OBJETO DE LA INVENCIÔN La presente invención se refiere a un método de análisis directo de trans-resveratrol (3,5, 4'-trihidroxiestilbeno) tanto en muestras naturales como productos manufacturados mediante una máquina que combina la desorciôn por laser con posterior ionización multifotónica resonante mediante un segundo laser y detección por espectrometria de masas por tiempo de vuelo. La ionización se debe realizar a la longitud de onda resonante de este compuesto, que hemos determinado que ocurre en intervalo de longitudes de ondas entre 302 y 307.5 nm.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la aplicación de la tecnologia laser al análisis quimico de alimentos.

ANTECEDENTES.

En la bibliografia se pueden encontrar diversos métodos para el analisis de resveratrol especialmente en vinos, debido al interés enológico de este compuesto. En general todos ellos son métodos cromatográficos, tanto por cromatografia de gases (CG), como cromatografia liquida de alta resoluciôn (HPLC). Previamente a la resoluciôn cromatogràfica del compuesto, es necesario realizar diversas operaciones para la separaciôn y extracciôn del compuesto ; las técnicas analiticas empleadas son : extracciôn con disolventes organicos (véase por ejemplo ; P. Jeandet et al. J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 316 ; E. H. Siemann et al. Am. J. Enol. Ttritic. 43 (1992) 49 ; O. Lamikanra et al. J.

Agric. Food Chem. 44 (1996) 1111) ; extracciôn en fase solda (D. M. Goldberg et al.

Anal. Chem. 66 (1994) 3959 y Am. J. Enol. Vitic. 46 (1995) 159) e inyección directa (G. J. Soleas et al. Anal. Chem. 69 (1997) 4405 ; J. P. Roggero et al. Sci. Aliments 15 (1995) 411).

Además en los métodos que emplean la cromatografia de gases es necesaria la derivación que generalmente se realiza con bis- [trimetilsylil]-trifluoroacetamida, (G. J. Soleas et al.

Am. J. Enol. Vitic. 46 (1995) 346 ; E. N. Frankel et al. J. Agric. Food Chem 43 (1995)

890), con posterior detecciôn mediante ionización por llama o espectrometria de masas.

En los métodos de HPLC la detecciôn empleada se basa en ! a absorciôn ultravioleta (A.

Gonzalo et al. J. Wine Res. 6 (1995) 213 ; D. M. Goldberg et al. J. Chromatogr. A 708 (1995) 89), fluorescencia (R. Pezet et al. J. Chromatogr. A 663 (1994) 191), electroquimica (K. D. McMurtrey et al. J. Agric. Food Chem 42 (1994) 2077) o red de diodos (F. Mattivi et al. J. Agric. Food Chem 43 (1995) 1820 ; D. M. Goldberg et al. Anal.

Chem. 68 (1996) 1688 ; R. M. Lamuela Raventós et al. J. Agric. Food Chem. 43 (1995) 281.

Aunque no se ha realizado ningùn tipo de comparaciôn inter-labotatorios, se supone tácitamente que cualquiera de estos métodos es correcto y conduciria a los mismos resultados en el análisis de una muestra determinada, sin embargo se ha observado que, en algunos casos, distintos investigadores obtienen concentraciones que difieren hasta en un orden de magnitud para el mismo tipo de vino. Recientemente se ha publicado un estudio en el que se realiza una evaluaciôn comparativa de cuatro de estos métodos de anàiisis de resveratrol en vino y se revisan los valores publicados por otros autores (G. J.

Soleas et al. Am. J. Enol. Vitic. 48 (1997) 169). La gran variabilidad encontrada se atribuye principalmente a la posibilidad de isomerizaciôn durante los procesos de derivación, pérdidas importantes durante las multiples etapas de extracciôn y la presencia de diversos compuestos derivados del resveratrol que pueden interferir en los resultados.

