La présente invention est relative à des folates de magnésium, à leur procédé de préparation, aux compositions pharmaceutiques les contenant, ainsi qu'aux applications thérapeutiques où leur apport peut avantageusement venir corriger les désordres et les divers troubles provoqués par les états de déficits et de carence en folates, de plus en plus fréquemment observés actuellement, notamment chez les personnes âgées.

Les causes des carences peuvent être multiples et consécutives à la malnutrition, à la malabsorbtion, à des besoins accrus engendrés à la suite d'infections, néoplasies, alcoolisme, maladies intestinales, hépatiques ou rénales, médications, thyrotoxicoses, maladies systématiques etc.. Il est reconnu que d'autres facteurs en particulier psychologiques comme l'apathie, la soli¬ tude, l'anxiété, la dépression peuvent contribuer à une alimentation carencée chez les personnes âgées (MARCUS DL, FREEDMAN ML in J. Am. Geriat. Soc. 1985, 33 : 552-8). Il a été observé chez les patientes admises en géronto- psychiatrie, une déficience quasi constante du taux des folates (ABALAN F. et al. Encéphale 1984 ; X : 9-12) . Les taux bas de folates dans le L.C.R., chez les sujets âgés en général, sont déterminés aussi par des modifications des plexus choroïdes qui entraîneraient une diminution du transport des vitamines hydrosolubles à travers la bar¬ rière hémo-encéphalique. Les carences en folates peuvent donc induire non seulement des troubles hématologiques, neurologiques périphériques mais, comme le démontrent certains travaux récents, peuvent être la cause de symp¬ tômes neurologiques. S'il n'existe pas, semble t-il, de signes spécifiques de 1'hypofolatémie, par contre, les troubles du comportement représentent, chez la personne âgée, les signes d'appel précoces de la carence en folates qu'il est indispensable de prévenir et de traiter

car cette symptomatologie sénescente peut avoir des conséquences irréversibles.

Les folates sont un groupe de composés synthé¬ tisés par les plantes et les microorganismes. Le terme folate est habituellement utilisé pour désigner globalement les divers composés de cette famille qui comprend :

- des dérivés conjugués à 1'acide glutamique : monoglutamate (acide folique) et polyglutamates ; - des composés réduits : dihydro et tétrahydrofolates, notamment le N^-for yl-tétrahydro- folate ou encore acide folinique sous forme de sel de calcium pentahydraté, métabolite actif utilisé en cli¬ nique. Les folates ont des rôles physiologiques importants. Les différents rôles peuvent être résumés par l'apport du chaînon carboné conduisant à la biosynthèse de la plupart des neuromédiateurs. Il intervient ainsi comme co-enzyme dans la synthèse de tous les neuro- transmetteurs des systèmes dopaminergiques, sérotoniner- giques, cholinergiques, adrénergiques qui dominent le fonctionnement cérébral, le psychisme. Les folates sont impliqués dans la synthèse des bases puriques et pyrimi- diques constituants des acides nucléiques, et par consé- quent dans les synthèses protéiques indispensables à des processus de renouvellement des cellules de l'organisme, à ceux de la mémorisation, de la vigilance. Par ailleurs, il a été reconnu 1'intervention des folates dans la syn¬ thèse de la myéline et de l'acétylcholine. En consé- quence, un déficit peut entraîner des altérations de la conduction nerveuse et de 1'association interneuronale et se traduire par des troubles au niveau des aires associa¬ tives avec perte des capacités d'association et de struc¬ turation. En outre l'acide folique (folates) est indis- pensable aux hydroxylations oxydatives et en particulier aux enzymes limitantes de la biosynthèse des monoamines.

Ces différents rôles expliqueraient que le déficit en folates peut entraîner l'apparation d'asthénie et la ten¬ dance à la dépression.

Ces folates apparaissent donc comme des vita- mines essentielles largement présentes dans un certain nombre d'aliments, notamment les légumes frais et le foie, mais facilement détruits.

Leur carence était surtout connue pour provo¬ quer une anémie, en particulier chez la femme enceinte, l'alcoolique et 1'épileptique sous phenytoïne.

On connaît plusieurs procédés de préparation de l'acide folique (acide pteroylglutamique) et notamment celui décrit dans le brevet US 2 956 057, qui permet d'obtenir un bon rendement en condensant la 2, 4, 5- triamino-6-hydroxypyrimidine avec l'acide p-amino-benzoyl glutamique et une haloacétone appropriée, en présence d'un agent réducteur.

On connaît également le brevet US 2 786 056, qui décrit un autre procédé de préparation de 1'acide folique et à des intermédiaires nouveaux pour sa prépara¬ tion.

