Das grundlegende Prinzip, Herbizide über Inhibierung eines definierten Targets zu identifizieren ist bekannt (z. Bsp. US 5,187, 071, WO 98/33925, WO 00/77185). Generell besteht ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Herbizide darstellen könnten. Gründe hierfür sind auftretende Resistenzproblematiken von an bereits bekannten Targets wirkenden herbiziden Wirkstoffen und das ständige Bemü- hen neue herbizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Verträglichkeit und/oder. geringe Aufwandmengen auszeichnen.

Die Detektion von neuen Targets ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbun- den, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselweges ist, häufig das Wachstum der Pflanze nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass die Pfanze auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht bekannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechselweg ist. Ferner zeichnen sich pflanzliche Genome durch eine große funktionelle Redundanz aus. Im Genom von Arabidopsis thaliana liegen funktional äquivalente Enzyme im Vergleich zu Insekten oder Säugern häufiger in Genfamilien vor (Nature, 2000, 408 (6814) : 796-815). Diese Annahme wird experimentell bestätigt durch die Tatsache, dass grosse Gen-Knock-out-Programme durch T-DNA-oder Transposoninsertion in Arabidopsis bisher weniger ausgeprägte Phänotypen lieferten als erwartet (Curr. Op.

Plant Biol. 4,2001, pp. 111-117).

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, neue Targets zu identifi- zieren, die für das Wachstum von Pflanzen essentiell sind bzw. deren Inhibierung für die Pflanze zu einem verminderten Wachstum führen, sowie Verfahren bereitzustellen, welche zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider und/oder wachstumsregula-

torischer Wirkung geeignet sind.

Die Aufgabe wurde gelöst durch die Verwendung von Malat Dehydrogenase in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden.

An dieser Stelle werden nun weitere der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.

"Affinitäts-Tag" : Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen kodierende Nukleinsäu- resequenz mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient zur Isolierung, Anreicherung und/oder gezielten Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts-Chromatographie aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann vorteilhaft eine Protease-Schnittstelle (z. B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespal- ten werden kann. Beispiele für gängige Affinitäts-Tags sind das"His-Tag"z. B. von Quiagen, Hilden,"Strep-Tag", das"Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Bio- labs, das Maltose-bindende Protein (pMal) von New England Biolabs und das soge- nannte CBD-Tag von Novagen. Der Affinitäts-Tag kann dabei am 5'-oder 3'-Ende der kodierenden Nukleinsäuresequenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz angebracht sein.

"Biologische Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase" : Dieser Begriff be- schreibt im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass durch die Präsenz der glyoxy- somalen Malat Dehydrogenase Wachstums-und Überlebensfähigkeit vermittelt wird.

Wird die Aktivität eines Proteins mit der biologischen Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase gehemmt, so führt dies zu einem verminderten Wachstum, einem Wachstumsstillstand oder einem Absterben der Pflanze.

"Enzymatische Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase" : Der Begriff en- zymatische Aktivität beschreibt die Fähigkeit eines Enzyms, ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln. Die enzymatische Aktivität kann in einem sogenannten Aktivitätstest über die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) oder die Abnahme eines spezifischen Cofaktors oder über eine Kombination aus mindes- tens zwei der vorstehend genannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeit- spanne bestimmt werden."Enzymatische Aktivität einer glyoxysomalen Malat De- hydrogenase"bezeichnet hier die Fähigkeit eines Enzyms, eine von der glyoxysomalen Malat Dehydrogenase katalysierte Reaktion ebenfalls zu katalysieren.

"Expressionskassette" : Eine Expressionskassette enthält eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft mit mindestens einem genetischen Kon- trollelement, wie einem Promotor, sowie vorteilhaft mit einem weiteren Kontrollelement, wie einem Terminator. Die Nukleinsäuresequenz der Expressionskasette kann bei- spielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA- Sequenz sowie halb-oder vollsynthetische Analoga davon sein. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extra-chromosomal oder integriert in das Ge- nom vorliegen. Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können synthetisch her- gestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Ge- nabschnitten verschiedener Organismen bestehen.

Auch artifizielle Nukleinsäuresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expres- sion eines durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuesequenz kodierten Polypeptides mit der enzymatischen Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase, vorzugs- weise der biologischen Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon-Nutzung des von den zu transformierenden Organismen optimiert wurden.

Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragment-Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann bei- spielsweise in bekannter Weise nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auf- lage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation einer Ex- pressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander erfolgt über allgemei- ne Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J.

Sambrook,"Molecular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al.,"Current Protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.

"Funktionelle Verknüpfung" : Unter einer funktionellen oder operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung regulativer Sequenzen bzw. genetischer Kontrollelemente derart, daß jede der regulativen Sequenzen bzw. jedes der geneti- scher Kontrollelemente ihre Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz

bestimmungsgemäß erfüllen kann.

"Funktionelle Äquivalente"beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die unter Stan- dardbedingungen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO : 2 oder Teilen der SEQ ID NO : 2 hybridisieren und befähigt sind, die Expression eines Polypeptides mit der enzy- matischen, vorzugsweise biologischen Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydroge- nase in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.

Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10-50 bp, vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann be- kannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 100-500 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure/Oligonukleotid, der Länge des Fragmentes oder der vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart, d. h. DNA oder RNA, für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA : DNA-Hybride ca 10°C niedri- ger als die von DNA : RNA-Hybriden gleicher Länge.

Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Kon- zentration zwischen 0, 1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCI, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedin- gungen für DNA : DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA : RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperatur- werte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik, wie bei- spielsweise Sambrook et al.,"Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln bei- spielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fach- <BR> <BR> mann folgenden Lehrbüchern entnehmen : Ausubei et al. (eds), 1985, "Current Proto- cols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York ; Hames and Higgins (eds), 1985,"Nucleic Acids Hybridization : A Practical Approach", IRL Press at Oxford Univer- sity Press, Oxford ; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology : A Practical Ap-

proach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.

Unter einem funktionellen Äquivalent der SEQ ID NO : 2 versteht man weiterhin auch Nukleinsäuresequenzen die mit der SEQ ID NO : 2 bis zu einem definierten Prozentsatz homolog bzw. identisch sind und ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der vorstehend genannten Nukieinsäuresequenzen, die für ein Polypeptid mit der enzymatischen, vorzugsweise biologischen Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase kodieren.

Es werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen erhält. Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem <BR> <BR> Fachmann geläufige Techniken, wie"Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp. 389-391) oder"Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16,1998, pp. 258-261) erzeugt werden. Ziel einer solchen Modifika- tion kann z. B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung von DNA zur Verkürzung der Sequenz, der Austausch von Nukleotiden zur Codon- Optimierung oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über modifi- zierte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, müssen trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.

Der Begriff des funktionellen Äquivalents kann sich auch auf das durch die entspre- chende Nukleinsäuresequenz kodierte Aminosäuresequenz beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO : 3 bis zu einem definierten Prozentsatz identisch bzw. homolog ist.

Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhalte- ne, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abge- leiteten Aminosäuresequenzen.

"Genetische Kontrollsequenz"beschreibt Sequenzen, die einen Einfluss auf die Transkription und gegebenenfalls Translation der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in prokaryotischen oder eukaryontischen Organismen haben. Beispiele hierfür sind Pro- motoren, Terminatoren oder sogenannte"enhancer"Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gege- benenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche Regulation ausge- schaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde.

Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Aus- gangsorganismus. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-

untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombina- tion bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfer- nung aus dem Genom erlauben. Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weite- re Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, sowie die Chromatinstruk- tur beeinflussende Sequenzen (z. B. Matrix attachment regions (MAR's)) die die ex- pressionssteuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch genetische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhän- gig von bestimmten Stressfaktoren erfolgen. Entsprechende Elemente sind zum Bei- spiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH, J Biol Chem 1991 ; 266 (26) : 17131-17135), Kälte-und Trockenstress (Plant Cell 1994, (6) : 251-264) und Hitzestress (Molecular & General Genetics, 1989,217 (2-3) : 246-53) beschrieben.

"Homologie"zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils ge- samte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus BESTFIT (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Compu- ter Group (GCG), Madison, USA unter Einstellung folgender Parameter für Polypeptide Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2,912 Average Mismatch : -2, 003 und folgender Parameter für Nukleinsäuren Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10.000 Average Mismatch : -9. 000 berechnet wird.

Anstelle des Begriff"homolog"oder"Homologie"wird im Folgenden auch gleichbedeu- tend der Begriff Identität verwendet.

"Mutationen"von Nuklein-oder Aminosäuresequenzen umfassen Substitutionen (=Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Verän- derungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wo- durch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Sub- stitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann, wobei jedoch insgesamt die funktionellen Eigenschaften des Zielproteins im wesentli- chen beibehalten werden.

"Natürliche genetische Umgebung"meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an 5'-oder 3'- Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders bevorzugt mindes- tens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp.

"Pflanzen"im Sinne der Erfindung sind Pflanzenzellen,-gewebe,-organe oder ganzen Pflanzen wie Samen, Knollen, Blüten, Pollen, Früchte, Sämlinge, Wurzeln, Blätter, Stengel oder sonstige Pflanzenteile zu verstehen. Außerdem ist unter Pflanzen Vermehrungsmaterial wie Samen, Früchte, Sämlinge, Stecklinge, Knollen, Schnitte oder Wurzelstöcke zu verstehen.

"Reaktionszeit"bezeichnet die Zeit, die man für die Durchführung eines Testes zur Ermittlung der enzymatischen Aktivität bis zum Erhalt einer signifikanten Aussage über eine enzymatische Aktivität benötigt und hängt sowohl von der spezifischen Aktivität des im Test eingesetzten Proteins als auch von der verwendeten Methode und der Empfindlichkeit der verwendeten Geräte ab. Dem Fachmann ist die Ermittlung der Reaktionszeiten bekannt. Bei auf photometrischen Methoden basierenden Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit herbizider Wirkung liegen die Reaktionszeiten beispielsweise im allgemeinen zwischen > 0 bis 120 Minuten.

"Rekombinante DNA"beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen herstellbar durch rekombinante DNA-Technologie.

"Rekombinate DNA-Technologie" : allgemein bekannte Techniken zur Fusionierung von DNA-Sequenzen (z. B. beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).

"Replikationsursprünge"gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen Ex- pressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen und Hefen z. B. der pBR322 ori oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al. :"Molecular Cloning. A Laboratory Manu- al", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und der ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000,28 (10) : 2060-2068).

"Reportergene"kodieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über Wachstums-, Fluo- reszenz-, Chemo-, Biolumineszenz-oder Resistenzassay oder über eine photometri- sche Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewer- tung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder-zeitpunktes vorge- nommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn

E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999 ; 13 (1) : 29-44) wie das"green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996 ; 389 (1) : 44-47 ; Chui WL et al., Curr Biol 1996,6 : 325-330 ; Leffel SM et al., Biotechniques. 23 (5) : 912-8,1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sci 1996,116 : 59- 72 ; Scikantha, J Bact 1996,178 : 121 ; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10 : 324- 414), sowie Lüziferasegene, im allgemeinen die ß-Galactosidase oder die ß-Glucu- ronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987,6, 3901-3907) oder das Ura3-Gen.