En cualquier caso es evidente que las distintas técnicas empleadas hasta el momento para el análisis de trans-resverarol en vino necesitan de largas y complejas operaciones de preparaciôn de la muestra previas al analisis. Dichas operaciones no solo dificultan y encarecen el proceso de analisis, sino que son una de las principales fuentes de error. Con el método de análisis que se reivindica en la presente solicitud de patente consideramos se resuelven estos problemas.

DESCRIPCION DE LA INVENCION.

La presente invención se refiere a un método para el analisis directo de trans-resveratrol mediante la combinaciôn de la desorciôn por laser con la posterior ionización multifotónica resonante de las moléculas desorbidas y posterior detecciôn por espectrometria de masas por tiempo de vuelo.

La principal innovaciôn de nuestro método es ! a realizaciôn de un análisis directo, ya que no requiere un tratamiento previo de preparaciôn de muestras ni separaciôn como en el caso de la cromatografia. Esto permite aumentar la exactitud y précision de la técnica al eliminar una de las principales fuentes de error presente en la mayoria de las técnicas que requieran este tipo de tratamientos. La ausencia de tratamiento previo supone, admis, un gran ahorro de tiempo y coste económico, facilitando el análisis, reduciendo el consumo de disolventes, etc. Además como se ha visto en el apartado anterior, es en este tratamiento previo de la muestra en el que aparecen los principales problemas que presenta el análisis del contenido de trans-resveratrol mediante las técnicas actualmente empleadas.

El montaje experimental, (figura 1), es un espectrômetro de masas por tiempo de vuelo acoplado a una càmara de desorciôn e ionización laser. Dicho sistema se compone basicamente de tres partes : equipo de vacio, liseres y equipos electrónicos. El equipo de alto vacio consta de dos càmaras : en la primera se realiza la desorciôn de la muestra a analizar, la ionización las moléculas desorbidas y la aceleraciôn de los iones mediante unas placas conectadas a tres fuentes de alto voltaje, adquiriendo cada uno una velocidad distinta en función de su masa. Posteriormente los iones entran en la segunda camara, que es un tubo de tiempo de vuelo de aproximadamente I m de longitud, donde el campo eléctrico es nulo ; esto permite separar los iones debido a su diferente velocidad y por tanto, según su masa. El sistema experimental emplea dos liseres pulsados de alta energia ; uno de ellos, el utilizado para la ionización, se puede sintonizar para elegir la longitud de onda adecuada para cada molécula de interés analitico. La detecciôn se realiza por un sistema de platos microcanales situados al final de dicha cámara. La senal obtenida es digitalizada en un osciloscopio acoplado a un ordenador ; dicha senal consiste en un espectro de tiempo de vuelo en el que cada pico corresponde a una masa.

En la figura 2 se muestran con mas detalle las partes internas del sistema experimental, asi como la interacciôn y direcciôn entre ambos liseres.

La muestra se prepara como se explica en el Apartado titulado"Forma de realizaciôn preferida"y se deposita sobre un disco de pyrex mediante un aerôgrafb. El disco se situa paralelo a la primera placa aceleradora a aproximadamente 2 mm de ella ; durante la desorciôn se hace girar el disco mediante un motor paso a paso y a su vez se encuentra

situado sobre un posicionador que permite variar la direction perpendicular a ! laser de desorciôn, lo que permite tener siempre una superficie fresca sobre la que desorber.

Para la desorciôn se utiliza el segundo armônico de un laser de Nd : YAG, que atraviesa el disco por su parte trasera y desorbe la muestra ; las moléculas desorbidas se expanden en la région de aceleraciôn por accon del vacio, y son ionizadas por el segundo pulso laser perpendicular al primero.

Nuestra invención se refiere no solo a la puesta a punto del método, sino al intervalo de longitudes de onda (302 a 307,5 nm) donde se produce la ionización resonante de la molécula de trans-resveratrol. Este proceso no lineal es posible gracias a la alta intensidad de la radiaciôn laser. Un proceso de absorciôn multifotónica puede en principio transcurrir a través de niveles reales o de niveles virtuales de la molécula : la vida media de un nivel virtual esta en torno a 10-15 segundos, mientras que la de un nivel real lo esta en torno a 10-9 y 10-6 segundos, por lo que la probabilidad de absorciôn de mas de un fotón es mayor si se hace a través de un estado real. Este proceso se denomina ionización multifotónica resonante y se conoce generalmente por sus siglas en inglés : REMPI, (Resonance Enhanced Multi-Photon Ioniwation).

