<γδT細胞の調製>
 健常人ドナー及び担がん被験者から血液を� ��取し、フィコールパック(アマシャム バイ� ��サイエンス社)を用いた密度勾配遠心法によ り末梢血単核球(Peripheral Blood Mononuclear cell� �以下PBMCという)を回収した。

 PBMCを10%となるようにヒトAB血清(Cambrex)を� ��加したRPMI1640培地(Cambrex)に、さらに700IU/mLの IL-2(カイロン)及び1μMのゾレドロネート(商品� ��ゾメタ 登録商標、ノバルティス)を添加し� ��14日間培養した。

 10~14日間培養するとエフェクター細胞中� �含まれるγδT細胞は70~95%となった。

 代表的なCD16陽性γδT細胞の増殖を図1Aに示� �た。培養7日目までは総γδT細胞数の増加を� �めたが、γδT細胞のCD16陽性率は低かった。� �れに続く14日目までの期間は緩やかに総γδT� ��胞数が増加したが、そのうちCD16陽性である ものの割合が急速に増加した(図1A)。1×10 ⁷ 個のPBMCを14日間培養することにより、平均9.7 ×10 ⁷ 個のγδT細胞を得たが、平均4.5×10 ⁷ 個がCD16陽性γδT細胞であった。総γδT細胞の� ��殖比は平均250倍であったが、CD16陽性γδT細� ��の増殖比は平均430倍であり、CD16陽性γδT細� ��をより効率良く増殖させることが出来た(図 1B, n=10)。培養後のγδT細胞に占めるCD16陽性� �胞の割合は、健常人で平均47%(n=5)、坦がん患 者で平均40%(n=5)であり、この方法が坦がん患� ��においてもCD16陽性γδT細胞を効率良く増殖� ��せることが出来ることが確認された(図1C)。

 機能解析の実験を行う際には、事前にエ� ��ェクター細胞群から磁気ビーズシステムmini MACS(ミルテニーバイオテク)を用い、必要に応 じてCD4陽性細胞、CD8陽性細胞及びCD56陽性細� �を除去してγδT細胞の精製を行った。

<細胞株の準備>
 CD20陽性リンパ腫細胞株としてDaudi、Raji及び Ramos細胞株、HER2陽性乳がん細胞としてSK-BR3、 HER2陰性がん細胞(ネガティブコントロール)と してMDA-MB231をATCC(American Type Culture Collection)� ��ら入手して標的がん細胞として使用した。� ��胞株は10%ウシ胎児血清(インビトロジェン、 Fatal Calf Serum、以下FCSという)を含むRPMI1640培 地により37℃、5%CO ₂ 環境下で培養した。付着性細胞を培養容器か らはがす際には0.05M EDTAを使用した。

<がん細胞の準備>
慢性リンパ球性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemi a、以下CLLという)の患者から採血し、密度勾� ��遠心法によりPBMCを取得した。これらの患者 の末梢リンパ球数は正常の10倍程度に増加し� ��おり、そのほとんどががん細胞であること� ��確認され、これを標的がん細胞として用い� ��。

 濾胞性B細胞リンパ腫(Follicular B cell Lymph oma)の患者由来のリンパ節生検組織を得た。� �時に行った組織学的検査により、リンパ節� �大部分はがん細胞で占められていることが� �認された。このリンパ節生検組織を少量のRP MI1640培地内で小切片に分け、ナイロン製のセ ルステイナー(BDバイオサイエンス)とプラン� �ャーを用いて、単細胞の懸濁液を調製し、� �れを標的がん細胞として用いた。

<非付着性がん細胞に対する細胞傷害活性&g t;
 標的細胞としてDaudi、Raji及びRamos細胞株、CL L患者又はNHL(非ホジキンリンパ腫;Non-Hodgkin’s  Lymphoma)患者から取得したがん細胞を使用し� ��標的細胞と反応細胞を区別するために、標� ��細胞をPKH-26(PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit 、SIGMA)で染色した。

