Markersequenzen zur Diagnose und Stratifizierung von Systemische Sklerose Patienten

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur

Identifizierung von Markern für Systemische Sklerose (SSc;

auch Sklerodermie oder synonym Progressive Systemische

Sklerose (PSS) ) und die mit Hilfe dieses Verfahrens

identifizierten Marker, die zwischen SSc und anderen

Autoimmunerkrankungen einerseits und zwischen verschiedenen SSc-Subgruppen andererseits differenzieren können. Weiterhin betrifft die Erfindung Panel, Diagnostika und Test-Kits, die diese Marker umfassen sowie deren Verwendung und Anwendung, beispielsweise zur Diagnose, Prognose und Therapiesteuerung bei SSc. Ferner Verfahren zum Screenen und zur Validierung von Wirkstoffen für die Anwendung bei SSc-Subgruppen.

Die SSc ist eine chronische, entzündliche, rheumatische

Erkrankung, die zu den klassischen immunologischen

Bindegewebserkrankungen (Kollagenosen) zählt.

Die SSc ist eine heterogene Erkrankung mit übermäßiger Fibrose der Haut. Es können auch weitere Organsysteme wie z.B. Lunge, Magen-Darm, Niere, Herz und Blutgefäße betroffen sein.

Zusätzlich treten Gelenksymptome (Arthritis) auf.

SSc ist eine sehr seltene Erkrankung. Die Inzidenz beträgt ca. 0,5-1,5/100.000 Einwohner/Jahr . Sie tritt meist zwischen dem 30.-50. Lebensjahr auf. Frauen sind 10-15 mal häufiger

betroffen als Männer (LeRoy et al . 1988) .

Klinisch werden nach LeRoy et al . (1988) zwischen der

limitierten und der diffusen SSc unterschieden. In frühen Phasen der Erkrankung ist es oftmals schwierig Patienten eindeutig zu klassifizieren, welches als undifferenzierte SSc bezeichnet wird. Treten zusätzlich zur Sklerodermie auch wesentliche Symptome anderer rheumatischer Krankheiten auf, spricht man von einem Sklerodermie-Überlappungssyndrom oder Overlap-Syndrome . Die limitierte Form der SSc tritt mit einer Frequenz von bis zu 60% auf. Diese ist charakterisiert durch eine Fibrose der Hände und Füße, die sich bis unterhalb der Ellbogen und

Kniegelenke ausbreitet. Vor Auftreten der Hautfibrose besteht häufig bereits über mehrere Jahre das Raynaud-Phänomen . Häufig treten auch gastrointestinale Veränderungen

(Schluckbeschwerden) und pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) auf. Zur limitierten Form gehört auch das CREST-Syndrom:

Calcinosis cutis, Raynaud-Phänomen,

Ösophagusmotilitätsstörung, Sklerodaktylie und

Teleangiektasie .

Bei der diffusen Form handelt es sich um die schneller und schwerwiegender verlaufende Form der SSc. Die Fibrose breitet sich dabei über die Ellbogen über den Körper und Gesicht aus. Im Gegensatz zur limitierten Form treten bereits 1-2 Jahre nach dem Auftreten des Raynaud-Phänomens Hautfibrosen auf.

Beim Sklerodermie-Überlappungssyndrom treten neben den

HauptSymptomen der Sklerodermie auch Symptome weiterer nicht- organspezifischer Autoimmunerkrankungen, wie z.B. der

Myositis, Lupus Erythematodes/SLE, Sjögren-Syndrom und

rheumatoide Arthritis/RA auf.

Patienten mit undifferenzierter SSc weisen das Raynaud-Syndrom auf und haben für SSc typische geschwollene Finger und

pulmonale arterielle Hypertonie. Nur ein Teil der Patienten entwickelt später tatsächlich eine diffuse oder limitierte SSc.

Die Diagnose der SSc kann aufgrund des klinischen Bildes mit den typischen Hautveränderungen gestellt werden. Dies kann jedoch in Frühstadien der Erkrankung zum Teil schwierig sein. Weiterhin wird der Nachweis von antinukleären Antikörpern (ANA) herangezogen. In etwa 90% der SSc Patienten sind ANA nachweisbar. Jedoch ist der ANA-Test nicht spezifisch für SSc, da auch andere Kollagenosen und bis zu 20% der Gesunden positiv getestet werden. Die drei wichtigsten Autoantikörper bei SSc sind anti-Topoisomerase I (Scl-70), anti-Centromere (CENP) und anti-RNA-Polymerase III (anti-RNAP III) . Diese Autoantikörper weisen eine hohe Spezifität für SSc auf und sind häufig mit einer Subform der SSc assoziiert. Jedoch eignen sich diese 3 Autoantikörper nur eingeschränkt zur

Subtypisierung der SSc, da diese nicht ausschließlich in einem Subtyp vorkommen und deren Frequenz offenbar in verschiedenen Ethnizitäten abweichen kann. Anti-Topoisomerase-Antikörper weisen eine hohe Spezifität für SSc auf und sind in etwa 30% der Patienten mit diffuser SSc nachweisbar. Anti-Centromere Antikörper sind dagegen in etwa 50-60% der Patienten mit limitierter SSc und in 10% der Patienten mit diffuser SSc nachweisbar. Beide Autoantikörper schließen sich aus und sind nur in sehr seltenen Fällen gemeinsam in Patienten

nachweisbar. Anti-RNAP III Antikörper sind häufiger in der diffusen Form nachweisbar und stellen einen Risikofaktor für die eine renale Krise dar. Insgesamt können mit den

Autoantikörpern gegen anti-Topoisomerase, anti-Centromere und anti-RNAP nur etwa 70% der SSc Patienten diagnostisch

identifiziert werden (Mierau et al . 2011; Mehra et al . 2013) .

Seltener treten auch Antikörper gegen Ul-RNP und PM-Scl

Antikörper auf. Diese weisen jedoch nur eine geringe

Spezifität für SSc auf: Anti-PM-Scl Antikörper werden häufig in Patienten mit Polymyositis/SSc Overlap Syndrom

nachgewiesen. Antikörper gegen Ul-RNP sind sowohl bei SSc als auch Mixed Connective Tissue Diseases (MCTD) und SLE

nachweisbar. Bei etwa einem Drittel der Patienten werden auch Antikörper gegen typische Kollagenosen-Antigene, wie Rho52/SS- A, R06O/SS-B, sowie citrullinated Peptide (ACPA) und

Rheumafaktoren nachgewiesen.

In der klinischen Praxis ist die Diagnosestellung einer frühen Form der SSc und deren Klassifizierung in die Subgruppen diffus, limitiert oder Overlap Syndrom oftmals schwierig, da noch nicht alle Symptome vorliegen bzw. etwa 10-30% der

Patienten Symptome einer anderen Kollagenose

(Bindegewebserkrankung, Connective Tissue Disease) tragen. Da die verschiedenen Unterformen eine sehr unterschiedliche

Prognose haben, besteht ein substantieller Bedarf an

Biomarkern für eine verbesserte Diagnosestellung der SSc und für eine Einteilung in SSc-Subgruppen . Weiterhin besteht ein hoher Bedarf an prognostischen und pradiktiven Biomarkern.

Ein weiteres Problem der derzeit angewendeten diagnostischen Verfahren ist, dass die Tauglichkeit der bisher untersuchten Autoantigene zur Diagnose von Organbeteiligungen und Komplikationen umstritten sind und zum Teil widersprüchliche Daten veröffentlicht wurden.

Daher besteht weiterhin Bedarf, an neuen Markern für SSc sowie die Sensitivität und Spezifität der bisher am häufigsten diagnostisch eingesetzten Autoantigene durch den Einsatz neuer Autoantigene oder Marker zu verbessern.

Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass ein differentielles , eine Vielzahl von Schritten umfassendes

Verfahren entwickelt wurde, bei dem Serumproben einer Vielzahl von Gesunden und Patienten mit verschiedenen

Autoimmunerkrankungen vergleichend im Hinblick auf ihre

Reaktivität mit einer Vielzahl von potentiellen Antigenen untersucht und diese Ergebnisse statistisch ausgewertet wurden. Die Auswahl der Serumproben und die Abfolge der

Schritte ermöglichte überraschend die Identifizierung

hochspezifischer Marker für SSc, die auch geeignet sind, SSc- Subgruppen zu identifizieren und Komplikationen zu

diagnostizieren sowie eine Differentialdiagnose im Hinblick auf andere Autoimmunerkrankungen wie rheumatoide Arthritis (RA) , insbesondere Frühstadien von RA („frühe RA") und

Spondylitis ankylosans bzw. Morbus Bechterew (SPA) . Gegenstand der Erfindung ist ein mehrstufiges Verfahren zur Identifizierung von spezifischen Markern für SSc sowie die mit Hilfe des Verfahrens identifizierten Marker für SSc, die Verwendung und / oder spezifische therapeutische Anwendung dieser Marker zur Diagnose und / oder differentiellen Diagnose der Systemischen Sklerose und / oder zur Unterscheidung von klinischen Subgruppen von SSc.

Daher ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Markern für Systemische Sklerose (SSc) umfassend die Schritte: a) Serumproben von mindestens 50, vorzugsweise 100 SSc Patienten werden mit mehr als 5000 an Beads, beispielsweise Luminex-Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine in den Serumproben der SSc Patienten durch Immunfluoreszenzassay gemessen und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI = median fluorescence intensity) für jedes einzelne Antigen bestimmt;

b) Serumproben von mindestens 50, vorzugsweise 100 Patienten mit Lupus Erythematodes (SLE) werden mit denselben an Beads, beispielsweise Luminex-Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine in den Serumproben der SLE Patienten durch Immunfluoreszenzassay gemessen und daraus die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes einzelne Antigen bestimmt;

c) Serumproben von mindestens 50, vorzugsweise 537 Patienten mit früher rheumatoider Arthritis (RA) werden mit denselben an Beads, beispielsweise Luminex-Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine in den Serumproben der RA Patienten durch Immunfluoreszenzassay gemessen und daraus die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes einzelne Antigen bestimmt;

d) Serumproben von mindestens 50, vorzugsweise 82 Patienten mit ankylosierender Spondylitis (SPA) werden mit denselben an Beads, beispielsweise Luminex-Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine in den Serumproben der SPA Patienten durch Immunfluoreszenzassay gemessen und daraus die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes einzelne Antigen bestimmt;

e) Serumproben von mindestens 50, vorzugsweise 343 Gesunden werden mit denselben an Beads, beispielsweise Luminex- Beads gekoppelten Antigenen in Kontakt gebracht, die Bindung der einzelnen Antigene an Proteine in den Serumproben der Gesunden durch Immunfluoreszenzassay gemessen und daraus die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für jedes einzelne Antigen bestimmt;

f) die MFI Daten jedes einzelnen Antigens aus a) , b) , c) , d) und e) werden statistisch mittels univariater Analyse ausgewertet und dadurch Marker identifiziert, mit denen SSc Patienten von Patienten mit SLE, Patienten mit früher RA, Patienten mit SPA und von Gesunden differenziert werden können;

g) und wobei die Marker ausgewählt werden aus den Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 955, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 1 bis 955 und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No. 1 bis 319.

Die Beads, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren in den Schritten a) bis e) verwendet werden, sind vorzugsweise fluoreszenzmarkiert . Die Begriffe Systemische Sklerose (SSc) , RA bzw. frühe RA, SLE und SPA sind beispielsweise in Pschyrembel, Klinisches Wörterbuch, de Gruyter, 261. Auflage (2011) definiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die Marker nach univariater statistischer Auswertung dadurch ausgewählt, dass sie einen Schwellenwert von p kleiner 0,05 und eine 1,5-fach veränderte Reaktivität in der SSc-Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe haben. Die Kontrollgruppe umfasst oder besteht aus Patienten mit SLE und / oder Patienten mit früher RA und / oder Patienten mit SPA und / oder Gesunden. Gesunde sind Personen, bei denen keine SSc, keine SSc-Subform, keine frühe RA und keine SPA nachgewiesen wurde oder nachweisbar ist.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Marker für SSc oder eine oder mehrere SSc-Subformen erhältlich durch das erfindungsgemäße Verfahren.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Marker für SSc oder eine oder mehrere SSc-Subgruppen ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 955, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 1 bis 955 und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 1 bis 319. Die SSc-Subgruppen sind beispielsweise diffuse SSc (kurz: dSSc) , limitierte SSc (kurz: lSSc) und / oder SSc Overlap-Syndrom (kurz: SSc-OS) .

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Marker für SSc ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327-352, 639, 641-643, 646-671, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327-352, 639, 641-643, 646-671 mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327- 352, 639, 641-643, 646-671, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327-352, 639, 641- 643, 646-671 mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Marker für dSSc ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741, mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741 mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 6, 7, 34-103.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Marker für lSSc ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 2, 104-171, 321, 423- 490, 640, 742-809, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 2, 104- 171, 321, 423-490, 640, 742-809, mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 2, 104-171, 321, 423-490, 640, 742-809, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 2, 104-171, 321, 423-490, 640, 742-809, mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 2, 104-171.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Marker für SSc-OS ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811- 929, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811- 929, mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No. 173-291, 492-610, 811-929, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811-929, mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No. 173-291.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Panel (Anordnung) von Markern für SSc oder SSc-Subgruppen umfassend mindestens zwei oder drei verschiedene Marker unabhängig voneinander

ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 %

Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID o. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und kodiert durch die Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 319. Weiterhin sind bevorzugte Panels in den Beispielen dargelegt.

Aufgrund der hohen klinischen und serologischen Heterogenitat der SSC Erkrankung ist es schwierig, mit nur einem Biomarker SSC eindeutig zu diagnostizieren. Daher ist es oft

erforderlich, möglichst unkorrelierte Autoantigene zu

sogenannten Paneln von Markern („Biomarker-Panel für SSc") zu kombinieren. Beispielsweise im Rahmen der individualisierten Medizin können entsprechende Panel von Markern für SSc für einzelne Patienten oder Patientengruppen individuell für den betreffenden SSc-Subtyp (Subgruppe) zusammengestellt werden. Deshalb ist es auch notwendig, eine Vielzahl von potentiellen Markern für SSc zur Verfügung zu haben, um entsprechende

Subgruppen bzw. Subtypen spezifische Marker für SSc für den jeweils individuellen Fall auszuwählen. Ein entsprechendes Panel kann beispielsweise in Form einer Anordnung, eines

Arrays oder auch eines oder mehrerer Beads ausgestaltet sein. Gegenstand der Erfindung ist somit eine Anordnung umfassend eine oder mehrere erfindungsgemäße Marker, ein Proteinarray umfassend eine oder mehrere erfindungsgemäße Marker, ein Bead (Kügelchen oder Plättchen) umfassend eine oder mehrere

erfindungsgemäße Marker.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Diagnostikum oder Test- Kit umfassend mindestens einen Marker für SSc oder SSc- Subgruppen ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und kodiert durch die Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 319. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines Markers ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 955, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit

mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie und kodiert durch die

Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 319 oder mindestens eines Panels von Markern oder eines Diagnostikums oder Test-Kits zur Identifizierung von Subgruppen von SSc Patienten, zur Diagnose von SSc, zur Differentialdiagnose von SSc oder SSc-Subgruppen, insbesondere zur Unterscheidung von SSc von anderen Autoimmunerkrankungen oder rheumatischen

Erkrankungen oder zur Diagnose von dSSc, lSSc oder SSc-OS, zur Prognoses bei SSc, zur Therapiesteuerung bei SSc, zur

Wirkstoffauswahl bei SSc, zur Therapieüberwachung bei SSc, zur Nachsorge bei SSc.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines Markers ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327-352, 639, 641-643, 646-671, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327-352, 639, 641-643, 646-671 mit mindestens 95 % Homologie und

Teilsequenzen von SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327- 352, 639, 641-643, 646-671, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33, 320, 322-324, 327-352, 639, 641- 643, 646-671 mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 1, 3-5, 8-33 zur Diagnose von SSc.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines Markers ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741, mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 6, 7, 34-103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672- 741, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 6, 7, 34- 103, 325, 326, 353-422, 644, 645, 672-741 mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 6, 7, 34-103 zur Diagnose von dSSc, zur Differentialdiagnose von dSSc, insbesondere zur Unterscheidung von dSSc von anderen

Autoimmunerkrankungen oder rheumatischen Erkrankungen oder von lSSc oder SSc-OS, zur Prognoses bei dSSc, zur

Therapiesteuerung bei dSSc, zur Wirkstoffauswahl bei dSSc, zur Therapieüberwachung bei dSSc, zur Nachsorge bei dSSc.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines Markers ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 2, 104- 171, 321, 423-490, 640, 742-809, Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 2, 104-171, 321, 423-490, 640, 742-809, mit mindestens 95 % Homologie und Teilsequenzen von SEQ ID No . 2, 104-171, 321, 423-490, 640, 742-809, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 2, 104-171, 321, 423-490, 640, 742-809, mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 2, 104-171 zur Diagnose von lSSc, zur Differentialdiagnose von lSSc, insbesondere zur Unterscheidung von lSSc von anderen Autoimmunerkrankungen oder rheumatischen Erkrankungen oder von dSSc oder SSc-OS, zur Prognoses bei lSSc, zur

Therapiesteuerung bei lSSc, zur Wirkstoffauswahl bei lSSc, zur Therapieüberwachung bei lSSc, zur Nachsorge bei lSSc.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines Markers ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811-929, Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811-929, mit mindestens 95 % Homologie und

Teilsequenzen von SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811-929, und Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No . 173-291, 492-610, 811-929, mit mindestens 95 % Homologie und Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 173-291 zur Diagnose von SSc-OS, zur

Differentialdiagnose von SSc-OS, insbesondere zur

Unterscheidung von SSc-OS von anderen Autoimmunerkrankungen oder rheumatischen Erkrankungen oder von dSSc oder lSSc, zur Prognoses bei SSc-OS, zur Therapiesteuerung bei SSc-OS, zur Wirkstoffauswahl bei SSc-OS, zur Therapieüberwachung bei SSc- OS, zur Nachsorge bei SSc-OS.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Früherkennung, Diagnose, Prognose, Therapiesteuerung und/oder Nachsorge bei SSc oder SSc-Subgruppen, wobei

a. mindestens einer der Marker ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955, den Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie, den

Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 oder den

Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie oder kodiert durch SEQ ID No . 1-319;

b. mit Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines zu

untersuchenden Individuums in Kontakt gebracht wird, und c. der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit dem oder den Markern aus a. erfolgt .

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Zusammensetzung, vorzugsweise eine pharmazeutische Zusammensetzung zur

spezifischen Anwendung bei SSc oder SSc-Subgruppen umfassend mindestens eine der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955, der

Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie, der Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 oder der Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie oder der Sequenzen kodiert durch SEQ ID No. 1-319.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Target zur Therapie von SSC ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955, den Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie, den Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 und den Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie sowie der durch die Sequenzen kodierten Proteine.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Screening von Wirkstoffen für SSc oder SSc-Subgruppen, wobei a. mindestens einer der Marker ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 955, den Homologen der Sequenzen SEQ ID No . 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie, den

Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 oder den

Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie oder den Sequenzen kodiert durch SEQ ID No . 1-319;

b. mit einer zu untersuchenden Substanz in Kontakt gebracht wird und

c. der Nachweis einer Wechselwirkung der zu untersuchenden Substanz mit dem oder den Markern a. erfolgt.

Die große klinische Heterogenität von SSc stellt derzeit sowohl für die Diagnostik als auch für die

Wirkstoffentwicklung ein großes Problem dar.

Die Identifizierung von spezifischen Antikörpersignaturen in SSC-Patienten-Subgruppen stellt daher einen wichtigen Schritt für die bessere Definition von Patientengruppen in klinischen Studien dar. So könnten beispielsweise spezifische

Autoantikörper für dSSc, lSSc oder SSc-OS dazu verwendet werden, diese Subgruppe für Medikamentenstudien zu

rekrutieren .