Se ha comprobado que el trans-resveratrol sufre un proceso de ionización bifotónica, cuyo ejemplo concreto se muestra en la figura 3, en la que se muestra la representaciôn bilogaritmica de la intensidad de la senal de trans-resveratrol frente a la energia de ionización, manteniendo el resto de las condiciones experimentales (energia de desorciôn, voltajes aceleradores, etc.) constantes. De acuerdo con las formulas de la absorciôn multifotónica, la pendiente de esta representaciôn indica el numéro de fotones que absorbe la molécula en el proceso de ionización ; en el caso del trans-resveratrol, los datos experimentales ajustan a una linea recta de pendiente 1,9 0,1 lo cual es consistente con un proceso resonante bifotónico (R2PI) con un solo color.

La principal ventaja de la técnica REMPI es la ionización selectiva de una molécula determinada en una mezcla compleja : evidentemente los estados electrónicos son diferentes para cada molécula, aún cuando estas sean estructuralmente similares.

Variando la longitud de onda del laser es posible determinar aquella que es resonante con el compuesto de interés, pero no con el resto de compuestos presentes en la muestra. Si se tiene en cuenta que para producir un proceso REMPI es necesario mucha menor irradiancia que para procesos de ionización no resonante, seleccionando la longitud de

onda adecuada y disminuyendo la energia del laser es posible obtener un espectro simple que contenga ùnicamente el pico de ! ion molecular que se pretende analizar. Mediante esta técnica es posible por tanto eliminar los efectos de matriz presentes en la mayoria de ! as técnicas analiticas convencionalcs.

Uno de los requisitos necesarios para el análisis mediante la Espectrometria de Masas por Ionización Resonante es por tanto el de conocer el espectro REMPI del analito, para asi poder seleccionar la longitud de onda optima para la ionizacion selectiva del compuesto.

Segun los estudios que hemos realizado, el intervalo de longitudes de onda en el que es resonante el trans-resveratrol es de 302 a 307,5 nm, con el màximo de absorciôn a 302,1 nm como puede apreciarse en la figura 4.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 : La figura 1 muestra una vista esquemática del montaje experimental comprendiendo tanto las camaras de alto vacio, los liseres y parte de la electrónica necesaria. Las abreviaturas empleadas son las siguientes : CI : Cimara de ionizacion.

TOF : Tubo de tiempo de vuelo.

G : Vàlvula de Guillotina.

Ll : Liseres de Nd : YAG empleado para la desorciôn.

L2 : Laser de Colorante empleado para la ionizacion.

US : Generador de pulsos para la sincronizaciôn entre ambos liseres.

V1-V3 : Fuentes de alto voltaje, conectadas a sus respectivas placas aceleradoras.

V4 : Voltaje alimentador del detector.

D : Detector de (2) placas microcanales.

Osc. : Osciloscopio digital.

PC : Ordenador personal.

Figura 2 : En la Figura 2 se muestran en mas detalle las partes internas de la cimara de ionización, principalmente :

L1, L2 : Sistemas laser, como se ha indicado anteriormente.

P : Disco de pyrex.

M : Muestra a analizar.

V 1 : Primera placa aceleradora, ("repeler").

V2 : Segunda placa aceleradora.

V3 : Lente iônica tipo Einzel.

Dl, D2 : Deflectores en las direcciones perpendiculares al haz de iones.

Figura 3 : La figura 3 muestra la representaciôn bilogaritmica de la intensidad de la senal de trans- resveratrol, (In), frente a la energia de ionización, (Ei), manteniendo el resto de las condiciones experimentales (energia de desorciôn, voltajes aceleradores, etc.) constantes.