"Selektionsmarker"verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika, oder andere toxische Verbindungen : Beispielhaft zu nennen seien hier das Neomycin-Phosphotransferase- Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycosid-Antibiotika Neomycin (G 418), Kanamycin, Paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), das sul Gen kodierend für eine mutierte Dihydropteroat Synthase (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990 ; 15 (1) : 127-136), das Hygromycin B Phosphotransferase-Gen (Gen Bank Accession NO : K 01193) und das shble Resistenzgen, das eine Resistenz gegen die Bleomycin Antibiotika wie zB. Zeocin verleiht. Weitere Beispiele für Seiektionsmarker- Gene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eine Antimetaboliten- <BR> <BR> Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physio. (Life Sci. Adv. ) 13 (1994) 142-149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (1988) 8047-8051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithin-Decar- boxylase) Gen (McConlogue, 1987 in : Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. ) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K etal., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).

"Transformation"beschreibt einen Prozess zur Einführung heterologer DNA in eine pro-oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus "Target/Target Protein" : ein Polypeptid codiert über die erfindungsgemäße Nukleinsäu- resequenz, welches ein Enzym im klassischen Sinne sein kann oder z. B. ein Struktur- protein, ein für Entwicklungsprozesse relevantes Protein, Regulationsproteine wie Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren, Untereinheiten von Kanä- len, Transportproteine, regulatorische Untereinheiten die einem Enzymkomplex eine substrat-oder Aktivitätsregulation verleihen. Allen Targets oder Wirkorten gemein ist dabei, dass deren funktionale Anwesenheit essentiell für das Überleben oder die nor- male Entwicklung und das Wachstum sind.

"Transgen" : Bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus transformiert mit der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenz, Ex- pressionskassette oder Vektor beschreibt der Ausdruck transgen alle solche durch gentechnische Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder die Nukleinsäuresequenz des Zielproteins oder eine mit der Nukleinsäuresequenz des Zielproteins funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden. Die Modifikation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleo- tidreste der entsprechenden Nukleinsäuresequenz erreicht werden.

Malat Dehydrogenase katalysiert die reversible, Pyridinnukleotid-abhängige Umset- zung von Oxalacetat und Malat. Aufgrund der Umsetzung dieser bedeutenden Metabo- lite des Primärstoffwechsels hat die von der Malat Dehydrogenase katalysierte Reakti- on für diverse Prozesse eine Bedeutung (Review in Faske et al. 1997, Plant Physiology 115,705-715). NAD+-abhängige Malat Dehydrogenasen sind in Mitochondrien, Micor- bodies wie Peroxysomen oder Glyoxysomen und dem Zytosol sowie in Wurzelknöll- chen zu finden, während Chloroplasten eine NADP+-abhängige Malat Dehydrogenase enthalten, die lichtabhängig reguliert wird. Malat Dehydrogenasen werden in Arabi- dopsis durch eine Genfamilie codiert. Die einzelnen Isoformen enthalten spezifische N-terminale Transitsequenzen für einen Transport in die Chloroplasten, Mitochondrien und Microbodies. Ferner finden sich Sequenzen für Malat Dehydrogenasen, die auf- grund fehlender Transitpeptide vermutlich im Zytosol verbleiben. Für Malat Dehydro- genasen codierende Sequenzen wurden aus verschiedenen C3-und C4-Pflanzen isoliert (siehe Miller et al. 1998 Plant Journal 15,173-184). Bekannt sind für glyoxyso- malen Malat Dehydrogenase kodierende Nukleinsäuresequenzen sowie Proteinse- quenzen aus Wassermelone (P19446, Swissprot ; Identität zur SEQ ID NO : 2 = 77,5% ; Identität zur Seq ID NO : 3 = 85,4%), Gurke, Arabidopsis, Soya und Reis.

Die Antisense-Inhibierung einer cytosolischen Malat Dehydrogenase in Kartoffel auf bis zu 40% Restaktivität führte zu keinen ausgeprägten Wachstumsphänotypen und kei- nem verringertem Knollenertrag (Jenner et al. 2001, Plant Physiology 126, 1139-1149).

Nach Faske et al. (1997, Plant Physiology 115,705-715) beeinflußt die Verringerung der Expression einer plastidären Malat Dehydrogenase aus Tabak durch Antisense und Cosuppression in transgenen Tabakpflanzen selbst bei stark verringerter Malat Dehydrogenase-Expression (< 20% Restaktivität) die Vitalität der transgenen Pflanzen nicht. Beobachtet wurde nur ein geringe Veränderungen bezüglich der Wachstumspa- rameter (Frischgewicht, Trockengewicht). Die versuchte Überexpression einer plastidä- ren Malat Dehydrogenase aus Sorghum in der C4-Pflanze Flaveria führte durch Co- suppression zur drastischen Inhibierung der Malat Dehydrogenase-Aktivität auf 5-50%

Restaktivität (Trevanion et al. 1997, Plant Physiology 113,1153-1165) ohne signifikan- te Einflüsse auf die Vitalität der Pfanzen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, dass Pflanzen, in denen gezielt glyoxysomale Malat Dehydrogenase verringert wurde, Phä- notypen aufwiesen, die mit durch Herbizdidapplikation erzeugten Phänotypen vegleich- bar sind. Beobachtet wurden drastische Wachstumsretardierungen und Schädigungen wie Chlorosen und Nekrosen.

Obgleich cytosolische und plastidäre Malat Dehydrogenase für Pflanzen nicht essen- tiell ist, können diese Enzyme prinzipiell auch zur Bestimmung von Inhibitoren der glyoxysomalen Malat Dehydrogenase herangezogen werden, da die durch die cytoso- lische und plastidäre Malat Dehydrogenase katalysierte Reaktion die gleiche ist wie die durch die glyoxysomalen Malat Dehydrogenase katalysierte.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Malat Dehydrogenase in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden, vorzugsweise von pflanzlicher Malat Dehydrogenase, besonders bevorzugt von pflanzlicher Malat Dehydrogenase kodiert durch eine Nukleinsäuresequenz umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Aminosäu- resequenz ableiten läßt ; oder d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von min- destens 63% aufweist, ableiten läßt, wobei sich die funktionellen Äquivalente nach c) und d) sich durch eine gleiche Funkti- onalität auszeichnen, d. h. sie haben die enzymatische Aktivität einer glyoxsysomalen Malat Dehydrogenase.

Der Begriff"umfassend"oder"umfassen"bezogen auf Nukleinsäuresequenzen meint, daß die erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz am 3'oder am 5'Ende zusätzliche

Nukleinsäuresequenzen enthalten kann, wobei die Länge der zusätzlichen Nukleinsäu- resequenzen 500 bp am 5'und 500 bp 3'Ende der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen, vorzugsweise 250 bp am 5'und 250 bp am 3'Ende nicht überschreitet, besonders bevorzugt 100 bp am 5'und 100 bp am 3'Ende.

Beispiele für funktionelle Äquivalente gemäß d) sind auch die pflanzlichen Nukleinsäu- resequenzen codierend für Malatdehydrogenase aus Gurke (Gen Bank Accession Number : L31900) Arabidopsis (Gen Bank Accession Number : AC005671) Soya (Gen Bank Accession Number : L01628) und Reis (Gen Bank Accession Number : D85763) sowie die Nukleinsäuresequenz, welche durch die Aminosäuresequenz einer Malat Dehydrogenase aus Wassermelone (Accession Number : P19446, Swissprot) codiert wird.

Alle vorstehend genannten Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Das erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO : 3 gemäß d) weist eine Homologie mit der SEQ ID No : 3 von mindestens 63%, 64%, 65%, 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% vorzugsweise mindestens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung von glyoxysomaler Malat Dehydrogenase in einem Verfahren zur Identifizierung von Herbiziden kodiert durch eine Nukleinsäurese- quenz umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Aminosäu- resequenz ableiten läßt ; oder d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen

Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von min- destens 66% aufweist, ableiten läßt.

Die funktionellen Äquivalente nach d) zeichnen sich durch eine gleiche Funktionalität aus, d. h. sie haben die biologische Funktion einer glyoxysomalen Malat Dehydrogena- se.

Die oben genannten Nukleinsäuresequenzen stammen vorzugsweise aus einer Pflan- ze.

Das erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO : 3 gemäß d) weist eine Homologie mit der SEQ ID No : 3 von mindestens 66%, 67%, 68% vorzugsweise min- destens 69%, 70%, 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% vorzugs- weise mindestens 81 %, 82%, 83% bevorzugt mindestens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.

Weiterhin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuresequenzen beansprucht kodierend für eine pflanzliche glyoxysomalen Malat Dehydrogenase um- fassend : a) eine Nukieinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Aminosäu- resequenz ableiten läßt ; oder d) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO : 2 mit einer Identi- tät von mindestens 79% zu der SEQ ID NO : 2 ; oder e) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von min- destens 87% aufweist, ableiten läßt.

Ebenfalls beansprucht werden die durch die vorstehend genannten Nukleinsäurese- quenzen kodierten Polypeptide. Die funktionellen Äquivalente nach c) und d) zeichnen

sich durch eine gleiche Funktionalität aus, d. h. sie haben die enzymatische, vorzugs- weise biologische Aktivität einer glyoxysomalen Malat Dehydrogenase.

Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO : 2 weisen eine Iden- tität mit der SEQ ID No : 2 von mindestens 79%, 80%, 81 %, 82%, 83% vorzugsweise mindestens 84%, 85%, 86%, 88%, 89%, bevorzugt mindestens 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95% besonders bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% auf.

Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO : 3 weisen eine Iden- tität mit der SEQ ID No : 3 von mindestens 87%, 88%, 89%, 89% vorzugsweise mindes- tens 90%, 91 %, 92%, 93% bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96% besonders bevor- zugt mindestens 97%, 98%, 99% auf.

Der im folgenden verwendete Begriff"erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen" steht für Nukleinsäuresequenzen kodierend für eine Malat Dehydrogenase, vorzugs- weise für Nukleinsäuresequenzen kodierend für eine planzliche Malat Dehydrogenase, besonders bevorzugt für Nukleinsäuresequenzen kodierend für eine planzliche Malat Dehydrogenase umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Aminosäu- resequenz ableiten läßt ; oder d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ) D N0 : 3, das eine Identität mit der SEQ) D N0 : 3 von min- destens 63% aufweist, ableiten läßt, ganz besonders bevorzugt für Nukleinsäuresequenzen kodierend für eine pflanzliche glyoxysomale Malat Dehydrogenase umfassend. a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQID NO : 1 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder

b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Aminosäu- resequenz ableiten läßt ; oder d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von min- destens 66% aufweist, ableiten läßt.

Die durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz kodierten Polypeptide mit der enzymatischen, vorzugsweise biologischen Aktivität einer glyoxsysomalen Malat De- hydrogenase werden im folgenden der Einfachheit halber als"MDH"bzeichnet. Der Begriff"Malat Dehydrogenase"bezeichnet jedes Protein/Enzym mit der enzymatischen Aktivität einer Malat Dehydrogenase.

Glyoxysomale MDHs verursachen in reduzierter Menge Wachstumsretardierungen sowie nekrotische und chlorotische Blätter in Pflanzen.

Die Genprodukte der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen neue Targets für Herbizide dar, welche die Bereitstellung neuer Herbizide zur Bekämpfung unerwünsch- ter Pflanzen ermöglichen. Des weiteren stellen die Genprodukte der erfindungsgemä- ßen Nukleinsäuren stellen neue Targets für Wachstumsregulatoren dar, welche die Bereitstellung neuer Wachstumsregulatoren zur Regulation des Wachstums von Pflan- zen ermöglichen.

