发明名称：芒果苷 -6-0-小檗碱盐及其制备方法与用途 技术领域

[0001] 本发明涉及芒果苷 -6-0-小檗碱盐及其制备方法及作为 AMPK激活剂等的用途。

背景技术

[0002] 芒果苷 (mangiferin)是天然多酚类化合物， 分子式： C ₁₉ H ₁₈ 0„， 分子量： 422。

其化学结构如下：

[0003] 小檗碱 (berberine)为异喹啉类生物碱。 分子式： [ C ₂ 。H ₁₈ NO .

[0004] 我们已公幵一种将芒果苷与小檗碱以离子键结 合的芒果苷小檗碱盐 【国际公布 号： WO2010/145192A1 ; 发明名称： 一种芒果苷小檗碱盐及其制备方法及用途

[0005] 首先， 该专利说明书第 5页-第 7页第 2段对所述芒果苷小檗碱盐的碳核磁数据、 氢核磁数据与芒果苷、 小檗碱原型化合物的相应数据进行了比较， 从而得出结 论： 芒果苷基团与小檗碱基团中各原子的化学环境 发生了变化， 说明小檗碱基 团与芒果苷基团结合形成了芒果苷小檗碱盐。

[0006] 分析芒果苷的结构可知， 芒果苷分子结构中有 4个酚羟基， 所以芒果苷成盐位 点存在着多种可能性， 这使得获得单一成盐位点的芒果苷盐的技术难 度大大增 加。

[0007] 根据 WO2010/145192A1所披露的芒果苷小檗碱盐的核磁数 据分析可知， 其所述 芒果苷小檗碱盐应为芒果苷 -3-0-小檗碱盐与芒果苷 -7-0-小檗碱盐的组合物。 但 关于芒果苷 -3-0-小檗碱盐与芒果苷 -7-0-小檗碱盐的具体情况， 如二者比例如何 ， WO2010/145192A1并未予以阐述。

[0008] 磷酸腺苷 （AMP) 激活的蛋白激酶 (AMP-activated protein kinase, AMPK) 是 一种在细胞内行使能量代谢调节的蛋白激酶。 随着对 ΑΜΡΚ研究的日益深入， A MPK在代谢性疾病、 心血管疾病、 神经系统疾病、 炎症性疾病、 肿瘤、 肌肉系 统疾病的发病中发挥至关重要的作用， AMPK正成为疾病治疗新靶点， 但目前尚 未有上市的 AMPK激活剂， 故研究幵发 AMPK激活剂具有重要的临床意义 【李忌 .AMPK: 糖尿病与心血管疾病治疗新靶点.中国医学论� �报, 2009,

(1149)； 任俊芳 .AMPK与心血管重构.国际病理科学与临床杂志, 2008,28(1):33-36 ； Ricardo Lage, Carlos Dieguez, Antonio Vidal-Puig. et al. AMPK: a metabolic gauge regulating whole-body energy homeostasis. Trends Mol Med, 2008, 14(12): 539-49； 符庆瑛，高钰琪.蛋白激酶 AMPK的研究进展.生命科学, 17(2): 147-152; 陈奇,梁后杰 ，邹岚，等.一磷酸腺苷活化蛋白激酶对环氧� �酶 -2表达与 5-氟尿嘧啶治疗结肠癌敏 感性的关系.实用医院临床杂志, 2008,5(3):56-58等】 。

技术问题

[0009] 按照药物注册的要求， 上市药物所提供的原料药结构必须是明确的， 如果原料 药是组合物， 其比例也必须是确定的， 才能符合药物质量可控的要求。 因此获 得单一成盐位点的芒果苷小檗碱盐对于该化合 物做为原料药而言， 是必须解决 的技术问题。

[0010] 其次， WO2010/145192A1专利说明书第 4页第 3段至倒数第 3段及实施例 1-6对所 述芒果苷小檗碱盐的制备方法给予详细论述， 如下：

[0011] ①在反应器中加入反应溶媒和芒果苷混悬得混 悬液， 将碱性钠 （钾） 盐水溶液 加入混悬液中， 反应至澄清， 滤过， 得溶液 A。

[0012] ②将小檗碱加入水中溶解， 滤过， 得溶液 B。

[0013] ③将溶液 A滴加入搅拌状态下的溶液 B中， 滴加完毕继续搅拌， 使反应完全， 产 生大量沉淀， 过滤， 固体物干燥， 得芒果苷小檗碱盐。

[0014] 所述反应溶媒为水与乙醇、 甲醇、 丙酮等可与水混溶的有机溶剂中一种或两种 以上的混合物， 其中水的体积比 10— 90%(v/v) _o

[0015] 从上述 WO2010/145192A1所披露的制备方法中可以看出： 芒果苷小檗碱盐在制 备过程中需要较大量的乙醇、 甲醇、 丙酮等有机溶剂， 这些有机溶剂不仅成本 高， 而且在工业生产中会带来沉重的环保压力。

