MéTODO PE ANáLISIS DE EXPRESIóN DIFERENCIAL EN CáNCER COLORECTAL

MEMORIA DESCRIPTIVA

OBJETO DE LA INVENCIóN

La presente invención se refiere a un método de análisis de Ia expresión diferencial basado en Ia sobreexpresión de proteínas del complejo condensina y proteínas asociadas en pacientes de cáncer colorectal que puede ser utilizado como criterio de diagnóstico de dichos tumores así como en Ia prevención y tratamiento de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIóN

En términos absolutos, el cáncer es Ia segunda causa de muerte en España. De entre los múltiples tipos de cáncer destaca el cáncer colorectal que causó el 11% de las defunciones por cáncer en hombres y el 15% en mujeres según los datos de 1999. En España se estima que el número de casos nuevos por año se sitúa en torno a los 18.000 en ambos sexos frente a 11.300 defunciones. Los tumores de colon y recto suelen analizarse conjuntamente debido a los frecuentes errores de clasificación de los tumores de Ia porción recto-sigmoide. La mortalidad es muy elevada, constituyendo Ia segunda localización tumoral en importancia en hombres y en mujeres, con una tendencia temporal ascendente (2,2% anual en hombres y 0,7% en mujeres). En Ia actualidad Ia mortalidad es más alta en hombres, aunque en los años 60 Io era más en mujeres.

En estos tumores los datos de mortalidad no reflejan Ia verdadera incidencia de Ia enfermedad, ya que Ia supervivencia ha mejorado en los últimos años, principalmente en personas jóvenes. La tendencia a la estabilización de Ia mortalidad puede reflejar las mejoras terapéuticas obtenidas con un diagnóstico precoz, por tratarse de tumores bastante accesibles a Ia exploración con sigmoidoscopio y a Ia generalización de las colonoscopias completas en grupos de riesgo identificados.

El riesgo acumulativo durante Ia vida de contraer Ia enfermedad es del 5-6%, estando influenciado por hábitos de vida y factores hereditarios. La forma de cáncer colorectal

más frecuente es el de tipo esporádico (90%) existiendo casos con componentes hereditarios: Ia poliposis adenomatosa familiar (0,01 %) y el cáncer colorectal hereditario no-polipósico (5-10%). Estos últimos son causados por síndromes familiares definidos por unos pocos genes. Sin embargo, los genes responsables de los cánceres esporádicos permanecen sin identificar. Se considera que el desarrollo tumoral colorectal es posiblemente Ia consecuencia de una serie de eventos moleculares que se inician con una o varias mutaciones o eventos epigenéticos y sigue con fenómenos de progresión, en los que pueden estar involucrados factores tanto genéticos como ambientales.

En general, el cáncer colorectal no suele dar síntomas hasta fases avanzadas de crecimiento en Ia pared intestinal, por Io que se hace necesaria Ia identificación de nuevos genes y/o mutaciones responsables y/o indicadores de este tipo de cáncer y el consiguiente desarrollo de métodos analíticos que permitan un diagnóstico molecular selectivo y rápido de Ia enfermedad para que puedan ser incluidos en Ia práctica clínica habitual.

También se produciría un ahorro de costes sanitarios y una reducción en los tiempos de espera, Ia adopción de nuevos criterios pronósticos y de orientación terapéutica en los casos positivos así como el diseño de terapias selectivas relacionadas con estos genes.

La proteína codificada por el gen SMC2L1 (ortólogo humano de SMC2 de S. cerevisiae, también denominado hCAP-E) es una proteína central en los complejos de condensación y compactación cromosómica que podría tener funciones relacionadas con Ia regulación de Ia transcripción génica (Hagstrom & Meyer, 2003; Hirano, 2002; Legagneux et al., 2004).

Esta proteína forma parte de una familia de proteínas denominadas SMC (por "structural maintenance of chromosomes") y que está formada por 6 proteínas numeradas de 1 a 6 (SMC1 , SMC2, SMC3, SMC4, SMC5 y SMC6). Estas proteínas forman dímeros entre ellas y complejos activos con otras proteínas denominadas no-SMC (divididas en dos familias, HEAT y Kleisina). En su conjunto forman tres complejos principales: condensina (en humanos existen dos complejos diferenciados, condensina I y condensina II), cohesina y el complejo hSMC5-hSMC6, relacionado con Ia reparación genómica

(Hagstrom & Meyer, 2003; Hirano, 2002). En las tablas 1 y 2 se describen las proteínas y los complejos que forman en distintas especies.

