцов выполнялось в пенициллиновых пузырьках на сублиматоре Heto FD 2.5 при давлении 0,1 -0,2 мбар.

Тест ускоренного хранения проводили в камере Memmert НСР50 при 40 °C и 75% влажности. Образцы отбирали раз в месяц в течение 6 месяцев и определяли содержание действующего вещества методом ВЭЖХ.

Варианты осуществления изобретения

Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Получение магниевого комплекса пептида НАЕЕ.

Для получения комплекса в качестве источника магния использовались ацетат магния, хлорид магния, и др. соли в разных соотношениях. В таблице 1 приведены различные соотношения солей магния для получения комплекса.

Для получения комплекса готовили раствор НАЕЕ с концентрацией 10' ⁵ М. В него добавляли раствор соли магния с концентрацией 10' ³ М (Таблица 1). Перемешивание осуществляли в течение 5-60 мин. Эквимолярные магниевые комплексы образовывались при молярном соотношении НАЕЕ и соли магния равные 1:1. Раствор медленно замораживали в холодильной установке при -20 или -80 °C и затем осуществляли лиофильную сушку в стандартном режиме. Далее детально изучали свойства полученного лиофилизированного магниевого комплекса.

При молярном соотношении компонентов менее 0,1 комплекс в растворе не обнаруживался методом ЯМР (сигналы основного вещества не смещались). При увеличении концентрации соли магния более 1:10 образовывались смесь из магниевого комплекса и соответствующей соли магния.

Для получения магниевого комплекса в твердой форме полученные растворы замораживали в морозильной камере (-20 °C) в пенициллиновых пузырьках в течение 2 ч. Замороженные образцы помещали в сублиматор с предварительно охлажденными полками и высушивали в течение 16-30 ч. Все высушенные образцы имели белый цвет. Выход продукта 99%. Высокий выход продукта обусловлен отсутствием потерь при высушивании образцов.

Полученные твердые образцы комплекса характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг. 1). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 2) комплекс характеризуется двумя максимумами: первый широкий эндотермический максимум начинается от 62 °C и имеет максимум при 120 °C; второй эндотермический максимум имеет температуру плавления при 267 °C (Фиг. 3). Методом ДСК-ТГА было показано, что магниевый комплекс в твердой форме может содержать гидратированную или остаточную воду, содержание которой для разных образцов не превышало 5% (потеря массы при нагревании до 100 °C).

Элементный анализ (EDXA) магниевого комплекса показал содержание магния в образцах (при молекулярном соотношении НАЕЕ : Mg = 1:1), от 4±0,5 до 7±1 % масс, в зависимости от природы аниона.

ИК-спектр с Фурье преобразованием комплекса по сравнению с НАЕЕ характеризуется смещением максимума при 1395 в область 1410 см ¹ (СНз деф.), что отличает заявляемый магниевый комплекс от НАЕЕ (Фиг. 4).

Исходный образец НАЕЕ характеризовался ЯМР ^[бООЛЗМЬг; D ₂ O; 298К; d, м.д.]: 1.27 (ЗН, d, j=7.13Hz, СН ₃ (16)), 1.87 (5Н, m, СН ₃ (3), 1/2СН ₂ (21),1/2СН ₂ (33)), 1.99 (2Н, sx, j=7.45Hz 1/2СН ₂ (21),1/2СН ₂ (33)), 2.28 (4Н, ш, 2СН ₂ (22,34 )), 3.13, 3,03 (2Н, щ, СН ₂ (8)), 4.19 (ЗН, m, ЗСН (15,20,29)), 4.56 (1Н, t, j=6.86Hz, СН(5)), 7.19 (Ш, s, СН(10)), 8.50 (1Н, s, СН(12)) (Фиг. 6).

После образования магниевого комплекса положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 7, что свидетельствует о взаимодействии магния с молекулой НАЕЕ в растворе и, следовательно, о сохранении комплекса, что важно для его фармакологических свойств. Смещение сигналов представлены в Таблица 2, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,02 м.д.

. Однако сравнение показывает, что не уширенные сигналы от протонов в комплексе также смещены относительно сигналов молекулы НАЕЕ. Смещение сигналов представлены в Таблица 2, значимыми были приняты сигналы отличающиеся на 0,03 м.д.

Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом магния при образовании комплекса; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в 'Н-ЯМР-спсктрс у определенных СН-групп молекулы.

При наличии в твердой фазе ацетата, бензоата, салицилата, тартрата в ’Н-ЯМР- спектре магниевого комплекса помимо молекулы НАЕЕ фиксировались сигналы от этих анионов, например от ацетата (СНз - 1,92 м.д.).

Характеризация магниевого комплекса [Mg(HAEE)]C12 в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье путем измерения точной массы характерных молекулярных ионов как при положительной, так и при отрицательной модах ионизации. Для проведения измерений образцы магниевого комплекса [Mg(HAEE)]C12 в водном растворе с концентрацией 20 мкМ вносили в смесь воды и ацетонитрила в соотношении 1:1 с добавлением муравьиной кислоты (для достижении финальной концентрации 0,1%). Масс-спектрометрический анализ водного раствора магниевого комплекса [Mg(HAEE)]C12, проведенный при положительной моде электроспрейного ионизационного источника, показал наличие молекулярного иона [НАЕЕ+Н] ⁺¹ с моноизотопной массой 526,2314 m/z и молекулярного иона [HAEE-H+Mg] ⁺¹ с моноизотопной массой 548,1950 ш/z. При использовании отрицательной моды электроспрейного ионизационного источника для анализа магниевого комплекса [Mg(HAEE)]C12 в водном растворе были идентифицированы молекулярный ион [НАЕЕ-Н] ^-1 с моноизотопной массой 524,2168 m/z и молекулярный ион [НАЕЕ-ЗН+Mg] ^-1 с моноизотопной массой 546,1972 m/z. Таким образом, полученные данные подтверждают специфическое связывание катиона магния (II) с пептидом НАЕЕ, которое характеризует внутреннюю координационную сферу магниевого комплекса [Mg(HAEE)] ²⁺ в водном растворе.

Сравнительный анализ магниевого комплекса методом ВЭЖХ-МС (2,5 нг/мл, 0,5% FA - муравьиная кислота, 50% МеОН (1:1)) показал, что в водных растворах in vitro при физиологических значениях pH его хроматографическая подвижность практически идентична НАЕЕ в тех же хроматографических условиях. Время выхода хроматографического пика с колонки составляло 2,75 (комплекс) и 2,85 мин (НАЕЕ), соответственно. С учетом известных из литературы данных молекулярного моделирования (Barykin Е.Р., Garifulina A.I., Tolstova А.Р. et al. (2020). Tetrapeptide Ac- HAEE-NH2 Protects a4p2 nAChR from Inhibition by A0. International journal of molecular sciences, 21(17), 6272, doi: 10.3390/ijms21176272), вышеприведённые результаты указывают на то, что пространственные структуры основной пептидной цепи магниевого комплекса и пептида НАЕЕ в условиях in vitro идентичны и характеризуется «развернутой» конформацией.

После введения магниевого комплекса и НАЕЕ внутривенно в организм здоровых мышей (п = 5) для определения в ней содержания комплекса было показано, что время выхода хроматографического пика НАЕЕ, экстрагированного из образцов крови мыши, не изменялось и также составляло 2,75 мин. Однако, для НАЕЕ, введенного в организм в нативной форме, экстрагированного из образцов крови, было неожиданно обнаружено, что время выхода хроматографического пика стало 1,27 мин. Только около 8% вещества продолжало выходить из колонки на времени 2,85 мин.

Полученные данные свидетельствует о том, что в образцах крови человека или мыши конформация пептида НАЕЕ резко отличается от конформации, наблюдаемой при тех же условиях для магниевого комплекса. Лишь 8% НАЕЕ находится в «развернутой» конформации после его взаимодействия с элементами плазмы крови. Таким образом, в образцах крови магниевый комплекс сохраняет свою конформацию (предположительно, «развёрнутую») неизменной, в то время как НАЕЕ приобретает иную конформацию, которая характеризуется гораздо более компактной структурой, предположительно, «спиральной». Это означает, что магниевый комплекс устойчив к изменению конформации в плазме крови. Согласно настоящему изобретению, для достижения терапевтического эффекта как от магниевого комплекса пептида НАЕЕ, так и от НАЕЕ требуется их введение в организм и присутствие в плазме крови, поэтому принципиальные различия в пространственной структуре этих молекул в плазме крови, исходя из общих представлений биохимии и физиологии, свидетельствуют о различном молекулярном механизме действия магниевого комплекса и НАЕЕ, что исключает их биоэквивалентность.