Ce brevet décrit un procédé de préparation de 2-acylamino-4-hydroxy-6-di R méthyl ptéridine en faisant réagir une 2-amino-4-hydrôxy-6-di-R avec un agent alky- lant et un procédé de préparation de 2-acylamino-4- hydroxy-6-formyl ptéridine en mettant en contact une 2- acylamino-4-hydroxy-6-di R méthyl ptéridine avec un agent hydrolysant.

On connaît également plusieurs procédés de préparation du 5-formyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolate ou acide folinique. Le brevet US 2 741 608 décrit un procédé qui comprend la formylation et l'hydrogénation de compo¬ sés de l'acide ptéroïque, puis en amenant le pH du com¬ posé obtenu à au moins 5. Ce brevet précise que les com- posés obtenus par ce procédé présentent une activité de facteur de croissance dans les tests microbiologiques.

Ces différents brevets précisent l'utilisation de ces dérivés notamment dans l'anémie macrocytique, la sprue et dans d'autres conditions du système circula¬ toire. Un sel de calcium de l'acide folinique, le fo- linate de calcium est utilisé comme antidote des inhibi¬ teurs de l'acide folique, comme le méthotrexate ; lors d'un symposium (20 mars 1987), il a été montré que la carence en folates chez des personnes âgées présentant des troubles du comportement à type de dépression et de démence, celle-ci peut être corrigée par l'administration parentérale de folinate de calcium.

De son côté, le magnésium est reconnu comme un cation dont le rôle est très important dans le fonctionnement normal des cellules, la transmission de l'influx nerveux, la contraction des muscles, la forma¬ tion des anticorps, l'action de nombreuses enzymes. Il intervient notamment dans la synthèse des neuromédia¬ teurs, dans les processus de stockage et dans l'efficacité au niveau des récepteurs. Les carences peu¬ vent se traduire par l'apparition de fatigue, des crampes, de l'anxiété, de l'hyperémotivité, des palpita¬ tions, des douleurs musculaires.

Les folates selon l'Art antérieur présentent plusieurs inconvénients :

. le folinate de calcium, qui a été utilisé chez la personne âgée risque, en raison de l'apport de calcium important, de provoquer des hypercalcifications ; . l'acide folinique et son sel, le folinate de calcium sont d'un prix de revient élevé ;

. il serait tentant d'utiliser plusieurs médi¬ caments, notamment l'acide folique d'une part et un dérivé du magnésium d'autre part ; cependant, leur utili¬ sation séparée présente un certain nombre .d'inconvé- nients : risque, surtout chez la personne âgée, d'une diminution de la compliance, pas ou très peu de synergie

d'action entre les différents médicaments, ce qui ne permet donc pas d'obtenir le résultat escompté.

La Demanderesse s'est en conséquence donné pour but de pourvoir de nouveaux folates qui répondent mieux aux besoins de la pratique tant en ce qui concerne les effets indésirables, le procédé de préparation, simple et peu coûteux, que la compliance.

C'est également un but de l'invention de four¬ nir des compositions pharmaceutiques contenant au moins un desdits folates, seul ou en association avec d'autres principes actifs. ^'

La présente invention a pour objet un folate, caractérisé en ce qu'il répond à l'une des deux formules isomères suivantes (I) et (I ¹ ) :

et

dans lesquelles

R-L représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle inférieur ou une liaison entre le carbone en 7 et l'azote en 8 ; R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe

CHO ou une liaison entre l'azote en 5 et le carbone en 6 ; et les deux fonctions acides carboxyliques libres terminales sont salifiées par le magnésium. Ces deux éléments biologiques indispensables à l'organisme (folate et magnésium), associés sous forme de sel, présentent une synergie d'action, notamment au niveau des neurotransmetteurs, ledit sel permettant ainsi de lutter efficacement contre les carences en ces deux éléments, notamment chez la personne âgée, tout en per¬ mettant une bonne compliance et en évitant un apport en calcium non désiré.

Les folates de magnésium présentent un certain nombre d'avantages par rapport aux produits de l'Art antérieur, notamment leur intérêt repose sur les proprié¬ tés biologiques provenant de la synergie des deux élé¬ ments constitutifs du composé ainsi défini en vue de com¬ battre, en particulier, les désordres carentiels rencon¬ trés chez des personnes déficitaires, notamment en géria- trie, avec les conséquences connues mais aussi mal défi¬ nies, voire insoupçonnées parfois, qu'ils peuvent engen¬ drer. Il s'agit donc de rechercher à rétablir l'équilibre perturbé par des carences nutritionnelles ou d'absorption ou consécutives à certaines maladies organiques ou méta- boliques pouvant entraîner asthénie, comportement dépres¬ sif, crampe, paresthésie, fasciculation, ainsi que d'autres pathologies en découlant.