Tabla 1. Mantenimiento estructural de cromosomas

Saccharomyces Schizosaccharomyces Caenorhabditis Drosophila Xenopus Homo

Cerevisiae pombe elegans melanogaster laevis sapiens

Cohesina

SMC1 Smc1 Psm1 HIM-1 SMC1 SMC1 SMC1

SMC3 Smc3 Psm3 SMC-3 SMC3 SMC3 SMC3

SCC1 Scc1/Mcd1 Rad21 SCC-1/COH-2 Rad21 RAD21 RAD21

SCC3 Scc3 Psc3 SCC-3 SA SA1 ,SA2 SA1 ,SA2

Condensina

SMC2 Smc2 Cutí 4 MIX-1 SMC2 CAP-E CAP-E

SMC4 Smc4 Cut3 SMC-4 SMC4/gluon CAP-C CAP-C

CAP-D2 Ycs4 Cnd1 HCP-6 CG1911 CAP-D2 CAP-D2

CAP-G Ycs5/Ycg1 Cnd3 CG 17054 CAP-G CAP-G

CAP-H Brn1 Cnd2 DPY-26 Barren CAP-H CAP-H

reparación de DNA

SMC5 Smc5 Spr18 C27A2.1 CG3248 SMC5 SMC5

SMC6 Smc6/Rhc18 Rad18 C23H4.6 CG5524 SMC6 SMC6

(Adaptado de Hagstrom & Meyer, 2003)

Tabla 2. Complejos de Condensina

Subunidades SMC subunidades de repetición subunidad HEAT Kleisina

Condensina S. cerevisiae Smc2 Smc4 Ycs4p Ycs5p/Ycg1p Brn1

Condensina S. pombe Cutí 4 Cut3 Cnd1 Cnd3 Cnd2

Condensina I D. melanogaster S SMMCC22 SMC4/Gluon CG1911 CG 17054 Barren

Condensina I C. elegans MIX-1 DPY-27 DPY-28 ? DPY-26 Condensina Il C. elegans MIX-1 SMC-4 HCP-6 ? KLE- 2/C29E4.2

Condensina I X. laevis XCAP-E XCAP-C XCAP-D2 XCAP-G XCAP-H Condensina Il X. laevis XCAP-E XCAP-C XCAP-D3 XCAP-G2 XCAP-H2

Condensina I H. sapiens hCAP-E hCAP-C hCAP-D2 hCAP-G hCAP-H Condensina Il H, sapiens hCAP-E hCAP-C hCAP-D3 hCAP-G2 hCAP-H2

SMC2L1 forma parte de los complejos de condensina I y II. Ambos complejos tienen funciones relacionadas con Ia compactación de cromatina (Hirano et al., 1994; Ono et al., 2004; Ono et al., 2003):

Condensina I: fomada por el dímero SMC2-SMC4 (hCAP-E-hCAP-C), las subunidades HEAT hCAP-D2/CNAP1 y hCAP-G, y Ia subunidad Kleisina hCAP-H. El dímero hCAP-E- hCAP-C se encuentra en el citoplasma en células interfásicas (fuera de mitosis). Una vez llegada Ia mitosis, las subunidades no-SMC se fosforilan, interaccionan con el dímero hCAP-E-hCAP-C, forman el complejo y se trasladan al núcleo donde interaccionan con el DNA y Io compactan (Hagstrom & Meyer, 2003).

Condensina II: fomada por el dímero SMC2-SMC4 (hCAP-E-hCAP-C), las subunidades HEAT hCAP-D3 y hCAP-G2, y Ia subunidad Kleisina hCAP-H2. Parece ser que el complejo se encuentra en el núcleo en células interfásicas (fuera de mitosis) (Rg. 1A) y podría tener relación con Ia regulación transcripcional génica, ayudando a compactar Ia zona promotora de determinados genes. Esto situaría Ia condensina en zonas de eucromatina y asociadas a regiones transcripcionalmente activas (las zonas donde existe regulación transcripcional, es decir, activación o inhibición de Ia transcripción), como son las equivalentes a Ia zona interna nuclear (Fig. 1A y 1 B) y a las bandas R de los cromosomas, con otros factores reguladores como histonas acetiladas (por ejemplo Ia histona H3 acetilada en Ia lisina K3) (Fig. 2 y 3).