问题的解决方案

技术解决方案

[0016] 本发明提供一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 其特征在于： 所述芒果苷 -6-0-小檗碱 盐具有下式 （I) 的结构。

C I )

[0017] 其中 0≤x≤4。

[0018] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 其特征在于： 所述 x=2。

[0019] 本发明提供所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于: [0020] ①将碱性钠盐或碱性钾盐加入水中， 制备碱性钠盐溶液或碱性钾盐溶液， 浓度

¾0.1%-2% (w/v) ；

[0021] ②将芒果苷加入二甲基亚枫中溶解， 制成芒果苷溶液；

[0022] ③将芒果苷溶液缓慢加入碱性钠盐溶液或碱性 钾盐溶液中， 充分搅拌， 50°C-10 0°C反应完全， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液或芒果苷 -6-0-钾盐溶液；

[0023] ④取盐酸小檗碱加 50°C-100°C水溶解， 制成盐酸小檗碱溶液；

[0024] ⑤将盐酸小檗碱溶液与芒果苷 -6-0-钠盐溶液或芒果苷 -6-0-钾盐溶液充分混合， 反应完全， 析出沉淀， 过滤， 得固体物；

[0025] ⑥固体物干燥， 得芒果苷 -6-0-小檗碱盐。

[0026] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述芒果苷与二 甲基亚砜的配比为 1:0.2-5 (w/v) 。

[0027] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述芒果苷与碱 性钠盐或碱性钾盐的摩尔配比为 1:0.5-1。

[0028] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述芒果苷 -6-0

-钠盐或芒果苷 -6-0-钾盐与盐酸小檗碱摩尔比为 1： 1。

[0029] 本发明所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 其特征在于： 所述碱性钠盐或 碱性钾盐选自碳酸钠、 碳酸氢钠、 碳酸钾、 碳酸氢钾中的一种或两种以上的混 合物， 所述盐酸小檗碱可由硫酸小檗碱或其它小檗碱 医学上可接受的盐替代。

[0030] 本发明提供一种药物， 其特征在于： 所述药物由上述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐与 可药用辅料组成， 并按相应制药方法， 即可制成临床适用的片剂、 胶囊剂、 颗 粒剂、 口服溶液剂、 口服混悬剂、 糖浆剂、 丸剂等任何一种口服制剂； 凝胶剂

、 软膏剂、 霜剂等外用制剂； 冻干粉针等注射剂。

[0031] 本发明提供所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备 AMPK激活剂的用途。

[0032] 本发明提供以所述的芒果苷 -6-0-小檗碱盐为活性成分制备的药物在制备 AMPK 激活剂的用途。

[0033] 鉴于现代医学对 AMPK在疾病发生发展中所起重要作用的揭示， 本发明提供一 种芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备 AMPK激活剂的用途， 其特征在于： 所述 AMPK 激活剂可用于预防或治疗下述疾病中的任何一 种或几种： 糖尿病、 糖尿病各种 慢性并发症 （包括冠心病、 动脉粥样硬化、 脑血管病、 糖尿病肾病、 糖尿病性 视网膜病变、 神经病变、 糖尿病足、 黄斑病、 白内障、 青光眼、 屈光改变、 虹 膜睫状体病变等） 、 肥胖、 高脂血症、 胰岛素抵抗、 高胰岛素血症、 代谢综合 征、 高血压、 动脉粥样硬化、 缺血性心脏病、 心肌肥大、 心律失常、 心力衰竭 、 上呼吸道感染、 慢性支气管炎、 慢性阻塞性肺病、 哮喘、 肺纤维化、 肝炎、 单纯性脂肪肝、 非酒精性脂肪性肝病、 非酒精性脂肪性肝炎、 酒精性肝病、 酒 精性肝炎、 肝纤维化、 肝硬化、 前列腺炎、 胰腺炎、 肾炎、 肾病综合征、 高血 压肾病、 慢性肾功能不全、 前列腺炎、 风湿性关节炎、 类风湿性关节炎、 骨性 关节炎、 炎症性肠病、 脑梗塞、 记忆障碍、 阿尔茨海默氏病、 梗塞性痴呆、 帕 金森氏症、 肿瘤、 肌肉萎缩、 肌肉无力症。

[0034] 本发明还提供一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐在制备乳腺增生、 子宫息肉、 前列腺增 生、 性功能障碍、 不孕、 湿疹、 疲劳治疗药物中的应用。

[0035] 本发明提供的芒果苷 -6-0-小檗碱盐用作上述疾病治疗的有效剂量范� ��为 37.5—

600mg/日 /人， 优选 75-300mg/日 /人， 每日给药 1-3次， 优选每日 2次。 用法可根据 具体疾病进行选择， 以口服为优选。

[0036] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的理化性质：

[0037] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐， 分子式： C ₂ 。H ₁₈ N0 ₄ .C ₁₉ H ₁₇ 0„ cH ₂ 0， 橙黄色粉末状 物， 熔点： 177-179°C， 几乎不溶于水， 微溶于甲醇， 在稀盐酸溶液中略溶。 结 构式如下：