Parmi les folates conforme à l'invention, on peut citer, de préférence, le sel de magnésium de l'acide dihydrofolique, le sel de magnésium de l'acide

tetrahydrofolique et le sel de magnésium de l'acide Nc- formyl-tétrahydrofolique.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des folates de magnésium conforme à l'invention, caractérisé par les étapes suivantes :

1 - préparation d'un sel alcalin du composé de formule A ou de son isomère de formule B, ci-après :

et

H

2 - condensation du sel alcalin du composé de formule A ou du composé de formule B formé avec un halo- génure de magnésium en quantités équimoléculaires, 3 élimination de l'halogénure alcalin soluble formé,

4 - lavages successifs et séchage du folate de magnésium précipité formé.

La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un folate de magnésium conforme

à l'invention, éventuellement associé aux vitamines hydrosolubles du groupe B et/ou à de la lécithine, ladite composition étant en outre éventuellement associée à au moins un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Les folates de magnésium peuvent être adminis¬ trés par voie orale ou parentérale, mais la voie orale est préférée ; la dose quotidienne se situe dans la gamme de 5 à 20 mg mais peut être modifiée suivant les besoins, compte-tenu de l'absence de toxicité du produit. Lorsqu'il est avantageusement associé aux vitamines hydrosolubles du groupe B telles que les vita¬ mines B- _j B2, Bg, PP et/ou à des composés tels que la lécithine, il permet d'améliorer les différents troubles évoqués ci-dessus, plus ou moins marqués chez les sujets âgés déficitaires. Chez ceux-ci, en effet, la ration ali¬ mentaire est à tort réduite en quantité pour de nom¬ breuses raisons psychiques, psychologiques et socio- économiques mais aussi par suite de malabsorption, voire également d'augmentation des besoins. La compensation s'avère indispensable car les retentissements cliniques multiples sont d'autant plus graves qu'ils surviennent sur un terrain particulièrement fragile, dont les dé¬ fenses se sont physiologiquement amenuisées.

Le folate de magnésium peut être présenté sous toutes les formes pharmaceutiques habituelles pour l'administration par voie orale ou parentérale. Toute¬ fois, il sera, de préférence, administré par voie orale et se présentera sous forme de comprimés, dragées, gélules. Associé à des vitamines hydrosolubles, et/ou à de la lécithine, en proportions définies, il sera avanta¬ geusement présenté sous des formes protégées, qui évite¬ ront les oxydations ou altérations éventuelles des prin¬ cipes actifs. Le folate de magnésium seul ou ses composi¬ tions peuvent être additionnés d'agents inertes, de

conservateurs pour permettre leur préparation par les procédés pharmaceutiques bien connus tels que le simple mélange, la compression, le broyage des constituants etc... Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à un exemple de mise en oeuvre du procédé, à des exemples de formulation des compositions conformes à la présente invention ainsi qu'à des compte-rendus d'expérimentations relatifs à l'activité thérapeutique desdites compositions.

Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

Exemple 1 : Préparation d'un folate de magné¬ sium

. Dissoudre 2,21 g d'acide folique (P.M. 442, soit 1/200 mole) dans 10 ml d'une solution normale de bicarbonate de sodium (0,84 g de NaHCO _β ) , puis ajouter 10 ml d'eau distillée. On obtient une solution jaune- clair de folate disodique (solution A) .

. Préparer, d'autre part, une solution de bro- mure de magnésium au 1/200 par dissolution de 1,46 g de gBr2 dans 10 ml d'eau distillée, puis ajouter 30 ml de méthyl-éthyl cétone (solution B) .

. Sous vive agitation, introduire lentement la solution A (folate disodique) dans la solution B (bromure de magnésium) .

Dès le début de l'addition, il se forme un précipité jaune clair cristallin.

Continuer l'addition tout en maintenant l'agitation et tiédir légèrement la masse réactionnelle au bain-marie (entre 30 et 40 ° C) . Laisser au repos, après la fin de l'addition, pendant environ une heure. Pour

parfaire la formation du folate de magnésium, réchauffer le mélange au bain-marie bouillant, sous agitation, pen¬ dant une heure.

Refroidir, puis recueillir le précipité formé par essorage.

. Sécher dans une étuve ventilée. . On récupère 2,30 g de folate de magnésium qui se présente sous forme de cristaux jaune-orangés fins, insolubles dans la plupart des solvants organiques et très légèrement soluble dans l'eau.

Le bromure de sodium formé au cours de la réaction est soluble dans l'eau dans la proportion de 1 g pour 1,10 ml d'eau. Il est entièrement éliminé dans les eaux-mères d'essorage (eau + méthyléthylcétone) . Caractéristiques physicochimiques du folate de magnésium :

- analyse élémentaire C, H, N, 0, Mg . calculé : C = 42,97 %, H = 5,44 % ; N = 18,33 % ; Mg = 4,55 % ;

excipient : aérosil, carbonate de Mg, stéarate de Mg

Q.S.P. 150 mg pour une gélule n° 3, vernie par une résine gastro-résistante de type acétophtalate de cellulose. . Posologie

2 par jour, de préférence le matin peut être augmentée jusqu'à 6 par jour (3 x 2).