No existen evidencias en Ia literatura que hayan relacionado estas proteínas con este tipo de cáncer. Sin embargo, Ia posible relación de Ia condensina con el silenciamiento transcripcional y Ia correcta compactación cromosómica hace pensar que podría estar alterada en cáncer. La mayoría de cánceres presentan hipometilación general del genoma acompañada de una hiperacetilación general. No obstante, se ha demostrado que determinadas zonas promotoras génicas ricas en islas CpG tiene hipermetilación y los genes están silenciados (no se transcriben). En Ia presente invención se describe que Ia condensina colabora en estos procesos de silenciamiento y que las proteínas que forman estos complejos y proteínas asociadas están sobreexpresadas. Asimismo, dado que se considera que Ia mayoría de alteraciones epigenéticas son muy iniciales en los procesos neoplásicos, esta sobreexpresión también puede ser característica de procesos incipientes como los adenomas.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención tiene por objeto un método de análisis de expresión diferencial en cáncer colorectal que comprende detectar en una muestra biológica aislada de un paciente una variación en los niveles de expresión de uno o más genes que codifican proteínas que forman parte del complejo condensina u otras proteínas que interaccionan con dicho complejo, donde dicha variación en los niveles de expresión del gen se utiliza como diagnóstico de Ia presencia de cáncer colorectal o de una condición pre-maligna del mismo.

En particular, el gen o genes a analizar se seleccionan entre el grupo formado por hCap- E, hCap-C, hCap-D2, hCap-D3, hCap-G, hCap-G2, hCap-H, hCap-H2 y KIF4A y Ia variación en los niveles de expresión del gen o genes es un incremento en los niveles de expresión.

En particular, dicha muestra puede ser DNA o RNA y puede aislarse a partir de células obtenidas por biopsia o cualquier otro método de extracción.

En una realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante una amplificación por PCR, SDA o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se puede llevar a cabo mediante biochips de DNA elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo o por biochips de DNA elaborados con oligonucleótidos sintetizados ¡n situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de mareaje.

En otra realización de Ia invención, la detección se lleva a cabo mediante geles de electroforesis. Opcionalmente, Ia detección se puede llevar a cabo mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante RMN o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen mediante Ia utilización de nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

Opcionalmente, Ia muestra analizada puede ser Ia proteína codificada por el gen o fragmentos de Ia misma.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante incubación con un anticuerpo específico. Opcionalmente, Ia detección se puede llevar a cabo mediante Western blot o mediante inmunohistoquímica.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante geles de electroforesis de proteína.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante chips de proteína.

En otra realización de Ia invención, Ia detección se lleva a cabo mediante ELISA o cualquier otro método enzimático.

La presente invención también tiene por objeto un método de análisis de expresión diferencial en cáncer colorectal donde Ia variación en los niveles de expresión de uno o más de los genes descritos se utiliza como pronóstico de Ia progresión del cáncer colorectal o de una condición pre-maligna del mismo o como pronóstico del riesgo de recurrencia de dicha enfermedad.

La presente invención también tiene por objeto un kit para llevar a cabo el método de análisis de expresión diferencial que comprende los reactivos y aditivos apropiados para detectar Ia variación en los niveles de expresión del gen o genes.

La presente invención tiene también por objeto adicional un método de análisis de compuestos con potencialidad terapéutica en cáncer colorectal que comprende determinar Ia capacidad de dichos compuestos de disminuir los niveles de expresión de uno o más de los genes descritos donde los compuestos son compuestos obtenidos de Ia información de Ia secuencia tales como oligonucleótidos antisentido o de interferencia de RNA u otros basados en Ia desestabilización y eliminación del mRNA o el impedimento de su traducción a proteína.