Была определена стабильность магниевого комплекса в тесте ускоренного хранения в течение 6 месяцев, что соответствует 2 годам хранения в обычных условиях (Таблица 3). Магниевый комплекс, как очищенный от анионов, так и в смеси с указанными анионами за время хранения сохранил свой цвет, консистенцию, не набирал воды (масса образца не увеличивалась в пределах 1-2%) и не терял активное вещество. Образец HAEE с течением времени набирал воду (до 7% масс.) и по данным ВЭЖХ деградировал до 67,4% активного вещества за 6 мес. Образец, полученный по патенту РФ № 2709539, представляющий собой комплекс HAEE-Zn-HSA также набирал воду (до 16% масс.) и деградировал до содержания 71,9% от исходного количества. Таким образом, стабильность заявляемого магниевого комплекса оказалась значительно выше по сравнению с НАЕЕ и HAEE-Zn-HSA.

Пример 2. Фармацевтические композиции на основе магниевого комплекса пептида НАЕЕ.

Фармацевтические композиции на основе магниевого комплекса пептида НАЕЕ могут содержать активное вещество в эффективном количестве (Таблица 4). Состав дозы рассчитывается индивидуально и может варьироваться от 0,1 мг до 100 мг на человека в сутки, более предпочтительно от 1 до 50 мг. Составы фармацевтических композиций представлены в Таблице 3. Пересчет выполнен на дозировку активного вещества. Возможны и другие соотношения активного вещества в фармацевтической композиции в диапазоне от 0,1 до 100 мг. Масса таблеток варьируется от 100 до 400 мг, таблетки могут быть покрыты оболочкой.

Пример 3. Влияние магниевого комплекса пептида НАЕЕ на поведенческие функции и степень тяжести церебрального амилоидоза у экспериментальных животных.

Для моделирования нейродегенеративного заболевания была выбрана модель болезни Альцгеймера, являющейся основным по распространённости нейродегенеративным заболеванием у людей пожилого возраста.

Для проведения экспериментов были использованы самцы трансгенных мышей линии APPswe/PSENldE9. Мыши данной линии также известны под названием APP/PS1: у контрольной группы мышей APP/PS1, начиная с 4-6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной болезни Альцгеймера, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс (Borchelt D.R., Ratovitski Т., Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron, 19(4), 939-945, doi: 10.1016/S0896-6273(00)80974- 5).

Для тестирования были использованы 8-месячные животные, сгруппированные в следующие экспериментальные группы (п = 12 в каждой группе):

1. контроль 1. Мыши дикого типа, которым внутривенно вводили физиологический раствор; 2. контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили физиологический раствор;

3. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили НАЕЕ;

4. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-Zn-HSA;

5. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили [Mg(HAEE)]C12.

Препараты НАЕЕ, HAEE-Zn-HSA и заявляемый магниевый комплекс вводили в ретроорбитальное венозное сплетение в соответствии с известной процедурой (Yardeni Т., Eckhaus М., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155- 160, doi: 10.1038/laban0511-155). Инъекции в дозе 0,05 мг/кг проводили ежемесячно, в возрасте от 2 до 7 месяцев (включительно), всего было сделано 6 инъекций препаратами НАЕЕ и магниевого комплекса, однако, препаратом HAEE-Zn-HSA было сделано только две инъекции, а далее эксперименты с этим препаратом были прекращены из-за появления признаков ухудшения внешнего вида экспериментальных животных после первой инъекции и гибели 5 трансгенных мышей непосредственно после второй инъекции. Скорее всего, это связано с влиянием высоких концентраций HSA, который отличается по структуре от эндогенного мышиного альбумина (MSA).