C I )

[0038] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的波谱数据： ESI-MS (-) m/z 756(M ),421； ESI-MS (+) m/z 336, 423； 芒果苷基团 ¹ HNMR(400MHz， DMSO-d ₆

)5： 4.56 (Η-1') ， 6.01 (Η-5),6.15 (Η-4),6.88 (Η-8)。 ¹³ CNMR (400MHz, DMSO-d ₆ )δ: 161.51 (C-l) ， 106.58 (C-2) ， 163.06 (C-3 ) ， 92.77 (C-4) ， 155.55 (C-4a) ， 103.74 (C-4b) ， 98.64 (C-5) ， 166.93 ( C-6) ， 147.03 (C-7) ， 100.47 (C-8) ， 100.53 (C-8a) ， 154.37 (C-8b) ， 176 .73 (C-9) ， 73.51 (C-Γ) ， 70.34 (C-2，) ， 79.14 (C-3，) ， 70.34 (C-4，) ， 8 1.37 (C-5') ， 61.27 (C-6，) 。 小檗碱基团 ¹ HNMR(400MHz， DMSO-d ₆ )δ: 3.2 (H-5)， 4.03 (-OCH3) , 4.07 (-OCH3) , 4.89 (H-6)， 6.13 (-0-CH2-0-) , 7.01 (H-4)， 7.69 (H-l)， 7.86 (H-12)， 8.07 (H-l l)， 8.78 (H-13) , 9.78 (H-8)。 ¹³ CNMR (400MHz, DMSO-d ₆ )δ: 105.33 (C-l) ， 120.29 (C-la) ， 147.56 (C-2 ) ， 149.71 (C-3) ， 108.22 (C-4) ， 130.45 (C-4a) ， 26.28 (C-5) ， 55.07 (C -6) ， 145.06 (C-8) ， 121.24 (C-8a) ， 143.51 (C-9) ， 150.15 (C-10) ， 126. 55 (C-11) ， 123.33 (C-12) ， 132.87 (C-12a) ， 120.08 (C-13) ， 137.3 (C-13 a) ， 56.93 (C10(-OCH ₃ )) ， 61.74 (C9(-OCH ₃ )) ， 101.96 (-O-CH ₂ -0-) 。

[0039] 附： 芒果苷的波谱数据： ESI-MS m/z 421(M - ); ΉΝΜΚ(400ΜΗζ, DMSO-d ₆ ) 5： 4.60 (Η-Ι') ， 6.37 (Η-5),6.86 (Η-4),7.39 (Η-8)。 ³

CNMR (400MHz, DMSO-d ₆ )δ: 161.68 (C-l) ， 107.54 (C-2) ， 163.73 (C-3 ) ， 93.27 (C-4) ， 156.15 (C-4a) ， 101.25 (C-4b) ， 102.54 (C-5) ， 153.91

(C-6) ， 143.63 (C-7) ， 108.05 (C-8) ， 111.68 (C-8a) ， 150.7 (C-8b) ， 17 9.02 (C-9) ， 73.04 (C-Γ) ， 70.24 (C-2，) ， 78.9 (C-3，) ， 70.56 (C-4，) ， 8 1.44 (C-5') ， 61.41 (C-6，) 。

[0040] 小檗碱的波谱数据： ESI-MS m/z 336(M); ΉΝΜΚ(400ΜΗζ, DMSO-d ₆

)5： 3.26 (Η-5)， 4.11 (-OCH3) , 4.21 (-OCH3) , 4.92 (Η-6)， 6.11 (-0-CH2-0-) ， 6.96 (Η-4)， 7.66 (Η-1)， 8.0 (Η-12)， 8.11 (Η-11)， 8.7 (Η-13), 9.76 (Η-8) 。 ¹³ CNMR (400MHz, DMSO-d ₆ )δ: 106.54 (C-l) ， 121.49 (C-la) ， 149.92

(C-2) ， 152.17 (C-3) ， 109.40 (C-4) ， 131.90 (C-4a) ， 28.24 (C-5) ， 57. 20 (C-6) ， 145.73 (C-8) ， 123.33 (C-8a) ， 146.42 (C-9) ， 152.02 (C-10) ， 128.04 (C-11) ， 124.55 (C-12) ， 135.13 (C-12a) ， 121.86 (C-13) ， 139.6 5 (C-13a) ， 57.61 (C10(-OCH ₃ )) ， 62.56 (C9(-OCH ₃ )) ,103.68 (-O-CH ₂ -0- [0041] 结构分析如下：

[0042] 与小檗碱原型化合物比较， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐中小檗碱基团碳谱数据各碳原 子的化学位移由于屏蔽作用均发生明显改变。

[0043] 与芒果苷原型化合物比较， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐中芒果苷基团碳谱数据中 C ₆ ， C ₇ ， C _8b 碳原子的化学位移由于去屏蔽作用而发生 显著改变， C ₆ 化学位移变化 最大； C ₅ 、 C ₈ 、 C _8a 碳原子的化学位移由于屏蔽作用均有不同 程度的改变， 其中 处于 C ₆ 原子间位的 C ₈ 和对位的 C _8a 化学位移变化较大。