La presente invención tiene también por objeto adicional un método de análisis de compuestos con potencialidad terapéutica en cáncer colorectal que comprende determinar Ia capacidad de dichos compuestos de contrarrestar Ia variación en los niveles de expresión de uno o más de los genes descritos donde los compuestos son nanopartículas paramagnéticas o nanopartículas de excitación térmica.

La presente invención tiene también por objeto adicional un método de análisis de compuestos con potencialidad terapéutica en cáncer colorectal que comprende determinar Ia capacidad de dichos compuestos de contrarrestar Ia variación en los niveles de expresión de uno o más de los genes descritos donde los compuestos son nanopartículas funcionalizadas con anticuerpos específicos y compuestos tóxicos vehiculados de forma simple, binaria o modular para Ia célula maligna.

Asimismo, Ia presente invención tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de compuestos con potencialidad terapéutica obtenidos según los métodos descritos anteriormente y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

Por otra parte, Ia presente invención también tiene por objeto el uso de compuestos con potencialidad terapéutica obtenidos según los métodos descritos anteriormente para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer colorectal o de una condición pre-maligna del mismo.

La presente invención se basa en Ia sobreexpresión de las proteínas del complejo condensina y proteínas asociadas observada en pacientes afectados de cáncer colorectal. Los datos demostraban una sobreexpresión de hCAP-E en el análisis por

Western blot utilizando anticuerpos específicos anti-hCAP-E en muestras de cáncer colorectal en comparación con muestras de tejido normal, de manera independiente de su estadiaje tumoral y con una incidencia de sobreexpresión del 90% de los tumores (18/20) (Fig. 4). Esta sobreexpresión también se observó en todos los análisis por inmunohlstoquímica en tejidos tumorales de cáncer colorectal (FIg. 5).

Asimismo, se observó que Ia expresión de hCAP-E es también específica de las células pluripotenciales (stem) de Ia cripta del colon (Fig. 6), que son las células indiferenciadas a partir de las cuales se originan los tumores colorectales. Su patrón de expresión indica que ésta prácticamente desaparece conforme Ia célula pluripotenclal se transforma en célula epitelial (célula Globbet) en una cripta normal para formar el epitelio, por Io que podría considerarse como un marcador de diferenciación celular.

En Ia Tabla 3 se muestran los niveles de sobreexpresión de hCAP-E en cáncer colorectal de acuerdo con el estadiaje.

Tabla 3. Sobreexpresión de hCAP-E en cáncer colorectal de acuerdo con el estadiaje

La incidencia de sobreexpresión (+) fue del 90% (18 sobre 20 tumores). Solamente se observó un caso en el que Ia expresión era inferior al normal (-) y un caso en el que el tejido normal y el tejido tumoral mostraban niveles similares de expresión (=).

Asimismo, se analizaron mediante PCR en tiempo real (real-time PCR) los niveles de expresión de otras proteínas que forman el complejo condensina, tales como hCap-C, hCap-D2, hCap-D3, hCap-G, hCap-G2 y hCap-H así como de otras proteínas asociadas que interactúan con el complejo, como KIF4A, en algunos casos tumorales en los que se había observado Ia sobreexpresión de hCap-E. Los resultados indicaron que todas las proteínas analizadas presentaban un incremento en los niveles de expresión en tejido tumoral en relación con los niveles en tejido normal (Fig. 7). Por Io tanto, se puede concluir que todas las proteínas que integran el complejo condensina y otras proteínas que interactúan con dicho complejo están sobreexpresadas en los tumores.

Así pues, las proteínas que forman el complejo condensina y otras proteínas asociadas que interactúan con el mismo pueden ser utilizadas como marcadores de cáncer colorectal o de una condición pre-maligna del mismo teniendo potencial como marcador de diagnóstico y/o de recomendación para Ia colonoscopia.

Asimismo, estas proteínas pueden ser marcadores de células pluripotenciaies (stem cells) de Ia cripta del colon como marcadores de diferenciación celular. Por otra parte, estas proteínas pueden ser marcadores histológicos de cáncer y/o pueden tener utilidad en sistemas de análisis por imagen.

Además, estas proteínas pueden constituir dianas terapéuticas directas o indirectas, permitiendo Ia llegada de tratamientos antitumorales vehicuiizados al tumor a través de interacciones con cualquiera de estas proteínas o mediante Ia modulación de sus niveles de expresión.