 γδT細胞と標的細胞の比(以下E:Tと表す)が1:1 ~25:1となるように48wellプレートに播種し、37� �、5%CO ₂ 濃度条件下で4時間共培養を行った。共培養� �際、ヒトIgG抗体(シグマ-アルドリッチ)を10μg /mL添加した群、リツキシマブ(ロシュ)を10μg/m L添加した群、抗体を添加しない群を準備し� �。また、標的細胞にリツキシマブのみを添� �した群も準備した。

 共培養した細胞を回収し、アポトーシス� ��初期および後期段階を同定するAnnexinVと、� �ポトーシス後期およびネクローシスを同定� �る7AAD(ANNEXIN V/7AAD KIT、ベックマン・コール� ��ー)により染色し、それぞれのがん細胞株又 はがん細胞に対する細胞傷害活性をFACSによ� �測定した。FACS解析においてPKH-26陽性細胞に� ��ートをかけることで標的がん細胞の受けた� ��胞傷害のみを解析することができる。

 Ann+はAnnexinVの蛍光を発色していた細胞数、A nn-は発色していない細胞数を示す。また、7AA D+は7AADの蛍光を発色していた細胞数、7AAD-は� ��色していなかった細胞数を示している。す� ��わち、Ann-7AAD+はネクローシスを起こしてい� ��細胞、Ann+7AAD+はアポトーシス後期である細� ��、Ann+7AAD-はアポトーシス初期である細胞、A nn-7AAD-は生存している細胞であることを示す� ��
なお、細胞傷害活性の値は下記の式により算 出した。

 図2に示すように、CD20陽性リンパ腫細胞� �Daudiに対して、リツキシマブとCD16陽性γδT細 胞を多く含む同種γδT細胞(患者由来)を併用� �ることにより、それぞれを単独で使用する� �合よりも有意に高い細胞傷害活性を得るこ� �が可能であった(併用時の細胞傷害活性はリ� ��キシマブ単独投与時の10倍、γδT細胞単独投 与時の2倍、E:T=5:1、n=10)。CD20陽性リンパ腫細� ��株Raji及びRamosにおいても同様の傾向を認め� ��(それぞれ20倍と17倍、3.5倍と2.5倍、E:T=5:1)。

また、図3に示すように、CLL患者より得た� �ん細胞を標的とした場合も、リツキシマブ� �CD16陽性γδT細胞を多く含む同種γδT細胞(他� �者由来)を併用することにより、それぞれを� ��独で使用する場合よりも有意に高い細胞傷� ��活性を得ることが可能であった(併用時の細 胞傷害活性はリツキシマブ単独投与時の3倍� �γδT細胞単独投与時の6倍、E:T=5:1)。

さらに、図4に示すように、濾胞性B細胞リ� ��パ腫の患者由来がん細胞を標的として自家� �δT細胞(患者本人由来)を用いた場合、リツキ シマブとCD16陽性γδT細胞を多く含むγδT細胞� ��併用することにより、それぞれを単独で使� ��する場合よりも有意に高い細胞傷害活性を� ��ることが可能であった(併用時の細胞傷害活 性はリツキシマブ単独投与時の7倍、γδT細胞 単独投与時の2倍、E:T=5:1)。

<付着性がん細胞に対する細胞傷害活性>
 標的細胞としてSK-BR3とMDA-MB-231を使用し、Cel lTiter96(プロメガ社)の解説に従いtetrazolium base d assay(MTS assay)を行った。MTS(テトラゾリウム 化合物)は生細胞によって生物的に還元され� �組織培養液に可溶な発色性のホルマザン産� �へと変換されるため、この発色の吸光度を� �定することにより共培養後の標的細胞生存� �および傷害率が測定可能となる。

 SK-BR3、MDA-MB-231を96穴プレートに1×10 ⁴ 個/wellとなるように播種し、37℃で一昼夜培� �して接着させた。γδT細胞と標的細胞の比が E:T=1:1~25:1となるようにγδT細胞を添加し、共� ��養を4時間行った。共培養の際、ヒトIgG抗体 を2μg/mL添加した群、トラスツズマブ(ロシュ) を2μg/mL添加した群、抗体を添加しない群を� �備した。また、標的細胞にトラスツズマブ� �みを添加した群も準備した。