[0044] 根据以上波谱数据分析显示： 芒果苷 -6-0 -与小檗碱 -N ÷

结合， 形成了芒果苷 -6-0-小檗碱盐。

[0045] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐及其水合物的元素分析数据：

[]

发明的有益效果

有益效果

[0046] 我们通过多年的研究， 终于成功获得了一种新的单一成盐位点的芒果 苷小檗碱 盐， 即芒果苷 -6-0-小檗碱盐。 该芒果苷 -6-0-小檗碱盐不但解决了芒果苷小檗碱 盐做为原料药必须结构明确的问题， 而且， 相较于 WO2010/145192A1所公幵的 芒果苷小檗碱盐， 本发明化合物芒果苷 -6-0-小檗碱盐取得以下意想不到的技术 效果：

[0047] 1、 本发明的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在盐酸溶液中的溶解度较 WO2010/145192A1 所公幵芒果苷小檗碱盐显著提高， 从而更有利于其在胃中的溶解， 从而增加吸 收。 在 pH值 1的盐酸溶液中， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐最大溶解度为 12mg/ml， 而 W 02010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐为 4mg/ml， 芒果苷 -6-0-小檗碱盐在 pH 值 1的盐酸溶液中的溶解度是 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐的 3倍 ， 且芒果苷 -6-0-小檗碱盐溶液的稳定性远好于 WO2010/145192A1所公幵的芒果 苷小檗碱盐。

[0048] 2、 本发明的芒果苷 -6-0-小檗碱盐在高湿环境下， 吸湿增重比远小于 WO2010/1 45192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐。 这种在高湿环境下的稳定性有利于药物的贮 藏， 减少制剂过程中的水分吸收， 提高药物质量。

[0049] 3、 意外发现本发明的芒果苷 -6-0-小檗碱盐对乳腺增生、 子宫息肉、 性功能障 碍、 前列腺增生、 不孕、 疲劳、 湿疹具有治疗作用。 这些治疗作用是无法根据 W O2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐的活性预� ��与获知的。

[0050] 我们还获得一种芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备方法， 相较于 WO2010/145192A1 所公幵的芒果苷小檗碱盐的制备方法， 本发明的制备方法不但解决大量有机溶 剂的使用带来的环保压力与成本问题， 从而更适合工业化生产， 而且还取得以 下意想不到的技术效果： 即获得了一种新的单一成盐位点的芒果苷小檗 碱盐， 即芒果苷 -6-0-小檗碱盐。

[0051] 试验例 1: 两种芒果苷小檗碱盐在 pH值 1的酸水溶解情况比较

[0052] 1.供试样品：

[0053] 样品 A: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物

[0054] 样品 B: 按 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐制备方法 制备的芒果苷 小檗碱盐。

[0055] 2.仪器： PHS-3C微机型 pH计 (上海康仪）

[0056] 3.试验方法与结果：

[0057] 取纯净水， 加盐酸调 pH值为 1的溶液 （25°C±2°C) 备用； 分别量取该溶液各 50 ml置三角瓶中， 分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐样品 A和样品 B各 200m g加入三角瓶中， 振摇； 观察溶解情况。

[0058] 样品 A在数秒钟内迅速溶解， 溶液为澄明状。

[0059] 样品 B在 1分钟内能溶解， 但溶液迅速呈浑浊状态， 表明有沉淀物析出。 [0060] 另取溶液各 50ml置三角瓶中， 分别精密称取研成细粉的芒果苷小檗碱盐样品 A

400mg和 600mg， 分别加入三角瓶中， 振摇； 观察溶解情况。

[0061] 400mg样品 A在 50ml酸水溶液中迅速溶解， 溶液为澄明状， 放置 24小吋未见沉 淀物析出。

[0062] 600mg样品 A在 50ml酸水溶液中完全溶解， 溶液为澄明状， 约 30分钟有少量沉 淀析出， 溶液呈微浊状态。

[0063] 上述试验结果显示样品 A在 pH值 1的盐酸液中最大溶解度约为 12mg/ml， 样品 B 在 pH值 1的酸液中最大溶解度约为 4mg/ml。 芒果苷 -6-0-小檗碱盐溶液的稳定性 远好于 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐。

[0064] 4.结论

[0065] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐在 pH值 1的盐酸液中最大溶解度为 WO2010/145192A1所 公幵的芒果苷小檗碱盐的 3倍。

[0066] 试验例 2: 两种芒果苷小檗碱盐高湿环境稳定性比较

[0067] 1.供试样品：

[0068] 样品 A: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物

[0069] 样品 B: 按 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐制备方法 制备的芒果苷 小檗碱盐