Tests pharmacologiques Exemple A

Test de PORSOLT ou Test du "comportement de désespoir" décrit par PORSOLT R.D. et al. dans European Journal of Pharmacology (1978) .

Ce test consiste à induire chez le Rat un état dépressif.

Protocole expérimental

L'animal est placé dans un cylindre (hauteur : 40 cm, diamètre : 18 cm) rempli d'eau tiède (25 ^* C) jusqu'à 20 cm, et dont il ne peut s'échapper ; celui-ci nage pendant un certain temps, puis adopte une attitude immobile très particulière : il surnage et flotte mais ne bouge plus. L'administration d' "antidépresseurs" corrige cet état dépressif, autorisant une reprise de l'activité (i.e. diminution du temps d'immobilité "Ti") .

- Dans le cadre de cette étude, le folate de magnésium (F.Mg) a été étudié comparativement à l'acide folique (AF) .

L'expérience est menée sur un lot homogène de rats Long Evans mâles pesant 480 ± 10 g, âgés de 9 mois.

AF et F.Mg sont mis en suspension dans une so¬ lution de gomme arabique à 5 %.

L'administration est effectuée une heure avant le test sous un volume constant de 0,1 ml/100 g de rat per os.

Les animaux sont répartis en 4 groupes : - groupe témoin : nombre de rats, n = 10 ; ils reçoivent de la gomme arabique

- groupe n" 1 : n = 10 ; reçoivent A.F. à la dose de 1 mg/kg

- groupe n° 2 : n = 10 ; reçoivent F.Mg à la dose de 1 mg/kg

- groupe n° 3 : n = 10 ; reçoivent F.Mg à la dose de 0,5 mg/kg.

Résultats et commentaires

. Dans le tableau I ci-après, sont exprimées les valeurs moyennes de temps d'immobilité Ti pour chaque groupe. En comparant le temps moyen d'immobilité (Ti en secondes) de chaque groupe, on constate que les animaux traités par A.F. et F.Mg arrivent à restaurer la nage, i.e. se comportent comme ceux qui sont traités par des antidépresseurs. Les animaux traités par le folate de Magnésium (F.Mg) ont un Ti significativement inférieur à celui de l'acide folique (A.F.)

. Dans le tableau II ci-après, pour vérifier si ces différences sont significatives, on utilise le test t de Student, i.e. on compare entre elles deux moyennes m _A et m _B observées pour n _A et n _β cas et la valeur "t" trouvée fixe le degré de signification.

Il est observé que les différences animaux té¬ moins/animaux traités par F.Mg aux doses de 0.5 et 1 mg/kg sont significatives (p < 0.001 aux 2 doses).

Il en est de même pour les animaux traités par AF mais à un moindre degré (p < 0.01) .

On met ainsi en évidence l'efficacité de F.Mg. On peut également déterminer la dose la plus efficace de F.Mg et différencier AF et F.Mg (p < 0.01).

TABLEAU I

Exemple B : Toxicologie

1. Toxicité aiguë (recherche de dose léthale

50)

L'étude est effectuée chez la souris IOPS fe¬ melle d'un poids moyen d'environ 40 g, origine IFA CREDO. Les animaux sont observés pendant une semaine.

Doses étudiées Effectifs

100 mg/kg

300 mg/kg

500 mg/kg

1 g/kg

2 g/kg 4 g/kg

Le F.Mg est administré en suspension dans la gomme arabique à 5 % par voie orale à raison de 0.2 ml/100 g. Dans tous les cas, la dose est unique. Dans ces conditions, il n'a été observé aucune mortalité.

2. Toxicité subaiguë (3 semaines) L'étude est effectuée chez la Rat Wistar, mâle et femelle, âgé de 2 mois, d'un poids moyen de 350 g (çf ) et 200 g ( 9 ) ^en provenance du C.E.R. Janvier. Les animaux sont observés pendant un mois.

Le F.Mg est étudié à la dose de 0,5 mg/kg/jour /per os chez 10 mâles et 10 femelles, ainsi qu'à la dose de 10 mg/kg/jour/per os chez 10 mâles et 10 femelles. . Le F.Mg est administré en suspension dans la gomme arabique à 5 % par voie orale à raison de 0.2 ml/100 g. La durée du traitement est de 3 semaines et l'administration est de une fois par jour.

. Dans ces conditions, il n'a été observé au- cune mortalité ni de signes particuliers. L'évolution de poids corporel a été normale.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ces modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui vien- nent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en em¬ brasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée de la présente inven¬ tion.