テアフラビン類
 テアフラビン類には、主に下記に示す4種類 がある。

 紅茶葉のテアフラビン類の含有比率は、� ��アフラビン(TF) 0.08%、テアフラビン3-O-ガレ� ��ト(TF3-G) 0.3%、テアフラビン3’-O-ガレート(T F3’-G) 0.2%、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレート (TFDG)0.4%である。

テアフラビンの生合成経路
 テアフラビンの生合成経路は下記のとおり� ��ある(Takashi Tanaka, Chie Mine, KyokoInoue, Miyuki� �Matsuda and Isao Kouno, J. Agric. Food Chem. 2002,� �50, 2141-2148)。

 まず、EC(エピカテキン)が、茶葉中のポリ フェノールオキシダーゼまたはペルオキシダ ーゼにより速やかに酸化されてEC-キノンとな り、つづいてEC-キノンはEGC(エピガロカテキ� �)を酸化して、EGC-キノンを生成させる。これ らの酸化過程で得られたEGC-キノンのEC-キノ� �へのマイケル付加、つづくカルボニル付加� �より3員環中間体を生成し、つづいて酸化、� ��炭酸を経てトロポノイド骨格を形成し、テ� ��フラビンが生成される。

 茶葉中には主として4種類のカテキン[EC,EGC,E CG(エピカテキンガレート)、EGCG(エピガロカテ キンガレート)]が存在し、紅茶の製茶工程、� ��わゆる発酵工程では、上記と同様の経路に� ��、以下のカテキンの組み合わせにより、4種 類のテアフラビン類(TF,TF3-G,TF3’-G,TFDG)が生成 される。

 紅茶葉中の4種類のテアフラビン類の割合 は、原料となるカテキンの含量により左右さ れる。紅茶葉中のテアフラビン(TF)の割合が� �テアフラビン中8%と低いのはエピカテキンの 含量が他のカテキンに比べ低いためである。 4種類のテアフラビン類の中でテアフラビン(T F)は紅茶の紅色が鮮やかであるため、TFの含� �が高い程、高価な紅茶葉である。

原料
 本発明の方法において使用する生茶葉とは� ��収穫後、萎凋処理をする前の茶葉をいい、� ��ましくは茶葉を破砕処理せずに用いる。茶� ��とは茶の葉及び茎であり別々に使っても良� ��し、あわせて使用してもよい。原料となる� ��茶葉としては、一般に栽培されている緑茶� ��種および紅茶品種のいずれの茶葉も用いる� ��とができる。生茶葉は、採取直後に冷凍し� ��使用しても良い。茶葉の採取時期は、1番茶 、2番茶、3番茶、4番茶のいずれでも良い。た だし、それぞれの葉ごとにカテキン量、ポリ フェノールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ 、タンナーゼ、加水分解酵素の活性が異なる ため、高収率を得るために反応条件を適宜調 節することが好ましい。価格、カテキン量、 酵素活性等を総合的に判定すると、本発明の 方法において用いる茶葉としては2番茶およ� �3番茶が望ましい。

茶葉の品種の違い
 日本で栽培されている代表的な茶葉として� ��、あさつゆ、やぶきた、やまとみどり、ま� ��のはらわせ、かなやみどり、おくみどり、� ��おいわせ、おくひかり、めいりょく、さみ� ��り、こまかげ、やまなみ、みねかおり、は� ��もみじ、紅富貴、紅ほまれ、べにひかり等� ��あり、本発明の方法では世界中で栽培され� ��いる茶葉のいずれをも好適に用いることが� ��きる。例えば、やぶきた茶は緑茶品種、紅� ��貴および紅ほまれは紅茶品種である。これ� ��の茶葉に含まれる主なカテキン類は以下の� ��おりである。
やぶきた茶:EGCG, ECG, EGC, EC
紅富貴:EGCG, ECG, EGC, EC, エピガロカテキン3- (3”-O-メチル)ガレート (EGC3”methyl), エピガ� ��カテキン3-(4”-O-メチル)ガレート (EGC4”meth yl), エピカテキン3-(3”-O-メチル)ガレート (E C3”methyl),
紅ほまれ:EGCG, ECG, EGC, EC, EGC3”methyl, EGC4” methyl, EC3”methyl