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Marker für SSc oder SSc-Subgruppen, einer erfindungsgemäßen Anordnung (Panel von Markern für SSc) , eines erfindungsgemäßen Proteinarrays , eines erfindungsgemäßen Beads, eines erfindungsgemäßen Diagnostikums oder eines erfindungsgemäßen Test Kits zur individualisierten Diagnostik und/oder Therapie bei einzelnen Patienten, Patientengruppen, Kohorten, Bevölkerungsgruppen, Varianten von SSc, Stadien von SSc.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Marker für SSc oder SSc-Subgruppen, einer erfindungsgemäßen Anordnung (Panel von Markern für SSc) , eines erfindungsgemäßen Proteinarrays , eines erfindungsgemäßen Beads, eines erfindungsgemäßen Diagnostikums oder eines erfindungsgemäßen Test-Kits zum Nachweis und/oder zur

Bestimmung der Menge von einem oder mehreren Autoantikörpern die mit SSc bzw. SSc-Subgruppen assoziiert sind,

beispielsweise in Körperflüssigkeiten wie Serum, Gewebe oder Gewebeauszügen des Patienten.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung einer oder mehrerer erfindungsgemäßer Marker, einer erfindungsgemäßen Anordnung, eines erfindungsgemäßen Proteinarrays, eines erfindungsgemäßen Beads, eines erfindungsgemäßen Diagnostikums oder eines erfindungsgemäßen Test-Kits zur Analyse von

Autoantikörperprofilen von Patienten, insbesondere zur

qualitativen und/oder quantitativen Analyse von

Autoantikörpern und/oder zur Überwachung von Veränderungen von Autoantikörperprofilen, die mit SSc oder SSc-Subgruppen assoziiert sind, beispielsweise in Körperflüssigkeiten wie Serum, Gewebe oder Gewebeauszügen des Patienten.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft

Verfahren zur Früherkennung und Diagnose von SSc bzw. SSc- Subgruppen, wobei der Nachweis einer Wechselwirkung der

Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit dem oder den Markern ein SSc bzw. SSc-Subgruppen assoziiertes

Autoantikörperprofil des Patienten oder einer Kohorte oder einer Bevölkerungsgruppe oder eines bestimmten

Krankheitsverlaufs (Prognose) oder eines bestimmten

Ansprechens auf eine Therapie/Arzneimittel abbildet. Die Erfindung umfasst damit die Verwendung mindestens eines Markers für SSc ausgewählt aus den Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 955, den Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie, den Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 oder den Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie sowie der durch die Sequenzen kodierten Proteine zur Analyse von

Autoantikörperprofilen von Patienten, insbesondere zur

quantitativen Analyse und/oder zur Überwachung von

Veränderungen von Autoantikörperprofilen von SSc Patienten.

Der Nachweis einer Wechselwirkung der Körperflüssigkeit oder des Gewebeauszugs mit der oder den SSc Markern kann

beispielsweise durch eine Sonde, insbesondere durch einen Antikörper erfolgen.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden mindestens 2, beispielsweise 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, vorzugsweise 15 bis 20 Marker für SSc bzw. SSc-Subgruppen oder 30 bis 50 oder 100 oder mehr Marker zusammen oder in Kombination verwendet (so genannte „Panel") , entweder gleichzeitig oder nacheinander und wobei die Marker für SSc ausgewählt unabhängig voneinander ausgewählt werden aus den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955, den Homologen der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie, den Teilsequenzen von SEQ ID No. 1 bis 955 oder den Teilsequenzen der Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 mit mindestens 95 % Homologie sowie der durch die Sequenzen kodierten Proteine. Diese Ausführungsform erfolgt vorzugsweise in Form eines erfindungsgemäßen Panels.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein erfindungsgemäßes Verfahren, wobei das Stratifizieren oder die Therapiesteuerung Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des Patienten, insbesondere Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlaufs, Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung samt Prognose umfasst. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zum

Stratifizieren, insbesondere zur Risikostratifizierung und / oder Therapiesteuerung eines Patienten mit SSc.

Ferner umfasst ist die Stratifizierung der Patienten mit SSc in neue oder etablierte SSc-Subgruppen sowie die sinnvolle Auswahl von Patientengruppen für die klinische Entwicklung von neuen Therapeutika. Der Begriff Therapiesteuerung umfasst ebenfalls die Einteilung von Patienten in Responder und Nicht- Responder bezüglich einer Therapie oder dessen

Therapieverlauf .

Die Erfindung betrifft insbesondere auch den Nachweis und die Bestimmung der Menge von mindestens zwei verschiedenen

Autoantikörpern bei einem Patienten mittels der

erfindungsgemäßen SSc Marker wobei vorzugsweise mindestens zwei verschiedene SSc Marker verwendet werden. Gegenstand der Erfindung ist auch eine erfindungsgemäße Verwendung von einer oder mehreren SSc Markern wobei mindestens 2, beispielsweise 3 bis 5 oder 10, vorzugsweise 30 bis 50 oder 50 bis 100 oder mehr SSc Marker bzw. die betreffenden Autoantikörper an oder von einem zu untersuchenden Patienten bestimmt werden.

Die Erfindung umfasst die SSc Marker auf einem festen Träger, beispielsweise einem Filter, einer Membran, einem kleinen Plättchen oder Kügelchen, beispielsweise einem magnetischen oder Fluorophor-markierten Kügelchen, einem Silizium-Wafer, einem Bead, einem Chip, einem massenspektrometrometrischen Target oder einer Matrix oder ähnlichem. Als Träger sind unterschiedliche Materialien geeignet, die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise Glas, Metall, Kunststoff, Filter, PVDF, Nitrocellulose oder Nylon (z.B. Immobilon P Millipore, Protran Whatman, Hybond N+ Amersham) . Der Träger kann beispielsweise einem Gitter entsprechen, dass die Größenordnung einer Mikrotiterplatte (8-12 Wells Streifen, 96 Wells, 384 Wells oder mehr) , eines Silizium-Wafers, eines Chips, eines massenspektrometrischen Targets oder einer Matrix besitzt .

In einer Ausführungsform der Erfindung liegen die Marker für SSc als Klonsequenzen bzw. Klon(e) vor.

Die erfindungsgemäßen Marker können mit bekannten Biomarkern für SSc oder Biomarkern für andere Erkrankungen kombiniert, ergänzt oder erweitert werden. Vorzugsweise sind bei einer solchen Kombination mindestens 50 %, vorzugsweise 60 %, besonders bevorzugt 70 % oder mehr erfindungsgemäße Marker für SSc umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Verwendung der SSc Marker außerhalb des menschlichen oder tierischen Körpers, beispielsweise erfolgt die Diagnose ex vivo / in vitro .

„Diagnose" im Sinne dieser Erfindung bedeutet die positive Feststellung von SSc mit Hilfe der erfindungsgemäßen Marker und die Zuordnung der Patienten bzw. deren Symptomen zu der Erkrankung SSc dar. Der Begriff der Diagnose umfasst die medizinische Diagnostik und diesbezügliche Untersuchungen, insbesondere die in-vitro Diagnostik und Labordiagnostik, ebenfalls Proteomics und Nukleinsäureblots . Weitere

Untersuchungen können zur Absicherung und zum Ausschluss anderer Krankheiten vonnöten sein. Daher umfasst der Begriff Diagnose insbesondere die Differentialdiagnose von SSc mittels der erfindungsgemäßen Marker.

„Stratifizieren (auch: Stratifikation) oder Therapiesteuerung" im Sinne dieser Erfindung bedeutet, dass beispielsweise die erfindungsgemäßen Verfahren Entscheidungen zur Behandlung und Therapie des Patienten erlauben, sei es Hospitalisierung des Patienten, Einsatz, Wirkung und / oder Dosierung eines oder mehrerer Arzneimittel, eine therapeutische Maßnahme oder die Überwachung eines Krankheitsverlaufes sowie Therapieverlauf bzw. Ätiologie oder Klassifizierung einer Erkrankung, z.B. in einen neuen oder bestehenden Subtyp oder die Differenzierung von Krankheiten und dessen Patienten. In einer weiteren

Ausführungsform der Erfindung umfasst der Begriff

„Stratifizierung" insbesondere die Risikostratifizierung mit der Prognose eines „outcome" eines nachteiligen

gesundheitlichen Ereignisses.

„Prognose" bedeutet die Vorhersage des Krankheitsverlaufs.

Erfindungsgemäß bedeutet „Therapiesteuerung", beispielsweise Vorhersage und Überwachung des Ansprechens auf ein

Arzneimittel oder eine Therapie sowie die Nachsorge.

Im Rahmen dieser Erfindung wird unter „Patient" bzw.

„Patientin" ein beliebiger Proband, ein beliebiges Individuum - Mensch oder Säugetier - verstanden, mit der Maßgabe, dass der Proband bzw. das Individuum auf SSc untersucht wird.

Der Begriff „Marker für SSc" im Sinne dieser Erfindung

bedeutet, dass die Nukleinsäure, beispielsweise DNA,

insbesondere cDNA oder RNA oder die kodierte Aminosäuresequenz oder das Polypeptid oder Protein signifikant (spezifisch) für SSc und / oder die mit SSc einhergehenden

Autoantikörperprofile sind. Erfindungsgemäße Marker sind

Nukleinsäuresequenzen und / oder Aminosäuresequenzen gemäß der Definition im anliegenden Sequenzprotokoll (SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No . 955), deren Homologe und Teilsequenzen und wobei auch modifizierte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen umfasst sind. Dabei bedeutet, Marker für SSc beispielsweise, dass die cDNA oder RNA oder das jeweils daraus erhältliche Polypeptid oder Protein eine Wechselwirkung mit Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug eines Patienten mit SSc aufweisen (z.B. Antigen (Epitop) / Antikörper (Paratop) Wechselwirkung) . In einer besonders bevorzugten

Ausführungsform der Erfindung ist der Marker für SSc ein

(Auto-) Antigen oder ein Teil eines Antigens oder kodiert für ein Antigen oder für einen Teil eines Antigens.

Die Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug treten entweder nur oder zumindest verstärkt bei SSc auf beziehungsweise werden exprimiert, wohingegen diese Substanzen bei Patienten ohne SSc oder Gesunden nicht oder zumindest in geringerem Maße (geringere Menge, geringerer Konzentration) vorhanden sind. Marker für SSc können sich andererseits auch dadurch auszeichnen, dass sie eine Wechselwirkung mit

Substanzen aus der Körperflüssigkeit oder Gewebeauszug von Patienten mit SSc eingehen, weil diese Substanzen nicht mehr oder zumindest in deutlich geringerer Menge/Konzentration bei SSC auftreten beziehungsweise exprimiert werden, wohingegen diese Substanzen bei Patienten ohne SSC vorhanden oder

zumindest in deutlich höherem Maße vorhanden sind. Marker für SSC können auch in gesunden Probanden vorhanden sein, jedoch verändert sich ihre Menge (Konzentration) beispielsweise bei der Entstehung, Etablierung und Therapie von SSC. Ein oder mehrere Marker können auf diese Weise ein Profil von

Substanzen aus Körperflüssigkeit und Gewebeauszug abbilden, beispielsweise ein SSc assoziiertes Autoantikörperprofil des betreffenden Patienten. Erfindungsgemäße Marker sind Biomarker für SSc.

Autoantikörperprofile umfassen die Menge an einem oder

mehreren Autoantikörpern deren Vorkommen/Expression mit der Entstehung und/oder Etablierung von SSc einhergehen.

Autoantikörperprofile umfassen somit einerseits die

Zusammensetzung, d.h. es werden beispielsweise ein oder mehrere Autoantikörper nur bei SSc exprimiert, und anderseits die Menge/Konzentration einzelner Autoantikorper, d.h. die Menge/Konzentration einzelner Autoantikorper verändert sich bei der Entstehung und Etablierung von SSc. Diese

Veränderungen können mit Hilfe der erfindungsgemäßen

Marker ( Sequenzen) nachgewiesen werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erkennt /bindet der SSc Marker an Autoantikorper, die im Verlauf der

Entstehung, Etablierung und Therapie von SSc (verstärkt) vorhanden sind oder in geringerem Maße (oder nicht mehr) vorhanden sind. Autoantikorper werden vom Körper gegen

körpereigene Antigene, die beispielsweise bei SSc entstehen, gebildet. Autoantikorper werden von Körper gegen

unterschiedliche Substanzen und Pathogene gebildet. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden insbesondere die

Autoantikorper detektiert, die beim Auftreten und im Laufe der Entstehung von SSc gebildet werden und/oder in ihrer

Expression hoch- beziehungsweise herunterreguliert werden. Diese Autoantikorper können mit Hilfe der erfindungsgemäßen Verfahren und Marker nachgewiesen werden und ihr Nachweis und ihre Überwachung (z.B. der Menge) kann zur Früherkennung, Diagnose und/oder Therapieüberwachung/Therapiesteuerung sowie zur Prognose und Vorhersage des Risikos des Wiederauftretens von SSc im Rahmen der Nachsorge verwendet werden.

Die Autoantikörperprofile können bereits bei Verwendung eines einzigen SSc Markers ausreichend charakterisiert werden. In anderen Fällen werden zwei oder mehr SSc Marker notwendig sein, um ein Autoantikörperprofil abzubilden, das für SSc spezifisch ist.

In einer Ausführungsform der Erfindung können Autoantikorper mit SSc Markern nachgewiesen werden, die sich von einem anderen Individuum ableiten und die beispielsweise aus einer kommerziellen cDNA-Bank stammen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können diese Autoantikörper mit SSc Markern nachgewiesen werden, die sich von dem gleichen Individuum ableiten und die beispielsweise aus einer eigens für den Patienten oder eine Gruppe von

Patienten beispielsweise im Rahmen der individualisierten Medizin hergestellten cDNA-Bank stammen. Beispielsweise können Homologe der genannten SSc Marker mit den Sequenzen SEQ ID. No . 1 bis 955 oder Teilsequenzen davon verwendet werden.

Autoantikörper können bereits viele Jahre vor Auftreten der ersten Krankheitssymptome vom Patienten gebildet werden. Damit sind eine Früherkennung, Diagnose und auch Prognose und vorbeugende Behandlung bzw. Umstellung der Lebensweise und andere Möglichkeiten der Prävention bereits Jahre vor dem sichtbaren Krankheitsausbruch möglich. Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen, Mittel und Verfahren ermöglichen somit ein im Vergleich zu bekannten Verfahren sehr frühes Eingreifen, was die Prävention, Behandlungsmöglichkeiten und Folgen von SSc deutlich verbessert.

Da sich die SSc-assoziierten Autoantikörperprofile während der Etablierung und Behandlung/Therapie von SSc verändern, ermöglicht die Erfindung auch den Nachweis und die Überwachung von SSc in jedem Stadium der Entstehung und Behandlung sowie die Überwachung im Rahmen der SSC Nachsorge. Die

erfindungsgemäßen Mittel, beispielsweise eine entsprechendes Diagnostikum oder ein Test-Kit erlauben auch eine einfache Handhabung zu Hause durch den Patienten und die kostengünstige routinemäßige Vorsorge zur Früherkennung.

Insbesondere durch die Verwendung von Antigenen als

spezifische Markers für SSc, die sich von bereits bekannten Sequenzen, z.B. aus kommerziellen cDNA Banken, ableiten, können Probanden getestet und gegebenenfalls vorhandene SSc assoziierte Autoantikörper in diesen Probanden nachgewiesen werden, auch wenn bei diesen Probanden die entsprechenden Autoantigene (noch) nicht bekannt sind.

Verschiedene Patienten können unterschiedliche SSc assoziierte Autoantikörperprofile aufweisen, beispielsweise unterscheiden sich verschiedene Kohorten oder Bevölkerungsgruppen. Jeder Patient kann dabei ein oder mehrere verschiedene SSc

assoziierte Autoantikörper im Laufe der Entstehung von SSc und des Fortschreitens der SSc Erkrankung, d.h. ebenfalls

verschiedene Autoantikörperprofile, bilden. Außerdem kann sich die Zusammensetzung und/oder die Menge der gebildeten

Autoantikörper im Laufe der SSc Entstehung und des

Fortschreitens der Krankheit verändern, so dass eine

quantitative Auswertung notwendig wird. Auch die

Therapie/Behandlung von SSc führt zu Veränderungen in der Zusammensetzung und/oder der Menge an SSc assoziierten

Autoantikörpern . Die große Auswahl an erfindungsgemäßen SSc Markern, die mit dieser Erfindung bereitgestellt werden, ermöglicht die individuelle Zusammenstellung von SSc Markern in einer Anordnung, einem Panel für einzelne Patienten,

Gruppen von Patienten, bestimmte Kohorten, Bevölkerungsgruppen und dergleichen. Im Einzelfall kann deshalb die Verwendung eines SSc Markers ausreichen, während in anderen Fällen mindestens zwei oder mehr SSc Marker zusammen oder in

Kombination verwendet werden müssen um ein aussagekräftiges Autoantikörperprofil zu erstellen.

Der Nachweis von SSc assoziierten Autoantikörpern

beispielsweise im Serum oder Plasma von Patienten hat

gegenüber anderen Biomarkern den Vorteil einer hohen

Stabilität und Lagerfähigkeit und einer guten Nachweisbarkeit. Auch unterliegt die Anwesenheit von Autoantikörpern keinem circardianen Rhythmus, so dass die Probennahme unabhängig von Tageszeit, Nahrungsaufnahme und dergleichen ist. Daneben können die SSc assoziierten Autoantikörper mit Hilfe der korrespondierenden Antigene/Autoantigene in bekannten Assays wie z.B. ELISA oder Western-Blot nachgewiesen werden und auf diese Weise die Ergebnisse überprüft werden.

Im Sinne der Erfindung wird eine Wechselwirkung zwischen dem SSc Marker und dem betreffenden Serum, beispielsweise einem Autoantikörper des Patienten, nachgewiesen. Eine solche

Wechselwirkung ist z.B. eine Bindung, insbesondere eine bindende Substanz an mindestens einen Marker für SSc oder für den Fall, dass der Marker für SSc eine Nukleinsäure,

beispielsweise eine cDNA ist, die Hybridisierung mit einer geeigneten Substanz unter gewählten Bedingungen, insbesondere stringenten Bedingungen (z.B. wie üblich definiert in J.

Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis (1989), Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd Edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, USA oder Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Ein Beispiel für stringente

Hybridisierungsbedingungen ist: Hybridisierung in 4 x SSC bei 65° C (alternativ in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42° C) , gefolgt von mehreren Waschschritten in 0,1 x SSC bei 65°C für insgesamt etwa eine Stunde. Ein Beispiel für wenig stringente Hybridisierungsbedingungen ist Hybridisierung in 4 x SSC bei 37° C, gefolgt von mehreren Waschritten in 1 x SSC bei

Raumtemperatur. Die Wechselwirkung zwischen der

Körperflüssigkeit oder dem Gewebeauszuges eines Patienten und den Markern für SSc ist vorzugsweise eine Protein-Protein Wechselwirkung .

Solche Substanzen, beispielsweise Antigene, Autoantigene, SSc assoziierte Autoantikörper, sind erfindungsgemäß Bestandteil einer Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Vollblut,

Blutplasma, Blutserum, Patientenserum, Urin,

Cerebrospinalflüssigkeit , Synovialflüssigkeit oder eines Gewebeauszuges des Patienten. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung dieser Körperflüssigkeiten und Gewebeauszüge für Früherkennung, Diagnose, Prognose,

Therapiesteuerung und Nachsorge.

Die SSc spezifischen Marker verfügen in einer weiteren

Ausführungsform der Erfindung über ein Erkennungssignal, welches an die zu bindende Substanz adressiert ist (z.B.

Antikörper, Nukleinsäure) . Erfindungsgemäß bevorzugt ist für ein Protein das Erkennungssignal Epitop und / oder Paratop und / oder Hapten und für eine cDNA eine Hybridisierungs- oder Bindungsregion .

Umfasst sind auch Homologe der erfindungsgemäßen Marker SEQ ID NO. 1 bis 955, wie z.B. in den Ansprüchen dargelegt. Homologe im Sinne der Erfindung sind zum einen solche mit Homologie der Amino- bzw. Nukleinsäuresequenz und solche, bei denen die entsprechende Sequenz modifiziert ist, beispielsweise die Proteinvarianten, die zwar die gleiche Aminosäuresequenz aufweisen, sich aber im Hinblick auf die Modifikation, insbesondere die posttranslationale Modifikation,

unterscheiden .

Erfindungsgemäß umfasst sind Modifikationen der

Nukleinsäuresequenz und der Aminosäuresequenz, beispielsweise Citrullinierung, Acetylierung, Phosphorylierung,

Glykosilierung, Methylierung, polyA-Strang-Verlängerung und andere dem Fachmann einschlägig bekannte Modifikationen.