В возрасте 8 месяцев проводили тестирование поведенческих функций, затем животные подвергались эвтаназии с последующим забором мозга и гистохимическим анализом числа конгофильных бляшек в областях CAI, СА2, САЗ и зубчатой извилине гиппокампа согласно известной процедуре (Kozin S.A., Barykin Е.Р., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-fl Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral p- Amyloidosis in ApPP/PSl Transgenic Mice Model of Alzheimer’s Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518).

3.1 Анализ улучшения поведенческих функций у 8-месячных самцов трансгенных мышей APP/PS1 под действием НАЕЕ и магниевого комплекса пептида НАЕЕ был проведён с помощью теста «Закапывание шариков». В качестве контроля использовались трансгенные мыши APP/PS1 и мыши дикого типа. Для проведения теста мышей помещали в клетки со свежим подстилом с размещенными на нем восемнадцатью шариками, расположенными в виде матрицы 3 x 6. Мышей оставляли в клетке на 30 минут, после чего определяли количество более чем на 2/3 закопанных шариков (КЗШ) в процентах от общего количества шариков. Поведение закапывания является признаком обсессивно-компульсивного поведения. Из-за повторяющегося и персеверативного характера закапывания такое поведение может представлять нейропсихиатрические симптомы, такие как персеверативное поведение и/или стереотипное поведение. Оба являются нейропсихиатрическими симптомами, обычно присутствующими у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими видами деменции.

По результатам тестирования, уровень поведения контрольной группы мышей дикого типа характеризовался значением КЗШ = 50, 6± 13,3 %. Это значение рассматривается в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение КЗШ = 12,6±4,2 %, что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов мышей APP/PS 1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверпродукции человеческого бета-амилоида на процессы нервной деятельности. Мыши, инъецированные НАЕЕ и магниевым комплексом пептида НАЕЕ, показали значения КЗШ = 20,6±7,3 % и КЗШ = 42,7±9,8 %, соответственно (Таблица 5).

Эти данные свидетельствуют о том, что использование магниевого комплекса пептида НАЕЕ существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS 1 , а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для НАЕЕ. Сравнительные эксперименты магниевого комплекса с другими анионами не выявили статистически значимых различий в биологическом эффекте. Введение ближайшего аналога HAEE-Zn-HSA приводило к нарушению физического состояния у мышей и к их гибели, что, по-видимому, связано с высокой дозировкой HSA.

3.2. Гистохимический анализ конгофильных амилоидных бляшек в областях CAI, СА2, САЗ и зубчатой извилине гиппокампа был проведен согласно ранее описанным процедурам (Kozin S.A., Barykin Е.Р., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-P Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral P- Amyloidosis in A PP/PSl Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518). Мозг мышей извлекали и фиксировали в 10% формалине. Процесс заливки образца в парафин проводили следующим образом: заливали 75% этанолом и оставляли на ночь, далее сменяли на 96% этанол и выдерживали 5 мин, 96% этанол - 10 мин, 100% этанол - 10 мин (две замены), этанол-хлороформ (1:1) - 30 мин, и оставляли в чистом хлороформе на ночь. Заливку парафином проводили при 60°С в течение 3 ч (три смены). Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG 1160. Серийные срезы головного мозга (8 мкм) вырезали с помощью микротома Leica RM2265 и помещали на предметные стекла. Для депарафинизации, гидратации и окрашивания срезов проводили следующие этапы: предметные стекла последовательно помещали в ксилол три смены (по 10 минут), 96% этанол - 5 мин, 90% этанол - 2 мин, 75% этанол - 2 мин, вода - 5 мин (три смены), раствор конго красного - 5 мин, далее добавлялся раствор гидроксида калия и вода. Для монтирования использовали среду ImMu-Mount (Thermo Scientific). Срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах (Franklin К., Paxinos, G. (2008). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. New York, NY: Academic Press), использовали для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Амилоидные бляшки идентифицировали окрашиванием конго красным и подсчитывали вручную. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества бляшек на 1 срез. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна-Уитни. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (Р <0,001).