 紅富貴および紅ほまれには、やぶきた茶� ��は含まれていないEGC3”methyl, EGC4”methyl, EC 3”methyl が存在する。これらの成分は花粉症 に有効とされる抗アレルギー物質である。紅 富貴及び紅ほまれは紅茶品種であるため、従 来の紅茶製法で製茶した場合、EGC3”methyl, EG C4”methyl, EC3”methyl の成分は消失してしま� �。

1番茶から4番茶等、茶葉の収穫時� ��による相違
 やぶきた1番茶、2番茶及び3番茶を用いた場� ��、葉を摘み取った後または冷凍庫で冷凍し� ��後、すぐミキサーで破砕し、静置または振� ��う、または撹拌することができる。しかし� ��ぶきた4番茶の場合、同様の方法ではテアフ ラビン類の生成量は低かった。これは、4番� �は1番茶、2番茶及び3番茶に比べポリフェノ� �ルオキシダーゼやペルオキシダーゼの酵素� �性が低いため、あるいはカテキン量が低い� �めであると考えられる。また。そこで葉を� �みとったのち、2日から5日間程、室温下放置 後、同様の操作を行うことが望ましい。また カテキン量が低く、テアフラビン類の生成量 が低い場合、2日から5日間程、室温下放置後� ��葉に水と番茶抽出液(番茶に水を加え抽出し た液)を加え同様の操作を行うことが望まし� �。

テアフラビン類の製造法
 本発明の方法においては、萎凋処理前の生� ��葉に水を加え、ミキサー等を用いて生茶葉� ��破砕した後、分離せずに静置または振とう� ��たは撹拌する。生茶葉に水を加えて破砕す� ��と、茶葉の細胞中に存在するポリフェノー� ��オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、タンナ� ��ゼ、加水分解酵素、さらに各種茶の成分カ� ��キン類、カフェイン等の成分が水中へ侵出� ��れる。これらの酵素及び成分が侵出された� ��を静置または振とうまたは撹拌すると、こ� ��らの酵素の作用により、カテキン類の全て� ��テアフラビン類に変換されると共に没食子� ��が生成される。ペルオキシダーゼは過酸化� ��素存在下、テアフラビンを生成させる酵素� ��ある。この場合、過酸化水素は代謝により� ��成されるので、外から添加しなくてもよい� ��一方、ポリフェノールオキシダーゼは、酸� ��存在下、テアフラビン類を生成させる酵素� ��ある。タンナーゼは、カテキン類およびテ� ��フラビン類のガレート基を切断することが� ��きる。また、ガレート基は加水分解酵素の� ��用によっても切断される。

静置法
 本発明の1つの態様においては、生茶葉に水 を加えて破砕した後、固液を分離せずに所定 時間静置する。採取直後のやぶきた茶の二番 茶の生葉に水を加えミキサーにて1分破砕し� �後、24時間静置したところ、TF,TF3G,TF3’Gおよ びTFDGが生成した(実施例1)。120時間静置する� �全てのカテキン類がテアフラビン(TF)に変換� ��た(実施例2)。一方、ミキサーにて破砕した� ��に振とうすると、他のテアフラビン類の生� ��率が高くなった(実施例7)。