[0070] 2.仪器： 万分之一电子天平 （Sartorius,德国） 。

[0071] 3.考察方法：

[0072] 分别取样品 A和样品 B适量各三份， 分别置平面皿内， 精密称定， 供试品置恒 湿密闭容器中， 于 25°C、 RH90%±5%条件下放置 10天， 分别于第 5天和第 10天精 密称定， 记录称定结果。 计算吸湿增重比。

4.结果： 如下表：

[0074] 5.结论

[0075] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物在高湿环境下， 吸湿增重比远小于 WO2010/14519

2A1所公幵的芒果苷小檗碱盐。

[0076] 试验例 3: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐对 AMPK激活作用

[0077] 1、 材料

[0078] 按上述实施例制备芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物， 以 DMSO溶解。 临用前以培 养基或 HBS缓冲液稀释。 DMSO终浓度≤0.2<¾。

[0079] L6细胞购自 ATCC。 高糖 DMEM培养基购自 GIBCO公司； 胎牛血清购自 Hyclon e公司。 抗 AMPK兔源多克隆抗体、 抗 ACC兔源多克隆抗体、 抗 AMPK苏氨酸 172 位点磷酸化兔源多克隆抗体、 抗 ACC丝氨酸 79位点磷酸化兔源多克隆抗体购自 C ell Signal Technology公司。

[0080] 2、 实验方法

[0081] 2.1细胞培养与分化：

[0082] 分化前的 L6细胞用高糖 DMEM培养基， 含 10%胎牛血清， 100

U/ml青霉素、 100 U/ml链霉素， 置于含有的 5% C02的培养箱内 37°C培养。 L6细 胞的分化是在细胞长满 60%左右吋， 换成含 2%胎牛血清的高糖 DMEM培养基， 每两天更换一次培养基， 直到 L6细胞分化至 90%左右。

[0083] 2.2化合物处理及样品收集：

[0084] 先将 6孔板中的细胞在无血清的高糖 DMEM培养基中饥饿。 受试物以不同的浓 度梯度加到无血清的高糖 DMEM培养基中， DMSO含量 0.2%。 受试物与细胞孵 育 3 h， 然后， 用冰冷的 lxPBS洗 2次， 加入 200μ1 lxSDS电泳缓冲液 （50mM Tris HCL, lOOmM

DTT， 2%电泳级 SDS， 0.1%溴酚蓝， 10%甘油） 裂解细胞 10min。 收集裂解液， 超声 15秒钟， 在 100°C煮样品 10 min。

[0085] 2.3免疫印迹检测：

[0086] 裂解液经 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析， 再在转膜仪中以 100V， l-2h转移 到 PVDF膜上。 将凝胶中的蛋白质半干转移到硝酸纤维薄膜上 ， 丽春红 S (Ponce au S) 确定条带。 在封闭液 （3%脱脂奶粉， 0.1<¾Tween， TBS溶解） 中封闭 1小 吋， 加入 1 : 1000稀释一抗 4°C过夜， TBS洗涤 3xl5min， 加入 1 : 1000稀释二抗， 室温孵育 1小吋， TBS洗涤 3xl5min， 置于 ECL中冲洗 5-10 min， 用 X光片压片显

[0087] 3、 结果

[0088] 结果表明： 1.25-5 mol/L芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物呈剂量依赖性地显著增 强了 AMPK磷酸化水平， 同吋显著增强 ACC磷酸化水平。

[0089] 试验例 4: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐对代谢紊乱各项指标的改善作用

[0090] 符合 2型糖尿病并非酒精性脂肪性肝病诊断标准的� �者， 给予芒果苷 -6-0-小檗 碱盐片 75mg (制备方法见实施例 7) ， 每日 2次， 口服。 6月后， 患者肝酶 （ALT

、 AST) 、 肝彩超脂肪变、 APRI指数 （反映肝纤维化） 、 糖化血红蛋白 （HbAl

C) 、 血清胰岛素 （INS) 、 胰岛素敏感指数 （ISI) 、 血脂 （TG) 、 血压 （收缩 压、 舒张压） 、 尿微量白蛋白、 体重皆明显改善。

[0091] 结果表明： 芒果苷 -6-0-小檗碱盐具有降肝酶、 改善肝脂肪变、 改善肝纤维化、 降糖、 降胰岛素、 增加胰岛素敏感性、 降脂、 降血压、 降尿蛋白、 降体重的作 用。

[0092] 具体如下表：

[]

注： *p .ft5。

[0093] 试验例 5: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐对人体的各种治疗作用

[0094] 给予芒果苷 -6-0-小檗碱盐片 （简称 A， 制备方法见实施例 7) ， 口服。 在人体 中发现芒果苷 -6-0-小檗碱盐对类风湿性关节炎、 乳腺增生、 子宫息肉、 前列腺 增生、 痴呆、 性功能障碍、 不孕、 心律失常、 心力衰竭、 疲劳具有改善作用。 给予芒果苷 -6-0-小檗碱盐凝胶 （简称 B， 制备方法见实施例 10) ， 涂患处， 具有 治疗湿疹作用。 具体如下：

[]