Unter unerwünschten Pflanzen sind im weitesten Sinne alle Pflanzen zu verstehen, die an Orten aufwachsen, an denen sie unerwünscht sind, zum Beispiel : Dikotyle Unkräuter der Gattungen : Sinapis, Lepidium, Galium, Stellaria, Matricaria, Anthemis, Galinsoga, Ch. enopodium, Urtica, Senecio, Amaranthus, Portulaca, Xan- thium, Convolvulus, Ipomoea, Polygonum, Sesbania, Ambrosia, Cirsium, Carduus, Sonchus, Solanum, Rorippa, Rotala, Lindernia, Lamium, Veronica, Abutilon, Emex, Datura, Viola, Galeopsis, Papaver, Centaurea, Trifolium, Ranunculus, Taraxacum.

Monokotyle Unkräuter der Gattungen : Echinochloa, Setaria, Panicum, Digitaria, Phleum, Poa, Festuca, Eleusine, Brachiaria, Lolium, Bromus, Avena, Cyperus, Sorg- <BR> <BR> hum, Agropyron, Cynodon, Monochoria, Fimbristyslis, Sagittaria, Eleocharis, Scirpus,

Paspalum, Ischaemum, Sphenoclea, Dactyloctenium, Agrostis, Alopecurus, Apera.

Die SEQ ID NO : 2 oder Teile der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen kön- nen für die Herstellung von Hybridisierungssonden verwendet werden. Die Herstellung dieser Sonden sowie die Durchführung der Experimente ist bekannt. Sie kann zum Beispiel über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nicht radioaktiver Sonden mit- tels PCR und der Verwendung von entsprechend markierten Oligonukleotiden mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfolgen. Die hierfür erforderlichen Technologien sind beispielsweise in T. Maniais, E. F. Fritsch und J. Sambróok,"Mole- cular Cloning : A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) aufgeführt. Die entsprechenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. random Mutagenesis) so modifiziert werden, dass sie für weitere Zwecke eingesetzt werden können, z. B. als Sonde, die spezifisch zu mRNA sowie den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert zwecks Analyse der entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen.

Die oben genannten Sonden können für die Detektion und Isolation von funktionellen Äquivalenten der SEQ ID NO : 2 aus anderen Pflanzenspezies aufgrund von Sequenz- identitäten verwendet werden. Hierbei wird ein Teil oder die gesamte Sequenz der entsprechenden SEQ ID NO : 2 als Sonde zum Screening in einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Pflanzenspezies oder in einer Computer-Recherche nach Sequenzen funktioneller Äquivalente in elektronischen Datenbanken verwendet.

Bevorzugte Pflanzenspezies sind hierbei die bereits eingangs erwähnten unerwünsch- ten Pflanzen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Expressionskassetten enthaltend a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit einer Nukleinsäuresequenz umfassend i. eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nuklein- säuresequenz ; oder ii. eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- schen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestell- ten Aminosäuresequenz ableiten läßt ; oder iii. funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO : 2 mit einer Identität von mindestens 79% zu der SEQ ID NO : 2 ;

iv. eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- schen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funk- tionellen Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von mindestens 92% aufweist, ableiten läßt. b) zusätzliche Funktionselemente ; oder c) eine Kombination aus a) und b) ; sowie die Verwendung von Expressionskassetten enthaltend a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller. Verknüpfung mit einer erfindungs- gemäßen Nukleirisäuresequenz ; b) zusätzliche Funktionselemente ; oder c) eine Kombination aus a) und b) ; zur Expression einer Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH, die in vitro Testsystemen verwendet werden kann. Beide Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Expressionskasetten werden im folgenden als erfindungsgemäße Expressionskassette bezeichnet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressi- onskassette am 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3'-Ende Transkriptions-Terminations-Signal und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollse- quenzen, welche mit der dazwischenliegenden erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenz funktionell verknüpft sind.

Unter den erfindungsgemäßen Expressionskassetten sind auch Analoga zu verstehen, die zum Beispiel durch eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.

Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen nach Punkt a) für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder für Vektoren enthaltend erfindungsgemäße Expressionska- setten sind beispielsweise Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, A-PR-oder im A-PL-Promotor, die zur Expression einer Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH, in gram-negativen Bakterienstämmen verwen- det werden können.

Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promoto- ren amy und SP02, die zur Expression der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH in gram-positiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe-oder Pilzpromotoren AUG1, GPD-1, PX6, TEF, CUP1, PGK, GAP1, TPI, PHO5, AOX1, GAL10/CYC1, CYC1, OiiC, ADH, TDH, Kex2, MFa oder NMT oder Kombinationen der vorstehend genannten Promotoren enthalten (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15 ; 11 (7) : 629-40 ; Romanos et al. Yeast 1992 Jun ; 8 (6) : 423-88 ; Benito et al. Eur. J. Plant Pathol. 104,207-220 (1998) ; Cregg et al. Biotechnology (N Y) 1993 Aug ; 11 (8) : 905-10 ; Luo X., Gene 1995 Sep 22 ; 163 (1) : 127-31 ; Nacken et al., Gene 1996 Oct 10 ; 175 (1-2) : 253-60 ; Turgeon et al., Mol Cell Biol 1987 Sep ; 7 (9) : 3297-305) oder den Transkriptions- terminatoren NMT, Gcy1, TrpC, AOX1, nos, PGK oder CYC1 (Degryse et al., Yeast 1995 Jun 15 ; 11 (7) : 629-40 ; Brunelli et al. Yeast 1993 Dec9 (12) : 1309-18 ; Frisch et al., <BR> <BR> Plant Mol. Biol. 27 (2), 405-409 (1995) ; Scorer et al., Biotechnology (N. Y. ) 12 (2), 181- 184 (1994), Genbank acc. number Z46232 ; Zhao et al. Genbank acc number : AF049064 ; Punt et al., (1987) Gene 56 (1), 117-124), die zur Expression der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH in Hefestämmen verwendet werden können.

Als zur Expression in Insektenzellen geeignete genetische Kontrollsequenzen sind exemplarisch der Polyhedrin-Promotor sowie der p10-Promotor (Luckow, V. A. and Summers, M. D. (1988) Bio/Techn. 6,47-55) zu nennen.

Vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH in Zellkultur sind sind neben Polyadenylierungssequenzen wie z. B. aus Simian Virus 40 eukaryontische Promotoren viralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40.

Weitere vorteilhafte genetische Kontrollsequenzen zur Expression der Malat Dehydro- genase, bevorzugt MDH in Pflanzen sind in den Pflanzenpromotoren CaMV/35S [Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294], PRP1 [Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993)], SSU, OCS, LEB4, USP, STLS1, B33, NOS ; FBPaseP (WO 98/18940) oder im Ubiqui- tin-oder Phaseolin-Promotor enthalten, vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt.

Insbesondere bevorzugt sind Promotoren viralen Ursprungs wie der Promotor des 35S- Transkriptes des Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294 ; Odell et al., Nature 313 (1985), 810-812). Weitere bevorzugte konstitutive Promotoren sind zum Beispiel der Promotor der Nopalinsynthase aus Agrobacterium, der TR- Doppelpromotor, der OCS (Octopin Synthase) Promotor aus Agrobacterium, der Ubi- quitin Promotor (Holtorf S et al., Plant Mol Biol 1995,29 : 637-649), die Promotoren der vakuolärer ATPase Untereinheiten oder der Promotor eines prolinreichen Proteins aus Weizen (WO 91/13991).

Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor als genetische Kontrollsequenz enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Pro- motoren, wie z. B. der PRP1 Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361- 366), ein durch Salicylsäure induzierbarer (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfona- mid-induzierbarer (EP-A-0388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2,397404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol-oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können ebenfalls verwendet werden.

Geeignet sind ferner Promotoren die eine gewebe-oder organspezifische Expression z. B. in Antheren, Ovarien, Blüten und Blütenorganen, Blättern, Schließzellen, Tricho- men, Stengel, Leitgeweben, Wurzeln und Samen vermitteln. Ebenfalls geeignet sind hier neben den oben genannten konstitutiven Promotoren, insbesondere solche Pro- motoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Pro- motor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel (WO 97/05900), der SSU Promotor (small subunit) der Rubisco (Ribulose-1, 5-bisphosphatcarboxylase) oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245). Bevorzugt sind ferner Promotoren, die eine Expression in Samen und pflanzlichen Embryonen steuern. Samenspezifische Promotoren sind zum Beispiel der Promotor des Phaseo- lins (US 5,504, 200, Bustos MM et al., Plant Cell. 1989 ; 1 (9) : 839-53), des 2S Albumin- gens (Joseffson LG et al., J Biol Chem 1987,262 : 12196-12201), des Legumins (Shir- sät A et al., Mol Gen Genet. 1989 ; 215 (2) : 326-331), des USP (unknown seed protein ; Bäumlein H et al., Molecular & General Genetics 1991,225 (3) : 459-67) des Napin Gens (Stalberg K, et al., L. Planta 1996,199 : 515-519), des Saccharosebindeproteins (WO 00/26388) oder der LeB4-Promotor (Bäumlein H et al., Mol Gen Genet 1991,225 : 121- 128 ; Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090).

Weitere als genetische Kontrollsequenzen geeignete Promotoren sind beispielsweise spezifische Promotoren für Knollen, Speicherwurzeln oder Wurzeln, wie beispielsweise der Patatin Promotor Klasse I (B33), der Promotor des Cathepsin D Inhibitors aus Kartoffel, der Promotor der Stärke Synthase (GBSS1) oder der Sporamin Promotor, fruchtspezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtspezifische Promotor aus Tomate (EP-A 409625), fruchtreifung-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der fruchtreifung-spezifische Promotor aus Tomate (WO 94/21794), blütenspezifische Promotoren, wie beispielsweise der Phytoen Synthase Promotor (WO 92/16635) oder der Promotor des P-rr Gens (WO 98/22593) oder spezifische Plastiden-oder Chro- moplasten-Promotoren, wie beispielsweise der RNA-Polymerase Promotor (WO 97/06250) oder auch der Promotor der Phosphoribosylpyrophosphat Amidotransferase aus Glycine max (siehe auch Genbank Accession Nr U87999) oder ein anderer No-

dien-spezifischer Promotor wie in EP-A 249676 können vorteilhaft verwendet werden.

Unter zusätzlichen Funktionselementen b) sind beispielhaft aber nicht einschränkend Reportergene, Replikationsursprünge, Selektionsmarker und sogenannte Affinitäts- Tags, fusioniert mit der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine Protease-Schnittstelle zu verstehen. Weitere geeigne- te zusätzliche Funktionselemente sind Sequenzen, die ein Targeting in den A- poplasten, in Plastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das Peroxisom, das En- doplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleis- ten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci, 15,4 (1996), 285-423).

Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der erfindungsge- mäßen Nukleinsäuresequenzen und/oder der erfindungsgemäßen Expressionskasset- ten enthalten.

Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.

In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nuk- leinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organis- men eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.

Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al.,"Molecular Cloning : A Laboratory Manual."2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant scien- ce, 5,2000) beschrieben.

Die erfindungsgemäße Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien (z. B. der Gattung Synechocystes, Anabaena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc), Proteobakte- rium wie etwa Magnetococcus sp. MC1, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontischen, nicht humanen Zellen (z. B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombi- nanten Herstellung der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH eingesetzt werden,

wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organis- mus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet.

Vektoren enthaltend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäure- sequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestellten Aminosäu- resequenz ableiten läßt ; oder c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO : 2 mit einer Identi- tät von mindestens 79% zu der SEQ ID NO : 2 ; d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funktionellen Ä- quivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identitiät mit der SEQ ID NO : 3 von min- destens 87% aufweist, ableiten läßt. sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.

Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.

Hierbei kann das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure (n), der Expressi- onskassette oder des Vektors in die entsprechenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.

Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989)"Molecular cloning : A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) "Current protocols in molecu- lar biology", John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al."Guide to Yeast Genetics and

Molecular Biology", Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Bei der Transformation von filamentösen Pilzen bieten sich zum einen die Herstellung von Protoplasten und Transformation mit Hilfe von PEG (Wiebe et al. (1997) Mycol. Res.

101 (7) : 971-877 ; Proctor et al. (1997) Microbiol. 143,2538-2591), zum anderen die Transformation unter zur Hilfe nahme von Agrobacterium tumefaciens (de Groot et al.

(1998) Nat. Biotech. 16,839-842) an.

Für dikotyle Pflanzen können die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt werden. Geeignete Methoden sind das biolisti- sche Verfahrens oder durch Protoplastentransformation (vergl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In : Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J.

Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds. ), Vol. 2,627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gen- transfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausge- geben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225) beschrieben.

Die Transformation mittels Agrobakterien sowie die für die Transformation zu verwen- denden Vektoren sind dem Fachmann bekannt und in der Literatur ausführlich be- schrieben (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti-oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir- Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertra- gen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agro- bakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzregion eingerahmt werden.

Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (; Holsters et al. Mol. Gen.

Genet. 163 (1978), 181-187), EP A 0 120 516 ; Hoekema, In : The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V ; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4 : 1-46 und An et al. EMBO J. 4 (1985), 277-287).

Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobacterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506 ; Hiei et al, Plant J. 6 (1994) 271-282 ; Deng et al ; Science in China 33 (1990), 28-34 ; Wilmink et al, Plant Cell Reports 11, (1992) 76-80 ; May et al ; Biotechnology 13 (1995) 486-492 ; Con- ner und Domisse ; Int. J. Plant Sci. 153 (1992) 550-555 ; Ritchie et al ; Transgenic Res.

(1993) 252-265). Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux ; Plant Physio. 104 (1994), 37-48 ; Vasil et al ; Biotechnology 11 (1992), 667-674 ; Ritala et al, Plant Mol. Biol 24, (1994) 317-325 ; Spencer et al, Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625- 631) die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen ; die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wurde in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128 ; EP 0513849 A1 ; EP 0465875 A1 ; EP 0292435 A1 ; Fromm et al, Biotechnology 8 (1990), 833-844 ; Gordon-Kamm et al, Plant Cell 2 (1990), 603-618 ; Koziel et al, Biotechnology 11 (1993) 194-200 ; Moroc et al, Theor Applied Genetics 80 (190) 721-726).

Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s. o. ; Ritala et al, s. o. ; Weizen (Nehra et al, Plant J.

5 (1994) 285-297).

Mit einem erfindungsgemäßen Vektor transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen wie Testpflanzen wie Arabidopsis oder Kulturpflanzen wie Getreide, Mais, Hafer, Roggen, Gerste, Weizen, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Toma- te, Karotte, Paprika, Raps, Tapioka, Maniok, Pfeilwurz, Tagetes, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß-und Weinspezies verwendet werden, z. B. indem verwun- dete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Die genetisch veränderten Pflanzenzellen können über alle dem Fachmann bekannten Methoden regeneriert werden. Entsprechende Methoden können den oben genannten Schriften von S. D. Kung und R. Wu, Potrykus oder Höfgen und Willmitzer entnommen werden.

Die durch Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen einer Expressionskassette, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz oder einem Vektor, enthaltend die vorstehend genannte Expressionskassette, hergestellten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von transgenen Organismen enthaltend eine erfindungsgemäße Expres- sionskassette z. B. für die Bereitstellung rekombinanten Proteins und/oder die Verwen- dung dieser Organismen in in vivo Testsystemen.

Bevorzugte Organismen für die rekombinante Expression sind sind neben Bakterien, Hefen, Moose, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinie.

Bevorzugte Moose sind Physcomitrella patens oder weitere in Kryptogamen, Bd. 2, Moose, Farne, 1991, Springer Verlag (ISBN 3540536515), beschriebene Moose.

Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacteri- um, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystes, Anä- baena, Calothrix, Scytonema, Oscillatoria, Plectonema und Nostoc, besonders bevor- zugt Synechocystis oder Anabena bevorzugt.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Schizosaccheromyces, Hansenula oder Pichia.

Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Secti- on B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze.

Bevorzugte Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten wie Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemäßen transge- nen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotyle Kulturpflanzen, wie zum Bei- spiel Brassicacae wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Kohlarten oder Canola ; Legumino- sae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss Solanaceae wie Kartof- fel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika ; Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula ; Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini, oder Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Roter Pfeffer, Möhre, Karotte, Zuckerrübe oder verschiedene Baum-, Nuss-und Weinspecies.

Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet wie beispielsweise C. elegans.

Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsystemen und Vektoren, die öffent- lich zugänglich oder kommerziell erhältich sind.

Zur Verwendung in E. coli Bakterien sind die typischen vorteilhaften, kommerziell erhältlichen Fusions-und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Inc ; Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67 : 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase bein- haltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69 : 301-315) der"pKK233-2"von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET"-, und die"pBAD"-Vektor-Serien von Stratagene, La Jolla zu nennen.

Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYepSec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6 : 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982)'Cell 30 : 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54 : 113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ- Derivate, pPICZ-Derivate sowie die Vektoren des"Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in : van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in : Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press : Cambridge.

Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z. B. für die Expression in Sf9, Sf21 oder Hi5 Zellen, welche über rekombinante Baculoviren infiziert werden. Dies sind z. B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3 : 2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170 : 31- 39). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme"MaxBac 2.0 Kit" und"Insect Select System"von Invitrogen, Calsbald oder"BacPAK Baculovirus Ex- pressionssystem"von CLONTECH, Palo Alto, CA. Insektenzellen eignen sich in be- sonderer Weise zur Überexpression eukaryontischer Proteine, da sie posttranslationale Modifikationen der Proteine durchführen, die in Bakterien und Hefen nicht möglich sind.

Die Handhabung von Insektenzellen in Zellkultur sowie ihre Infektion zur Expression von Proteinen sind dem Fachmann bekannt und können in Analogie zu bekannten Methoden erfolgen (Luckow und Summers, Bio/Tech. 6,1988, pp. 47-55 ; Glover and Hames (eds) in DNA Cloning 2, A practical Approach, Expression Systems, Second Edition, Oxford University Press, 1995,205-244).

Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich wie obenste- hend erwähnt in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20 : 1195-1197 oder in Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl.

Acid. Res. 12 : 8711-8721.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in : Seed, B. (1987) Nature 329 : 840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6 : 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ur- sprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simi- an Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind ge- nannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual.

2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al.

(Trends in plant science, 5,2000) beschrieben.

Die transgenen Organismen, welche eine Nukleisäuresequenz umfassend enthalten, werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung beansprucht.

Sämtliche, oben beschriebenen Ausführungsformen der transgenen Organismen wer- den unter dem Begriff"erfindungsgemäßer transgener Organismus"zusammengefaßt.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH in einem Verfahren zur Identifizierung von Testver- bindungen mit herbizider Wirkung.

Bevorzugt umfasst das erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung von Verbin- dungen mit herbizider Wirkung die folgenden Schritte : i. Inkontaktbringen von Malat Dehydrogenase, bevorzugt von MDH mit einer oder mehreren Testverbindungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testverbin- dung (en) an die Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH erlauben ; und ii. Nachweis, ob die Testverbindung an die Malat Dehydrogenase, bevorzugt an die MDH aus i) bindet ; oder iii. Nachweis, ob die Testverbindung die enzymatische oder biologische Aktivität der Malat Dehydrogenase, bevorzugt der MDH aus i) reduziert oder blockiert ; oder iv. Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression einer Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH reduziert oder blockiert.

Der Nachweis gemäß Schritt (ii) des oben stehenden Verfahrens kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, erfol- gen. Hierbei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine detektierbare Markierung enthalten, wie z. B. eine fluoreszierende, radioisotope, chemilumineszie- rende oder enzymatische Markierung. Beispiele für enzymatische Markierungen sind Meerrettich Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luzifierase. Die anschließende Detektion richtet sich nach der Markierung und ist dem Fachmann bekannt.

Hierbei sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung auch für Hochdurchsatzmethoden (High Troughput Screening, HTS) geeignet sind :

1. Über Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 11753-11575) läßt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Flores- zenzmoleküls in Abhängigkeit zur Masse in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an die Malat De- hydrogenase, bevorzugt die MDH läßt sich FCS zur Bestimmung von Protein- Ligand-Wechselwirkungen einsetzten. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten Testverbindung aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Ver- fahren so konzipiert sein, dass eine durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch weitere Testverbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay").

2. Die Fluoreszenzpolarisation nutzt die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emittie- ren. Kann der Fluorophor allerdings während des angeregten Zustands rotieren, so geht die Polarisation des emittierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger ver- loren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z. B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmit- tel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das Mess- signal eine Aussage über die Größe des am Fluorophor gebundenen Rests tref- fen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300). Ein erfindungsge- mäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Flores- zenzmolekül markierten Testverbindung an die Malat Dehydrogenase, bevorzugt die MDH aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen"Verdrängungsassays"konzipiert sein.

3. Fluoreszenz-Resonanz Energie Tranfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekü- len unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Ak- zeptormoleküls. Durch Fluoreszenzmarkierung der Malat Dehydrogenase, bevor- zugt der MDH und den auf Bindung Tetsverbindung kann mittels FRET die Bin- dung gemessen werden (Cytometry 34,1998, pp. 159-179). Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen"Verdrän- gungsassays"konzipiert sein. Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die"Homogenous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), wie sie von Packard BioScience vertrieben wird.

4. Surface Enhanced-Laser Desorption/lonisation (SELDI) in Kombination mit ei- nem"Time of Flight"Massenspektrometer (MALDI-TOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein-

Ligand Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Bio- chem. 70 : 750-756). In einer bevorzugten Ausführungsform immobilisiert man nun die Malat Dehydrogenase, bevorzugt die MDH auf einem geeigneten Träger und inkubiert diesen mit der Testverbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten kann man die an die Malat Dehydrogenase, bevorzugt die MDH zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik detektieren und somit an die Malat Dehydrogenase, bevorzugt an die MDH gebundene Testverbindungen selektieren.

5. Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des Brechnungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Bre- chungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Ober- fläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al. Sensor Actua- tors 4 (1983) 299-304 ; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). Die Messung kann beipielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) vertriebenen auf Oberflä- chen-Plasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungsge- mäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung einer Testverbindung an die Malat Dehydrogenase, bevorzugt an die MDH aufgebaut werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Form des unter 1 beschriebenen "Verdrängungsassays"konzipiert sein.

Die über die oben genannten Verfahren 1 bis 5 identifizierten Verbindungen können als Inhibitoren geeignet sein. Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einer anderen Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens auf ihre herbizide Wirkung überprüft werden.

Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensionalen Struktur der Malat Dehydrogenase, bevorzugt der MDH mittels Röntgenstrukturanalyse weitere potentielle herbizide Wirkstoffe mittels"Molecular Modelling"zu detektieren. Die Her- stellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen dieser Messungen, die Detektion einer Bindungstelle im Protein sowie die Vorhersage möglicher Inhibi- torstrukturen sind dem Fachmann bekannt. Über"Molecular Modelling"ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbin- dungen möglich.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und ii) basiert, besteht darin, daß eine Testverbindung selektiert wird, wel-

che die enzymatische Aktivität einer Malat Dehydrogenase, vorzugsweise MDH redu- ziert oder blockiert.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und ii) basiert, besteht darin, daß eine Testverbindung selektiert wird, welche die enzymatische Aktivität einer Malat Dehydrogenase, vorzugsweise MDH reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubier- ten Malat Dehydrogenase, vorzugsweise MDH mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten Malat Dehydrogenase, vorzugsweise MDH verglichen wird.