 共培養の後、培地及び培地中に浮遊して� ��る細胞を取り除き、MTSテトラゾリウム塩(317  μg/ml)を含む新しい培地を加えた。

 3時間の反応後、Multiskan Ascent microplate reade r(Thermo)を用いて490nmに対する光学密度(Optical  Density、以下ODという)を測定した。
 細胞傷害活性は以下の式により算出した。

 図5に示すように、HER2陽性乳がん細胞株SK -BR3に対して、トラスツズマブとCD16陽性γδT� �胞を多く含む同種γδT細胞(患者由来)を併用� ��ることにより、それぞれを単独で使用する� ��合よりも有意に高い細胞傷害活性を得るこ� ��が可能であった(併用時の細胞傷害活性はト ラスツズマブ単独投与時の15倍、γδT細胞単� �投与時の11倍、E:T=5:1、n=8)。しかし、HER2陰性 乳がん細胞株MDA-MB231においては、併用効果は ほとんど見られなかった。

<HER2発現細胞株に対する細胞傷害活性>
 標的細胞としてHER2高発現乳がん細胞株であ るBT474(ATCCより購入)を使用し、ADCC活性の測定 を行った。BT474をRPMI1640(10%FBS:Fetal Bovine Serum) で1×10 ⁶ cells/mLに調製し、Calcein AM(同仁科学)10μg/mLで3 7℃、30分染色後洗浄し、トラスツズマブ(商� �名:ハーセプチン、中外製薬)0.2μg/mLを添加し た群と添加しない群を準備した。それぞれの 群を96 well plate(Coster)に1×10 ⁴ cells/wellで播種した。そこへCD16を発現したγδ T細胞を多く含む細胞集団を標的細胞に対し� �1:1~25:1となるように播種し、37℃、5%CO ₂ 条件下で4時間共培養を行った。
 次いで1時間ごとのターゲット細胞の蛍光強 度を測定、0時間測定時の蛍光強度からの残� �率を算出し、下記の式により細胞傷害活性� �求めた。

図6に示すようにHER2陽性乳がん細胞株BT474� �対して、トラスツズマブとビスホスホネー� �とIL-2とで活性化及び/又は増殖させたγδT細� ��を併用することにより、ビスホスホネート� ��IL-2とで活性化及び/又は増殖させたγδT細胞 を単独で使用する場合よりも高い細胞傷害活 性を得ることが可能であった。

<トラスツズマブの濃度依存性>
SK-BR3を96穴プレートに1×10 ⁴ cells/wellとなるように播種し、37℃で一昼夜培 養して接着させた。CD16を発現したγδT細胞を 含む細胞集団と標的細胞のE:Tが1:1~25:1となる� ��うにγδT細胞を添加し、共培養を4時間行っ� ��。共培養の際、トラスツズマブを0.001~1μg/mL 添加した群と添加しない群を準備した。

 共培養の後、培地及び培地中に浮遊して� ��る細胞を取り除き、MTSテトラゾリウム塩(317  μg/ml)を含む新しい培地を加えた。

 3時間の反応後、Multiskan Ascent microplate re ader(Thermo)を用いて490nmに対するODを測定した� �また、細胞傷害活性は(数2)の式により算出� �た。

図7に示すように、ビスホスホネートとIL-2� ��で活性化及び/又は増殖させたγδT細胞はHER2 陽性乳がん細胞株SK-BR3に対して、トラスツズ マブの濃度が0.1μg/mL以上の濃度において高い ADCC活性を得ることが可能であった。ハーセ� �チンの添付文書によると、ハーセプチンと� �与時の血中動態は承認されている初回投与� �の4mg/kgを投与した場合最高血中濃度は72±17μ g/mL、2回目以降の2mg/kgを投与した場合は最高� ��中濃度は43±8.5μg/mLであるから、γδT細胞は� ��分にADCC機能を発揮することができる。また 、ハーセプチン濃度が0.1μg/mLでもγδT細胞はA DCC機能を発揮できることからハーセプチンと γδT細胞と組み合わせた医薬では、モノクロ� ��ナル抗体治療薬の投与量を少なくしても(ハ ーセプチンの最高血中濃度と本実施例濃度を 比較すると約1/700~1/400)、ほぼ同等の細胞傷害 活性効果が得られることが示唆された。