Cabe destacar que recientemente se ha descrito que los niveles de expresión de las proteínas del complejo condensina no varían a Io largo de ciclo celular y, por Io tanto, no varían durante Ia mitosis (Takemoto et al., 2004). Así pues, el hecho de encontrar niveles elevados de estas proteínas en células cancerosas tal como se describe en Ia presente invención no puede ser atribuido simplemente a un aumento de Ia actividad replicativa

(mitosis) de Ia célula tumoral, sino que se trata de una sobreexpresión relativa real debida al desarrollo de Ia enfermedad.

Por Io tanto, Ia presente invención demuestra una asociación total entre los niveles de expresión de las proteínas que integran el complejo condensina y otras proteínas asociadas a dicho complejo y Ia presencia de cáncer colorectal cualquiera que sea su estadio de desarrollo, Io que supone disponer de una nueva herramienta molecular que permite el diagnóstico de Ia enfermedad incluso en sus estadios más iniciales, Io cual no es posible con los métodos actuales.

BIBLIOGRAFíA

- Hagstrom K, Meyer BJ. Condensin and cohesin: more than chromosome compactor and glue. Nat Rev Genet 2003 JuIy 4:520-534.

- Hirano T. The ABC of SMC proteins: two-armed ATPases for chromosome condensation, cohesión and repair. Genes & Development, 2002 16:399-341.

- Legagneux V, Cubizolles F, Watrin E. Múltiple roles of condensins: a complex story. Biology of the CeII, 2004 96:201-213.

- Hirano T, Mitchison TJ. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome condensation in vitro. CeI1 1994 Nov 4;79(3):449-58.

- Ono T, Fang Y, Spector DL, Hirano T. Spatial and temporal regulation of Condensins I and Il in mitotic chromosome assembly in human cells. Mol Biol CeII. 2004 Jul;15(7):3296- 308.

- Ono T, Losada A, Hirano M, Myers MP, Neuwald AF, Hirano T. Differential contributions of condensin I and condensin Il to mitotic chromosome architecture in vertébrate cells. CeII. 2003 Oct 3;115(1 ):109-21.

- Takemoto A, Kimura K, Yokoyama S, Hanaoka F. CeII cycle-dependent phosphorylation, nuclear localization, and activation of human condensin. J Biol Chem. 2004 Feb 6;279(6):4551-9.

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

La figura 1A indica Ia localización de hCAP-E en células interfásicas, representado por los cúmulos blanquecinos. La figura 1 B representa Ia imagen de un núcleo celular obtenida

por microscopía electrónica. En ella pueden observarse separadas Ia heterocromatina y Ia eucromatina

La figura 2 representa Ia coiocalización de hCAP-E en las regiones cromosómicas equivalentes a Ia eucromatina (bandas R). Se representa el mismo cromosoma teñido con hCAP-E y por bandas G. La heterocromatina se identifica por las zonas más oscuras, en cada una de las figuras Ia derecha.

La figura 3 indica Ia coiocalización de hCAP-E con histona 4 acetilada (H4Ac) y las bandas R en cromosomas metafásicos (bandas claras en el cromosoma).

La figura 4 representa los resultados del análisis por Western blot de hCAP-E en muestras normales (N) y tumorales (T) de cáncer colorectal. La actina se utilizó como control de carga.

La figura 5 corresponde a un análisis por inmunohistoquímica de tejido colorectal utilizando un anticuerpo específico anti-hCAP-E. Se observa Ia zona correspondiente a Ia cripta normal (N) y Ia zona correspondiente al adenocarcinoma de colon (T) que presenta una mayor expresión de hCAP-E.

La figura 6 corresponde a un análisis por inmunohistoquímica en criptas normales de colon utilizando un anticuerpo específico anti-hCAP-E, en Ia que se observa que las células pluripotenciales (stem) presentan una tinción específica más fuerte para hCAP-E que las células Globbet.

La figura 7 representa los resultados del análisis por PCR a tiempo real de otras proteínas del complejo condensina y de Ia proteína asociada KIF4A. La muestra analizada fue Ia muestra 67T en Ia que se había observado previamente una sobreexpresión de hCAP-E en comparación con su muestra normal correspondiente. El análisis se hizo por triplicado y se utilizó el ribosomal 18S como control interno.