Homologe umfassen auch Sequenz-Homologe der Marker und deren Teilsequenzen. Sequenz-Homologe sind beispielsweise

Nukleinsäure- und/oder Proteinsequenzen, die eine Identität mit den SSC Markern der Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 von mindestens 70 % oder 80 %, vorzugsweise 90 % oder 95 %, besonders bevorzugt 96 % oder 97 % oder mehr, beispielsweise 98 % oder 99 % aufweisen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt für den Fall, dass es sich bei den SSc Markern um Antigene handelt, die Homologie im Sequenzbereich, in dem die Antigen-Antikörper- beziehungsweise Antigen-Autoantikörper-Wechselwirkung stattfindet, mindestens 95 %, vorzugsweise mindestens 97 %, besonders bevorzugt mindestens 99 %. Erfindungsgemäß umfasst sind beispielsweise Mutationen wie Basenaustauschmutationen, Rastermutationen, Baseneinschubmutationen, Basenverlustmutationen,

Punktmutationen, Insertionsmutationen .

Gegenstand der Erfindung sind auch Teilsequenzen der SSc

Marker mit der Sequenz SEQ ID o. 1 bis 955. Teilsequenzen sind solche Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die gegenüber der vollständigen Nukleinsäure oder dem

vollständigen Protein/Peptid verkürzt sind. Die Deletion kann sich dabei an dem oder den Ende und/oder innerhalb der Sequenz befinden. Umfasst sind beispielsweise Teilsequenzen, die 50 bis 100 Nukleotide, 70-120 Nukleotide der Sequenz SEQ ID No . 1 bis 955 aufweisen. Homologe von Teilsequenzen sind ebenfalls erfindungsgemäß umfasst. In einer besonderen Ausführungsform sind die SSc Marker gegenüber den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 so weit verkürzt, dass sie nur noch aus der/den

Bindungsstellen für den betreffenden SSc assoziierten

Autoantikörper bestehen. Erfindungsgemäß umfasst sind auch SSc Marker, die sich von den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 dadurch unterscheiden, dass sie ein oder mehrere Insertionen beinhalten, wobei die Insertionen beispielsweise 1 bis 100 oder mehr Nukleotide/Aminosäuren, vorzugsweise 5 bis 50, besonders bevorzugt 10 bis 20 Nukleotide/Aminosäuren lang sind und die Sequenzen aber ansonsten identisch oder homolog zu den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 sind. Besonders bevorzugt sind Teilsequenzen, die mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 %, besonders bevorzugt mindestens 97 % oder 98 % der Länge der erfindungsgemäßen SSc Marker mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 955 aufweisen.

In einer weiteren Ausführungsform kann der jeweilige SSc

Marker in unterschiedlichen Mengen in einem oder mehreren Bereichen in der Anordnung oder auf dem Träger oder in dem Panel repräsentiert sein. Dies erlaubt eine Variation der Sensitivität . Die Bereiche können jeweils eine Gesamtheit von SSc Markern aufweisen, d.h. eine genügende Zahl an

verschiedenen SSc Markern, insbesondere 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 oder mehr verschiedene. Beispielsweise können 20 bis 50 (numerisch) oder mehr, bevorzugt mehr als 100, besonders bevorzugt 150 oder mehr, beispielsweise 25.000 oder 5.000 oder 10.000 verschiedene oder gleiche SSc Markersequenzen und gegebenenfalls weitere Nukleinsäuren und/oder Proteine, insbesondere andere Biomarker auf dem Träger oder in dem Panel repräsentiert sein.

Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet „Anordnung" synonym „Array" und synonym „Panel. Sofern dieser „Array" zur

Identifizierung von Substanzen an SSc Markern verwendet wird, ist hierunter vorzugsweise ein „Assay" oder ein Bead oder eine diagnostische Vorrichtung oder ein Screening Assay zu

verstehen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die

Anordnung derart gestaltet, dass die auf der Anordnung

repräsentierten Marker in Form eines Gitters auf einem Träger vorliegen. Ferner sind solche Anordnungen bevorzugt, die eine hochdichte (high-density) Anordnung von SSC Markern erlauben. Vorzugsweise werden die Marker gespottet. Solche hochdichte gespotteten Anordnungen sind beispielsweise in der WO 99/57311 und WO 99/57312 offenbart und können vorteilhaft in einem robotergestützten automatisierten High-Throughput Verfahren zur Anwendung kommen. Im Rahmen dieser Erfindung umfasst der Begriff „Assay" oder Diagnostikum ebenfalls solche Ausführungsformen wie ELISA, Bead-based Assay, Line Assay, Western Blot,

immunchromatographische Verfahren (z.B. so genannte Lateral Flow Immunoassays ) oder ähnliche immunologische Single- oder Multiplex-Nachweisverfahren .

Ein „Proteinarray" im Sinne dieser Erfindung ist die

systematische Anordnung von SSc Markern auf einem festen

Träger und wobei der Träger jede beliebige Form und/oder Größe haben kann und wobei der Träger vorzugsweise ein fester Träger ist .

Die SSc Marker der Anordnung sind auf dem Träger fixiert, vorzugsweise gespottet oder immobilisiert, aufgedruckt oder ähnliches, insbesondere reproduzierbar aufgebracht. Ein oder mehrere SSc Marker können mehrfach in der Gesamtheit aller SSc Marker präsent sein und in unterschiedlichen Mengen bezogen auf einen Spot vorliegen. Ferner können die SSc Marker auf dem Träger standardisiert sein (z.B. mittels serieller

Verdünnungsreihen von z.B. Humanglobulinen als interne

Kaiibratoren zur Datennormalisierung und quantitativen

Auswertung) . Gegebenenfalls kann auch ein Standard (z.B. ein Gold Standard) auf dem Träger aufgebracht sein.

In einer weiteren Ausführungsform liegen die SSc Marker als Klone vor. Solche Klone können beispielsweise mittels einer erfindungsgemäßen cDNA-Expressionsbibliothek erhalten werden. In einer bevorzugten Ausführungsform werden solche

Expressionsbibliotheken mittels Expressionsvektoren aus einer exprimierenden cDNA Bibliothek, umfassend die cDNAs der SSc spezifischen Markersequenzen, erhalten. Diese

Expressionsvektoren enthalten vorzugsweise induzierbare

Promotoren. Die Induktion der Expression kann z.B. mittels eines Induktors, solche wie IPTG, erfolgen. Geeignete Expressionsvektoren sind beschrieben in Terpe et al . (Terpe T

Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60 (5) : 523-33) .

Expressionsbibliotheken sind dem Fachmann bekannt, diese können nach Standardwerken, wie Sambrook et al, "Molecular Cloning, A laboratory handbook, 2nd edition (1989), CSH press, Cold Spring Harbor, New York hergestellt werden. Weiterhin bevorzugt sind solche Expressionsbibliotheken, die

gewebespezifisch sind (z.B. humanes Gewebe, insbesondere humane Organe. Ferner sind erfindungsgemäß ebenfalls solche Expressionsbibliotheken mit eingeschlossen, die mittels exon- trapping erhalten werden können.

Weiterhin bevorzugt sind Proteinarrays oder entsprechende Expressionsbibliotheken, die keine Redundanz aufweisen (so genannte: UnicloneO-Bibliothek) und nach den Lehren der WO 99/57311 und WO 99/57312 beispielsweise hergestellt werden können. Diese bevorzugten Uniclone- Bibliotheken weisen einen hohen Anteil an nicht-fehlerhaften vollständig exprimierten Proteinen einer cDNA-Expressionsbibliothek auf.

Im Rahmen dieser Erfindung können die Klone ebenfalls nicht abschließend solche sein wie transformierte Bakterien,

rekombinante Phagen oder transformierte Zellen von Säugern, Insekten, Pilzen, Hefen oder Pflanzen.

Zusätzlich können die SSc Marker in der jeweiligen Form als Fusionsprotein vorliegen, welches beispielsweise mindestens ein Affinitätsepitop oder "Tag" enthält, wobei das Tag

beispielsweise ausgewählt wird aus c-myc, His-Tag, Arg-tag, FLAG, alkalische Phosphatase, V5-Tag, T7-Tag oder Strep-Tag, HAT-tag, NusA, S-tag, SBP-tag, Thioredoxin, DsbA oder das Fusionsprotein beispielsweise ein oder mehrere zusätzliche Domänen aufweist, beispielsweise eine Cellulose-bindende

Domäne, grünfluoreszierendes Protein, Maltose bindendes Protein, Calmodulin-bindendes Protein, Glutathione S- transferase oder lacZ.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Assay, beispielsweise einen multiplex Assay, einen Bead basierten Assay oder Proteinarray zum Identifizieren und

Charakterisieren einer Substanz, beispielsweise eines Hits, einer LeitSubstanz , eines Wirkstoffs für SSc. Dabei wird eine zu untersuchende Substanz eingesetzt. Diese kann ein

beliebiges natives oder nicht-natives Biomolekül, ein

(synthetisches) chemisches Molekül, ein Naturstoff, eine

Mischung oder eine Substanzbibliothek sein. Nachdem die zu untersuchende Substanz einen SSC Marker kontaktiert hat, erfolgt die Auswertung des Bindungserfolges, beispielsweise unter Verwendung mit handelsüblicher Image-Analyse Software

(GenePix Pro (Axon Laboratories) , Aida (Raytest) , ScanArray

(Packard Bioscience) .

Die Visualisierung erfindungsgemäßer Bindungen,

Bindungserfolge, Wechselwirkungen wie Protein-Protein- Wechselwirkungen (z.B. Protein an SSc Marker wie

Antigen/Antikörper) oder entsprechende „Mittel zum Nachweis des Bindungserfolges" kann beispielsweise mittels

Fluoresenzmarkierung, Biotiniylierung, Radio-Isotopen- Markierung oder kolloidale Gold- oder Latex-Partikel- Markierung in üblicher Weise erfolgen. Ein Nachweis von gebundenen Antikörpern erfolgt vorzugsweise mit Hilfe von sekundären Antikörpern, die mit handelsüblichen

Reportermolekülen markiert sind (z.B. Cy-, Alexa-, Dyomics, FITC- oder ähnliche Fluoreszenzfarbstoffe, kolloidale Gold ^¬ oder Latex-Partikel) , oder mit Reporter-Enzymen wie

alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, usw. und den entsprechenden colorimetrischen, fluoreszenten oder

chemolumineszenten Substraten. Eine Auslesung erfolgt z.B. mittels eines Microarray-Laserscanners , einer CCD-Kamera oder visuell .

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Arzneimittel oder einen Wirkstoff oder eine Prodrug für SSc entwickelt und erhältlich durch den Einsatz eines

erfindungsgemäßen SSc Markers.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines SSc Markers ausgewählt aus Sequenzen SEQ ID o. 1 bis 955 und Teilsequenzen von SEQ ID No . 1 bis 955 mit mindestens 90 %, vorzugsweise mindestens 95 % der Länge von SEQ ID No. 1 bis 955 und Homologen von SEQ ID No. 1 bis 955 und deren

Teilsequenzen mit einer Identität von mindestens 95 %,

vorzugsweise mindestens 98 % oder mehr zu den entsprechenden Sequenzen und Proteinen/Peptiden kodiert durch die Sequenzen SEQ ID No. 1 bis 638, kodiert durch deren Teilsequenzen und Homologen als Affinitätsmaterial zur Durchführung einer

Apherese oder Blutwäsche für Patienten mit SSc. Die Erfindung betrifft somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Marker, vorzugsweise in Form einer Anordnung, als Affinitätsmaterial zur Durchführung einer Blutwäsche im weiteren Sinne, wobei Substanzen aus Körperflüssigkeiten eines Patienten mit SSc, wie Blut oder Plasma, an die erfindungsgemäßen Marker binden und folglich der Körperflüssigkeit selektiv entzogen werden können. Die Anwendung in der Blutwäsche ist ein Spezialfall der Verwendung der SSc Marker als Target.

Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der

Erfindung ohne die Erfindung jedoch auf die Beispiele

einzuschränken. In den nachfolgen Figuren wird die Systemische Sklerose mit PPS (Progressive Systemische Sklerose)

bezeichnet .

Figur 1: Vulcano Plot der relativen Antigenreaktivitäten der SSc Patienten im Vergleich zu Gesundkontrollen Figur 2: Vulcano Plot der Antigenreaktivitäten von SSc Patienten gegen eine vereinigte Gruppe von Patienten mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen wie SSC SPA, frühere Rheumatoide Arthritis und SPA.

Figur 3: Autoantikörperreaktivität in SSc Patientenseren im Vergleich zu Gesundkontrollen und SSC Patienten.

Figur 4: Frequenz der Autoantikörperreaktivitäten ausgewählter Antigen in SSc Patienten und Gesundproben. Es wurde ein Schwellenwert von 3 SD Abweichungen über dem Mittelwert der Gesundprobe angesetzt.

Figur 5: Vulcano Plot der Autoantikörperreaktivitäten von SSc Patienten mit diffuser Subform gegen Gesundkontrollen

Figur 6: Frequenz der Autoantikörperreaktivitäten ausgewählter Antigen in der limitierten und diffusen SSc-Subform. Es wurde ein Schwellenwert von 3 Standard Abweichungen über dem Mittelwert der Gesundprobe angesetzt.

Figur 7: Vulcano Plot der Autoantikörperreaktivitäten von SSc Patienten mit limitierter Subform gegen Gesundkontrollen.

Figur 8: Vulcano Plot der Autoantikörperreaktivitäten von Patienten mit Overlap Syndrome gegen Gesundkontrollen

Figur 9: Frequenz der Autoantikörper in anti-CENP und anti- Scl70 negativen Patienten.

Figur 10: Receiver Operating Characteristic-Kurven (ROC) für die Diagnose von SSc im Vergleich zu Gesundproben; A) ROC Kurve Panel I, B) ROC Kurve Panel II.

Figur 11: Boxplot basierend auf den anti-KDM6B und anti-BICD2 ELISA Messungen für die Diagnose von SSc im Vergleich zu

Gesundkontrollen .

Figur 12: Receiver Operating Characteristic-Kurven (ROC) für die ELISA Bestimmung anti-KDM6B und anti-BICD2 Antikörpern: a) Anti-KDM6B ELISA: SSc im Vergleich zu Gesundkontrollen b) Anti-BICD2 ELISA: SSc im Vergleich zu Gesundkontrollen Beispiele :

Beispiel 1: Auswahl der SSc Patienten- und Kontrollproben Patienten und Probanden

Auswahl der zu testenden Patientengruppen: Es wurden Blutproben von 100 SSc Patienten, 100 Patienten mit SLS, 537 Patienten mit früher Rheumatoide Arthritis („RA"; Erkrankungsdauer unter 6 Monaten) und 82 Patienten mit ankylosierende Spondylitis (SPA) bzw. Morbus Bechterew analysiert. Als Kontrollgruppe wurden 343 Blutproben vom Bayrischen Roten Kreuz (BRK) bezogen. Von allen Probanden wurde eine Einverständniserklärung (Informed Consent) der Ethikkommission der klinischen Partner und der Biobank des BRK eingeholt .

Tabelle 1: Patientenproben und klinische Daten

SLE SSc SSc SSc SSc frühe

RA (<6 SPA

Monate) Gesund ohne

Sub- Sub- Sub- Angabe

gruppe gruppe gruppe der

lSSc dSSc SSc-OV Sub- gruppe

Anzahl

der

Patien100 50 32 9 9 537 82 343 ten bzw.

Proben

Durchschnitt ^¬ 39.8 61.53 53.88 51.78 47.56 56.8 43.7 47.7 liches +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- Alter 11.9 16.97 14.75 9.18 16.97 14.3 10.1 11.7 (Jahre)

Anzahl

der

83 50 32 8 9 62.2 15.9 58.3 weibl .

Patien- ten bzw.

Proben

ANA

100 47 32 9 7 N.D . N.D . N.D . positive

Anti-

N.D . 30 4 2 2 N.D . N.D . N.D . CENP

Anti-

N.D . 9 20 1 2 N.D . N.D . N.D . Scl70

Beispiel 2: Antigen Produktion

Fünf cDNA Bibliotheken, die aus verschiedenen humanen Geweben (fötales Gehirn, Darm, Lunge, Leber und T-Zellen) erzeugt worden waren, wurden für die Produktion der rekombinanten

Antigene verwendet. Alle cDNAs wurden in E.coli unter der transkriptioneilen Kontrolle des Lactose-induzierbaren

Promotors exprimiert . Die resultierenden Proteine tragen an ihrem Aminoterminus eine zusätzliche Sequenz für einen

Hexahistidin-Aufreinigungstag (His6-Tag) . Targetantigene, die nicht in der cDNA Biobliothek vorhanden waren, wurden durch chemische Synthese (Life Technologies) erzeugt und in den

Expressionsvektor pQE30-NST, der bereits einen Aminoterminalen His6-Tag kodiert, kloniert.

Nach rekombinanter Expression der Proteine wurden diese unter denaturierenden Bedingungen isoliert und mittels

Metallaffinitätschromatographie (IMAC) aufgereinigt . Bis zur weiteren Verwendung wurden die Proteine lyophilisiert und bei -20°C gelagert.

Beispiel 3: Herstellung von Bead Based Arrays (BBAs)

Die Herstellung von BBAs wurde auf ein Mikrotiterplatten- Format adaptiert, so dass 384 Kopplungsreaktionen parallel mit Pipettierautomaten (Starlet, Hamilton Robotics, Evo Freedom 150, Tecan) angesetzt werden konnten. Für die Verwendung von Pipettierautomaten wurden die einzelnen Beadregionen in

Kopplungsplatten (96 Well Greiner) und die Antigene in 2D Barcode Gefäße (Thermo Scientific) überführt. Für jede

Kopplungsreaktion wurden 0.6 bis 2.5 Millionen Beads und abhängig von Antigen 1 bis 100 pg Protein eingesetzt.

Alle Wasch- und Pipettierschritte der Kopplungsreaktion wurden in Kopplungsplatten, die auf Magneten fixiert wurden,

durchgeführt. Die Beads wurden zweimal mit 100 μΐ LxAP-Puffer (100 mM NaH ₂ PC>4, pH 6.2) gewaschen und anschließend in 120 μΐ LxAP-Puffer aufgenommen. Für die Aktivierung wurden 15 μΐ 1- Ethyl-3- ( 3-dimethylaminopropyl ) carbodiimid (EDC; 50mg/ml) und 15 μΐ N-Hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS; 50mg/ml) zur Bead- Suspension pipettiert und diese wurde anschließend 20 Minuten auf dem Schüttler (RT, 900 rpm, lichtgeschützt) inkubiert. Die Beads wurden 3x mit 150 μΐ LxKPT-Puffer gewaschen und

anschließend die Proteinlösung zugegeben. Nach zweistündiger Inkubation auf dem Schüttler (RT, 900 rpm, lichtgeschützt) wurden die Beads dreimal mit 150 μΐ LxWPT-Puffer gewaschen. Zur Blockierung von freien Bindungsstellen wurden 100 μΐ

LxCBSP-Puffer (PBS, 1% BSA, 0.05% ProClin300) zugegeben und 20 min auf dem Schüttler inkubiert (RT, 900 rpm, lichtgeschützt) . Anschließend folgte eine Inkubation bei 4-8°C über Nacht. Das BBA wurde durch die Vereinigung von mit Antigen gekoppelten Beads hergestellt und bis zur Anwendung bei 4-8°C

lichtgeschützt gelagert.

Beispiel 4: Anwendung von BBAs

Für die Anwendung wurden BBAs mit Seren inkubiert und alle an Antigene gebunden IgG-basierte Autoantikörper wurden mit Hilfe eines sekundären Antikörper detektiert. Um einen hohen

Durchsatz an Messungen zu ermöglichen, wurde die Anwendung von BBAs auf ein Mikrotiterplatten-Format adaptiert, so dass entweder ein 8-Kanal (Starlet, Hamilton Robotics) oder ein 96- Kanal (Evo Freedom 150, Tecan) Pipettierautomat verwendet werden konnte. Die zu untersuchenden Seren wurden in 2D

Barcode Gefäße überführt und anschließend 1:100 mit

Assaypuffer (PBS, 0.5% BSA, 10% E.coli Lysate, 50% Low-Cross Buffer (Candor Technologies)) verdünnt. Um humane Antikörper, die gegen E.coli Proteine gerichtet sind, zu neutralisieren, erfolgte eine Präinkubation der Serenverdünnungen für 20 min. In dieser Zeit wurden 500 Beads pro Beadregion in die

Assayplatte verteilt. In die Kopplungsplatte wurden 50 μΐ verdünntes Serum zu den Beads gegeben und die Reaktionsansätze 18-22 h auf dem Schüttler inkubiert (4-8 °C, 900 rpm,

lichtgeschützt) . Nach drei Waschschritte mit jeweils 100 μΐ LxWPT-Puffer wurden 5 pg/ml des Detektionsantikörpers Ziege- anti-human IgG-PE (Dianova) zu den Reaktionsansätzen gegeben und für 1 h auf dem Schüttler inkubiert (RT, 900 rpm) .