[0095] 试验例 6: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐与芒果苷小檗碱盐的药代比较

[0096] 1.试验方案

[0097] 样品 A: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物

[0098] 样品 B: 按 WO2010/145192A1所公幵的芒果苷小檗碱盐制备方法 制备的芒果苷 小檗碱盐

[0099] 一次性灌胃给予 SD大鼠受试样品 A或样品 B 100 mg/kg, 于 0， 0.083, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12 and 24 h经颈静脉采血。

[0100] 芒果苷对照品溶液的配制： 精密称取芒果苷对照品， 置 25ml容量瓶中， 加甲醇 溶解并稀释至刻度， 制得对照品母液， 备用。 精密量取对照品母液适量稀释成 含芒果苷 2、 5、 10、 50、 100、 200ng/ml的对照品溶液。

[0101] 盐酸小檗碱对照品溶液的配制： 精密称取盐酸小檗碱对照品， 置 25ml容量瓶中 ， 加甲醇溶解并稀释至刻度， 制得对照品母液， 备用。 精密量取对照品母液适 量稀释成含小檗碱 0.2、 0.5、 2、 10、 20、 50ng/ml的对照品溶液。

[0102] 内标物溶液的配制： 精密称取格列本脲， 置 25ml容量瓶中， 加乙腈溶解并稀释 至刻度， 制得格列本脲 50ng/ml的内标物溶液。

[0103] 血样处理方法： 取大鼠血液置肝素抗凝离心管中， 6000rpm离心 10min， 取血浆

， -20°C冷冻备用。

[0104] 空白血浆的处理： 取血浆 100ul， 加入乙腈 -乙酸 （9: 1) 溶液 500ul涡旋 5min， ， 6000rpm离心 10min， 取上清， 50°C真空干燥， 残留物加流动相溶液 100ul， 涡旋 3 min， 6000rpm离心 10min， 得空白血浆样品， 取上清进样 10ul。

[0105] 给药血浆样品的预处理： 取给药各采血点血浆 100ul， 加入乙腈 -乙酸 （9: 1) 溶 液 500ul涡旋 5min， 6000rpm离心 10min， 取上清， 50°C真空干燥， 残留物加流动 相溶液 100ul， 祸旋 3min， 6000rpm离心 10min， 得空白血浆样品， 取上清进样 10 ul。

[0106] 色谱条件： A相: 0.1%甲酸溶液， B相： 甲醇； 色谱柱： Waters Xbridge Cl 8

(50x2.1 mm, 5 μηι)； 流速： 0.40 mL-min- 1。

[0107] 梯度洗脱程序：

[]

[0108] 质谱条件： 离子检测方式： 多离子检测 （MRM) ； 离子极性： 正离子； 芒果 苷： m/z 422.9/327.1， 小檗碱： m/z 337.3/321.3， 内标： m/z 494.2/369.1。

[0109] 2.试验结果

[0110] 采用 Pharsight Phoenix 6.3中的非房室模型计算药代动力学参数。

[] 芒杲苷—S-C 、檗碱盐与芒果苷小檗碱盐的 ADC比较（均数 i 淮差)

[0111] 上述结果显示： 口服芒果苷 -6-0-小檗碱盐 AUC是芒果苷小檗碱盐的 2倍， 表明 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的吸收较芒果苷小檗碱盐有所提� ��。

实施该发明的最佳实施例

本发明的最佳实施方式

[0112] 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备

[0113] 在反应器中加水 670ml， 将碳酸氢钾 O.lmol加入水中制成浓度为 1.5<¾(w/v)的碳 酸氢钾溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 21ml DMS0 (芒果苷与 DMSO的配 比为 l:0.5(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钾 溶液中， 充分搅拌， 70°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钾盐溶液， 60°C 保温备用； 取盐酸小檗碱 O.lmol加 70°C水 3700ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 80°C 保温备用。 将芒果苷 -6-0-钾盐溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中， 充分搅拌， 反 应完全， 静置析出沉淀， 过滤， 固体物 45°C真空干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0 -小檗碱盐 2水合物 65.7g， 收率为 82.8%。 样品纯度经 HPLC测定为 97.6<¾。

本发明的实施方式

[0114] 本发明所述的芒果苷采用市售品 （西安杨凌东科药业有限公司， 具有相应提取 设备的厂家均可以生产， 含量 98%) 。 盐酸小檗碱、 硫酸小檗碱等均为市售品 ( 西安小草植物科技有限公司） 。 碳酸氢钠、 碳酸钠、 碳酸氢钾、 碳酸钾、 二甲 基亚砜 （DMSO) 等试剂均采用市售品。

[0115] 制备例 1 : 芒果苷 -6-0-钠盐的制备

[0116] 在反应器中加水 1700ml， 将碳酸氢钠 O.lmol力卩入水中制成浓度为 0.5<¾(w/v)的碳 酸氢钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 85ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配 比为 l:2(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钠溶 液中， 充分搅拌， 85°C保温反应完全， 滤过， 反应液降至室温， 加入反应液体积 2倍量的丙酮， 充分搅拌， 析出大量沉淀， 过滤， 沉淀物无水乙醇充分洗涤， 沉 淀物 40°C真空干燥， 粉碎， 得淡黄色粉末芒果苷 -6-0-钠盐 21.3g， 收率为 50.5% ， 样品纯度经 HPLC测定为 98.6%。