Eine bevorzugte Ausführungsform des auf den Schritten i) und ii) basierenden Verfah- rens besteht darin, dass i. eine Malat Dehydrogenase, bevorzugt eine MDH in einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß eine Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH enthält, kultiviert wird ; ii. die Malat Dehydrogenase, bevorzugt die MDH aus Schritt i) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird ; und iii. eine Verbindung selektiert wird, welche die Aktivität der Malat Dehydrogenase, bevorzugt der MDH reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Test- verbindung inkubierten Mal at Dehydrogenase.

Eine bevorzugte Ausführungsform des auf den Schritten i) und ii) basierenden Verfah- rens besteht darin, dass i. eine Malat Dehydrogenase, bevorzugt eine MDH in einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß eine Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH enthält, kultiviert wird ; ii. die Malat Dehydrogenase, bevorzugt die MDH aus Schritt i) im Zellaufschluss des transgenen bzw. nicht transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird ; und iii. eine Verbindung selektiert wird, welche die Aktivität der Malat Dehydrogenase, bevorzugt der MDH reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Test- verbindung inkubierten Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH mit der Aktitivtät

einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten Malat Dehydrogenase, bevor- zugt MDH ermittelt wird.

Die Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen, mit einer erfindungsgemäßen Expressionskasette transformierten Organismus bestehen. Falls erforderlich kann die Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH partiell oder vollständig über gängige Methoden aufgereinigen werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reini- gung von Proteinen sind beispielsweise in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) ; ISBN 0- 87969-309-6 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über nach dem Fachmann bekannten Affini- tätschromoatographie erfolgen.

Die für in vitro Verfahren benötigte Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH kann somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus oder aus einem Organismus, der ein Enzym mit der enzymatischen Aktivi- tät vorzugsweise biologischen einer Malatdehydrogenase enthält, isoliert werden, zum Beispiel aus einer unerwünschten Pflanze, wobei unter dem Begriff der unerwünschten Pflanze die eingangs erwähnten Spezies zu verstehen sind.

Zur Identifizierung von herbiziden Verbindungen wird nun die Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH mit einer Testverbindung inkubiert. Nach einer Reaktionszeit wird die enzymatische Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH mit der enzymatischen Aktitivtät einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH ermittelt. Bei Inhibition der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH beobachtet man eine signifikante Abnahme der Akti- vität im Vergleich zur Aktivität des nicht inhibierten erfindungsgemäßen Polypeptides, wobei eine Abnahme von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% bis hin zu einer 100% Reduktion (Blockierung) erzielt wird. Bevorzugt mindestens 50% Hemmung bei Kon- zentrationen der Testverbindung von 104 M, bevorzugt bei 10-5 M, besonders bevor- zugt von 10'6. M bezogen auf Enzymkonzentration im mikromolaren Bereich.

Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH kann beispielsweise über einen Aktivitätstest erfolgen, in welchem die Zunahme des Produktes, die Abnahme des Substrates (oder Eduktes) bzw. die Ab-oder Zuname des Cofaktors oder über eine Kombination aus mindestens zwei der vorstehend ge- nannten Parameter in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden.

Beispiele für geeignete Substrate sind z. B. Malat (-) -Tartrate (S, S), (S)-Malate, 2- Hydroxybutyrat, 2-Hydroxyglutarate 2-Hydroxymalonat, 2-Oxobutyrat, 2-oxoglutarat, Ketomalonat, L-Malat, meso-Tartrat (S, R), oxalacetat und für geeignete Cofaktoren NAD+, NADH, APAD, APADH. Je nach verwendeter Malat Dehydrogenase kann auch NADPH als Cosubstrat eingesetzt werden. Gegebenenfalls können auch Derivate der vorstehend genannten Verbindungen verwendet werden, die eine detektierbare Mar- kierung enthalten, wie z. B. eine fluoreszierende, radioisotope oder chemilumineszie- rende Markierung.

Die für den Aktivitätstest einzusetzenden Mengen an Substrat können zwischen 0.5- 100 mM und Mengen an Cofaktor zwischen 0.1-5 mM bezogen auf 1-100 pg/ml Enzym liegen.

Die Bestimmung der Aktivität kann beispielsweise in Analogie zu dem von Gietl et al (1996, BBA 1274,48-58) beschriebenen Verfahren erfolgen.

Des weiteren kann die Bestimmung der Aktivität in Schritt iii) des oben genannten Verfahrens a) photometrisch über die Umwandlung von NADH zu NAD+ ; und/oder b) photometrisch über die Umwandlung von NAD+ zu NADH erfolgt ; oder c) photometrisch über die Umwandlung von APAD zu APADH ; oder erfolgen.

Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das auf den Schritten i) und iii) basiert, besteht aus den folgenden Schritten : i. Herstellung eines transgenen Organismus enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine glyoxsomale Malat Dehydrogenase umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nuklein- säuresequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NÖ : 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- schen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestell-

ten Aminosäuresequenz ableiten läßt ; oder d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- schen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funk- tionellen Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von mindestens 66%, vorzugsweise 81 % aufweist, ableiten läßt ; ii. Aufbringen einer Testverbindung auf den transgenen Organismus nach i) und auf einen nicht-transgenen Organismus des gleichen Genotyps ; iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht transgenen Organismus nach der Aufbringung der Testverbindung ; und iv. Selektion von Testverbindungen, die ein vermindertes Wachstum oder einge- schränkte Oberlebensfähigkeit des nicht-transgenen Organismus bewirken ver- glichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus bewirken.

Im oben genannten Verfahren wird in dem transgenen Organismus Malat Dehydroge- nase überexprimiert.

Hierbei beträgt der Wachstumsunterschied der in Schritt iv) zur Selektion eines Inhibi- tors mit herbizider Wirkung mindestens 10%, vorzugsweise 20%, bevorzugt 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt 50%.

Der transgene Organismus ist hierbei vorzugsweise eine Pflanze, Alge, ein Cyanobak- terium z. B. der Gattung Synechocystes oder ein Proteobakterium wie etwa Magneto- coccus sp. MC1, bevorzugt Pflanzen, die sich mittels gängiger Techniken transformie- ren lassen, wie Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Nicotiana Tabacum, Cyano- bakterien die sich leicht transformieren lassen, wie z. B. Synechocystis, in welchen die für ein erfindungsgemäße Polypeptid kodierende Sequenz über Transformation inkor- poriert wurde. Diese transgenen Organismen weisen daher eine erhöhte Toleranz gegen Verbindungen auf, welche das erfindungsgemäße Polypeptid inhibieren. Hierbei können auch"knock-out"-Mutanten verwendet werden, bei denen das in diesem Or- ganismus natürlich vorhandene analoge Gen für Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH gezielt ausgeschaltet worden ist.

Die vorstehend genannte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jedoch auch zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wirkung verwendet werden. Hierbei wird als transgener Organismus eine Pflanze eingesetzt.

Das Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit wachstumsregulatorischer Wir-

kung umfasst somit die folgenden Schritte : i. Herstellung einer transgenen Pflanze enthaltend eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine glyoxsomale Malat Dehydrogenase umfassend a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 1 dargestellten Nuklein- säuresequenz ; oder b) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz ; oder c) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- schen Codes durch Rückübersetzung aus der in SEQ ID NO : 3 dargestell- ten Aminosäuresequenz ableiten läßt ; oder d) eine Nukleinsäuresequenz, die sich aufgrund des degenerierten geneti- schen Codes durch Rückübersetzung der Aminosäuresequenz eines funk- tionellen Äquivalents der SEQ ID NO : 3, das eine Identität mit der SEQ ID NO : 3 von mindestens 66%, vorzugsweise 81 % aufweist, ableiten läßt ; ii. Aufbringen einer Testsubstanz auf die transgene Pflanze nach i) und auf eine nicht-transgene Pflanze der gleichen Sorte ; iii. Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit der transgenen und der nicht transgenen Pflanze nach dem Aufbringen der Testsubstanz ; und iv. Selektion von Testsubstanzen, die ein verändertes Wachstum der nicht- transgenen Pflanze bewirken verglichen mit dem Wachstum der transgenen Pflanze.

Im oben genannten Verfahren wird in dem transgenen Organismus Malat Dehydroge- nase überexprimiert.

Hierbei werden in Schritt iv) Testverbindungen selektiert, die ein verändertes Wachs- tum des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organmismus bewirken. Unter verändertem Wachstum ist hierbei eine Hemmung des vegetativen Wachstums der Pflanzen zu verstehen, was sich insbeson- dere in einer Reduzierung des Längenwachstums äußeren kann. Die behandelten Pflanzen weisen demgemäß einen gedrungenen Wuchs auf ; außerdem ist eine dunkle- re Blattfärbung zu beobachten. Weiterhin ist unter verändertem Wachstum auch eine zeitliche Veränderung des Reifeverlaufs, eine Heummung oder Vermehrungen seitli-

cher Verzweigungen der Pflanzen, eine Verkürzung bzw. Verlängerung der Entwick- lungsstadien, eine Erhöhung der Standfestigkeit, das Wachstum größerer Mengen an Knospen, Blüten, Blättern, Früchten, Samenkörnern, Wurzeln und Knollen, eine Erhö- hung des Zuckergehaltes in Pflanzen wie Zuckerrüben, Zuckerrohr sowie Zitrusfrüch- ten, des Proteingehaltes in Pflanzen wie Getreide oder Soja oder eine Stimulierung des Latexfluß an Gummibäumen zu verstehen. Die Detektion dieses veränderten Wachstums ist dem Fachmann bekannt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können auch mehrere Testverbindungen in einem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden. Wenn durch eine Gruppe von Testverbindungen eine Beeinflussung des Targets erfolgt, dann ist es entweder mög- lich, die einzelnen Testverbindungen direkt zu isolieren oder die Gruppe von Testver- bindungen in verschiedene Untergruppen zu teilen, z. B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Testver- bindungen im erfindungsgemäßen Verfahren zu reduzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren wiederholt man dann mit der einzelnen Testverbindung oder der entspre- chenden Untergruppe von Testverbindungen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Untergruppe nur noch eine geringe Anzahl von Testverbindungen oder nur noch eine Testverbindung umfaßt.

Alle oben beschriebenen Verfahren für die Identifizierung von Inhibitoren mit herbizider oder wachstumsregulatorischer Wirkung werden im folgenden als"erfindungsgemäße Verfahren"bezeichnet.

Sämtliche, über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen kön- nen anschließend auf ihre herbizide oder wachstumsregulatorische Wirkung in vivo überprüft werden. Eine Möglichkeit zur Prüfung der Verbindungen auf herbizide Wir- kung ist die Verwendung der Wasserlinse Lemna minor in Mikrotiterplatten. Als Para- meter können Veränderungen des Chlorophyllgehalts und die Photosyntheseleistung gemessen werden. Es ist auch möglich, die Verbindung auf unerwünschte Pflanzen direkt zu applizieren, wobei die herbizide Wirkung z. B. über eingeschränktes Wachs- tum festgestellt werden kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch vorteilhaft in Hochdurchsatzverfahren, sog. HTS durchgeführt werden, welches das parallele Testen einer Vielzahl verschie- dener Verbindungen ermöglicht.