 本発明では、生茶葉に水を加え破砕する� ��、ポリフェノールオキシダーゼ、ペルオキ� ��ダーゼ、加水分解酵素、さらに各種茶の成� ��カテキン類、カフェイン等の成分が水中へ� ��出される。これらの酵素及び成分が侵出さ� ��た液を静置させた場合、振とう法に比べ酸� ��の供給が断たれるため、テアフラビン生成� ��関わるポリフェノールオキシダーゼとペル� ��キシダーゼのうち、ポリフェノールオキシ� ��ーゼの作用が低い(ポリフェノールオキシダ ーゼは酸素存在下酸化反応を触媒するため、 静置法では水中の溶存酸素が消費されれば働 けない)。このため、24時間静置では、TF3G, TF 3’G,TFDGは生成するが、振とう法に比べ他の� �アフラビン類の生成率は抑えられたと考え� �れる(実施例1と7の比較)。一方120時間放置す� ��と、酸素供給が絶たれているためペルオキ� ��ダーゼが主として作用するとともに、加水� ��解酵素が働き、24時間の反応で得られたTF3G,  TF3’G, TFDGの加水分解反応が進行し、全てTF に変換する(実施例1と2の比較)。さらにこの� �、次のような反応も進行すると考えられる� �まず、ECとEGCよりペルオキシダーゼの酵素反 応によりTFが生成する。一方、TFに関与しな� �ECG及びEGCGは、タンナーゼあるいは加水分解� ��素によりガレート基が切断され、EC及びEGC� �変換された後、ペルオキシダーゼによりTFへ と変換される。加水分解反応は平衡反応であ るが、加水分解により得られたEC及びEGCはペ� ��オキシダーゼによりテアフラビンに変換す� ��ため、EC及びEGCの消費に伴い平衡反応は右� �傾き、ECG及びEGCGの加水分解反応は完全に進� ��して、120時間後では4種類のカテキンが全て テアフラビン(TF)に変換した。

 静置時間は、使用する茶葉の種類、含有� ��分、保存状態等によって異なるが、好まし� ��は12時間以上、より好ましくは24時間以上、 さらにより好ましくは120時間以上である。静 置時間の上限は特になく、テアフラビン類の 生成をモニターしながら、適当な時期に反応 を終了させることができる。静置温度は、酵 素が作用しうる温度範囲内であれば特に制限 はなく、例えば10℃から40℃、好ましくは20℃ から30℃である。

振とう法
 本発明の別の態様においては、生茶葉に水� ��加えて破砕した後、固液を分離せずに所定� ��間振とうする。萎凋処理前の生茶葉に大量� ��水を加えミキサーで1分から5分間破砕後、10 分から1時間振とうすると、茶生葉中の4種類� ��カテキン類が全て4種類のテアフラビン類に 変換する。振とうすることにより、ポリフェ ノールオキシダーゼとペルオキシダーゼが共 に作用するため、テアフラビン、テアフラビ ン3-O-ガレート、テアフラビン3’-O-ガレート� ��テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレートの4種類の� �合物を得ることができる。

 振とう時間は、使用する茶葉の種類、含� ��水分、保存状態等によって異なるが、好ま� ��くは3分間から2時間、より好ましくは10分間 から1時間である。カテキン類がテアフラビ� �類に変換した後にさらに振とうを続けると� �テアフラビン類がポリマー化していくため� �収量の低下が顕著である。最適な振とう時� �は用いる茶葉により異なり、当業者は容易� �条件を最適化することができる。振とう温� �は、酵素が作用しうる温度範囲内であれば� �に制限はなく、例えば10℃から40℃、好まし� ��は20℃から30℃である。

撹拌法
 本発明の別の態様においては、生茶葉に水� ��加えて破砕した後、固液を分離せずに所定� ��間撹拌を行う。撹拌は、ミキサー、スター� ��ー、回転板、ボトルローラーなどを用いて� ��気が液体中に巻き込まれないような速度で� ��転することにより行うことができる。萎凋� ��理前の生茶葉に大量の水を加えミキサーで1 分から5分間破砕後、10分から8時間撹拌する� �、茶生葉中の4種類のカテキン類が全て4種類 のテアフラビン類に変換する。空気の巻き込 みに注意して非常にゆっくり撹拌すると全て のカテキン類がテアフラビン(TF)に変換した(� ��施例10)。撹拌速度をあげると空気の巻き込� ��がおこるため他のテアフラビン類の生成率� ��高くなった(実施例11)。撹拌法は静置法に比 べ反応の時間を非常に短くすることができる という利点を有する。