[0117] 芒果苷 6-0-钠盐： ΉΝΜΚ(400ΜΗζ， DMSO-d ₆

)5： 4.60 (Η-1') ， 6.01 (Η-5),6.10 (Η-4),6.96 (Η-8)。 ¹³

CNMR(400MHz， DMSO-d ₆ ) (5ppm) ： 162.43(C-1), 106.82(C-2)， 161.56(C-3) ， 93.50(C-4)， 157.12 (C-4a)， 101.06(C-4b) , 99.53C-5) , 161.56(C-6), 147.08(C- 7)， 103.75(C-8)， 106.83 (C-8a) ， 154.28 (C-8b) ， 176.63(C-9)， 73.67(C-1') ， 70.24(C-2，）， 79.19(C-3')， 70.24(C-4，）， 81.05(C-5，）， 60.97(C-6')=

[0118] 制备例 2: 芒果苷 -6-0-钾盐的制备

[0119] 在反应器中加水 1700ml， 将碳酸钾 0.05mol力卩入水中制成浓度为 0.8<¾(w/v)的碳 酸钾溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 42ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:l(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸钾溶液中 ， 充分搅拌， 60°C保温反应完全， 滤过， 反应液降温至 40°C， 加入反应液体积 2 倍量的丙酮， 充分搅拌， 析出大量沉淀， 过滤， 沉淀物无水乙醇充分洗涤， 沉 淀物 50°C真空干燥， 粉碎， 得淡黄色粉末芒果苷 -6-0-钾盐 25.3g， 收率为 60.2% ， 样品纯度经 HPLC测定为 98.3%。

[0120] 实施例 1 : 芒果苷 -6-0-小檗碱盐的制备

[0121] 在反应器中加水 2000ml， 将碳酸氢钠 O.lmol力卩入水中制成浓度为 0.4<¾(w/v)的碳 酸氢钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 127ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配 比为 l:3(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钠溶 液中， 充分搅拌， 80°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 60°C保 温备用； 取 O.lmol盐酸小檗碱加 60°C7j 2000ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 60°C保 温备用。 将芒果苷 -6-0-钠盐溶液缓慢加入盐酸小檗碱溶液中， 充分搅拌， 反应 完全， 静置析出沉淀， 过滤， 固体物 60°C真空干燥， 将所得干燥物加入适量 DM SO中溶解， 将 DMSO溶液缓慢滴加入适量丙酮中， 充分搅拌均匀， 静置， 析出 沉淀， 过滤， 沉淀物用适量无水乙醇洗涤， 固体物 55。C真空干燥， 得橙黄色固体 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 52.0g， 收率为 65.6%。 样品纯度经 HPLC测定为 95.6<¾。

[0122] 实施例 2: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备

[0123] 在反应器中加水 3500ml， 将碳酸钠 0.05mol力卩入水中制成浓度为 0.3<¾(w/v)的碳 酸钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 169ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:4(w/v)) 溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸钠溶液中， 充 分搅拌， 100°C保温反应完全， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 80°C保温备用； 取 0.1m ol盐酸小檗碱加 90°C水 3700ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 80°C保温备用。 将盐酸 小檗碱溶液缓慢加入中芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 充分搅拌， 反应完全， 静置析出 沉淀， 过滤， 固体物干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物 57.0g， 收率为 71.8%。 样品纯度经 HPLC测定为 94.5%。

[0124] 实施例 3: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备

[0125] 在反应器中加水 13800ml， 将碳酸钾 0.06mol力卩入水中制成浓度为 0.1<¾(w/v)的碳 酸钾溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 210ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:5(w/v)) 溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸钾溶液中， 充 分搅拌， 50°C保温反应完全， 得芒果苷 -6-0-钾盐溶液， 40°C保温备用； 取 O.lmol 硫酸小檗碱加 50°C水 870ml溶解， 滤过， 得硫酸小檗碱溶液， 40°C保温备用。 将 硫酸小檗碱溶液缓慢加入芒果苷 -6-0-钾盐溶液中， 充分搅拌， 反应完全， 静置 析出沉淀， 过滤， 固体物 50°C真空干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水 合物 48.2g， 收率为 57.6%。 样品纯度经 HPLC测定为 95.5%。