Im HTS bietet sich für die praktische Durchführung die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfingungsgemäße Nukleinsäuresequenz enthaltenden Vektoren, einen

oder mehrere transgene Organismen, welche mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten oder eines oder mehrere (Poly) peptide codiert über die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten. Der verwendete Träger kann fest oder flüssig sein, ist bevorzugt fest, besonders bevorzugt eine Mikrotiterplat- te. Die vorstehend genannten Träger sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gemäß der am weit verbreitesten Technik werden 96-well, 384-well und 1536 well Mikrotiterplatten verwendet, die in der Regel Volumina von 200nul umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS- Systems passend zu den entsprechenden Mikrotiterplatten wie viele Instrumente, Materialien, automatische Pipettiervorichtungen, Robotoren, automatisierte Plattenle- ser sowie Plattenwascher kommerziell erhältlich.

Neben den auf Mikrotiterplatten basierenden HTS-Verfahren können auch sogenannte "free format assays"oder Testsysteme, die zwischen den Proben keine physischen Barrieren aufweisen, verwendet werden wie z. B. in Jayaickreme et al., Proc. Natl.

Acad. Sci U. S. A. 19 (1994) 161418 ; Chelsky,"Strategies for Screening Combinatorial Libaries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Phila- delphia, Pa. (Nov. 710,1995) ; Salmon et al., Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5, 976, 813.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit herbizider Wirkung identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Diese Verbindungen werden im folgenden"selektierte Verbindungen"genannt. Sie weisen ein Molekulargewicht von kleiner als 1000 g/möl, vorteilhaft kleiner 500 g/mol, bevorzugt kleiner 400 g/mol, be- sonders bevorzugt kleiner 300 g/mol. Verbindungen mit herbizider Wirkung weisen einem Ki-Wert kleiner 1 mM, bevorzugt kleiner 1 uM, besonders bevorzugt kleiner 0,1 pM ganz besonders bevorzugt kleiner 0, 01 uM aufweisen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen mit wachstumsregulatorsi- cher Wirkung identifiziert nach den erfindungsgemäßen Verfahren. Auch diese Verbin- dungen werden im folgenden"selektierte Verbindungen"genannt.

Die selektierte Verbindungen können natürlich auch in Form ihrer landwirtschaft brauchbaren Salze vorliegen. Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die herbizide Wirkung der über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen mit herbizider Wirkung nicht negativ beeinträchtigen.

Ferner können die selektierte Verbindungen sofern sie asymmetrisch substituierte a- Kohlenstoffatome enthalten, entweder als Racemate, Enantiomerengemische, reine

Enantiomere oder, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch als Diastereome- rengemische vorliegen.

Die selektierten Verbindungen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z. B. in Zellextrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikro- organismen auftreten. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreie Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3rd Edition (1994), z. B. Kapitel 17. Die selektierte Verbindungen können auch aus umfangreichen Substanzbibliotheken stammen.

Mögliche Testverbindungen können Expressionsbibliotheken wie z. B. cDNA-Expressi- onsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stof- fe, Hormone, PNAs oder ähnliches sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880 ; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245 ; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen).

Die selektierte Verbindungen können zur Bekämpfung von unerwünschtem Pflanzen- wuchs und/oder als Wachstumsregulatoren verwendet werden. Herbizide Zusammen- setzungen, welche die selektierten Verbindungen enthalten, bekämpfen Pflanzen- wuchs auf Nichtkulturflächen sehr gut. In Kulturen wie Weizen, Reis, Mais, Soja und Baumwolle wirken sie gegen Unkräuter und Schadgräser, ohne die Kulturpflanzen nennenswert zu schädigen. Dieser Effekt tritt vor allem bei niedrigen Aufwandmengen auf. Die selektierten Verbindungen können zur Bekämpfung der oben bereits erwähn- ten Schadpflanzen verwendet werden.

In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können selektierten Verbin- dungen bzw. diese enthaltende herbizide Zusammensetzungen vorteilhaft noch in einer weiteren Zahl von Kulturpflanzen zur Beseitigung unerwünschter Pflanzen einge- setzt werden. In Betracht kommen beispielsweise folgende Kulturen : Allium cepa, Ananas comosus, Arachis hypogaea, Asparagus officinalis, Beta vulgaris spec. altissima, Beta vulgaris spec. rapa, Brassica napus var. napus, Brassica napus var. napobrassica, Brassica rapa var. silvestris, Camellia sinensis, Carthamus tinctori- us, Carya illinoinensis, Citrus limon, Citrus sinensis, Coffea arabica (Coffea canephora, Coffea liberia), Cucumis sativus, Cynodon dactylon, Daucus carota, Elaeis guineen- sis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium hirsutum, (Gossypium arboreum, Gossy- pium herbaceum, Gossypium vitifolium), Helianthus annuus, Hevea brasiliensis, Hor- deum vulgäre, Humulus lupulus, Ipomoea batatas, Juglans regia, Lens culinaris, Linum usitatissimum, Lycopersicon lycopersicum, Malus spec., Manihot esculenta, Medicago sativa, Musa spec., Nicotiana tabacum (N. rustica), Olea europaea, Oryza sativa, Pha-

seolus lunatus, Phaseolus vulgaris, Picea abies, Pinus spec., Pisum sativum, Prunus avium, Prunus persica, Pyrus communis, Ribes sylestre, Ricinus communis, Saccha- rum officinarum, Secale cereale, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor (s. vulgare), Theobroma cacao, Trifolium pratense, Triticum aestivum, Triticum durum, Vicia faba, Vitis vinifera, Zea mays.

Darüber hinaus können die selektierten Verbindungen auch in Kulturen, die durch Züchtung einschließlich gentechnischer Methoden gegen die Wirkung von Herbiziden tolerant sind, verwandt werden. Die Herstellung dieser Kulturen wird weiter unten beschrieben.

Weiter Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der oben bereits erwähnten herbiziden oder wachstumsregulatorischen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man selektierten Verbindungen mit geeigneten Hilfsmitteln zu Pflanzenschutzmitteln formuliert.

Die selektierten Verbindungen können z. B. in Form von direkt versprühbaren wässri- gen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, emulgierbaren Konzentraten, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten formuliert werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur der selektierten Verbindungen und sollte in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der selektierten Verbindungen gewährleisten. Die herbiziden Zusammensetzung enthalten eine herbizid wirksame Menge mindestens einer selektierten Verbindung und für die Formulierung von herbizi- den Zusammensetzungen übliche Hilfsstoffe.

Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wässrigen oder ölhaltigen Formulierun- gen sowie dispergierbaren Konzentraten (DC) können die selektierten Verbindungen in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formule- rungshilfsstoffe zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus selektierter Verbindung, gegebenenfalls Lösungsmitteln oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind emulgierbare Konzentrate (EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), dispergierbaren Konzentrate (DC), Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granulaten, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich (soluble) oder dispergierbar (wet- table) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffreisetzung

verhinderenden Überzug ("coating") versehen werden.

Prinzipiell sind unter dem Begriff"Hilfsmittel"folgende Verbindungsklassen zu verste- hen : Antischäumungsmittel, Verdicker, Netzmittel, Haftmittel, Dispergiermittel, Emul- giermittel, Bakterizide und/oder thixotrophe Agentien. Die Bedeutung der oben ge- nannten Mittel ist dem Fachmann bekannt.

SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder Vermahlen in speziellen Mühlentypen (z. Bsp. Hammermühlen). DC, SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermah- lung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organi- schen Phase, die weitere Hilfsmittel oder selektierte Verbindungen enthalten kann, hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Pulver-, Streu-und Stäubemittel können vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirksamen Sub- stanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden. Granulate, z. B. Umhüllungs-, Imprägnierungs-und Homogengranulate können durch Bindung der selektierten Ver- bindungen an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Weitere Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z. Bsp. in folgenden Schriften aufgeführt : US <BR> <BR> 3,060, 084, EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Che- mical Engineering ; Dec. 4,1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 und ff. WO 91/13546, US 4,172, 714, US 4,144, 050, US 3,920, 442, US 5,180, 587, US 5,232, 701, US 5,208, 030, GB 2,095, 558, US 3,299, 566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation tech- nology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Federal Republic of Germany), 2001.

Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die erfindungsgemäßen Formu- lierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z. Bsp. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Diesel- öl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclo- hexanon oder stark polare Lösungsmittel, z. B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser.

Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomee- nerde, Calcium-und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Dün- gemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und

pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz-und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.

Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierun- gen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z. Bsp. Alkali-, Erdalkali-, Ammo- niumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z. B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin-und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl-und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether-und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta-und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfo- niertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxye- thylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl-oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalko- holethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin- Sulfitablaugen oder Methylcellulose.

Die Applikation der herbiziden Zusammensetzungen bzw. der selektierten Verbindun- gen kann im Vorauflauf-oder im Nachauflaufverfahren erfolgen. Sind die selektierten Verbindungen für gewisse Kulturpflanzen weniger verträglich, so können Ausbrin- gungstechniken angewandt werden, bei welchen die selektierten Verbindungen mit Hilfe der Spritzgeräte so gespritzt werden, daß die Blätter der empfindlichen Kultur- pflanzen nach Möglichkeit nicht getroffen werden, während die selektierten Verbindun- gen auf die Blätter darunter wachsender unerwünschter Pflanzen oder die unbedeckte Bodenfläche gelangen (post-directed, lay-by).

Die Aufwandmengen an selektierten Verbindungen betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha.

Die Bereitstellung des herbiziden Targets ermöglicht weiterhin ein Verfahren zur Identi- fizierung einer Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH, welche nicht oder nur einge- schränkt durch ein Herbizid, welches als Wirkort die Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH hat, z. B. die herbizid wirkenden selektierten Verbindungen, gehemmt wird. Im folgenden wird ein sich derart von der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH unter- scheidendes Protein als MDH-Variante bezeichnet, welches durch eine Nukleinsäuresequenz codiert wird, welche i) für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Malat Dehydrogenase kodiert, welche durch nach den oben genannten Verfahren ermittelte Substanzen

mit herbizider Wirkung, welche Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH inhibie- ren, nicht inhibiert wird ; ii) durch ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO : 3 mit einer Identität von mindestens 63% zu der SEQ ID NO : 3 kodiert werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das oben genannte Verfahren zur Er- zeugung von Nukleinsäuresequenzen codierend für MDH-Varianten von Nukleinsäu- resequenzen umfassen aus folgenden Schritten : a) Expression der von den oben genannten Nukleinsäuren kodierten Proteine in einem heterologen System oder in einem zellfreie System ; b) Randomisierte oder gerichtete Mutagenese des Proteins durch Modifikation der Nukleinsäure ; c) Messung der Interaktion des veränderten Genprodukts mit dem Herbizid ; d) Identifizierung von Derivaten des Proteins die eine geringere Interaktion aufwei- sen ; e) Testung der biologischen Aktivität des Proteins nach Applikation des Herbizides ; Auswahl der Nukleinsäuresequenzen, die eine veränderte biologische Aktivität gegenüber dem Herbizid aufweisen.

Das funktionelle Äquivalent der SEQ ID NO : 3 gemäß ii) weist eine Homologie mit der SEQ ID No : 3 von mindestens 63%, 64%, 65%, 66% vorzugsweise mindestens 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74% vorzugsweise mindestens 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% besonders bevorzugt mindestens 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.

Die nach dem oben beschriebenen Verfahren nach ausgewählten Sequenzen werden vorteilhaft in einen Organismus eingebracht. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsge- genstand ein nach diesem Verfahren hergestellter Organismus. Bevorzugt ist der Organismus eine Pflanze, besonders bevorzugt eine der oben definierten Kulturpflan- zen.