Figura 4 : La figura 4 muestra el espectro de absorciôn REMPI del trans-resveratrol en el intervalo entre 294 y 306 nm.

FORMA DE REALIZACIÔN PREFERIDA.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no son en ningún caso limitativos de su alcane, el cual viene definido exclusivamente por la nota <BR> <BR> <BR> <BR> reivindicatoria<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 1.-Preparaci6n de la muestra.

La preparaciôn depende en primer lugar del estado de muestra que se quiera analizar : Ejemplo 1 : En el caso de muestras liquidas como el vino, zumos, etc. esta se deposita sobre un disco de pyrex, mediante un aerógrafo que pulveriza la muestra permitiendo la evaporaciôn subsiguiente de los compuestos mas volatiles una pelicula delgada y homogénea sobre la superficie del pyrex. El sistema de homogeneizaciôn consta de un motor que hace girar la placa Pyrex a velocidad constante. Frente a la placa y a una distancia regulable se situa un aerógrafo que trabaja de modo continuo impulsando la

muestra mediante aire a una pression variable. La distancia entre la placa y el aerógrafo, la apertura de la boquilla del aerôgrafb y la pression del gas deben ser optimizadas en cada caso, dependiendo de las caracteristicas del liquido que se quiere depositar : viscosidad, volatilidad, etc. Si el liquido no es demasiado volatil, como es el caso del vino, es necesario que la deposición se haga lo mas lentamente posible, para permitir al liquido evaporarse sobre la superficie del disco. Si fuera necesario se podria emplear un disolvente adecuado (acetona, metanol, etanol,...) como vehiculo para facilitar la evaporaciôn.

Ejemplo 2 : En el caso de que la muestra se encuentre en este estado solide (frutas, vegetales, etc.) se procede a su trituración y dispersion en un disolvente adecuado que se usa como véhicule. Para ello se utiliza un dispersor-homogeneizador que asegura un tamano de particula de 5 a 25 ! ; dado que la boquilla del aerógrafo empleado tiene 0.4 mm de diamètre, este tamano de particula es suficiente para poder realizar la deposición sobre la placa de pyrex segùn el procedimiento empleado anteriormente.

2.-Desorción e ionización oor liser.

Una vez introducida la placa de pyrex en la càmara de ionizacion, segun el esquema mostrado en la Figura 2, se produce la desorciôn de las moléculas mediante el segundo armónico de un laser de Neodimio-YAG que es introducido en la càmara sin focalizar. La fluencia del laser de desorciôn debe ser optimizada de manera que se obtenga la maxima sénat evitando a su vez la fragmentaciôn de las moléculas desorbidas.

Las moléculas desorbidas son ionizadas posteriormente mediante un segundo pulso laser.

En este caso es preciso utilizar un laser sintonizable, ya que la longitud de onda de trabajo depende, como se ha visto anteriormente, de la molécula que se quiera ionizar. En el caso del resveratrol hemos determinado que el intervalo de longitud de onda resonante es 302 y 307,5 nm, presentando la maxima absorciôn aproximadamente a 302,1 nm ; esta debe ser por tanto la longitud de onda optima de trabajo para lograr la ionización selectiva del trans-resveratrol en muestras complejas. En la siguiente tabla se recogen otros importantes paràmetros experimentales empleados en el análisis de trans- resveratrol. .Presiônenlacàmaradeionizaciôn1x10'-5x10' Pression en ! a càmara de TOF 1x10-7 - 5x10-8 Vi (voltios) 1540 V2 (voltios) 1350 V3 (voltios) 230 V4 (voltios) 2000 Distancia desorción-ionización (mm) 7,5 Frecuencia de ambos láseres (Hz) 10 Duración láserpulso (nm) 6- Retraso entre ambos liseres (µs) 25 532#Desorción(nm) (nm) 302, 1 8Edesorción(mJ/pulso) 83Elonización(µJ/pulso) CondicionesexperimentalesdelsistemaTabla.1-.