[0126] 实施例 4: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 4水合物的制备

[0127] 在反应器中加水 800ml， 将碳酸氢钠 O.lmol加入水中制成浓度为 l<¾(w/v)的碳酸 氢钠溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 8.5ml DMSO (芒果苷与 DMSO的配比 为 l:0.2( _W /v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢加入碳酸氢钠溶 液中， 充分搅拌， 90°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钠盐溶液， 80°C保 温备用； 取盐酸小檗碱 O.lmol加 80°C水 37000ml溶解， 得盐酸小檗碱溶液， 70°C 保温备用。 将芒果苷 -6-0-钠盐溶液加入得盐酸小檗碱溶液中， 充分搅拌， 反应 完全， 析出沉淀， 过滤， 沉淀物用纯水充分洗涤， 固体物干燥， 得干燥物 56.2g ， 收率为 70.8%; 将所得干燥物用适量甲醇中进行重结晶， 得橙黄色芒果苷 -6-0- 小檗碱盐 4水合物 35.9g， 收率为 44.3%。 样品纯度经 HPLC测定为 97.5<¾。

[0128] 实施例 5: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物的制备

[0129] 在反应器中加水 380ml， 将碳酸钠 0.04mol和 0.04mol碳酸氢钠加入水中制成浓度 为 2<¾(w/v)的碱性钠盐溶液； 将 O.lmol芒果苷 （42.2g) 加入 50ml DMSO (芒果苷 与 DMSO的配比为 l:1.2(w/v)) 加热溶解， 制成芒果苷溶液； 将芒果苷溶液缓慢 加入碱性钠盐溶液中， 充分搅拌， 95°C保温反应完全， 滤过， 得芒果苷 -6-0-钠 盐溶液， 90°C保温备用； 取 O.lmol盐酸小檗碱加 100°C水 3700ml溶解， 滤过， 得 盐酸小檗碱溶液， 90°C保温备用。 将盐酸小檗碱溶液缓慢加入中芒果苷 -6-0-钠 盐溶液， 充分搅拌， 反应完全， 降温， 静置析出沉淀， 过滤， 沉淀物用纯水充 分洗涤， 固体物 55°C真空干燥， 得橙黄色固体芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物 64.9g ， 收率为 81.8%。 样品纯度经 HPLC测定为 96.5%。

[0130] 实施例 6: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐片剂的制备

[0131] 将按实施例方法制备的芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物粉碎过 160目筛， 称取粉末 37.5g， 加入微晶纤维素 50g、 预胶化淀粉 45g作为稀释剂组成制剂配方， 混匀， 以 10%聚维酮 K30乙醇溶液为粘合剂制软材， 24目筛制粒， 干燥后整粒， 加入 0.5 %硬脂酸和 2%的微粉硅胶为润滑剂， 混匀， 压片， 制成 1000片， 包薄膜衣， 即 得， 含药量为 37.5mg/片。

[0132] 实施例 7: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐颗粒的制备

[0133] 将按实施例方法制备的芒果苷 -6-0-小檗碱盐粉碎过 160目筛， 称取粉末 103g， 加入预胶化淀粉 150g作为稀释剂， 加入 100g木糖为矫味剂组成制剂配方， 混匀 ， 以 1%羧甲基纤维素钠溶液为粘合剂制软材， 24目筛制粒， 干燥后整粒， 分装 ， 即得， 含药量为 42mg/g。

[0134] 实施例 8: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐胶囊的制备

[0135] 将按实施例方法制备的芒果苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物粉碎过 160目筛， 称取粉末 75g， 加入微晶纤维素 20g、 药用淀粉 25g作为稀释剂组成制剂配方， 混匀， 以 10 <¾聚维酮 K30乙醇溶液为粘合剂制软材， 24目筛制粒， 干燥后整粒， 分装胶囊， 制成 1000粒， 即得， 含药量为 75mg/粒。

[0136] 实施例 9: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐凝胶剂的制备 [0137] 取羟丙基甲基纤维素 15g、 海藻酸钠 10g， 加适量水， 搅拌溶解， 制成基质， 取 芒果苷 -6-0-小檗碱盐 4水合物 5g加 100ml二甲基亚砜溶解， 与基质混合均匀， 制 成 1000ml均匀液体， 即芒果苷 -6-0-小檗碱盐凝胶。

[0138] 实施例 10: 芒果苷 -6-0-小檗碱盐冻干粉针的制备

[0139] 称取 40g甘露醇， 置于适当容器内， 加入 200ml注射用水， 加针用炭 0.2g(0.1<¾w/ v)， 加热至 80°C， 搅拌 30min， 0.22μηι微孔滤膜过滤， 滤液备用。 称取 10g芒果 苷 -6-0-小檗碱盐 2水合物， 加叔丁醇 100ml， 搅拌使芒果苷 -6-0-小檗碱盐完全溶 解。 混合芒果苷 -6-0-小檗碱盐溶液及甘露醇溶液， 补加注射用水至 1000ml, 用 0 .22μηι微孔滤膜过滤， 分装， 装量为每支含芒果苷 -6-0-小檗碱盐 10mg， 冷冻干 燥。 真空压塞， 轧盖， 贴签， 包装即得。

[0140] 上述具体实施方式对本发明作进一步说明， 但不限于此。

工业实用性

[0141] 本发明的化合物的制备方法解决大量有机溶剂 的使用带来的环保压力与成本问 题， 从而更适合工业化生产。