У контрольной группы мышей дикого типа (группа 1) никаких амилоидных бляшек обнаружено не было (Таблица 4). Конгофильные амилоидные бляшки, визуализированные в областях CAI, СА2, САЗ и зубчатой извилине гиппокампа головного мозга трансгенных животных были сходны по локализации и распределению размеров в паренхиме головного мозга. Однако, количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами. В контрольной группе 2 (трансгенные мыши APP/PS1) среднее число бляшек в областях на один срез мозга (ЧБ) составляло ЧБ = 31,7 ± 4,9. В группе 3, где трангсенным мышам APP/PS1 вводили НАЕЕ, ЧБ = 24,7 ± 3,4. В группе 4, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили заявляемый магниевый комплекс, ЧБ = 8,1±2,8. Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции магниевого комплекса приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность магниевого комплекса примерно в три раза выше таковой, выявленной для НАЕЕ.

Пример 4. Специфическое связывание магниевого комплекса пептида НАЕЕ с человеческим бета-амилоидом (А₽42).

Дополнительно была проведена оценка связывания заявляемого магниевого комплекса с бета-амилоидом как одного из механизмов действия данного комплекса при нейро дегенеративных поражениях, связанных с бета-амилоидом. Образование комплексов между находящимся в растворе аналитом (заявляемый магниевый комплекс или НАЕЕ) и иммобилизованным 42-членным человеческим бета-амилоидом (лигандом) было исследовано с помощью БППР. По результатам таких экспериментов рассчитывали кинетические параметры взаимодействий и значение константы диссоциации (KD) взаимодействия магниевого и иммобилизованного лиганда. Если значение KD < 10' ⁴ М, то взаимодействие между магниевым комплексом и бета-амилоидом является биологически значимым.

Взаимодействий между НАЕЕ и лигандом обнаружено не было. Напротив, при введении магниевого комплекса пептида НАЕЕ было обнаружено его взаимодействие с иммобилизованным А 42 при его различных концентрациях 150, 300, 500, 1000, 1500 мкМ. На основании полученных данных были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия магниевого комплекса пептида НАЕЕ с иммобилизованным бета- амилоидом Ар42: kon = (1,29±0,06) х 10 ³ NT's' ¹ ; код х 10' ⁶ М. Кинетические характеристики оставались в этих же значениях пределах погрешности при использовании магниевого комплекса с разным набором анионов - нитрат, ацетат, хлорид, глюконат, лактат, салицилат и др.

Таким образом, на основании вышеприведенных результатов доказано образование стабильных межмолекулярных комплексов между 42-членным человеческим бета- амилоидом (Ар42) и магниевым комплексом пептида НАЕЕ. В отличие от магниевого комплекса пептида НАЕЕ, нативный пептид НАЕЕ в идентичных экспериментальных условиях не взаимодействует с АР42.

Полученные в данном Примере настоящего изобретения результаты указывают на отсутствие способности НАЕЕ связываться с А 2. Напротив, магниевый комплекс пептида НАЕЕ связывается с Ар42. Несмотря на то, что и НАЕЕ и заявляемый магниевый комплекс при введении в кровеносную систему трансгенных мышей APP/PS1 улучшают когнитивные функции и снижают количество амилоидных бляшек у экспериментальных животных (Примеры 3.1 и 3.2 настоящего изобретения), полученные результаты свидетельствует о различных молекулярных механизмах терапевтического воздействия НАЕЕ и заявляемого магниевого комплекса, что, в свою очередь, исключает биоэквивалентность НАЕЕ и заявляемого магниевого комплекса при их использовании для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Таблица 1. Объемы реагентов для приготовления магниевых комплексов НАЕЕ с различными анионами.

Таблица 2. Смещение сигналов протонов в Н - ЯМ Р- спектре заявляемого магниевого комплекса по сравнению с НАЕЕ.

Таблица 3. Данные по стабильности магниевого комплекса пептида НАЕЕ в тесте ускоренного хранения (40 °C, 75% влажности).

Таблица 4. Состав фармацевтических композиций с магниевым комплексом пептида НАЕЕ. В/м - внутримышечное введение, в/в - внутривенное введение.

Таблица 5. Влияние магниевого комплекса пептида НАЕЕ на когнитивные функции у мышей в тесте «закапывание шариков» и на количество амилоидных бляшек. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (Р <0,001).