Anschließenden wurden die Beads dreimal mit 100 μΐ LxWPT gewaschen und in 100 μΐ Trägerflüssigkeit (Luminex)

aufgenommen. Das Fluoreszenzsignal der Beads wurde mit Hilfe des FlexMAP3D Instruments detektiert. Dabei wurden zum einen der Beadcount und zum anderen der MFI-Wert (Median der

Fluoreszenz intensitität)

Beispiel 5: Biostatistische Analyse

Die biostatistische Analyse umfasste univariate und

multivariate Methoden um die statistischen Eigenschaften einzelner Antigene sowie von Gruppen von Antigenen zu

beschreiben. Für das Auffinden von interessanten Kandidaten für Panels war die entscheidende Eigenschaft eine gute

Trennung zwischen den Gruppen von Proben auf Basis der MFI- Werte. Um Antigen-Kandidaten für eine Panel-Generierung zu finden, wurden als Methoden univariates Testen, Receiver

Operating Characteristic (ROC) Analysen, Korrelationsprofile, Powered Partial Least Squares Diskriminanzanalyse (PPLS-DA) und Zufallswälder angewendet. Biostatistische Analysen wurden einer Expertenbewertung unterzogen um finale Antigen-Panels z definieren .

Vor der statistischen Analyse wurden die MFI-Werte log2- transformiert Antigene, bei denen mehr als 20% der Werte fehlten, wurden von der Analyse ausgeschlossen und fehlende Werte durch Median-Imputation ersetzt. Eine Quantil- Normalisierung unter Berücksichtigung der Referenzseren wurde durchgeführt, um pro BBA-Set alle gemessenen Proben auf individuellen Platten zu normalisieren.

Neben deskriptiven Standardstatistiken für MFI-Werte wurden mit Hilfe des zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests

nichtparametrische Tests durchgeführt um Unterschiede in den Medianwerten der Gruppen zu entdecken. Korrektur des

Testniveaus für multiples Testen erfolgte nach der Bonferroni Holm Prozedur. Außerdem wurde die Benjamini-Hochberg Prozedur inklusive der Bestimmung der False Discovery Rate (FDR, q- Wert) angewendet. Zusätzlich wurden Fold-Change und

Effektgröße bestimmt. Um die Klassifikationsgüte zu bewerten wurde eine ROC-Analyse durchgeführt, in deren Rahmen

Sensitivität , Spezifität und die Fläche unter der ROC-Kurve (AUC) berechnet wurden, jeweils inklusive der 95%

Konfidenzintervalle auf Basis des Bootstrap-Verfahrens . Zur grafischen Darstellung wurden Boxplots und Volcanoplots genutzt. Auf Basis der univariaten Ergebnisse wurde ein

Scoring-System implementiert.

Durch die Anwendung einer PPLS-DA wurde die Korrelation zwischen den Komponenten und der Response-Matrix maximiert. Für die finale Klassifizierung wurde eine lineare

Diskriminanzanalyse mit den latenten Komponenten als

Prädiktoren genutzt. Ein Zufallswald wurde angewendet, in dem binäre Entscheidungsbäume kombiniert werden. Die Entscheidungsbäume wurden gebildet auf Basis mehrerer Bootstrap-Stichproben einer Lernstichprobe und durch

zufälliges Auswählen einer Subgruppe von erklärenden Variablen an jedem Knoten. Die Anzahl der Eingangsvariablen, die an jedem Teilungsschritt zufällig gewählt wurde, wurde als die Quadratwurzel der Gesamtzahl der Variablen festgelegt, und die Anzahl der Bäume im Zufallswald wurde auf 1000 gesetzt. Für beide multivariaten Ansätze wurde eine Kreuzvalidierung mit 500-fachem Durchlauf implementiert.

Bespiel 6: Autoantikörper/ Antigenreaktivitäten differenzieren SSc von Gesundkontrollen, SLE, Rheumatoider Arthritis und anderen Autoimmunerkrankungen (AID)

In einem Screening wurden die Antigenreaktivitäten von 100 SSc Patienten, 537 Patienten mit Early RA, 82 Patienten mit SPA und 343 nach Alter und Geschlecht zugeordnete Gesundkontrollen wurden differentiell getestet. Dazu wurden die

Autoantikörperreaktivitäten dieser Blutproben an 5857 an Luminex-Beads gekoppelten Antigenen getestet.

Um Antigene zu identifizieren, mit denen die Gruppe aller SSc Patienten von verschiedenen Kontrollgruppen bestehend aus Gesundproben und Patienten mit verschiedenen rheumatischen Erkrankungen unterschieden werden kann, wurden univariate statistische Tests durchgeführt. Das Ergebnis der statistischen Tests ist als Vulcano Plot für alle 5857 Antigene dargestellt. Im Vulcano Plot wird auf der x-Achse die relative Änderung der Antigenreaktivtät in SSc Patienten im Vergleich zu Gesundkontrollen (Figur 1) und AID Patienten (Figur 2) dargestellt. Die Y-Achse gibt den p-Wert des statistischen Tests wieder. Figuren 1 und 2 zeigen, dass spezifische Autoantikörperreaktivitäten gefunden wurden, die in der Gruppe aller SSc erhöht sind und diese sowohl von gesunden Spendern als auch von Patienten mit rheumatischen Erkrankungen unterschieden unterscheiden können. Tabelle 2 umfasst alle in SSc Patienten identifizierte Autoantigene (Tabelle 2) .

Tabelle 2: Zusammenfassung der in SSc identifizierten (Auto- ) Antigene (auch „Marker" oder „Biomarker" genannt)

Angegeben ist die fortlaufende Sequenz ID, die Gene ID, Gene Symbol und der Gene Name. Die Gruppe bezeichnet die Verwendung des Biomarkers zur Identifizierung aller SSc Patienten oder bestimmter SSc-Subgruppen basierend auf einem statistischen Schwellenwert von p<0.05 und relativ höheren Reaktivität

(Fold-Change) gegenüber der Kontrollgruppe von größer 1.5.

Gruppe 1: Marker zur Identifizierung aller SSc Patienten unabhängig von der klinischen Subform;

Gruppe 2: Marker zur Identifizierung von diffuser SSc (dSSc) ;

Gruppe 3: Marker zur Identifizierung der limitierten SSc

(lSSc) ;

Gruppe 4: Marker zur Identifizierung von SSc Overlap-Syndrom (Überlappungssydromen; SSc-OS) und

Gruppe 5: zusätzliche Marker, die keiner bestimmten Gruppe zugeordnet werden.

SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

Hauptantigene / Hauptmarker

1 23135 KDM6B lysine (K) -specific 1 SSc; dSSc;

demethylase 6B lSSc; SSc- OS

2 23299 BICD2 bicaudal D homolog 2 3 lSSc

(Drosophila)

3 55695 NSUN5 NOLl/NOP2/Sun domain 1 SSc; lSSc family, member 5

4 51750 RTEL1 regulator of telomere 1 SSc; lSSc elongation helicase 1

5 11143 MYST2 MYST histone 1 SSc; dSSc acetyltransferase 2

6 29968 PSAT1 phosphoserine 2 dSSc

aminotransferase 1 SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

7 51368 TEX264 testis expressed 264 2 dSSc

Bevorzugte Antigene / bevorzugte Marker

8 6737 TRIM21 tripartite motif 1 SSc; dSSc;

containing 21 SSc-OS;

ISSc

9 11194 ABCB8 ATP-binding cassette, 1 SSc; ISSc sub-family B (MDR/TAP),

member 8

10 57099 AVEN apoptosis, caspase 1 SSc; ISSc activation inhibitor

11 7423 VEGFB vascular endothelial 1 SSc; dSSc;

gro th factor B ISSc; SSc- OS

12 55049 C19orf6 chromosome 19 open 1 SSc

0 reading frame 60

13 1058 CENPA centromere protein A 1 SSc; ISSc;

14 1060 CENPC1 centromere protein C 1 1 SSc; ISSc;

dSSc

15 80152 CENPT centromere protein T 1 SSc; ISSc

16 1131 CHRM3 cholinergic receptor, 1 SSc; ISSc;

muscarinic 3 SSc-OS

17 64689 GORASP 1 golgi reassembly 1 SSc; SSc-OS stacking protein 1,

65kDa

18 2997 GYSI glycogen synthase 1 1 SSc; ISSc

(muscle )

19 10014 HDAC5 histone deacetylase 5 1 SSc

20 80895 ILKAP integrin-linked kinase- 1 SSc; ISSc associated

serine/threonine

Phosphatase 2C

21 27257 LSM1 LSM1 homolog, U6 small 1 SSc

nuclear RNA associated

(S. cerevisiae)

22 153562 MARVELD MARVEL domain 1 SSc; ISSc

2 containing 2

23 4784 NFIX nuclear factor I/X 1 SSc; ISSc

(CCAAT-binding

transcription factor)

24 23762 OSBP2 oxysterol binding 1 SSc; ISSc protein 2

25 415116 PIM3 pim-3 oncogene 1 SSc

26 5364 PLXNB1 plexin Bl 1 SSc;

27 11243 PMF1 polyamine-modulated 1 SSc; dSSc;

factor 1 ISSc

28 10450 PPIE peptidylprolyl 1 SSc; dSSc;

isomerase E SSc-OS (cyclophilin E)

29 63976 PRDM16 PR domain containing 16 1 SSc SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

30 26140 TTLL3 tubulin tyrosine 1 SSc; dSSc;

ligase-like family,

member 3

31 84196 USP48 ubiquitin specific 1 SSc

peptidase 48

32 563 AZGP1 alpha-2-glycoprotein 1, 1 SSc; dSSc;

zinc-binding lSSc; SSc- OS

33 7791 ZYX zyxin 1 SSc; dSSc;

34 55324 ABCF3 ATP-binding cassette, 2 dSSc

sub-family F (GCN20),

member 3

35 39 ACAT2 acetyl-Coenzyme A 2 dSSc

acetyltransferase 2

36 79921 TCEAL4 transcription 2 dSSc

elongation factor A

(Sll)-like 4

37 81 ACT 4 actinin, alpha 4 2 dSSc

38 79913 ACTR5 ARP5 actin-related 2 dSSc

protein 5 homolog

(yeast )

39 216 ALDH1A1 aldehyde dehydrogenase 2 dSSc

1 family, member AI

40 80216 ALPK1 alpha-kinase 1 2 dSSc

41 321 APBA2 amyloid beta (A4) 2 dSSc

precursor protein- binding, family A,

member 2

42 27237 ARHGEF1 Rho guanine exchange 2 dSSc

6 factor (GEF) 16

43 8623 ASMTL acetylserotonin Ci2 dSSc

methyltransferase-like

44 23400 ATP13A2 ATPase type 13A2 2 dSSc

45 56946 Cllorf3 chromosome 11 open 2 dSSc

0 reading frame 30

46 56912 Cllorf6 chromosome 11 open 2 dSSc

0 reading frame 60

47 56985 C17orf4 chromosome 17 open 2 dSSc

8 reading frame 48

48 90580 C19orf5 chromosome 19 open 2 dSSc

2 reading frame 52

49 51507 C20orf4 chromosome 20 open 2 dSSc

3 reading frame 43

50 55755 CDK5RAP CDK5 regulatory subunit 2 dSSc

2 associated protein 2

51 51727 CMPK1 cytidine monophosphate 2 dSSc

(UMP-CMP) kinase 1,

cytosolic

52 10391 COR02B coronin, actin binding 2 dSSc

protein, 2B SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

53 9377 COX5A cytochrome c oxidase 2 dSSc

subunit Va

54 1488 CTBP2 C-terminal binding 2 dSSc

protein 2

55 8529 CYP4F2 cytochrome P450, family 2 dSSc

4, subfamily F,

Polypeptide 2

56 9909 DENND4B DENN/MADD domain 2 dSSc

containing 4B

57 10901 DHRS4 dehydrogenase/reductase 2 dSSc

(SDR family) member 4

58 84062 DTNBP1 dystrobrevin binding 2 dSSc

protein 1

59 1936 EEF1D eukaryotic translation 2 dSSc

elongation factor 1

delta (guanine

nucleotide exchange

protein)

60 8891 EIF2B3 eukaryotic translation 2 dSSc

initiation factor 2B,

subunit 3 gamma, 58kDa

61 64787 EPS8L2 EPS8-like 2 2 dSSc

62 9638 FEZ1 fasciculation and 2 dSSc

elongation protein zeta

1 (zygin I)

63 2300 FOXL1 forkhead box LI 2 dSSc

64 2519 FUCA2 fucosidase, alpha-L- 2, 2 dSSc

plasma

65 79690 GAL3ST4 galactose-3-Ο- 2 dSSc

sulfotransferase 4

66 54960 GEMIN8 gern (nuclear organeile) 2 dSSc

associated protein 8

67 51031 GLOD4 glyoxalase domain 2 dSSc

containing 4

68 2934 GSN gelsolin (amyloidosis , 2 dSSc

Finnish type)

69 3157 HMGCS1 3-hydroxy-3- 2 dSSc

methylglutaryl-Coenzyme

A synthase 1 (soluble)

70 3320 HSP90AA heat shock protein 2 dSSc

1 90kDa alpha

(cytosolic) , class A

member 1

71 3633 INPP5B inositol polyphosphate- 2 dSSc

5-phosphatase, 75kDa

72 3654 IRAK1 interleukin-1 receptor- 2 dSSc

associated kinase 1

73 23479 ISCU iron-sulfur Cluster 2 dSSc

scaffold homolog (E.

coli ) SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

74 51520 LARS leucyl-tRNA synthetase 2 dSSc

75 4057 LTF lactotransferrin 2 dSSc

76 10724 MGEA5 meningioma expressed 2 dSSc

antigen 5

(hyaluronidase)

77 84954 MPND MPN domain containing 2 dSSc

78 4437 MSH3 mutS homolog 3 (E. 2 dSSc

coli )

79 23385 NCSTN nicastrin 2 dSSc

80 4758 NEU1 sialidase 1 (lysosomal 2 dSSc

sialidase )

81 5034 P4HB prolyl 4-hydroxylase, 2 dSSc

beta Polypeptide

82 5187 PER1 period homolog 1 2 dSSc

(Drosophila)

83 5195 PEX14 peroxisomal biogenesis 2 dSSc

factor 14

84 10404 PGCP plasma glutamate 2 dSSc

carboxypeptidase

85 5493 PPL periplakin 2 dSSc

86 5575 PRKAR1B protein kinase, cAMP- 2 dSSc

dependent, regulatory,

type I, beta

87 84867 PTPN5 protein tyrosine 2 dSSc

Phosphatase, non- receptor type 5

( striatum-enriched)

88 9230 RABIIB RABIIB, member RAS 2 dSSc

oncogene family

89 84440 RAB11FI RAB11 family 2 dSSc

P4 interacting protein 4

(class II)

90 10900 RUNDC3A RUN domain containing 2 dSSc

3A

91 50861 STM 3 stathmin-like 3 2 dSSc

92 81551 STM 4 stathmin-like 4 2 dSSc

93 6814 STXBP3 syntaxin binding 2 dSSc

protein 3

94 93426 SYCE1 synaptonemal complex 2 dSSc

central element protein

1

95 6904 TBCD tubulin folding 2 dSSc

cofactor D

96 7110 TMF1 TATA element modulatory 2 dSSc

factor 1

97 10102 TSFM Ts translation 2 dSSc

elongation factor,

mitochondrial

98 7296 TXNRD1 thioredoxin reductase 1 2 dSSc SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

99 55585 UBE2Q1 ubiquitin-con jugating 2 dSSc

enzyme E2Q family

member 1

100 92912 UBE2Q2 ubiquitin-con jugating 2 dSSc

enzyme E2Q family

member 2

101 65264 UBE2Z ubiquitin-con jugating 2 dSSc

enzyme E2Z

102 54915 YTHDF1 YTH domain family, 2 dSSc

member 1

103 7764 ZNF217 zinc finger protein 217 2 dSSc

104 10290 SPEG SPEG complex locus 3 lSSc

105 84936 ZFYVE19 zinc finger, FYVE 3 lSSc

domain containing 19

106 26574 AATF apoptosis antagonizing 3 lSSc

transcription factor

107 10152 ABI2 abl-interactor 2 3 lSSc

108 84320 ACBD6 acyl-Coenzyme A binding 3 lSSc

domain containing 6

109 9049 AIP aryl hydrocarbon 3 lSSc

receptor interacting

protein

110 286 ANK1 ankyrin 1, erythrocytic 3 lSSc

111 396 ARHGDIA Rho GDP dissociation 3 lSSc

inhibitor (GDI) alpha

112 51582 AZIN1 antizyme inhibitor 1 3 lSSc

113 128061 Clorfl3 chromosome 1 open 3 lSSc

1 reading frame 131

114 79095 C9orfl6 chromosome 9 open 3 lSSc

reading frame 16

115 11335 CBX3 chromobox homolog 3 3 lSSc

(HP1 gamma homolog,

Drosophila)

116 92922 CCDC102 coiled-coil domain 3 lSSc

A containing 102A

117 23582 CCNDBP1 cyclin D-type binding- 3 lSSc

protein 1

118 64946 CENPH centromere protein H 3 lSSc

119 79585 CORO7 coronin 7 3 lSSc

120 1653 DDX1 DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) 3 lSSc

box Polypeptide 1

121 23220 DTX4 deltex homolog 4 3 lSSc

(Drosophila)

122 51143 DYNC1LI dynein, cytoplasmic 1, 3 lSSc

1 light intermediate

chain 1

123 1977 EIF4E eukaryotic translation 3 lSSc

initiation factor 4E

124 256364 EML3 echinoderm microtubule 3 lSSc SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe associated protein like

3

125 55740 ENAH enabled homolog 3 lSSc

(Drosophila)

126 8320 EOMES eomesodermin homolog 3 lSSc

(Xenopus laevis)

127 9130 FAM50A family ith sequence 3 lSSc

similarity 50, member A

128 89848 FCHSD1 FCH and double SH3 3 lSSc

domains 1

129 2549 GABI GRB2-associated binding 3 lSSc

protein 1

130 2653 GCSH glycine cleavage System 3 lSSc

protein H (aminomethyl

carrier )

131 10755 GIPC1 GIPC PDZ domain 3 lSSc

containing family,

member 1

132 28964 GIT1 G protein-coupled 3 lSSc

receptor kinase

interacting ArfGAP 1

133 65056 GPBP1 GC-rich promoter 3 lSSc

binding protein 1

134 2962 GTF2F1 general transcription 3 lSSc

factor IIF, Polypeptide

1, 74kDa

135 3024 HIST1H1 histone Cluster 1, Hla 3 lSSc

A

136 3551 IKBKB inhibitor of kappa 3 lSSc

light Polypeptide gene

enhancer in B-cells,

kinase beta

137 57461 ISY1 ISY1 splicing factor 3 lSSc

homolog (S. cerevisiae)

138 3791 KDR kinase insert domain 3 lSSc

receptor (a type III

receptor tyrosine

kinase)

139 22920 KIFAP3 kinesin-associated 3 lSSc

protein 3

140 4137 MAPT microtubule-associated 3 lSSc

protein tau

141 9412 MED21 mediator complex 3 lSSc

subunit 21

142 55034 MOCOS molybdenum cofactor 3 lSSc

sul furase

143 64981 MRPL34 mitochondrial ribosomal 3 lSSc

protein L34

144 55968 NSFL1C NSFL1 (p97) cofactor 3 lSSc

(p47) SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

145 10130 PDIA6 protein disulfide 3 lSSc

isomerase family A,

member 6

146 55857 PLK1S1 polo-like kinase 1 3 lSSc

Substrate 1

147 23654 PLXNB2 plexin B2 3 lSSc

148 6004 RGS16 regulator of G-protein 3 lSSc

signaling 16

149 6047 RNF4 ring finger protein 4 3 lSSc

150 6125 RPL5 ribosomal protein L5 3 lSSc

151 6285 S100B S100 calcium binding 3 lSSc

protein B

152 6418 SET SET nuclear oncogene 3 lSSc

153 6421 SFPQ splicing factor 3 lSSc

proline/glutamine-rich

(polypyrimidine tract

binding protein

associated)