茶葉の破砕条件
 破砕は0℃から30℃の温度で行うことができ� ��。ミキサーによる破砕時間を3分にすると、 1分に比べ、テアフラビン類の含量が大幅に� �えた。その後静置し、24時間と120時間でテア フラビン類の含量を測定したところ、120時間 後では24時間後に比べTF3G, TF3’G, TFDGの含量� ��減ったが、実施例2のように完全にTFに変換� ��きなかった。この理由として、3分の振とう ではTF3G,TF3’G,TFDGの含量が増えたため、120時� ��の加水分解では完全に加水分解反応が進行� ��なかったと思われる。この場合さらに長時� ��静置する必要がある。もしくはEGCG及びECGは 加水分解されやすく、TF3G, TF3’G及びTFDGは加 水分解されにくいため、120時間の加水分解で は3分の振とうにより増大したTF3G, TF3’G及び TFDG の加水分解を完全に進行させることが出 来なかったと考えられる(実施例2と4と5の比� �)。なお、ここでいうミキサーとは容量約700~ 1000ml、出力200~300W程度の家庭用のミキサー(ブ レンダー)であり、工業生産用にスケールア� �プして本発明を実施する場合には、当業者� �、用いる機械と処理量に応じて適切な破砕� �間を設定することができる。本発明の方法� �用いることができる工業生産用ミキサーの� �は、容量約4000ml、出力1400W程度の業務用のミ キサー(ブレンダー)であり、回転数は高速(18, 500rpm)、中速(16,300rpm)、低速(14,000rpm)である。� ��らに大量のスケールで行う場合は特注のブ� ��ンダーを使うか、茶葉の量に合わせミキサ� ��操作を繰り返しても良い。生茶葉の破砕は� ��砕できればどのような機械でも使用可能で� ��り、例えばミキサー、ウルトラマイザー、� ��ンマーミル、ホモゲナイザーなどを使用で� ��るが特にミキサー(ブレンダー)が好ましい� �

水の量
 生茶葉に加える水の量は、使用する茶葉の� ��類、含有水分、保存状態等によって適宜選� ��することができるが、好ましくは生茶葉1g� �対して5mlから500ml、より好ましくは7mlから200 ml、さらに好ましくは10mlから100mlである。5ml� ��り少ないと、収率が低下し、500mlより多い� �、酵素反応の効率および生成物の精製効率� �低下する。水の量を大量にした場合、テア� �ラビンまたはテアフラビン類の含量が増大� �た(実施例2と3の比較、実施例5と6の比較)。

緑茶葉抽出液
 生茶葉中のカテキン量は限られているため� ��テアフラビン類の収量をさらに高めるため� ��は、生茶葉または冷凍生茶葉に水と緑茶抽� ��液を加え同様の操作を行うことが望ましい� ��緑茶抽出液としては、加熱処理した緑茶葉� ��水を加え抽出した液、加熱処理した緑茶葉� ��水を加え抽出し濃縮した茶エキスに水を添� ��した液、茶抽出物に水を添加した液などの� ��4種類のカテキン類が含まれている水溶液を 用いることができる。この場合、生茶葉中の 酵素の作用により、生茶葉に含まれるカテキ ン類と緑茶抽出液に含まれるカテキン類との 両方を効率よくテアフラビンに変換でき、よ り高含量のテアフラビンまたはテアフラビン 類を得ることができる。

精製
 得られたテアフラビン類は、反応水溶液を� ��機溶媒で抽出することにより容易に高純度� ��回収することができる。例えばクロロホル� ��でカフェイン(caffeine)を抽出して除去したの ち、酢酸エチル、エーテルなどの有機溶媒で 抽出することにより、テアフラビン類を高純 度で得ることができる。クロマト分離によっ ても高純度で回収することができる。反応混 合物からカフェインと没食子酸を昇華させて テアフラビン類を高純度で回収することがで きる。反応水溶液の温度を適宜に変える事に より分別再結晶によりテアフラビン類を高純 度で回収することもできる。以上はテアフラ ビン類を高純度で得る方法について述べたが 、用途によってはテアフラビン類を単離せず 、カフェイン及び没食子酸を含む混合物で用 いる事も可能である。その場合は従来良く知 られた技術、例えばスプレードライ法、凍結 乾燥法などを用いて水を除去すれば良い。生 成したテアフラビン類の種類および量は、定 法にしたがってHPLC等を用いて測定すること� �できる。

 本明細書において明示的に引用される全� ��の特許および参考文献の内容は全て本明細� ��に参照として取り込まれる。