Anschließend erfolgt die Regeneration ganzer Pflanzen und Überprüfung der Resis- tenz gegenüber der selektierten Verbindung in intakten Pflanzen.

Veränderte Proteine und/oder Nukleinsäuren, die in Pflanzen Resistenz gegen die selektierten Verbindungen vermitteln können, können aus den oben genannten Nuk- leinsäuresequenzen auch Über die sogenannte"site directed mutagenesis"hergestellt werden, durch diese Mutagenese kann beispielsweise die Stabilität und/oder Aktivität des Target Proteins oder die Eigenschaften wie Bindung und Wirkung der oben ge- nannten erfindungsgemäßen Inhibitoren sehr gezielt verbessern bzw. verändert wer- den.

Beispielsweise wurde von Zhu et al. (Nature Biotech., Vol. 18, May 2000 : 555-558) eine"site directed mutagenesis"-Methode in Pflanzen beschrieben, die vorteilhaft verwendet werden kann.

Weiterhin können Veränderungen über die von Spee et al. (Nucleic Acids Research, Vol. 21, No. 3,1993 : 777-78) beschriebenen PCR-Methode unter Verwendung von dITP zur zufälligen Mutagenese erzielt werden oder durch die von Rellos et al. (Protein Expr. Purif., 5,1994 : 270-277) weiter verbessert Methode.

Eine weitere Möglichkeit zur Herstellung dieser veränderten Proteine und/oder von Nukleinsäuren ist eine von Stemmer et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91,1994 : 10747-10751) beschriebene"in vitro"Rekombinationstechnik für die molekulare Evolu- tion oder die von Moore et al. (Nature Biotechnology Vol. 14,1996 : 458-467) beschrie- bene Kombination der PCR-und Rekombinationsmethode.

Ein weiterer Weg zur Mutagenese von Proteinen wird von Greener et al. in Methods in Molecular Biology (Vol. 57,1996 : 375-385) beschrieben. In EP-A-0 909 821 wird eine Methode zur Veränderung von Proteinen unter Verwendung des Mikroorganismus E. coli XL-1 Red beschrieben. Dieser Mikroorganismus erzeugt bei der Replikation Mutan- tionen in den eingeführten Nukleinsäuren und führt so zu einer Veränderung der gene- tischen Information. Über Isolierung der veränderten Nukleinsäuren bzw. der veränder- ten Proteine und Testung auf Resistenz lassen sich leicht vorteilhafte Nukleinsäuren und die durch sie kodierten Proteine identifizieren. Diese können dann nach Einbringen in Pflanzen dort die Resistenz ausprägen und so zur Resistenz gegen die Herbizide führen.

Weitere Methoden der Mutagenese und Selektion sind beispielsweise Methoden wie die in vivo Mutagenese von Samen oder Pollen und Selektion resistenter Allele in Anwesenheit der erfindungsgemäßen Inhibitoren, gefolgt von genetischer und moleku- larer Identifizierung des veränderten, resistenten Allels. Weiterhin die Mutagenese und

Selektion von Resistenzen in der Zellkultur durch Vermehrung der Kultur in Anwesenheit von sukzessiv steigenden Konzentrationen der erfindungsgemäßen Inhibitoren. Dabei kann die Erhöhung der spontanten Mutationsrate durch chemi- sche/physikalische mutagene Behandlung ausgenutzt werden. Wie vorgehend be- schrieben lassen sich auch mit Mikroorgansimen, die eine endogene oder rekombinan- te Aktivität der durch die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuren codierten Proteine haben, und die gegenüber den erfindungsgemäß identifizierten Inhibitoren sensitiv sind, veränderte Gene isolieren. Die Anzucht der Mikroorganismen auf Medien mit steigenden Konzentration von erfindungsgemäßen Inhibitoren erlaubt die Selektion und Evolution von resistenten Varianten der erfindungsgemäßen Targets.

Die Frequenz der Mutationen kann wiederum durch mutagene Behandlungen erhöht werden.

Daneben stehen Verfahren zur gezielten Veränderungen von Nukleinsäuren zur Verfü- gung (Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 96,8768-8773 und Beethem et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol 96,8774-8778). Diese Methoden ermöglichen es, in den Proteinen solche Aminosäuren, die für die Bindung von Inhibitoren von Bedeutung sind, durch funktionell analoge Aminosäuren zu ersetzen, die jedoch die Bindung des Inhibitors verhindern.

Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist deshalb ein Verfahren zur Erstellung von Nuk- leinsäuresequenzen, welche für Genprodukte kodieren, die eine veränderte biologische Aktivität aufweisen, wobei die biologische Aktivität dahingegen verändert wurde, daß eine erhöhte Aktivität vorliegt. Unter erhöhter Aktivität ist eine gegenüber dem Aus- gangsorganismus bzw. gegenüber dem Ausgangsgenprodukt um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50%, ganz be- sonders bevorzugt um mindestens 100% höhere Aktivität zu verstehen. Weiterhin kann die biologische Aktivität dahingegen verändert worden sein, daß die erfindungsgemä- ßen Substanzen und/oder Mittel nicht mehr oder nicht mehr richtig an die Nukleinsäu- resequenzen und/oder die durch sie kodierten Genprodukte binden. Unter nicht mehr oder nicht mehr richtig ist im Sinne der Erfindung zu verstehen, daß die Substanzen um mindestens 30%, bevorzugt mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 70%, ganz besonders bevorzugt um mindestens 80% oder gar nicht mehr an die ver- änderten Nukleinsäuren und/oder Genprodukte im Vergleich zum Ausgangsgenprodukt oder den Ausgangsnukleinsäuren binden.

Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft deshalb eine transgene Pflanze, welche mit einer Nukleinsäuresequenz, welche für ein Genprodukt kodiert, das eine veränderte biologische Aktivität aufweist, oder mit einer Nukleinsäuresequenz codierend für eine MDH-Variante transformiert wurde. Verfahren zur Transformation sind dem Fachmann

bekannt und beispielhaft weiter oben ausgeführt.

Genetisch veränderten transgene Pflanzen, die gegen die nach den erfindungsgemä- ßen Verfahren gefundenen Substanzen und/oder Mittel enthaltend diese Substanzen resistent sind, können auch durch Transformation gefolgt von Überexpression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz erzeugt werden. Deshalb ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen, die gegen Substanzen, die nach einem erfindungsgemäßen Verfahren gefunden wurden, resis- tent sind, dadurch gekennzeichnet, daß in diesen Pflanzen Nukleinsäuren codierend für eine Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH überexprimiert werden. Ein ähnliches Verfahren wird beispielhaft in Lermantova et al., Plant Physio, 122,2000 : 75-83 beschrieben.

Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung resistenter Pflanzen ermöglichen die Entwicklung neuer Herbizide, die eine möglichst umfassende Pfianzenspezies unabhängige Wirkung aufweisen (sog. Totalherbizide), in Kombination mit der Entwicklung von gegenüber dem Totalherbizid resistenten Nutzpflanzen. Ge- genüber Totalherbiziden resistente Nutzpflanzen sind bereits verschiedentlich be- schrieben worden. Dabei können mehrere Prinzipien zur Erzielung einer Resistenz unterschieden werden : a) Resistenzerzeugung in einer Pflanze über Mutationsverfahren oder gentechni- sche Verfahren, indem das als Zielort für das Herbizid dienende Protein deutlich überproduziert wird und indem auf Grund des großen Überschusses des als Zielort für das Herbizid dienende Protein, die von diesem Protein in der Zelle ausgeübte Funktion auch nach Applikation des Herbizides beibehalten wird. b) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß eine modifizierte Version des als Zielort des Herbizid fungierenden Proteins eingeführt wird und daß das neu ein- geführte modifizierte Protein vom Herbizid nicht in seiner Funktion beeinträchtigt wird. c) Veränderung der Pflanze dahingehend, daß ein neues Protein/eine neue RNA eingeführt wird welches dadurch gekennzeichnet ist, daß die für die herbizide Wirkung der niedermolekularen Substanz verantwortliche chemische Struktur des Proteins oder der Nukleinsäure wie der RNA oder der DNA so verändert wird, daß durch die veränderte Struktur keine herbizide Wirkung mehr entfaltet werden kann, daß heißt die Interaktion des Herbizids mit dem Zielort nicht mehr erfolgen kann.

d) das die Funktion des Targets durch ein neues in die Pflanze eingebrachtes Gen ersetzt wird, und so ein sogenannter"alternativer Pathway"geschaffen wird. e) Das die Funktion des Targets durch ein anderes in der Pflanze vorhandenes Gen bzw. dessen Genprodukt übernommen wird.

Dem Fachmann sind alternative Verfahren zur Identifizierung von den homologen Nukleinsäuren beispielsweise in anderen Pflanzen mit ähnlichen Sequenzen wie beispielsweise unter Verwendung von Transposons, bekannt. Gegenstand dieser Erfindung ist daher auch die Verwendung von alternativen Insertionsmutagenesever- fahren zur Insertion von fremder Nukleinsäuren in die Nukleinsäuresequenz SEQ ID NO : 3 in von diesen Sequenzen aufgrund des genetischen Codes abgeleitete Sequen- zen und/oder deren Derivate in anderen Pflanzen.

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt mit einer der oben beschrieben Aus- führungsformen der erfindungsgemäßen Expressiönskassette nach ebenfalls oben beschriebenen gängigen Transformationsmethoden.

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten MDH-Variante kann bei- spielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung oder durch einen Keimungstest ermittelt werden.

Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH Gens Gens und deren Auswirkung auf die Resistenz gegenüber Hemmstoffen der Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH an Testpflanzen in Ge- wächshausversuchen getestet werden.

Die Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als beschränkend aufgefaßt werden sollten.

Beispiel 1 : Erzeugung einer cDNA-Bibliothek im Pflanzentransformationsvektor Zur Erzeugung einer cDNA-Bibliothek (im folgenden"binäre cDNA-Bank"genannt) in einem Vektor, der direkt für die Transformation von Pflanzen verwendet werden kann, wurde mRNA aus verschiedenen Pflanzengeweben isoliert und mit dem TimeSaver cDNA Synthese Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) in doppelsträngige cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Erststrangsynthese wurde mit T12-18 Oligonucleotiden nach Herstellerangaben durchgeführt. Nach Größenfraktionierung und Ligation von EcoRI-Notl-Adaptern nach Herstellerangaben und Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase (Stratagene) wurde die cDNA-Population normalisiert. Hierzu wurde die Methode nach Kohci et al, 1995, Plant Journal 8,771-776 vorgegangen, wobei die cDNA durch PCR mit dem Oligonukleotid N1 unter den in Tabelle 1 aufgeführten Be- dingungen amplifiziert wurde.

Tabelle 1 Temperatur [°C] Zeit [sec] Zyklennummer 94 300 1 94 8 10 52 60 72 180 94 ~ 8 10 50 60 72 180 94 8 10 48 60 72 180 724201 Das erhaltene PCR-Produkt wurde an die Säulenmatrix des PCR-Purification Kits (Qiagen, Hilden) gebunden und mit 300 mM NaP-Puffer, pH 7.0, 0.5 mM EDTA, 0.04% SDS eluiert. Die DNA wurde 5 Minuten im kochenden Wasserbad denaturiert und anschließend 24 Stunden bei 60°C renaturiert. 50pal der DNA wurden auf eine Hydroxy- lapathitsäule aufgetragen und diese 3 Mal mit 1 ml 10 mM NaP-Puffer, pH 6.8 gewa- schen. Die gebundene Einzelstrang-DNA wurde mit 130 mM NaP-Puffer, pH 6.8 elu- iert, mit Ethanol gefällt und in 40pal Wasser gelöst. Hiervon wurden 20jul für eine weitere PCR-Amplifikation wie oben beschrieben verwendet. Nach einer weiteren Anreiche- rung von ssDNA wurde eine dritte PCR-Amplifikation wie oben beschrieben durchge- führt.