154 6456 SH3GL2 SH3-domain GRB2-like 2 3 lSSc

155 1059 CENPB centromere protein B, 3 lSSc

80kDa

172 255626 HIST1H2 histone Cluster 1, H2ba 5 lSSc; SSc- BA OS

156 84501 SPIRE2 spire homolog 2 3 lSSc

(Drosophila)

157 6709 SPTAN1 spectrin, alpha, non- 3 lSSc

erythrocytic 1 (alpha- fodrin)

158 6741 SSB Sjögren Syndrome 3 lSSc

antigen B (autoantigen

La)

159 25949 SYF2 SYF2 homolog, RNA 3 lSSc

splicing factor (S.

cerevisiae)

160 6880 TAF9 TAF 9 RNA Polymerase II, 3 lSSc

TATA box binding

protein ( TBP ) - associated factor,

32kDa

161 11022 TDRKH tudor and KH domain 3 lSSc

containing

162 7265 TTC1 tetratricopeptide 3 lSSc

repeat domain 1

163 23331 TTC28 tetratricopeptide 3 lSSc

repeat domain 28

164 11344 TWF2 t infilin, actin- 3 lSSc

binding protein,

homolog 2 (Drosophila)

165 55833 UBAP2 ubiquitin associated 3 lSSc SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe protein 2

166 9094 UNC119 unc-119 homolog (C. 3 lSSc

elegans )

167 58525 WIZ idely interspaced zinc 3 lSSc

finger motifs

168 7494 XBP1 X-box binding protein 1 3 lSSc

169 56252 YLPM1 YLP motif containing 1 3 lSSc

170 51538 ZCCHC17 zinc finger, CCHC 3 lSSc

domain containing 17

171 84240 ZCCHC9 zinc finger, CCHC 3 lSSc

domain containing 9

173 11332 ACOT7 acyl-CoA thioesterase 7 4 SSc-OS

174 10120 ACTR1B ARP1 actin-related 4 SSc-OS

protein 1 homolog B,

centractin beta (yeast)

175 118 ADD1 adducin 1 (alpha) 4 SSc-OS

176 9131 AIFM1 apoptosis-inducing 4 SSc-OS

factor, mitochondrion- associated, 1

177 203 AK1 adenylate kinase 1 4 SSc-OS

178 8165 AKAP1 A kinase (PRKA) anchor 4 SSc-OS

protein 1

179 207 AKT1 v-akt murine thymoma 4 SSc-OS

viral oncogene homolog

1

180 29945 A APC4 anaphase promoting 4 SSc-OS

complex subunit 4

181 54522 ANKRD16 ankyrin repeat domain 4 SSc-OS

16

182 203286 ANKS6 ankyrin repeat and 4 SSc-OS

sterile alpha motif

domain containing 6

183 324 APC adenomatous Polyposis 4 SSc-OS

coli

184 397 ARHGDIB Rho GDP dissociation 4 SSc-OS

inhibitor (GDI) beta

185 140459 ASB6 ankyrin repeat and SOCS 4 SSc-OS

box-containing 6

186 513 ATP5D ATP synthase, H+ 4 SSc-OS

transporting,

mitochondrial Fl

complex, delta subunit

187 10476 ATP5H ATP synthase, H+ 4 SSc-OS

transporting,

mitochondrial F0

complex, subunit d

188 60370 AVPI1 arginine vasopressin- 4 SSc-OS

induced 1

189 146712 B3GNTL1 UDP-GlcNAc : betaGal 4 SSc-OS SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe beta-1, 3-N- acetylglucosaminyltrans

ferase-like 1

190 593 BCKDHA branched chain keto 4 SSc-OS

acid dehydrogenase El,

alpha Polypeptide

191 27154 BRPF3 bromodomain and PHD 4 SSc-OS

finger containing, 3

192 64776 Cllorf1 chromosome 11 open 4 SSc-OS

reading frame 1

193 144097 Cllorf8 chromosome 11 open 4 SSc-OS

4 reading frame 84

194 55195 C14orf1 chromosome 14 open 4 SSc-OS

05 reading frame 105

195 55257 C20orf2 chromosome 20 open 4 SSc-OS

0 reading frame 20

196 51300 C3orfl chromosome 3 open 4 SSc-OS

reading frame 1

197 763 CA5A carbonic anhydrase VA, 4 SSc-OS

mitochondrial

198 794 CALB2 calbindin 2 4 SSc-OS

199 822 CAPG capping protein (actin 4 SSc-OS

filament) , gelsolin- like

200 23624 CBLC Cas-Br-M (murine) 4 SSc-OS

ecotropic retroviral

transforming sequence c

201 54862 CC2D1A coiled-coil and C2 4 SSc-OS

domain containing 1A

202 339230 CCDC137 coiled-coil domain 4 SSc-OS

containing 137

203 55036 CCDC40 coiled-coil domain 4 SSc-OS

containing 40

204 124808 CCDC43 coiled-coil domain 4 SSc-OS

containing 43

205 728642 CDC2L2 cell division cycle 2- 4 SSc-OS

like 2 (PITSLRE

proteins )

206 79959 CEP76 centrosomal protein 4 SSc-OS

76kDa

207 55748 CNDP2 CNDP dipeptidase 2 4 SSc-OS

(metallopeptidase M20

family)

208 116840 CNTROB centrobin, centrosomal 4 SSc-OS

BRCA2 interacting

protein

209 8161 COIL coilin 4 SSc-OS

210 1410 CRYAB crystallin, alpha B 4 SSc-OS

211 1674 DES desmin 4 SSc-OS SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

212 54505 DHX29 DEAH (Asp-Glu-Ala-His) 4 SSc-OS

box Polypeptide 29

213 22982 DIP2C DIP2 disco-interacting 4 SSc-OS

protein 2 homolog C

(Drosophila)

214 1810 DR1 do n-regulator of 4 SSc-OS

transcription 1, TBP- binding (negative

cofactor 2)

215 23741 EID1 EP300 interacting 4 SSc-OS

inhibitor of

differentiation 1

216 10613 ERLINI ER lipid raft 4 SSc-OS

associated 1

217 90736 FAM104B family ith sequence 4 SSc-OS

similarity 104, member

B

218 58516 FAM60A family with sequence 4 SSc-OS

similarity 60, member A

219 2194 FASN fatty acid synthase 4 SSc-OS

220 2209 FCGR1A Fe fragment of IgG, 4 SSc-OS

high affinity Ia,

reeeptor (CD64)

221 23307 FKBP15 FK506 binding protein 4 SSc-OS

15, 133kDa

222 23770 FKBP8 FK506 binding protein 4 SSc-OS

8, 38kDa

223 8939 FUBP3 far upstream element 4 SSc-OS

(FUSE) binding protein

3

224 26515 FXC1 fracture callus 1 4 SSc-OS

homolog (rat)

225 2954 GSTZ1 glutathione transferase 4 SSc-OS

zeta 1

226 94239 H2AFV H2A histone family, 4 SSc-OS

member V

227 3178 HNRNPA1 heterogeneous nuclear 4 SSc-OS

ribonucleoprotein AI

228 92906 HNRPLL heterogeneous nuclear 4 SSc-OS

ribonucleoprotein L- like

229 440498 HSBP1L1 heat shock factor 4 SSc-OS

binding protein 1-like

1

230 3312 HSPA8 heat shock 70kDa 4 SSc-OS

protein 8

231 134728 IRAKIBP interleukin-1 reeeptor- 4 SSc-OS

1 associated kinase 1

binding protein 1

232 3735 KARS lysyl-tRNA synthetase 4 SSc-OS SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

233 8645 KCNK5 potassium Channel, 4 SSc-OS

subfamily K, member 5

234 91012 LASS5 LAG1 homolog, ceramide 4 SSc-OS

synthase 5

235 3991 LIPE lipase, hormone ^¬ 4 SSc-OS

sensitive

236 1001291 LOC1001 hypothetical 4 SSc-OS

19 29119 LOC100129119

237 643733 LOC6437 hypothetical LOC643733 4 SSc-OS

33

238 26065 LSM14A LSM14A, SCD6 homolog A 4 SSc-OS

(S. cerevisiae)

239 149986 LSM14B LSM14B, SCD6 homolog B 4 SSc-OS

(S. cerevisiae)

240 51599 LSR lipolysis stimulated 4 SSc-OS

lipoprotein receptor

241 51631 LUC7L2 LUC7-like 2 (S. 4 SSc-OS

cerevisiae)

242 4128 MAOA monoamine oxidase A 4 SSc-OS

243 23542 MAPK8IP mitogen-activated 4 SSc-OS

2 protein kinase 8

interacting protein 2

244 53615 MBD3 methyl-CpG binding 4 SSc-OS

domain protein 3

245 124995 MRPL10 mitochondrial ribosomal 4 SSc-OS

protein L10

246 65003 MRPL11 mitochondrial ribosomal 4 SSc-OS

protein LH

247 4478 MSN moesin 4 SSc-OS

248 83463 MXD3 MAX dimerization 4 SSc-OS

protein 3

249 4601 MXII MAX interactor 1 4 SSc-OS

250 4780 NFE2L2 nuclear factor 4 SSc-OS

(erythroid-derived 2)- like 2

251 57224 NHSL1 NHS-like 1 4 SSc-OS

252 4826 NNAT neuronatin 4 SSc-OS

253 29959 NRBP1 nuclear receptor 4 SSc-OS

binding protein 1

254 129401 NUP35 nucleoporin 35kDa 4 SSc-OS

255 23594 ORC6L origin recognition 4 SSc-OS

complex, subunit 6 like

(yeast )

256 55229 PANK4 pantothenate kinase 4 4 SSc-OS

257 57326 PBXIP1 pre-B-cell leukemia 4 SSc-OS

homeobox interacting

protein 1

258 57060 PCBP4 poly(rC) binding 4 SSc-OS

protein 4 SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

259 94274 PPP1R14 protein Phosphatase 1, 4 SSc-OS

A regulatory (inhibitor)

subunit 14A

260 56978 PRDM8 PR domain containing 8 4 SSc-OS

261 5764 PTN pleiotrophin 4 SSc-OS

262 6175 RPLPO ribosomal protein, 4 SSc-OS

large, PO

263 6188 RPS3 ribosomal protein S3 4 SSc-OS

264 950 SCARB2 scavenger receptor 4 SSc-OS

class B, member 2

265 10806 SDCCAG8 serologically defined 4 SSc-OS

colon cancer antigen 8

266 56948 SDR39U1 short chain 4 SSc-OS

dehydrogenase/reductase

family 39U, member 1

267 10993 SDS serine dehydratase 4 SSc-OS

268 22872 SEC31A SEC31 homolog A (S. 4 SSc-OS

cerevisiae)

269 866 SERPINA serpin peptidase 4 SSc-OS

6 inhibitor, clade A

(alpha-1

antiproteinase,

antitrypsin) , member 6

270 30011 SH3KBP1 SH3-domain kinase 4 SSc-OS

binding protein 1

271 4086 SMAD1 SMAD family member 1 4 SSc-OS

272 79856 SNX22 sorting nexin 22 4 SSc-OS

273 9580 SOX13 SRY (sex determining 4 SSc-OS

region Y) -box 13

274 6730 SRP68 signal recognition 4 SSc-OS

particle 68kDa

275 140597 TCEAL2 transcription 4 SSc-OS

elongation factor A

(Sll)-like 2

276 6924 TCEB3 transcription 4 SSc-OS

elongation factor B

(SIII), Polypeptide 3

(HOkDa, elongin A)

277 10915 TCERG1 transcription 4 SSc-OS

elongation regulator 1

278 6949 TCOF1 Treacher Collins- 4 SSc-OS

Franceschetti Syndrome

1

279 26517 TIMM13 translocase of inner 4 SSc-OS

mitochondrial membrane

13 homolog (yeast)

280 22906 TRAK1 trafficking protein, 4 SSc-OS

kinesin binding 1

281 10107 TRIM10 tripartite motif- 4 SSc-OS SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe containing 10

282 81844 TRIM56 tripartite motif- 4 SSc-OS

containing 56

283 92181 UBTD2 ubiquitin domain 4 SSc-OS

containing 2

284 54576 UGT1A8 UDP 4 SSc-OS

glucuronosyltransferase

1 family, Polypeptide

A8

285 23074 UHRF1BP UHRFl binding protein 4 SSc-OS

IL 1-like

286 55031 USP47 ubiquitin specific 4 SSc-OS

peptidase 47

287 10493 VATI vesicle amine transport 4 SSc-OS

protein 1 homolog (T.

californica)

288 22911 WDR47 WD repeat domain 47 4 SSc-OS

289 23613 ZMYND8 zinc finger, MYND-type 4 SSc-OS

containing 8

290 170959 ZNF431 zinc finger protein 431 4 SSc-OS

291 147837 ZNF563 zinc finger protein 563 4 SSc-OS

292 4747 NEFL neurofilament , light 5 lSSc; SSc- Polypeptide OS; dSSc;

293 3925 STMN1 stathmin 1 5 lSSc; SSc- OS; dSSC

294 1039 CDR2 cerebellar 5 lSSc; SSc- degeneration-related OS

protein 2, 62kDa

295 5504 PPP1R2 protein Phosphatase 1, 5 lSSc; SSc- regulatory (inhibitor) OS

subunit 2

296 55131 RBM28 RNA binding motif 5 lSSc; SSc- protein 28 OS

297 6749 SSRP1 structure specific 5 lSSc; SSc- recognition protein 1 OS

298 54969 C4orf27 chromosome 4 open 5 dSSc; lSSc reading frame 27

299 784 CACNB3 calcium Channel, 5 dSSc; lSSc voltage-dependent , beta

3 subunit

300 842 CASP9 caspase 9, apoptosis- 5 dSSc; lSSc related cysteine

peptidase

301 1105 CHD1 chromodomain helicase 5 dSSc; lSSc

DNA binding protein 1

302 1687 DFNA5 deafness, autosomal 5 dSSc; lSSc dominant 5

303 2237 FEN1 flap structure-specific 5 dSSc; lSSc endonuclease 1 SEQ Gene ID Gene Gene Name Gruppe p<0.05 und

ID Symbol fold-change

No. >1.5 in

Gruppe

304 2961 GTF2E2 general transcription 5 dSSc; lSSc factor IIE, Polypeptide

2, beta 34kDa

305 4313 MMP2 matrix metallopeptidase 5 dSSc; lSSc

2 (gelatinase A, 72kDa

gelatinase, 72kDa type

IV collagenase)

306 64976 MRPL40 mitochondrial ribosomal 5 dSSc; lSSc protein L40

307 8775 APA N-ethylmaleimide ^¬ 5 dSSc; lSSc sensitive factor

attachment protein,

alpha

308 1001370 PLA2G4B phospholipase A2, group 5 dSSc; lSSc

49 IVB (cytosolic)

309 5515 PPP2CA protein Phosphatase 2 5 dSSc; lSSc

( formerly 2A) ,

catalytic subunit,

alpha isoform

310 5819 PVRL2 poliovirus receptor- 5 dSSc; lSSc related 2 (herpesvirus

entry mediator B)

311 9400 RECQL5 RecQ protein-like 5 5 dSSc; lSSc

312 11124 FAF1 Fas (TNFRSF6) 5 SSc-OS;

associated factor 1 dSSc

313 54521 WDR44 WD repeat domain 44 5 dSSc; SSc- OS

314 7150 TOP1 TOP1 1 SSc

SSc; dSSc; SS

315 23135 KDM6B KDM6B 1 c-OS;

316 55695 NSUN5 NSUN5 1 SSc; lSSc

317 7644 ZNF91 ZNF91 2 dSSc

318 / / PGSScAg318 1 SSc

319 / PGSScAg319 1 SSc

Figur 3 zeigt die Autoantikörperreaktivität von SSc Patienten im Vergleich zu Gesunden Spendern und SLE Patienten.

Dargestellt ist eine sogenannte Heatmap der logarithmierten MFI Werte, wobei Signalhöhe in einer Schwarz/Weiß Skala

wiedergegeben wird.

Nach univariater statistischer Auswertung wurde ein

Schwellenwert von p<0.05 und eine 1,5 fach veränderte

Reaktivität gegenüber der Kontrollgruppe angelegt. Gruppe 1 umfasst Antigene, die in der Gruppe aller SSc

Patienten im Vergleicht zu Gesundkontrollen und/oder anderen rheumatischen Erkrankungen einen Schwellenwert von p<0.05 unterschreiten und eine 1,5 fach veränderte Reaktivität gegenüber der Kontrollgruppe erreichen: KDM6B, NSUN5, RTEL1, MYST2, TRIM21, ABCB8, AVEN, VEGFB, C19orf60, CENPA, CENPC1, CENPT, CHRM3, GORASP 1, GYSI, HDAC5, ILKAP, LSM1, MARVELD2 , NFIX, OSBP2, PIM3, PLXNB1, PMF1, PPIE, PRDM16, TTLL3, USP48, AZGP1, AZGP1, ZYX.

Tabelle 3 fasst die Ergebnisse der statistischen Tests für 36 Antigene aus Tabelle 2 zusammen, die einen p-Wert von <0.05 gegenüber Gesundproben aufweisen.

Angegeben sind der p-Wert (p-value) , die Erhöhung der

Reaktivität gegenüber der Kontrollgruppe (Fold-Change) , die Area under the Curve (AUC) und der Confidence Interval (CI), sowie Sensitivität (Sens.) und Spezifität (Spec).