DESCRIPCIóN DE UNA REALIZACIóN PREFERENTE

A continuación se describe una realización preferente, aunque no limitativa, de Ia invención.

Muestras de pacientes.

Se obtuvieron biopsias de tejido normal y tumoral de 20 pacientes diagnosticados con cáncer colorectal. Las muestras obtenidas quirúrgicamente fueron congeladas de inmediato en nitrógeno líquido y mantenidas a -80 ⁰ C para Ia posterior extracción de proteínas y RNA. Además, se realizaron cortes histológicos para realizar pruebas de inmunohistoquímica. Se registraron las características clínico-patológicas incluyendo el estadio y grado de diferenciación de los tumores asi como de un seguimiento de al menos tres años para detectar los casos con recidiva temprana.

Análisis de los niveles de expresión de hCAP-E.

Western blot: Las proteínas fueron extraídas a partir de las muestras de tejido normal y colorectal mediante métodos estándar, utilizando tampón de lisis RIPA. Noventa μg de proteína fueron fraccionados en un gel SDS-PAGE al 10 %, transferidas a una membrana de nitrocelulosa (BioRad, USA), bloqueadas con 5 % leche en TBS-T, e hibridadas con un anticuerpo primario anti-hCAP-E (Abcam, UK) diluido 1 :2500 en solución de bloqueo, y luego con un anticuerpo secundario anti-conejo (Dako Cytomation, Denmark) diluido 1 :500. La señal quimioluminescente fue detectada utilizando el kit ECL (Amersham, USA) y se compararon los niveles de expresión de las muestras tumorales con su contraparte normal. Finalmente, Ia membrana fue rehibridada con anticuerpo anti-actina (Invitrogen, USA) que fue utilizada como control de carga. Como se observa en Ia figura 4, todas las muestras tumorales presentaban un incremento en los niveles de expresión de hCAP-E.

Inmunohistoquímica: Los cortes histológicos correspondientes a los tejidos de pacientes con cáncer colorectal fueron desparafinados con xileno y rehidratados en series decrecientes de etanol y agua destilada. Las secciones fueron tratadas con tampón citrato pH 6 (5 min 800W y 10 min 450W, al microondas), Ia peroxidasa endógena fue bloqueada con H ₂ O ₂ , y luego fueron hibridadas con el anticuerpo primario anti-hCAP-E

(Abcam, UK). Para el análisis inmunohistoquímico se empleó el kit EnVision + Dual Link System (Dako Cytomation, Denmark) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Finalmente, se comparó el nivel de expresión de hCAP-E entre zonas de tejido normal y tumoral. En Ia figura 5 se observa una mayor expresión de hCAP-E en tejido tumoral respecto al tejido control.

Análisis de los niveles de expresión de otras proteínas del complejo condensina y proteínas asociadas.

Real-time PCR: Los niveles de mRNA correspondientes a otras proteínas del complejo condensina y proteínas asociadas fueron cuantificados mediante PCR en tiempo real (real-time PCR), para Io cual el RNA fue extraído a partir de las muestras de tejido normal y colorectal mantenidas a -8O ⁰ C, utilizando Trizol (Invitrogen, USA). Diez μg de RNA fueron retrotranscritos empleando el kit High Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, USA) y amplificados con TaqMan® Gene Expression Assays (Applied Biosystems, USA) para hCAP-C, hCAP-D2, hCAP-D3, hCAP-G, hCAP-G2, hCAP-H y KIF4A, respectivamente. La reacción de amplificación se llevó a cabo utilizando TaqMan Universal PCR Master Mix en el equipo 7500 Real Time PCR system (ambos de Applied Biosystems, USA). Los niveles relativos de mRNA de cada gen fueron cuantificados empleando el método δδC _Tl con el programa asociado al sistema. Se realizó el ensayo por triplicado y se utilizó 18S rRNA como control endógeno, y se comparó Ia expresión entre tejido normal y tumoral del mismo paciente. Como se observa en Ia figura 7, las muestras tumorales presentaban unos niveles de mRNA muy incrementados respecto a las muestras control para todos los genes analizados.