<リツキシマブの濃度依存性>
 標的細胞としてCD20陽性細胞株であるDaudiとR ajiを使用し、標的細胞と反応細胞を区別する ために、標的細胞をPKH-26で染色した。

 CD16陽性γδT細胞を多く含む細胞集団と標的� ��胞のE:Tが5:1、10:1となるように48wellプレート に播種し、37℃、5%CO ₂ 濃度条件下で4時間共培養を行った。共培養� �際、リツキシマブ(商品名:リツキサン、全薬 工業、中外製薬)を0.01~10μg/mL添加した群と添� ��しない群を準備した。

 共培養した細胞を回収し、ANNEXIN V/7AAD KI Tにより染色し、それぞれのがん細胞株に対� �る細胞傷害活性をFACSにより測定した。また� ��細胞傷害活性の値は(数1)の式により算出し� ��。

図8に示すように、ビスホスホネートとIL-2� ��で活性化及び/又は増殖させたγδT細胞はCD20 陽性リンパ腫細胞株DaudiとRajiに対して、リツ キシマブの濃度が0.1μg/ml以上の濃度において 高いADCC活性を得ることが可能であった。

<γδT細胞とモノクローナル抗体治療薬を併 用する場合の適時性>
 標的細胞としてCD20陽性細胞株であるRajiを� �用し、標的細胞と反応細胞を区別するため� �、標的細胞をPKH-26で染色した。

 CD16陽性γδT細胞を多く含む細胞集団と標的� ��胞のE:Tが1:1~25:1となるように48wellプレート� �播種し、37℃、5%CO ₂ 濃度条件下で4時間共培養を行った。共培養� �際、リツキシマブの血中濃度域でγδT細胞と リツキシマブが同時に存在することを想定し 、0.1~200μg/mL添加した群と添加しない群を準� �した。実際にリツキシマブを通常用量で投� �した場合、得られる最高血中濃度は194.3±58.3 μg/mLである(リツキサンインタビューフォー� �より抜粋)。

 また、共培養の際、あらかじめ標的細胞� ��リツキシマブを10μg/mLで、4℃、30分間処理� �た後にリツキシマブを洗浄除去した群、リ� �キシマブを10μg/mL添加した群と添加していな い群を準備した。

 図9に示すように、ビスホスホネートとIL- 2とで活性化及び/又は増殖させたγδT細胞は� �ツキシマブの濃度が0.1~200μg/mLの条件下にお� ��て同程度のADCC活性を有していることが確認 された。このことから、リツキシマブが高濃 度に存在していてもγδT細胞によるADCC活性に 影響を与えないことが示され、γδT細胞とリ� ��キシマブを同時に投与できる可能性が示さ� ��た。

 また、リツキサンの添付文書によると、� ��ツキサン投与時の血中動態は、最高血中濃� ��194.3±58.3μg/mLであるから、γδT細胞は十分に ADCC機能を発揮することができる。また、リ� �キサン濃度が0.1μg/mLでもγδT細胞はADCC機能� �発揮できることからリツキシマブとγδT細胞 と組み合わせた医薬では、モノクローナル抗 体治療薬の投与量を少なくしても(リツキサ� �の最高血中濃度と本実施例濃度を比較する� �約1/2000)、ほぼ同等の細胞傷害活性効果が得� ��れることが示唆された。

 図10に示すように、標的細胞にリツキシ� �ブを処理し洗浄した群とリツキシマブが共� �している群に傷害活性の差は確認されず、γ δT細胞単独よりも高い傷害活性を有している ことが確認された。このことから、リツキシ マブをあらかじめ投与し、腫瘍細胞とリツキ シマブが結合した条件下に、γδT細胞を投与� ��ることにより高い傷害活性が期待できるこ� ��が示された。洗浄した群とリツキシマブが� ��存している群と傷害活性の差が確認されな� ��ったことから、γδT細胞とモノクローナル� �体治療薬は混合して同時に投与しても、先� �モノクローナル抗体治療薬を投与してその� �にγδT細胞を投与する時間差投与しても細胞 傷害活性を示すことが示唆された。