AID 0.74 0.63 0.86

2997 GYSI SSc 3.21E-08 1.76 0.69 0.64 0.57 0.45 0.72 0.66 s

HV 0.73 0.69 0.79

2997 GYSI SSc 6.14E-07 1.59 0.65 0.58 0.52 0.41 0.70 0.68 vs

AID 0.71 0.63 0.73

1058 CENPA SSc 7.05E-09 2.20 0.68 0.63 0.49 0.43 0.80 0.77 vs

AID 0.73 0.56 0.83

1058 CENPA SSc 9.47E-08 2.13 0.69 0.63 0.50 0.37 0.81 0.75 vs

HV 0.75 0.63 0.87

11194 ABCB8 SSc 9.59E-06 1.42 0.63 0.56 0.46 0.35 0.76 0.71 vs

AID 0.71 0.58 0.81

11194 ABCB8 SSc 9.54E-06 1.54 0.64 0.57 0.46 0.32 0.77 0.72 vs

HV 0.71 0.6 0.82

51750 RTEL1 SSc 2.45E-05 2.55 0.64 0.57 0.53 0.43 0.67 0.61 vs

HV 0.71 0.63 0.73

51750 RTEL1 SSc 1.28E-05 2.47 0.62 0.57 0.52 0.41 0.67 0.63 vs

AID 0.68 0.63 0.71

7423 VEGFB SSc 1.95E-04 2.41 0.63 0.55 0.53 0.43 0.65 0.58 vs

HV 0.7 0.64 0.73

7423 VEGFB SSc 5.04E-03 2.23 0.59 0.51 0.53 0.43 0.63 0.58 vs

AID 0.66 0.63 0.67

11243 PMF1 SSc 1.33E-04 2.51 0.61 0.52 0.53 0.41 0.68 0.6 vs

HV 0.7 0.65 0.75

11243 PMF1 SSc 6.62E-05 2.51 0.62 0.53 0.54 0.42 0.66 0.63 vs

AID 0.7 0.67 0.7

57099 AVEN SSc 1.85E-04 2.09 0.62 0.57 0.55 0.48 0.64 0.6 vs

AID 0.66 0.62 0.67

57099 AVEN SSc 4.48E-03 1.71 0.60 0.54 0.54 0.42 0.61 0.54 vs

HV 0.67 0.65 0.67

1131 CHRM3 SSc 6.46E-03 1.41 0.58 0.51 0.51 0.4 0.64 0.6 vs

AID 0.64 0.63 0.68

1131 CHRM3 SSc 1.64E-03 1.56 0.60 0.53 0.53 0.37 0.66 0.58 vs

HV 0.67 0.68 0.74

4784 NFIX SSc 1.47E-03 1.51 0.60 0.52 0.48 0.37 0.67 0.6 vs

HV 0.68 0.59 0.74

4784 NFIX SSc 3.88E-02 1.30 0.55 0.46 0.44 0.28 0.64 0.61 vs

AID 0.64 0.59 0.67

84196 USP48 SSc 4.11E-03 1.60 0.60 0.54 0.52 0.42 0.63 0.58 vs

HV 0.65 0.63 0.69

84196 USP48 SSc 2.15E-01 1.21 0.53 0.46 0.45 0.36 0.57 0.52 vs AID 0.6 0.54 0.62

11143 MYST2 SSc 4.21E-03 1.68 0.60 0.52 0.43 0.34 0.67 0.61 s

HV 0.67 0.52 0.74

11143 MYST2 SSc 2.75E-03 1.76 0.59 0.55 0.44 0.34 0.66 0.64 vs

AID 0.64 0.54 0.69

5364 PLXNB1 SSc 6.60E-05 1.88 0.62 0.52 0.53 0.36 0.67 0.63 vs

AID 0.72 0.71 0.7

5364 PLXNB1 SSc 6.04E-03 1.67 0.59 0.53 0.52 0.45 0.65 0.59 vs

HV 0.66 0.6 0.71

10450 PPIE SSc 1.96E-03 1.64 0.59 0.52 0.49 0.37 0.69 0.66 vs

HV 0.67 0.6 0.72

10450 PPIE SSc 9.14E-02 1.33 0.56 0.48 0.45 0.35 0.63 0.59 vs

AID 0.64 0.55 0.68

80152 CENPT SSc 5.10E-03 1.60 0.59 0.53 0.48 0.34 0.67 0.63 vs

AID 0.64 0.62 0.72

80152 CENPT SSc 8.21E-03 1.57 0.59 0.51 0.49 0.35 0.65 0.61 vs

HV 0.67 0.63 0.69

64689 GORASP 1 SSc 5.03E-01 1.03 0.53 0.46 0.44 0.33 0.59 0.55 vs

AID 0.59 0.55 0.63

64689 GORASP 1 SSc 1.37E-02 1.55 0.58 0.52 0.47 0.37 0.64 0.59 vs

HV 0.65 0.57 0.69

27257 LSM1 SSc 1.58E-04 1.58 0.61 0.56 0.59 0.5 0.61 0.58 vs

AID 0.66 0.67 0.65

27257 LSM1 SSc 1.46E-02 1.39 0.58 0.52 0.51 0.38 0.62 0.56 vs

HV 0.63 0.64 0.67

153562 MARVELD SSc 1.82E-02 1.56 0.56 0.49 0.56 0.45 0.60 0.57

2 vs

AID 0.64 0.68 0.63

153562 MARVELD SSc 1.39E-02 1.61 0.57 0.51 0.57 0.44 0.62 0.56

2 vs

HV 0.64 0.7 0.67

415116 PIM3 SSc 9.59E-02 1.53 0.56 0.52 0.41 0.36 0.66 0.63 vs

AID 0.6 0.46 0.7

415116 PIM3 SSc 2.65E-02 1.68 0.57 0.5 0.42 0.31 0.68 0.61 vs

HV 0.65 0.53 0.76

23762 OSBP2 SSc 4.13E-03 1.52 0.59 0.51 0.49 0.39 0.67 0.64 vs

AID 0.67 0.6 0.7

23762 OSBP2 SSc 5.45E-03 1.57 0.57 0.46 0.43 0.25 0.65 0.57 vs

HV 0.68 0.62 0.73

26140 TTLL3 SSc 1.16E-02 1.50 0.57 0.46 0.48 0.32 0.64 0.58 vs

HV 0.68 0.64 0.71

26140 TTLL3 SSc 1.14E-01 1.35 0.55 0.49 0.47 0.39 0.63 0.6 vs AID 0.61 0.55 0.66

10014 HDAC5 SSc 1.36E-01 1.94 0.55 0.51 0.53 0.46 0.50 0.46 s

AID 0.59 0.6 0.55

10014 HDAC5 SSc 4.32E-02 3.15 0.57 0.51 0.55 0.43 0.54 0.46 vs

HV 0.62 0.67 0.63

7791 ZYX SSc 1.75E-02 1.54 0.57 0.49 0.50 0.35 0.58 0.52 vs

HV 0.64 0.64 0.64

7791 ZYX SSc 2.79E-01 1.23 0.53 0.48 0.51 0.38 0.56 0.52 vs

AID 0.58 0.63 0.6

563 AZGP1 SSc 1.04E-02 1.55 0.57 0.51 0.46 0.37 0.62 0.58 vs

AID 0.63 0.55 0.65

563 AZGP1 SSc 3.62E-02 1.72 0.57 0.48 0.45 0.29 0.62 0.58 vs

HV 0.65 0.6 0.66

63976 PRDM16 SSc 1.09E-01 1.35 0.54 0.42 0.47 0.27 0.60 0.56 vs

AID 0.65 0.68 0.63

63976 PRDM16 SSc 4.52E-02 1.56 0.54 0.47 0.46 0.34 0.61 0.56 vs

HV 0.61 0.59 0.65

80895 ILKAP SSc 6.86E-04 1.53 0.60 0.52 0.52 0.43 0.69 0.66 vs

AID 0.69 0.61 0.73

80895 ILKAP SSc 1.52E-01 1.31 0.54 0.44 0.47 0.32 0.66 0.62 vs

HV 0.63 0.62 0.7

55049 C19orf6 SSc 6.48E-03 1.56 0.58 0.53 0.60 0.5 0.57 0.54 0 vs

AID 0.64 0.7 0.6

55049 C19orf6 SSc 3.59E-01 1.39 0.49 0.41 0.51 0.37 0.54 0.48 0 vs

HV 0.57 0.65 0.6

SSc 0.53

vs 0.53 0.66

23299 BICD2 HV 1.79E-03 1.45 0.59 0.66 0.44 0.37

SSc 0.49

vs 0.49 0.65

23299 BICD2 AID 1.02E-02 1.28 0.57 0.65 0.43 0.34

SSc 0.62

vs 0.62 0.75

1059 CENPB HV 9.17E-08 1.37 0.69 0.75 0.46 0.34

SSc 0.6

vs 0.6 0.74

1059 CENPB AID 1.04E-08 1.35 0.67 0.74 0.46 0.36

SSc 0.55

vs 0.55 0.68

10290 SPEG HV 2.68E-04 1.31 0.61 0.68 0.47 0.36

SSc 0.53

vs 0.53 0.72

10290 SPEG AID 8.12E-05 1.42 0.62 0.72 0.51 0.35

SSc 0.52

vs 0.52 0.71

6749 SSRP1 HV 6.26E-04 1.36 0.61 0.71 0.49 0.40

SSc 0.55

0.55 0.65

6749 SSRP1 vs 6.16E-04 1.31 0.60 0.48 0.40 AID 0.65

SSc 0.52

s

29968 PSAT1 HV 1.83E-02 1.10 0.58 0.52 0.63 0.63 0.37 0.24

SSc 0.47

vs

29968 PSAT1 AID 7.17E-02 1.06 0.57 0.47 0.67 0.67 0.39 0.23

SSc 0.51

vs

51368 TEX264 HV 1.49E-02 1.42 0.57 0.51 0.64 0.64 0.42 0.33

SSc 0.47

vs

51368 TEX264 AID 3.16E-01 1.18 0.54 0.47 0.60 0.6 0.40 0.29

Um die Frequenz der neuidentifizierten Antigene aus Tabelle 3 im Vergleich zu bekannten Antigenen zu analysieren, wurde ein Schwellenwert von 3 Standardabweichungen (SD) über dem

Mittelwert der Gesundproben definiert.

Erstaunlicherweise wurden mindestens 6 zusätzliche Antigene identifiziert, deren Frequenz bei Betrachtung aller SSc Patienten größer gleich 10% ist. Dazu gehören KDM6B, (21%), BICD2 (19%), RTEL1 (14%), NSUN5 (13%), SSRP1 (10%) und SPEG (10%) . Zusätzlich wurden zwei weitere Antigene mit einer Frequenz größer oder gleich 5% in SSc gefunden: VEGFB(9%) und PSAT1 (7%) .

Figur 4 zeigt die Frequenz von 8 neuen Antigenen in SSc

Patienten im Vergleich zu anti-Centromere Antikörpern.

Beispiel 7: Identifizierung von Autoantikörper Reaktivitäten in Patienten mit diffuser Subform.

Nur etwa 62.5% der analysierten Patienten mit limitierter Form wiesen Anti-Scl70 Antikörper auf. Weitere 12.5% der Patienten zeigten anti-Centromere Antikörper. Um weitere Autoantikörper in Patienten mit limitierter SSc zu identifizieren, wurden die Serumproben der Patienten mit diffuser SSc mit verschiedenen Kontrollgruppen verglichen. Diese bestanden aus Patienten mit limitierter SSc und Patienten mit Overlap Syndrome. Autoantikörper, die in der Gruppe der SSc Patienten mit diffuser Form einen p-Wert von kleiner als 0.05 und einen Fold-Change größer als 1.5 aufwiesen wurden ausgewählt. Das Ergebnis der statistischen Tests ist in Tabelle 2 zusammengefasst .

Gruppe 2 umfasst 72 zusätzliche Antigene, die für die Identifizierung von Patienten mit diffuser SSc geeignet sind.

Gruppe 2 Antigene Gene Symbol: PSAT1, TEX264, ABCF3 , ACAT2 , TCEAL4 , ACTN4, ACTR5 , ALDH1A1 , ALPK1 , APBA2 , ARHGEF16 , ASMTL, ATP13A2, Cllorf30, Cllorf60, C17orf48, C19orf52, C20orf43, CDK5RAP2, CMPK1, COR02B, COX5A, CTBP2 , CYP4F2 , DENND4B, DHRS4 , DTNBP1, EEF1D, EIF2B3, EPS8L2 , FEZ1, FOXL1, FUCA2 , GAL3ST4 , GEMIN8, GLOD4 , GSN, HMGCS1, HSP 90AA1 , INPP5B, IRAK1, ISCU, LARS, LTF, MGEA5, MPND, MSH3, NCSTN, NEU1, P4HB, PER1, PEX14, PGCP, PPL, PRKAR1B, PTPN5, RABIIB, RAB11FIP4, RUNDC3A, STMN3, STMN4, STXBP3, SYCE1, TBCD, TMF1, TSFM, TXNRD1, UBE2Q1, UBE2Q2, UBE2Z, YTHDF1, ZNF217.

Figur 5 zeigt den Vulcano Plot der Autoantikörperreaktivitäten von SSc Patienten mit diffuser Subform gegen Gesundkontrollen.

Figur 6 zeigt die Frequenz der Autantikörper in der diffusen Form im Vergleich zur limitierten Form.

Patienten mit diffuser SSc weisen häufiger Antikörper für die Antigene PSAT1 (12.5%), VEGFB (12.5%), CMPK1 (9.4%), TEX264 (9.4%), WDR44 (9.4%), PPL (6.3%) und MYST2 (6.3%) auf.

Tabelle 4 fasst die Ergebnisse der statischen Tests für ausgewählte Antigene der Gruppe 1 und 2 zusammen. Diese Antigene sind zur Identifizierung und Unterscheidung der SSc- Subgruppen limitiert und diffus geeignet.

Tabelle 4: Zusammenfassung der p-values, AUC und Fold-Change Reaktivität der Antigene in den SSc-Subgruppen limitiert und diffuse zusammen. GenelD Gene Test p-value Fold- AUC Sensitivi Specifici Symbol change ty ty

57099 AVEN Diffuse vs 6.04E- -1.46 0.4 0.48 0.56

HV 01 4

57099 AVEN Limited vs 1.74E- 4.00 0.7 0.63 0.67

HV 06 0

23299 BICD2 Diffuse vs 7.98E- 1.05 0.4 0.30 0.56

HV 01 5

23299 BICD2 Limited vs 2.53E- 2.10 0.7 0.59 0.71

HV 05 1

1058 CENPA Diffuse vs 3.21E- 1.26 0.5 0.35 0.70

HV 01 5

1058 CENPA Limited vs 9.49E- 31.39 0.7 0.70 0.85

HV 11 9

1059 CENPB Diffuse vs 8.87E- -1.05 0.5 0.36 0.63

HV 01 0

1059 CENPB Limited vs 7.69E- 28.22 0.8 0.72 0.91

HV 12 2

1060 CENPC1 Diffuse vs 2.96E- 1.51 0.6 0.45 0.77

HV 02 3

1060 CENPC1 Limited vs 7.42E- 12.12 0.8 0.63 0.90

HV 16 4

51727 CMPK1 Diffuse vs 1.14E- 1.73 0.6 0.55 0.60

HV 01 0

51727 CMPK1 Limited vs 5.98E- -1.51 0.6 0.64 0.48

HV 02 0

23135 KDM6B Diffuse vs 2.82E- 2.06 0.6 0.63 0.67

HV 03 5

23135 KDM6B Limited vs 1.82E- 7.15 0.8 0.70 0.82

HV 14 4

11143 MYST2 Diffuse vs 3.44E- 3.32 0.6 0.55 0.71

HV 03 5

11143 MYST2 Limited vs 1.95E- 1.33 0.5 0.45 0.63

HV 01 6

4796 NFKBIL2 Diffuse vs 1.21E- 1.47 0.5 0.39 0.69

HV 01 7

4796 NFKBIL2 Limited vs 9.90E- 2.42 0.6 0.56 0.73

HV 03 4

55695 NSUN5 Diffuse vs 2.02E- 1.05 0.5 0.42 0.75

HV 01 8

55695 NSUN5 Limited vs 4.07E- 2.69 0.8 0.71 0.87

HV 12 1

55857 PLK1S1 Diffuse vs 2.01E- -1.39 0.5 0.61 0.55

HV 01 5

55857 PLK1S1 Limited vs 9.02E- 1.65 0.6 0.49 0.61

HV 03 0

11243 PMF1 Diffuse vs 2.89E- 2.45 0.6 0.60 0.67

HV 02 4

11243 PMF1 Limited vs 5.75E- 3.29 0.6 0.55 0.69

HV 04 4

5493 PPL Diffuse vs 1.53E- 2.05 0.6 0.53 0.68

HV 03 5

5493 PPL Limited vs 8.45E- 1.30 0.5 0.50 0.64

HV 02 8

29968 PSAT1 Diffuse vs 2.46E- 2.24 0.6 0.52 0.80

HV 03 6

29968 PSAT1 Limited vs 6.76E- 1.01 0.5 0.33 0.75

HV 01 2

51750 RTEL1 Diffuse vs 3.30E- -1.35 0.4 0.49 0.48

HV 01 5 51750 RTEL1 Limited vs 5.56E- 5.97 0.7 0.74 0.75 HV 10 8

10290 SPEG Diffuse vs 2.46E- 1.02 0.5 0.33 0.55

HV 01 4

10290 SPEG Limited vs 7.89E- 2.34 0.6 0.61 0.62

HV 04 9

6749 SSRP1 Diffuse vs 2.45E- -1.15 0.4 0.40 0.54

HV 01 7

6749 SSRP1 Limited vs 1.37E- 2.11 0.7 0.62 0.73

HV 05 1

51368 TEX264 Diffuse vs 1.66E- 2.02 0.6 0.52 0.70

HV 02 3

51368 TEX264 Limited vs 1.12E- 1.31 0.5 0.36 0.64

HV 01 7

7423 VEGFB Diffuse vs 1.77E- 2.46 0.6 0.54 0.66

HV 02 2

7423 VEGFB Limited vs 8.40E- 2.15 0.6 0.56 0.64

HV 03 1

54521 WDR44 Diffuse vs 5.07E- 2.37 0.6 0.57 0.61

HV 02 4

54521 WDR44 Limited vs 3.00E- -1.21 0.5 0.58 0.44

HV 01 6

Beispiel 8: Identifizierung von Autoantikörper Reaktivitäten in Patienten mit limitierter Subform.

Nur etwa 60% der analysierten Patienten mit limitierter Form wiesen Anti-Centromere Antikörper auf. Weitere 18% der Patienten zeigten anti-Scl70 Antikörper. Um weitere Autoantikörper in Patienten mit limitierter SSc zu identifizieren, wurden die Serumproben der Patienten mit limitierter SSc mit verschiedenen Kontrollgruppen verglichen. Diese bestanden aus Patienten mit diffuser SSc und Patienten mit Overlap Syndrome. Autoantikörper, die in der Gruppe der SSc Patienten mit limitierter Form einen p-Wert von kleiner als 0.05 und einen Fold-Change größer als 1.5 aufwiesen wurden ausgewählt. Das Ergebnis der statistischen Tests ist in Tabelle 2 zusammengefasst .

Figur 7 zeigt den Vulcano Plot der Autoantikörperreaktivitäten von Patienten mit limitierter SSc im Vergleich zu Gesundproben .

Tabelle 4 fasst die Ergebnisse der statistischen Tests der SSc-Subgruppen limitiert und diffus zusammen. Gruppe 3 umfasst 69 zusätzliche Antigene, die für die Identifizierung von Patienten mit limitierter SSc geeignet sind .

Gruppe 3 Antigene Gene Symbol:

BICD2, SPEG, ZFYVE19, AATF , ABI2, ACBD 6 , AIP, ANK1, ARHGDIA, AZIN1, Clorfl31, C9orfl6, CBX3, CCDC102A, CCNDBP1, CENPH, COR07, DDX1, DTX4, DYNC1LI1, EIF4E, EML3, ENAH, EOMES, FAM50A, FCHSD1, GABI, GCSH, GIPC1, GIT1, GPBP1, GTF2F1, HIST1H1A, IKBKB, ISY1, KDR, KIFAP3, MAPT, MED21 , MOCOS, MRPL34, NSFL1C, PDIA6, PLK1S1, PLXNB2, RGS16, RNF4, RPL5, S100B, SET, SFPQ, SH3GL2, CENPB, SPIRE2, SPTAN1, SSB, SYF2, TAF 9 , TDRKH, TTC1, TTC28, TWF2, UBAP2, UNC119, WIZ, XBP1, YLPM1 , ZCCHC17, ZCCHC9

Figur 8 zeigt die Frequenz der Autoantikörper in der diffusen Form im Vergleich zur limitierten Form.

Neben anti-Centromere und anti-Ro52 (TRIM21) Antikörpern wurden in Patienten mit limitierter SSc mit einer Frequenz von größer gleich 10% Antikörper gegen die Antigene KDM6B (38%) , BICD2 (26%), RTEL1 (22%), NSUN5 (20%), SSRP1 (14%), AVEN (12%), PMF1 (10%), NFKBIL2 (10%), SPEG (10%) und PLK1S1 (10%) gefunden .

Beispiel 9: Identifizierung von Autoantikörper Reaktivitäten in Patienten mit Overlap Syndrome

Eine häufige Verlaufsform der SSc ist das sogenannte Überlappungssyndrom oder Overlap Syndrome. In der klinischen Praxis ist die Abgrenzung zu anderen Kollagenosen oftmals schwierig .

Gruppe 4 umfasst 119 Antigene, die zur Identifizierung von Patienten mit Overlap Syndrome geeignet sind:

Gruppe 4 Antigene Gene Symbol : ACOT7 , ACTR1B, ADD1, AIFM1, AK1, AKAP1, AKT1, A APC4 , ANKRD16, ANKS6, APC, ARHGDIB, ASB6, ATP5D, ATP5H, AVPI1, B3GNTL1, BCKDHA, BRPF3, Cllorfl, Cllorf84, C14orfl05, C20orf20, C3orfl, CA5A, CALB2 , CAPG, CBLC, CC2D1A, CCDC137 , CCDC40, CCDC43, CDC2L2 , CEP76, CNDP2, CNTROB, COIL, CRYAB, DES, DHX29, DIP2C, DR1 , EID1, ERLINI, FAM104B, FAM60A, FASN, FCGR1A, FKBP15, FKBP8, FUBP3, FXC1, GSTZ1, H2AFV, HNRNPA1, HNRPLL, HSBP1L1, HSPA8, IRAK1BP1, KARS, KCNK5, LASS5, LIPE, LOCI 00129119 , LOC643733, LSM14A, LSM14B, LSR, LUC7L2, MAOA, MAPK8IP2, MBD3, MRPL10, MRPL11, MSN, MXD3, MXI1, NFE2L2, NHSL1, NNAT, NRBP1, NUP35, ORC6L, PANK4, PBXIP1, PCBP4, PPP1R14A, PRDM8, PTN, RPLPO, RPS3, SCARB2 , SDCCAG8, SDR39U1, SDS, SEC31A, SERPINA6, SH3KBP1, SMAD1, SNX22, SOX13, SRP68, TCEAL2, TCEB3, TCERG1, TCOF1, TIMM13, TRAK1, TRIM10, TRIM56, UBTD2, UGT1A8, UHRF1BP1L, USP47, VATI, WDR47, ZMYND8, ZNF431, ZNF563.