Die Herstellung des Pflanzentransformationsvektors zur Aufnahme der wie oben be- schrieben hergestellten cDNA-Population erfolgte über Restriktionsenzym-Verdau des Vektor pUC18 mit Sbfl und BamHl, Reinigung des Vektorfragment gefolgt von Auffüllen der Überhänge mit Pfu DNA Polymerase und Religation mit T4 DNA Ligase (Stratage- ne). Das so hergestellte Konstrukt wird im folgenden als pUC18Sbfl-bezeichnet.

Der Vektor pBinAR wurde zunächst mit Notl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert, mit Sbfl gespalten, nach Auffüllen der Enden religiert und im Anschluß mit EcoRl und Hindlil gespalten. Das resultierende Fragment wurde in ein Derivat des binären Pflanzentransformationsvektors pPZP (Hajdukiewicz, P, Svab, Z, Maliga, P., (1994) Plant Mol Biol 25 : 989-994) ligiert, der eine Transformation von Pflanzen mittels Agrobakterium ermöglich und eine Kanamycinresistenz in transgenen Pflanzen vermit-

telt, ligiert. Das hierbei erzeugte Konstrukt wird im folgenden als pSun12/35S bezeich- net. pUC18Sbfl-wurde als Template für eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) mit den Oligonucleotiden V1 und V2 (siehe Tabelle 2) und Pfu DNA Polymerase eingesetzt.

Das resultierende Fragment wurde in den mit Smal gespalten pSun12/35S ligiert, wodurch pSunblues2 erzeugt wurde. Nach Spaltung mit Notl, Dephosphorylierung mit Shrimp Alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics, Mannheim) und Aufreinigung des Vektorfragmentes wurde pSunblues2 mit der normalisierten und ebenfalls mit Notl gespaltenen cDNA Population ligiert. Nach Transformation in E. coli XI-1 blue (Stratage- ne) wurden die so erzeugte Klone in Mikrotiterplatten abgelegt. Die binäre cDNA-Bank enthält cDNAs in"Sense"-und in"Antisense"-Orientierung unter Kontrolle des Blumen- kohimosaikvirus 35s Promotors, die dementsprechend nach der Transformation in Tabakpflanzen zu"Cosuppressions"-und"Antisene"-Effekten führen können.

Tabelle 2 : Verwendete Oligonukleotide Oligonukleotid Nukleinsäuresequenz N1, 5'-AGAATTCGCGGCCGCT-3' (SEQ ID N0 : 4) V1 (PWL93not) 5'-CTCATGCGGCCGCGCGCAACGCAATTAATGTG-3' (SEQ ID NO : 5) V2 (pWL92) 5'-TCATGCGGCCGCGAGATCCAGTTCGATGTAAC-3' (SEQ ID NO : 6) G1 (35S) 5'-GTGGATTGATGTGATATCTCC-3' (SEQ ID NO : 7) G2 (OCS) 5'-GTAAGGATCTGAGCTACACAT-3' (SEQ ID NO : 8) Beipiel 2 : Transformation und Analyse von Tabakpflanzen Ausgewählte Klone der binären cDNA-Bank wurden in Agrobacterium tumefaciens C58C1 : pGV2260 transformiert (Deblaere et al., Nucl. Acids. Res. 13 (1984), 4777- 4788) und unter Streptomycin/Spectinomycin-Selektion inkubiert. Zur Transformation von Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN mit dem Klon nt002035041 r wurde eine in YEB-Medium auf OD600 = 0.8-1. 6 verdünnte Übernachtkultur einer positiv transformierten Agrobakterienkolonie benutzt. Blattscheiben steriler Pflanzen (zu je ca. 1 cm2) wurden in einer Petrischale mit der Agrobakterienverdünnung für 5-10 Minuten inkubiert. Es folgte eine 2-tägige Inkubation in Dunkelheit bei 25oC auf Muras- hige-Skoog Medium (Physiol. Plant. 15 (1962), 473) mit 2% Saccharose (2MS-Medium) mit 0,8 % Bacto-Agar. Die Kultivierung wurde nach 2 Tagen mit 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit weitergeführt und in wöchentlichem Rhythmus auf MS-Medium mit 50mg/1 Claforan (Cefotaxime-Natrium), 50mg/l Kanamycin, 1 mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0, 2mg/) Naphtylessigsäure und 1, 6ganz Glukose weitergeführt. Wachsende

Sprossen wurden auf MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mull Claforan und 0,8 % Bacto-Agar überführt. Regenerierte Sprossen wurden auf 2MS-Medium mit Kanamycin und Claforan erhalten. Auf diese Weise wurden transgene Pflanzen der Linie E0000005869 erzeugt.

Die Integration der cDNA der Klone in das Genom der transgenen Linien wurde über PCR mit den Oligonukleotiden G1 und G2 (siehe Tabelle 2) und genomischer DNA, die aus den entsprechenden transgenen Linien präpariert wurde nachgewiesen. Hierzu wurde vorzugsweise TAKARA Taq-DNA Polymerase nach Herstellerangaben (MoBi- Tec, Göttingen) eingestzt. Als Positivkontrolle diente der jeweils zur Transformation verwendete cDNA-Klon der binären cDNA-Bank als Template für eine PCR-Reaktion.

PCR Produkte identischer Größe oder ggf. gleicher Spaltungsmuster, die nach Spal- tung mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, dienten als Nachweis der Integration der entsprechenden cDNA. Das Insert des Klons nt002035041 r wurde auf diese Weise in den transgenen Pflanzen mit den oben genannten Phänotypen nachgewiesen.

Nach Transfer der Sprosse in Erde wurden die Pflanzen für 2-20 Wochen im Gewächs- haus auf die Ausprägung von Phänotypen beobachtet. Dabei stellte sich heraus, däss transgene Pflanzen der Linie E0000005869, in welchen das Insert von nt002035041 r nachgewiesen wurde, ähnliche Phänotypen aufwiesen. Diese Pflanzen zeigten nach 2 Wochen starke Wachstumsretardierungen, sowie chlorotische Blätter und vereinzelt Nekrosen.

Beispiel 3 Sequenzanalyse des Klones Zu Isolierung einer Volle Länge cDNA-Sequenz von nt002035041 r (SEQ ID NO : 2) wurde das Smart-RACE kit (Clontech) nach Herstellerangaben eingesetzt. Die SEQ ID NO : 2 von 1513 bp Länge codiert auf einem offenen Leseramen (nt 148-1221) von 960 nt Länge für ein Protein von 320 Aminosäuren.

Hiermit wurde erstmalig und überraschend gezeigt, dass die natürliche Expression von glyoxysomalen MDH codierenden Sequenzen essenziell für Pflanzen ist und eine ver- ringerte Expression zu Schädigungen entsprechend den unter Beispiel 2 aufgeführten Phänotypen führt. Daraus folgt, dass sich Malat Dehydrogenase, bevorzugt MDH als Target für Herbizide eignet.

Die größte Homologie findet sich zu glyoxysomalen MDHs aus Wassermelone (P19446, Swissprot) mit 77,5 % Identität auf Nukleotidebene (90,7% Ähnlichkeit bzw.

85,4% Identität auf Proteinebene), Gurke, Arabidopsis, Soya und Reis. Die N-termi-

nalen 38 Aminosäuren stellen vermutlich eine glyoxysomale Transitsequenz dar.

Beispiel 4 : Expression in E. coli Zur Erzeugung aktiven Nt-MDH Proteins mit pflanzlicher MDH-Aktivität wurde die Codierregion von Nt-MDH sowie MDH aus Arabidopsis (Genbank : At2g22780) in E. coli Bakterien überexprimiert. Dazu wurden Nt-MDH-Fragmente mittels spezieller Oligonukleotide und Pfu-Ultra Polymerase (Stratagene) per PCR amplifiziert und in den Expressionsvektor pCR T7/CT TOPO (Invitrogen) ligiert (Konstrukte Nt1 und At1, Tabelle 7). Auf diese Weise wurden codierte Fusionsproteine mit C-terminalen Hexa- histidin-tag erzeugt. Bei der Klonierung wurde durch die Verwendung der angegebenen Oligonucleotide eine N-terminal verkürzte Version der MDH erzeugt, um die glyoxyso- male Transitsequenz, die einer funktionellen Expression entgegenstehen könnte aus- zuschließen. Dabei wurde von der Transitsequenz der glyoxysomalen MDH aus Was- sermelone ausgegangen (Gietl. Et al. 1996, BBA 1274,48-58). Die PCR wurde nach Standardbedingungen (z. B. nach Sambrook, J. et al. (1989)"Molecular cloning : A laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press) in 36 Zyklen durchgeführt, wobei die Annealingtemperaturen zwischen 44 und 55oC lagen und für die Polymerisa- tionszeit je 60sec pro 1000bp betrug. Die Template sowie die für die jeweiligen Template verwendeten Primer sowie Annealingtemperaturen sind in Tabelle 7 aufge- führt.

Tabelle 7 Konstrukt Annealing-Primer (Nukleinsäuresequenz) Temp. [°C] Nt-gMDH-E1 53 5'-ATGAGGGCGAMGGGGG-3' (SEQ ID NO : 9) 5'-TTTCTTTACAAAGTTGACACCCTTC-3' (SEQ ID NO : 10) At-gMDH-E1 56 5'-ATGCGGGCAAAAGGTGG-3' (SEQ ID NO : 11) 5'-TTTCTTCGCAAAGGTAACACC-3' (SEQ ID N0 : 12) (1) Templat : Nicotiana tabacuum cDNA-BAnk (2) Templat : Arabidopsis thaliana cDNA-Bank Die in der PCR erhaltenen Produkte wurden in den Vektor pCR T7/CT TOP ligiert und in E. coli transformiert. Die Expression wurde in E. coli BL21 (DE3) Stämmen wie BL21 (DE3) pLysS oder BL21 (DE3) pLysE (Invitrogen), BL21-CodonPlus (DE3) oder BL21-CodonPlus (DE3) RIL (Stratagene) nach Induktion mit IPTG durchgeführt. Dazu

wurde nach Standardprotokollen (Invitrogen) vorgegangen.

Die Expressionsprodukte Nt-gMDH-E1 und At-gMDH-E1 wurden über Ni-Agarose affinitätschromatographisch aufgereinigt. Hierzu, wurde nach Herstellerangaben (Qia- gen) vorgegangen.

Beispiel 5 : in vitro Testsysteme Die Enzymaktivität der gMDH kann nach Huang et al. (1974, Plant Physiol 54,364- 368) aus Präparationen pflanzlicher Microbodies gemessen werden. Es bietet sich jedoch an, die wie oben beschreiben in E. coli exprimierten und aufgreinigten Proteine einzusetzen, um Hintergrundaktivitäten cytosolischer und Mitochondrialer MDHs zu minimieren.

Die Messung der enzymatischen Aktivität der gMDH aus Beispiel 3 wurde über die Umsetzung von NAD+ zu NADH erfolgte photometrisch bei 340nm nach Gietl et al.

(1996, BBA 1274,48-58). Dieser Assay kann im Mikrotiterplatten Maßstab durchge- führt werden.