Gruppe 5 in Tabelle 2 enthält weitere statistisch signifikante Antigene, die für die Diagnose und Differentialdiagnose von SSc gegenüber Gesund und anderen Autoimmunerkrankungen herangezogen werden können.

Gruppe 5 Antigene Gene Symbol: HIST1H2BA, NEFL, STMN1, STMN1, CDR2, PPP1R2, RBM28, SSRP1, C4orf27, CACNB3, CASP9, CHD1, DFNA5, FEN1, GTF2E2, MMP2, MRPL40, NAPA, PLA2G4B, PPP2CA, PVRL2, RECQL5, FAF1, WDR44.

Beispiel 10: Anwendung von Antigen Panels und zur verbesserten Diagnose von SSc

Aufgrund der klinischen und serologischen Heterogenität der SSc Erkrankung ist es nicht möglich mit nur einem Biomarker diese zu diagnostizieren. Laut Mierau et al . (2011) weisen nur ca. 35.9% der SSc Patienten Autoantikörper gegen Centromere- Proteine und nur 30.1% Autoantikörper gegen anti-topoisomerase I (anti-Scl70) auf. Daher besteht weiterhin ein hoher Bedarf an spezifischen diagnostischen und prognostischen Markern. Um ein verbessertes diagnostisches Antigenpanel für SSc zu entwickeln, wurden aus den Tabellen 3 und 4 Antigene ausgewählt .

In die engere Auswahl gelangten zunächst fünf der in SSc am häufigsten vertretenen Antigene KDM6B, BICD2, RTEL1 und NSUN5 (Figur 4 ) .

Zusätzlich berücksichtigt wurde auch die Häufigkeit von Autoantikörpern in der besonders schwer verlaufenden diffusen SSc. Hier wurden zwei der am häufigsten reaktiven Antigene BICD2 (12.5) und PSAT1 (12.5) ausgewählt.

Zusätzlich wurden Antigene ausgewählt, gegen die anti-Scl70 negative und anti-Centromere negative Patienten reaktiv sind.

Figur 9 zeigt die Häufigkeit von Autoantikörpern gegen eine Auswahl von Antigenen aus Tabelle 3 und 4 in anti-Centromere und anti-Scl70 negativen Patienten.

Insbesondere die Antigene MARVELD2 (19%), MYST2 (19%), VEGFB (19%) .PSAT1 (14%) . NSUN5 (14%) und TEX264 (14%) weisen eine Frequenz von mehr als 10% in anti-Centromere und anti-Scl70 negativen SSc Patienten auf. Diese Antigene sind daher besonders zur Verbesserung der Diagnose geeignet.

Für die Entwicklung eines verbesserten diagnostischen Tests wurden daher vier der am häufigsten in doppelt negativen SSc Patienten reaktiven Antigene MYST2, PSAT1, NSUN5 und TEX264 ausgewählt .

Die finale Zusammensetzung der Panels ist in Tabelle 5 dargestellt .

Zusammensetzung des verbesserten diagnostischen

1059 CENPB centromere protein B, 80kDa X X

7250 TOP1 topoisomerase (DNA) I X X

23135 KDM6B lysine (K) -specific demethylase 6B X

23299 BICD2 bicaudal D homolog 2 (Drosophila) X

55695 NSUN5 NOLl/NOP2/Sun domain family, member 5 X

51750 RTEL1 regulator of telomere elongation X

helicase 1

11143 MYST2 MYST histone acetyltransferase 2 X

29968 PSAT1 phosphoserine aminotransferase 1 X

Die ersten 7 Antigene in Tabelle 2 umfassen die wichtigsten Antigene, die für die Berechnung von Biomarker-Panels zur Diagnose von SSc verwendet werden: KDM6B, NSUN5, BICD2, RTEL1, MYST2, PSAT1 und TEX264

Zur Validierung der in Tabelle 5 genannten Antigene aus Panel I und Panel II wurden 100 SSc Patienten und 100 Gesundproben mit Antigen-gekoppelten Luminex Beads vermessen.

Die MFI Werte der Antigene TOP1, CENPB, KDM6B, NSUN5, BICD2, RTEL1, MYST2, PSAT1 und TEX264 wurden zur Berechnung der Area under the Curve (AUC) , Sensitivität und Spezifität

herangezogen .

Figur 10a zeigt die Receiver Operator Kurven (ROC) für ein logistisches Regressionsmodel basierend auf dem Panel I bestehend aus anti-CENPB und anti-Scl70.

Figur 10b die ROC Kurve für das verbesserte Panel bestehend aus anti-CENPB und anti-Scl70 und den fünf neuen Antigenen KDM6B, NSUN5, BICD2, RTEL1, MYST2, PSAT1 und TEX264.

Durch den Einschluss der 5 Antigene KDM6B, NSUN5, BICD2,

RTEL1, MYST2, PSAT1 und TEX264 konnte die Sensitivität um 7% von 72% auf 79% gesteigert werden. Anhand des Beispiels wird deutlich, wie sich unter Einbeziehung der zusätzlichen Marker die Vorhersagequalität eines Biomarkermodells steigern lässt um eine bessere Klassifikation von Erkrankten zu erreichen.

Die Einbeziehung zusätzlicher Marker zu den bekannten Markern verbessert die Vorhersagequalität im angewendeten Verfahren mit etwa 7% ROC deutlich.

Tabelle 6: AUC, Sensitivität und Spezifität der SSc Panels

Tabelle 7

55049 C19orf60 NM_001100418.1

1058 CENPA NM_001042426.1

1060 CENPC1 NM_001812.2

80152 CENPT NM_025082.3

1131 CHRM3 NM_000740.2

64689 GORASP1 NM_031899.3

2997 GYSI NM_001161587.1

10014 HDAC5 NM_001015053.1

80895 ILKAP NM_030768.2

27257 LSM1 NM_014462.2

153562 MARVELD2 NM_001038603.2

4784 NFIX NM_002501.3

23762 OSBP2 NM_030758.3

415116 PIM3 NM_001001852.3

5364 PLXNB1 NM_001130082.2

11243 PMF1 NM_001199653.1 10450 PPIE NM_001195007.1 4057 LTF NM_001199149.1

63976 PRDM16 NM_022114.3 10724 MGEA5 NM_001142434.1

26140 TTLL3 NM_001025930.3 84954 MPND NM_001159846.1

84196 USP48 NM_001032730.1 4437 MSH3 NM_002439.4

563 AZGP1 NM_001185.3 23385 NCSTN NM_015331.2

7791 ZYX NM_001010972.1 4758 NEU1 NM_000434.3

55324 ABCF3 NM_018358.2 5034 P4HB NM_000918.3

39 ACAT2 NM_005891.2 5187 PER1 NM_002616.2

79921 TCEAL4 NM_001006935.1 5195 PEX14 NM_004565.2

81 ACTN4 NM_004924.4 10404 PGCP XM_006716498.1

79913 ACTR5 NM_024855.3 5493 PPL NM_002705.4

216 ALDH1A1 NM_000689.4 5575 PRKAR1B NM_001164758.1

80216 ALPK1 NM_001102406.1 84867 PTPN5 NM_001039970.1

321 APBA2 NM_001130414.1 9230 RAB11B NM_004218.3

27237 ARHGEF16 NM_014448.3 84440 RAB11FIP4 NM_032932.3

8623 ASMTL NM_001173473.1 10900 RUNDC3A NM_001144825.1

23400 ATP13A2 NM_001141973.1 50861 STMN3 NM_015894.3

56946 Cllorf30 NM_020193.3 81551 STMN4 NM_030795.3

56912 Cllorf60 NM_001168618.1 6814 STXBP3 NM_007269.2

56985 C17orf48 NM_020233.4 93426 SYCE1 NM_001143763.1

90580 C19orf52 NM_138358.2 6904 TBCD NM_005993.4

51507 C20orf43 NM_016407.4 7110 TMF1 NM_007114.2

55755 CDK5RAP2 NM_001011649.2 10102 TSFM NM_001172695.1

51727 CMPK1 NM_001136140.1 7296 TXNRD1 NM_001093771.2

10391 COR02B NM_001190456.1 55585 UBE2Q1 NM_017582.6

9377 COX5A NM_004255.3 92912 UBE2Q2 NM_001145335.1

1488 CTBP2 NM_001083914.1 65264 UBE2Z NM_023079.4

8529 CYP4F2 NM_001082.4 54915 YTHDF1 NM_017798.3

9909 DENND4B NM_014856.2 7764 ZNF217 NM_006526.2

10901 DHRS4 NM_021004.3 10290 SPEG NM_001173476.1

84062 DTNBP1 NM_032122.4 84936 ZFYVE19 NM_001077268.1

1936 EEF1D NM_001130053.2 26574 AATF NM_012138.3

8891 EIF2B3 NM_001166588.2 10152 ABI2 NM_005759.5

64787 EPS8L2 NM_022772.3 84320 ACBD6 NM_032360.3

9638 FEZ1 NM_005103.4 9049 AIP NM_003977.2

2300 FOXL1 NM_005250.2 286 ANK1 NM_000037.3

2519 FUCA2 NM_032020.4 396 ARHGDIA NM_001185077.1

79690 GAL3ST4 NM_024637.4 51582 AZIN1 NM_015878.4

54960 GEMIN8 NM_001042479.1 128061 Clorfl31 NM_152379.2

51031 GLOD4 NM_016080.3 79095 C9orfl6 NM_024112.3

2934 GSN NM_000177.4 11335 CBX3 NM_007276.4

3157 HMGCS1 NM_001098272.2 92922 CCDC102A NM_033212.3

3320 HSP90AA1 NM_001017963.2 23582 CCNDBP1 NM_012142.4

3633 INPP5B NM_005540.2 64946 CENPH NM_022909.3

3654 IRAK1 NM_001025242.1 79585 COR07 NM_001201472.1

23479 ISCU NM_014301.3 1653 DDX1 NM_004939.2

51520 LARS NM_020117.9 23220 DTX4 NM_015177.1 51143 DYNC1U1 NM_016141.3 56252 YLPM1 NM_019589.2

1977 EIF4E NM_001130678.1 51538 ZCCHC17 NM_016505.3

256364 EML3 NM_153265.2 84240 ZCCHC9 NM_001131035.1

55740 ENAH NM_001008493.1 255626 HIST1H2BA NM_170610.2

8320 EOMES NM_005442.3 11332 AC0T7 NM_007274.3

9130 FAM50A NM_004699.3 10120 ACTR1B NM_005735.3

89848 FCHSD1 NM_033449.2 118 ADD1 NM_001119.4

2549 GABI NM_002039.3 9131 AIFM1 NM_001130846.2

2653 GCSH NM_004483.4 203 AK1 NM_000476.2

10755 GIPC1 NM_005716.3 8165 AKAP1 NM_001242902.1

28964 GIT1 NM_001085454.1 207 AKT1 NM_001014431.1

65056 GPBP1 NM_001127235.2 29945 ANAPC4 NM_013367.2

2962 GTF2F1 NM_002096.2 54522 ANKRD16 NM_001009941.2

3024 HIST1H1A NM_005325.3 203286 ANKS6 NM_173551.3

3551 IKBKB NM_001190720.2 324 APC NM_000038.5

57461 ISY1 NM_001199469.1 397 ARHGDIB NM_001175.5

3791 KDR NM_002253.2 140459 ASB6 NM_001202403.1

22920 KIFAP3 NM_001204514.1 513 ATP5D NM_001001975.1

4137 MAPT NM_001123066.3 10476 ATP5H NM_001003785.1

9412 MED21 NM_004264.4 60370 AVPI1 NM_021732.2

55034 MOCOS NM_017947.2 146712 B3GNTL1 NM_001009905.1

64981 MRPL34 NM_023937.3 593 BCKDHA NM_000709.3

55968 NSFL1C NM_001206736.1 27154 BRPF3 NM_015695.2

10130 PDIA6 NM_005742.3 64776 Cllorfl NM_022761.2

55857 PLK1S1 NM_001163022.1 144097 Cllorf84 NM_138471.1

23654 PLXNB2 NM_012401.3 55195 C14orfl05 NM_018168.3

6004 RGS16 NM_002928.3 55257 C20orf20 NM_018270.4

6047 RNF4 NM_001185009.2 51300 C3orfl NM_016589.3

6125 RPL5 NM_000969.3 763 CA5A NM_001739.1

6285 S100B NM_006272.2 794 CALB2 NM_001740.4

6418 SET NM_001122821.1 822 CAPG NM_001256139.1

6421 SFPQ NM_005066.2 23624 CBLC NM_001130852.1

6456 SH3GL2 NM_003026.2 54862 CC2D1A NM_017721.4

1059 CENPB NM_001810.5 339230 CCDC137 NM_199287.2

84501 SPIRE2 NM_032451.1 55036 CCDC40 NM_001243342.1

6709 SPTAN1 NM_001130438.2 124808 CCDC43 NM_001099225.1

6741 SSB NM_003142.4 728642 CDC2L2 NM_024011.2

25949 SYF2 NM_015484.4 79959 CEP76 NM_024899.3

6880 TAF9 NM_001015891.1 55748 CNDP2 NM_001168499.1

11022 TDRKH NM_001083963.1 116840 CNTROB NM_001037144.5

7265 TTC1 NM_003314.2 8161 COIL NM_004645.2

23331 TTC28 NM_001145418.1 1410 CRYAB NM_001885.2

11344 TWF2 NM_007284.3 1674 DES NM_001927.3

55833 UBAP2 NM_018449.3 54505 DHX29 NM_019030.2

9094 UNC119 NM_005148.3 22982 DIP2C NM_014974.2

58525 WIZ NM_021241.2 1810 DR1 NM_001938.2

7494 XBP1 NM_001079539.1 23741 EID1 NM_014335.2 10613 ERLINI NM_001100626.1 6188 RPS3 NM_001005.4

90736 FAM104B NM_001166699.1 950 SCARB2 NM_001204255.1

58516 FAM60A NM_001135811.1 10806 SDCCAG8 NM_006642.3

2194 FASN NM_004104.4 56948 SDR39U1 NM_020195.2

2209 FCGR1A NM_000566.3 10993 SDS NM_006843.2

23307 FKBP15 NM_015258.1 22872 SEC31A NM_001077206.2

23770 FKBP8 NM_012181.3 866 SERPINA6 NM_001756.3

8939 FUBP3 NM_003934.1 30011 SH3KBP1 NM_001024666.2

26515 FXC1 NM_012192.3 4086 SMAD1 NM_001003688.1

2954 GSTZ1 NM_001513.3 79856 SNX22 NM_024798.2

94239 H2AFV NM_012412.4 9580 S0X13 NM_005686.2

3178 HNRNPA1 NM_002136.2 6730 SRP68 NM_014230.3

92906 HNRPLL NM_001142650.1 140597 TCEAL2 NM_080390.3

440498 HSBP1L1 NM_001136180.1 6924 TCEB3 NM_003198.2

3312 HSPA8 NM_006597.5 10915 TCERG1 NM_001040006.1

134728 IRAK1BP1 NM_001010844.3 6949 TCO Fl NM_000356.3

3735 KARS NM_001130089.1 26517 TIMM13 NM_012458.3

8645 KCNK5 NM_003740.3 22906 TRAK1 NM_001042646.2

91012 LASS5 NM_147190.3 10107 TRIM10 NM_006778.3

3991 LIPE NM_005357.3 81844 TRIM56 NM_030961.1129119 LOC10012911 92181 UBTD2 NM_152277.2 9 54576 UGT1A8 NM_019076.4

643733 LOC643733

23074 UHRF1BP1L NM_001006947.1

26065 LSM14A NM_001114093.1

55031 USP47 NM_017944.3

149986 LSM14B NM_144703.2

10493 VATI NM_006373.3

51599 LSR NM_015925.6

22911 WDR47 NM_001142550.1

51631 LUC7L2 NM_001244584.2

23613 ZMYND8 NM_012408.5

4128 MAOA NM_000240.3

170959 ZNF431 NM_133473.2

23542 MAPK8IP2 NM_012324.4

147837 ZNF563 NM_145276.2

53615 MBD3 NM_003926.5

4747 NEFL NM_006158.4

124995 MRPL10 NM_145255.3

3925 STMN1 NM_001145454.1

65003 MRPL11 NM_016050.3

1039 CDR2 NM_001802.1

4478 MSN NM_002444.2

5504 PPP1R2 NM_006241.6

83463 MXD3 NM_001142935.1

55131 RBM28 NM_001166135.1

4601 MXI1 NM_001008541.1

6749 SSRP1 NM_003146.2

4780 NFE2L2 NM_001145412.2

54969 C4orf27 NM_017867.2

57224 NHSL1 NM_001144060.1

784 CACNB3 NM_000725.3

4826 NN AT NM_005386.2

842 CASP9 NM_001229.4

29959 NRBP1 NM_013392.2

1105 CHD1 NM_001270.2

129401 NUP35 NM_138285.4

1687 DFNA5 NM_001127453.1

23594 0RC6L NM_014321.3

2237 FEN1 NM_004111.5

55229 PANK4 NM_018216.1

2961 GTF2E2 NM_002095.4

57326 PBXIP1 NM_020524.2

4313 MMP2 NM_001127891.1

57060 PCBP4 NM_001174100.1

64976 MRPL40 NM_003776.2

94274 PPP1R14A NM_001243947.1

8775 NAPA NM_003827.3

56978 PRDM8 NM_001099403.1

100137049 PLA2G4B NM_001114633.1

5764 PTN NM_002825.5

5515 PPP2CA NM_002715.2

6175 RPLPO NM_001002.3

Beispiel 11: Validierung von SSc-assozierten Autoantikörpern in einem unabhängigen Probenkollektiv

Die in Tabelle 2 genannten Marker wurden in einem zweiten unabhängigen Probenkollektiv getestet (SSc Kohorte II).

Insgesamt wurden 180 Serumproben von SSc Patienten analysiert, deren demogrophischen und klinischen Daten der EUSTAR

Datenbank entnommen worden sind. EUSTAR ist eine

multizentrische, prospektive Kohorte der European League

Against Rheumatism (EULAR) Scleroderma Trials and Research (EUSTAR) group. Als Kontrollproben wurden n=99 Serumproben von Gesundkontrollen und n=110 Serumproben von Patienten mit rheumatischen Autoimmunerkrankungen (AD) eingesetzt. Diese setzten sich zusammen aus Serumproben von Patienten mit der Diagnose SLE, Myositis, Arthritis und Sjögrens' s Syndrom.

Tabelle 6: Demographische, klinische und serologische Daten der SSc Kohorte II.

Hierzu wurden die in Tabelle 2 genannten humanen Proteine an Luminex Beads gekoppelt und die Protein-gekoppelten Beads in einem Multiplex Assay mit den Patientenproben vermessen. Die Bindung von Autoant ikörpern wurde mittels eines PE- konjugierten Autoant ikörpers in einem Luminex Instrument gemessen .

Es wurde eine univariate statistische Auswertugen durchgeführt mit dem Wilcoxon-Rangsummentest . Das vorgegebene

Signifikanzniveau wurde bei 0.05 angelegt. Tabelle 7 enthält 41 Antigene, die sowohl in der SSc Kohorte I, die zur

Entdeckung der Marker verwendet wurde (Bespiel 6) , als auch in der SSc Kohorte II einen p-Wert kleiner als das festgelegte Signifikanzviveau 0.05 erreichten. Für den Vergleich aller SSc Proben gegen Gesundkontrollen (HC) erreichten 31 Marker einen p-Wert kleiner als 0.05. Für den Vergleich aller SSc Proben gegen eine zusammengefasste Gruppe aus Serumproben

verschiedener rheumatoider Erkrankungen (AD) erreichten 24 Marker einen p-Wert kleiner als 0.05.

Tabelle 7: Zusammenfassung der p-Werte (Wilcoxon- Rangsummentest ) für 41 Marker für die Diagnose von SSc in der SSc Kohorte II

SSc vs HC SSc vs AD

Mar Gene Symbol SSc Scl70 & dSSc lSSc SSc ker CENPB

Nr neg

1 KDM6B 3.09E-10 1.33E-03 6.13E-05 2.02E-08 2.25E-02

2 BICD2 4.19E-03 6.48E-01 7.77E-01 5.11E-04 7.37E-01

3 NSUN5 1.62E-05 4.06E-01 9.41E-01 4.30E-06 5.04E-03

4 RTEL1 1 -28E-03 3.69E-01 4.16E-01 4.32E-04 7.74E-02

8 TRIM21 5.30E-09 1.51E-05 1.65E-06 5.90E-07 3.88E-01

9 ABCB8 1.81E-03 8.10E-01 3.37E-01 1.13E-02 1.02E-02

10 AVE 2.06E-03 7.33E-01 4.37E-01 1.83E-03 7.88E-02

13 CENPA 2.31E-04 3.02E-01 3.03E-01 8.03E-05 1.92E-03

14 CENPC 4.17E-11 5.64E-03 2.25E-02 5.14E-10 5 · 01E ö 7

15 CENPT 7.50E-02 4.61E-01 8.25E-01 1.05E-02 1.98E-02

18 GYSI 1.99E-02 2.91E-02 3.40E-01 2.07E-02 8.24E-01

22 MARVELD2 3.77E-02 1.84E-01 1.26E-01 1.71E-01 X 78E ö 2

27 PMF1 4 , 96E-02 9.77E-01 3.39E-01 3.28E-01 3 · 60E ö 2

30 TTLL3 2.01E-02 1.30E-01 9.82E-01 2.04E-02 9.67E-01

40 ALPK1 1.07E-02 1 , 90E-03 5.15E-02 5.65E-02 7.13E-01 44 ATP13A2 1. S3E-Ö2 7.52E-02 6.30E-01 1.61E-02 3.62E-01

48 C19orf52 8.67E-03 1.70E-01 7.77E-01 3.51E-02 5.48E-03

75 LTF 7.97E-03 4.52E-01 7.16E-01 3.10E-03 9.21E-01

92 STM 4 5.50E-05 6.47E-04 3.64E-03 7.59E-04 3.06E— 02

108 ACBD6 4.17E-03 3.71E-01 2.99E-01 6.41E-03 4.02E-02

115 CBX3 2 , 66E-03 5.41E-01 2.33E-01 3.48E-02 4.45E-03

118 CENPH 2.27E-01 1.78E-01 5.44E-01 4.22E-02 2.19E-02

123 EIF4E 2 , 78E-02 9.74E-01 6.72E-01 1.52E-02 2.54E-04

134 GTF2F1 1.07E-04 4.08E-02 3.28E-02 6.88E-05 2.30E-01

137 ISY1 2.19E-02 2.06E-02 4 , 30E-02 1.35E-01 3.65E-01

138 KDR 3.68E-02 1.77E-01 4.65E-02 4.22E-01 3.39E-04

140 MAPT 2.50E-04 5.34E-01 2.76E-01 2 , 63E-05 7.82E-01

155 CENPB 4.27E-12 7.99E-01 8.41E-03 6.90E-11 2.91E-09

158 SSB 9.04E-02 1.56E-01 6.06E-01 3.07E-02 2.61E-01

213 DIP2C 2 , 44E-02 5.27E-02 5.08E-01 8.26E-03 1.87E-01

224 TIMM10B 4.05E-02 5.16E-03 3.86E-02 2.42E-01 3.51E-01

227 HNRNPA1 1 , 48E-02 2.54E-02 1 , 67E-03 1.28E-01 7.77E-01

229 HSBP1L1 2.45E-02 1.03E-01 1.91E-02 2.88E-01 1.05E-01

232 KARS 1.25E-02 5.71E-03 2.85E-02 1.12E-01 8.70E-03

257 PBXIP1 6.43E-06 2.08E-01 2.49E-01 8.61E-05 3.83E-01

290 ZNF431 3.94E-02 3.68E—02 1.59E-01 9.45E-02 4.67E-02

292 NEFL 6.97E-03 6.01E-02 9.19E-02 3.95E-02 8.50E-01

293 STMN1 6.1 IE—05 6.13E-04 3.69E-03 8.75E-04 4.19E-03

295 PPP1R2 1.19E-02 7.79E-01 3.69E-01 6.39E-02 1.98E-01

297 SSRP1 4.79E-02 7.17E-01 7.91E-01 2.02E-02 4.19E-03

314 T0P1 6.19E-07 4.23E-01 6.94E-05 4.10E-05 4.96E-07

Beispiel 12: Anwendung von Autoant ikörper-Panels zur Diagnose von SSc

Aus den in Tabelle 2 und Tabelle 7 enthaltenen Markern wurden verschiedene Markerkombinationen mittels logistischer

Regressionsmodelle getestet. Dabei wurde als Vorgabe die

Spezifität gegenüber der Kontrollgruppe auf mindestens 95% gesetzt. Eine Übersicht über die in den Panels 1,3-8

verwendeten Antigene ist in Tabelle 8 enthalten. Zusätzlich wurde ein diagnostisches Panel 9 unter Verwendung aller Marker aus Tabelle 2 gerechnet. Die Panels 1,3,4,5 und 9 eignen sich bevorzugt zur Diagnose aller SSc Patienten, unabhängig von der jeweiligen Subform. Die AUC (Area under the Curve) der Panels 1,3,4,6 und 9 ist in Tabelle 8 für 2 unabhängige SSc Probenkollektive (Kohorte I und Kohorte II) angegeben.

Panel 1 besteht aus den üblicherweise diagnostisch verwendeten Antigenen Scl70(Topl) und CENPB und erreicht eine AUC von 0.81 in Kohorte I und 0.85 in Kohorte II für den Vergleich SSc versus Gesund (HC) .

Panel 3 besteht aus aus zwei diagnostischen Antigenen, CENPB und Scl70, und zwei neuen SSc Antigenen, KDM6B und BICD2.

Gegenüber dem üblicherweise verwendeten Markern des Panels 1 zeigt ein logistisches Model für das Panel 3, eine deutlich höhere AUC für den Vergleich SSc versus Gesund (HC) : für

Kohorte I 0.88 gegenüber 0.81 und für Kohorte II 0.87

gegenüber 0.85.

Panel 4 basiert auf Panel 3 und enthält zwei weitere neue Marker, NSUN5 und PPP1R2. Ein logistisches Regressionsmodel für das Panel 4 erreicht für die Diagnose von SSc im Vergleich zu Gesundproben für die Kohorte I eine AUC von 0.9 und für die Kohorte II eine AUC von 0.85.

Panel 5 basiert auf Panel 4 und enthält neben den

diagnostischen Markern CENPB und Scl70, die Marker KDM6B, BICD2, NSUN5, PPP1R2, RTEL1, TRIM21, ABCB8, AVEN,

CENPA, CENPC1, GYSI, MARVELD2, PMF1, TTLL3, ATP13A2, LTF,

STMN4, ACBD6, GTF2F1, KDR, DIP2C, FXC1, HNRNPA1, HSBP1L1, KARS, PBXIP1, ZNF431, STMN1 und SSRP1.

Tabelle 8: Zusammensetzung der Marker-Panels

CENPB &

Diagnose SSc Scl70 dSSc lSSc neg.

Gene

# PI P3 P4 P5 P6 P7 P8

Symbol

155 CENPB X X X X X

314 TOP1 X X X X X X

1 KDM6B X X X X X X

2 BICD2 X X X X 3 NSUN5 X X X

4 RTEL1 X X

8 TRIM21 X X X X

9 ABCB8 X X

10 AVEN X X

13 CENPA X X

14 CENPC1 X X X

15 CENPT X

18 GYSI X X X

22 MARVELD2 X

27 PMF1 X

30 TTLL3 X

40 ALPK1 X

44 ATP13A2 X

48 C19orf52 X

75 LTF X

92 STM 4 X X X

108 ACBD6 X X

115 CBX3 X

118 CENPH X

123 EIF4E X

134 GTF2F1 X X

137 ISY1 X

138 KDR X

140 MAPT X

158 SSB X

213 DIP2C X X

224 FXC1 X

227 HNRNPA1 X X X

229 HSBP1L1 X

232 KARS X

257 PBXIP1 X X

290 ZNF431 X

292 NEFL X

293 STMN1 X X X

295 PPP1R2 X X

297 SSRP1 X X

Beispiel 13: Anwendung von Autoantikörper-Panels zur

Identifizierung von Patienten mit fehlendem Nachweis von anti- Zentromer und anti-Scl70 (Topl)- Autoantikörpern .

Wie in Tabelle 6 dargelegt, testeten nur etwa 41% der SSc Patienten aus der SSc Kohorte II positiv für anti-CENPB Antikörper und 25.3% positiv für anti-Scl70 Antikörper. Da in der Literatur sehr wenige Patienten mit doppelt-positiver Reaktivität beschrieben worden sind, wird der Anteil an anti- CENPB und anti-Scl70 negativen Patienten mit etwa 30%

angegeben. Um diese diagnostische Lücke zu schließen, wurde ein logistisches Regressionsmodel für Panels 6, das aus 7 Markern besteht erstellt.

Panel 6 enthält die Marker KDM6B, TRIM21, GYSI, ALPK1, STMN4, HNRNPA1, STMN1.

Wie in Tabelle 6 zusammengefasst wurde mit den Markern des Panels 6 in der Kohorte I eine AUC von 0.91 und für Kohorte II eine AUC von 0.84 erreicht.

Beispiel 14: Anwendung von Autoantikörper-Panels zur

Identifizierung von SSc Patienten mit diffuser Form

Wie in Tabelle 6 dargelegt wurden 36.8% der SSc Patienten mit diffuser SSc (dSSc) und 25.3% der Patienten mit limitierter Form positiv für Autoantikörper gegen Scl70 (Topl) getestet. Dies zeigt, dass anti-Scl70 Antikörper zwar mit der diffusen Form assoziiert sind, aber nicht spezifisch sind. Zur Diagnose der diffusen Form werden daher zusätzliche Marker benötigt. Panel 7 umfasst 6 Marker, die besonders zur Diagnose der diffusen SSc geeignet sind.

Panel 7 enthält die Marker KDM6B, TOP1, TRIM21, CENPC1, ISY1, HNRNPA1.

Für Panel 7 wurde mittels einer logistischen Regression eine AUC von 0.81 für Kohorte I und 0.87 für Kohorte II berechnet.

Beispiel 15: Anwendung von Autoantikörper-Panels zur

Identifizierung von SSc Patienten mit limitierter Form

Wie in Tabelle 6 dargelegt wurden 41% der SSc Patienten mit limitierter SSc(lSSc) und 8.8% der Patienten mit diffuser Form positiv für Autoantikörper gegen CENPB getestet. Dies zeigt, dass anti-CENPB Antikörper zwar mit der limitierten Form assoziiert sind, aber nicht spezifisch sind. Zur Diagnose der limitierten Form werden daher zusätzliche Marker benötigt. Panel 8 umfasst 27 Marker, die besonders zur Diagnose der limitierten SSc geeignet sind.

Panel 8 umfasst die Marker KDM6B, BICD2, NSUN5, CENPB, TOP1, RTEL1, TRIM21, ABCB8, AVEN, CENPA, CENPC1, CENPT, GYSI,

C19orf52, STMN4, ACBD6, CBX3, CENPH, EIF4E, GTF2F1, MAPT, SPTAN1, DIP2C, PBXIP1, NEFL, STMN1, SSRP1.

Für Panel 8 wurde mittels einer logistischen Regression eine AUC von 0.97 für Kohorte I und 0.99 für Kohorte II berechnet.

Tabelle 9: AUC der SSc Panels in der SSc Kohorte I und Kohorte II

Beispiel 16: ELISA für die Bestimmung von anti-KDM6B

Antikörpern in der Systemsklerose Entsprechend der Erfindung wurde rekombinant hergestelltes und verbessertes KDM6B Protein (Seq ID 315) , welches die

Aminosäuren 42-421 de Uniprot Datenbank Eintrags 015054 umfasst. KDM6B wird über mehrere Stufen mittels Nickelchelat- Affinitäts Chromatographie, Größenausschlusschromatographie und Ionentauscher Chromatographie aufgereinigt . Anschließend wurde das aufgereinigte KDM6B in einer Konzentration von 1 pg pro Milliliter in einem Na-Karbonatpuffer pH 9.0 auf eine Flachboden ELISA Platte (beispielsweise NUNC) mit ΙΟΟμΙ pro Kavität aufgebracht und 4h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert.

Nach der Inkubation wurde der überschüssige Puffer entfernt und die freien Bindungsstellen der ELISA Platte wurden mit einem Inert-Protein (Kalt-Wasserfisch-Gelantine) in PBS für lh bei Raumtemperatur blockiert.

Serum oder Plasmaproben wurden 1:101 in HBS-T Puffer verdünnt in die Kavitäten aufgebracht und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit binden die KD6MB spezifischen IgG Autoantikörper aus der Serum oder Plasma Probe an das gebundene Protein.

Unspezifisch-gebundene Antikörper werden nach der Inkubation durch zweimaliges Waschen mit einem PBS Tween Puffer entfernt. Es folgt eine halbstündige Inkubation mit einem HRP (Horse- Radish-Peroxidase-konjugierten) anti-human IgG

Detektionsantikörper . Wiederum werden nach der Inkubation unspezifische Bindungspartner durch zweimaliges waschen mit PBS-Tween-Puffer entfernt.

Die kolorimetrische Nachweis Reaktion erfolgt durch Zugabe eines TMB (Tetra Methylbenzidin) Substrats. Diese Reaktion wird nach 15 Minuten durch Zugabe eine IM Schwefelsäure gestoppt, und in einem ELISA Messgerät (TECAN) bei einer

Wellenlänge von 450nm vs 620nm ausgewertet. Die farbliche Intensität (optische Dichte, OD) der Nachweis Reaktion ist direkt proportional zur Konzentration der KDM6B-spezifischen IgG Autoantikörper in der Serum oder Plasma Probe.

Die Auswertung des Tests erfolgt semi-quantitativ über eine ein-Punkt Kalibration.

Die OD-Werte des anti-KDM6B ELISAS wurden zur Berechnung der p-Werte mittels Wilcoxon-Rangsummentest und der Berechnung eines logistischen Regressionsmodells mit ROC-Analyse für den Vergleich SSc gegen HC herangezogen. Da die Gruppe der SSc- Patienten größer als die der Kontrollgruppe HC ist, wird für die logistische Regression ein Random Under-Sampling

durchgeführt, sodass die SSc Kohorte II gleich große Gruppen hat. Die ROC-Analyse wurde berechnet, indem aus diesem

verkleinerten Datensatz der SSc Kohorte II 75% zum Trainieren und 25% zum Testen des Modells verwendet werden. Dieser Ansatz wird 100 Mal wiederholt.

Tabelle 10 zeigt die p-Werte für den Vergleich SSc versus Gesundkontrollen und SSc versus Autoimmunkontrollen, welcher aus Proben der SSc Kohorte II berechnet wurde.

Tabelle 11 zeigt die empirisch kalkulierte Fläche unter der Kurve (AUC) , Sensitivität und Spezfität des anti-KDM6B ELISAS für die Diagnose SSc (SSc Kohorte II) im Vergleich zu

Gesundproben .

Figur 12 zeigt ROC Kurve für ein logistisches Regressionsmodel basierend auf den ELISA OD Werten von KDM6B für die Diagnose von SSc im Vergleich zu Gesundkontrollen.

Beispiel 17: ELISA für die Bestimmung von anti-BICD2

Antikörpern in der Systemsklerose

Entsprechend der Erfindung wurde rekombinant hergestelltes BICD2 Protein über mehrere Stufen mittels Nickelchelat- Affinitäts Chromatographie, Größenausschlusschromatographie und Ionentauscher Chromatographie aufgereinigt . Anschließend wurde das aufgereinigte BICD2 in einer Konzentration von 1,7 pg pro Milliliter in einem Na-Karbonatpuffer pH 9.0 auf eine Flachboden ELISA Platte (beispielsweise NUNC) mit ΙΟΟμΙ pro Kavität aufgebracht und 4h bei RT inkubiert.

Nach der Inkubation wurde der überschüssige Puffer entfernt und die freien Bindungsstellen der ELISA Platte werden mit einem Inert-Protein (Kalt-Wasserfisch-Gelantine) in PBS für lh bei Raumtemperatur blockiert.

Serum oder Plasmaproben wurden 1:101 in HBS-T Puffer verdünnt in die Kavitäten aufgebracht und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Während dieser Zeit binden die BICD2-spezifischen IgG Autoantikörper aus der Serum oder Plasma Probe an das gebundene Protein.

Unspezifisch-gebundene Antikörper werden nach der Inkubation durch zweimaliges Waschen mit einem PBS Tween Puffer entfernt. Es folgt eine halbstündige Inkubation mit einem HRP (Horse- Radish-Peroxidase-konjugierten anti-human IgG

Detektionsantikörper . Wiederum werden nach der Inkubation unspezifische Bindungspartner durch zweimaliges waschen mit PBS-Tween-Puffer entfernt.

Die kolorimetrische Nachweis Reaktion erfolgt durch Zugabe eines TMB (Tetra Methylbenzidin) Substrats. Diese Reaktion wird nach 15 Minuten durch Zugabe eine IM Schwefelsäure gestoppt, und in einem ELISA Messgerät (TECAN) bei einer

Wellenlänge von 450nm vs 620nm ausgewertet. Die farbliche Intensität der Nachweis Reaktion ist direkt proportional zur Konzentration der BICD2-spezifischen IgG Autoantikörper in der Serum oder Plasma Probe.

Die OD-Werte des Antigens BICD2 wurde zur Berechnung der p- Werte mittels Wilcoxon-Rangsummentest und der Berechnung von die Receiver Operator Kurven (ROC) herangezogen.

Die OD-Werte des anti-BICD2 ELISAS wurden zur Berechnung der p-Werte mittels Wilcoxon-Rangsummentest und der Berechnung eines logistischen Regressionsmodells mit ROC-Analyse für den Vergleich SSc gegen HC herangezogen. Da die Gruppe der SSc- Patienten größer als die der Kontrollgruppe HC ist, wird für die logistische Regression ein Random Under-Sampling

durchgeführt, sodass die SSc Kohorte II gleich große Gruppen hat. Die ROC-Analyse wurde berechnet, indem aus diesem

verkleinerten Datensatz der SSc Kohorte II 75% zum Trainieren und 25% zum Testen des Modells verwendet werden. Dieser Ansatz wird 100 Mal wiederholt.

Tabelle 10 zeigt die p-Werte für den Vergleich SSc versus Gesundkontrollen (HC) und SSc versus Autoimmunkontrollen (AD) , welcher aus Proben der SSc Kohorte II berechnet wurde.

Tabelle 10: Wilcoxon-Rangsummentest (p-Wert) für den anti- KDM6B und anti-BICD2 ELISA für die Diagnose von SSc im

Vergleich zu Gesundkontrollen.

Figur 11 zeigt den Boxplot des BICD2 ELISAS für SSc Proben im Vergleich zu Gesundproben.

Tabelle 11 zeigt die empirisch kalkulierte Fläche unter der Kurve (AUC) , Sensitivität und Spezfität für den anti-BICD2 ELISA. Die Berechnung wurde für Proben der SSc Kohorte II und Gesundproben durchgeführt.

Tabelle 11: Empirisch kalkulierte, Sensitivität und Spezifität des anti-KDM6B und anti-BICD2 ELISAS für die SSc Kohorte II für die Diagnose SSc im Vergleich zu Gesundkontrollen

ELISA Test Wert

anti-KDM6B AUC 0.63

Sensitivität 0.19

Spezifität 0.90

anti-BICD2 AUC 0.64

Sensitivität 0.19

Spezifität 0.95 Figur 12 zeigt ROC Kurve mit Konfidenzbändern für ein logistisches Regressionsmodel basierend auf den ELISA OD

Werten von BICD2 für die Diagnose von SSc im Vergleich zu Gesundkontrollen .

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