【명세서】

【발명의 명칭】

단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 장치 [기술분야]

단백질—단백질 상호작용 분석을 통하여 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 (s ignal ing pathway)의 활성화 상태를 분석하는 방법 및 이를 이용하여 개인 맞춤형 치료제를 선정 및 /또는 치료제의 효능을 모니터링하는 방법 및 이에 사용하기 위한 장치에 관한 것이 _. 다 .

【배경기술】

최근까지는 질병의 개인에 따른 맞춤형 진단， 예후 예측 및 치료는 주로 유전자 분석 (genom i c prof i l ing)에 집중되어 왔다. 하지만， 암을 비롯한 특정 질병의 발병원인은 신체를 구성하는 세포의 ᅳ비정상적인 활동, 더욱 자세하게는 세포를 구성하고 조절하는 다양한 단백질간의 비정상적인 상호작용에 의한 것이므로， 유전자 분석을 통한 단백질만의 개별적인 관찰만으로는 이해하기 어려운 문제가 있다. 실제로 이러한 유전자 돌연변이의 프로파일링을 통해 동일한 유전적 성질올 지닌 환자들에 대해서도 표적 항암제에 대한 감수성이 다르고， 예후 역시 다양하게 나타나는 것으로 나타난다. 단백질-단백질 상호작용의 정확한 분석은 세포 내 신호전달 네트워크 (s ignal ing network)가 어떻게 변화하는 지를 이해할 수 있도록 할 뿐 아니라, 개별적인 암의 진행과 특성 및 그 치료방법에 대한 정보까지도 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

일 예는 제 1 단백질과 거 12 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 (s ignal ing pathway)에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질인. 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법을 제공한다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위. 단백질인， 상기 세포 또는 조직， 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체의 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 ^' 방법 또는 예측에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질인, 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 치료쎄 적합한 개체를 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 초직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하류 단백질이고， 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 2개 이상의 제 1 단백질에 대하여 수행하는, 상기 세포 또는 조직, 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체 (개별 환자)에 적용하기에 적합한 표적으로서의 제 1 단백질 또는 이를 표적으로 하는 약물을 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법.을.제공한다.

다른 예는, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물이 처리된 세포 또는 조직 , 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질인, 상기 세포 또는 조직, 또는 상기 개체의 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성을 모니터링하는 방법 또는 모니터링에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는, 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물이 처리된 분리된 세포 또는 조직， 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 제 1 단백질과 . 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질인, 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.

다른 예는 상기 기재된 방법에 사용하기 위한 장치를 제공한다.

【기술적 해결방법】

본 명세서에 제공된 일 예는 제 1 단백질과 게 2 단백질 간 단백질- 단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 거 11 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 (s ignal ing pathway)에 관여하는 단백질이고， 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질 .중에서 선택된 것인, 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질 중에서 선택된 것인, 상기 세포 또는 조직， 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체의 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 방법 또는 예측에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 제 1 단백질이 2종 이상 사용되는 경우， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물은 상기 2종 이상의 제 1 단백질 중 어느 하나 또는 2종 이상올 표적으로 하는 약물일 수 있다. 다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질 중에서 선택된 것인， 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 제 1 단백질이 2종 이상 사용되는 경우, 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료는 상기 2종 이상의 제 1 단백질 중 어느 하나 또는 2종 이상을 표적으로 하는 치료일 수 있다. 상기 치료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및 /또는 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이 경우， 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물이 소망하는 효과를 발휘할 수 있는 개체를 의미할 수 있다.

다른 예는， 제 1 단백질올 표적으로 하는 약물이 처리된 세포 또는 조직， 또는 상기 약물을 투여한 개체로부터 분리된 세포 또는 조직에서 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질인， 상기 세포 또는 조직, 또는 상기 개체의 상기 제 1 .단백질을 표적으로 하는 약물 처리 후의 상기 약물에 대한 반응성을 모니터링하는 방법 또는 모니터링에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

다른 예는， 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물이 처리된 분리된 세포 또는 조직에서 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질—단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고， 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하위 단백질인， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 스크리닝 방법을 제공한다 .

이하, 보다 상세히 설명한다.

본 명세서에서 사용된 바로서, 용어 "단백질-단백질 상호작용 (prote in-protein interact i on : PPI ) "은 ^' 제 1 단백질과 게 2 단백질 간의 물리적 및 /또는 화학적 결합 또는 복합체 형성을 의미할 수 있으며， 예컨대， 결합 빈도， 결합 세기 (강도) , 및 결합 시간 등의 인자들 중에서 하나 이상으로 측정될 수 있다. 또한, 상기 제 1 단백질과 게 2 단백질. 간의 상호작용 (결합)은 이들 간의 직접적인 상호작용 (결합)뿐 아니라 중간에 다른 단백질 (신호전달경로 중에서 제 1 단백질 및 제 2 단백질 사이에 위치하는 단백질)을 매개로 한 상호작용 (결합)도 포함할 수 있다. 본 명세서에서의 단백질-단백질 상호작용은 단분자 (s ingl e mol ecul e) 반응 ( 1 분자의 제 1 단백질과 1 분자의 제 2 단백질 간의 반응)일 수 있다.

본 명세서에서, 제 1 단백질과 제 2 단백질은 각각 독립적으로 진핵 유기체 (예컨대， 다세포 동물, 다세포 식물 등)의 세포 또는 조직의 신호전달경로에 관여하는 단백질 중에서 선택되는 1종 이상이다. 따라서, 상기 제 1 단백질 및 제 2 단백질 간의 단백질-단백질 상호작용은 생체 신호경로상의 상호작용이므로, 약하고 일시적인 상호작용 (weak and trans i ent protein-protein interact i on)이 아닐 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서， 제 1 단백질은 신호전달경로에 관여하는 1종 이상 (예컨대, 1종 내지 10종, 1종 내지 8종, 1종 내지 6종， 1종 내지 5종， 1종 내지 4종， 1종 내지 3종, 2종 내지 10종, 2종 내지 8종， 2종 내지 6종, 2종 내지 5종， 2종 내지 4종, 2종 내지 3종， 3종 내지 10종, 3종 _. 내지 8종, 3종 내지 6종， 3종 내지 5종, 또는 3종 내지 4종)의 단백질을 의미할 수 있다. 또한, 제 2 단백질은 상기 제 1 단백질과 상호작용 (결합)하는 단백질로서, 상기 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 하위 경로에 관여하는 단백질 중에서 선택된 1종 이상, 2종 이상 또는 3종 이상 (예컨대, 1종 내지 10종， 1종 내지 8종, 1종 내지 6종, 1종 내지 5종, 1종 내지 4종， 1종 내지 3종， 2종 내지 10종, 2종 내지 8종， 2종 내지 6종, 2종 내지 5종， 2종 내지 4종, 2종 내지 3종， 3종 내지 10종, 3종 내지 8종， 3종 내지 6종， 3종 내지 5종， 또는 3종 내지 4종)의 단백질을 의미할 수 있다. 제 1 단백질이 2종 이상인 경우， 상기 제 2 단백질은 제 1 단백질 각각에 대하여 독립적으로 1종 이상 선택될 수 있으며, 각각의 제 1 단백질에 대하여 선택된 제 2 단백질은 서로 다르거나， 부분적으로 또는 전부 중복될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 상기 제 1 단백질은 병적 상태 (예컨대, 암, 염증, 그 외 면역 질환 둥)와 관련 있는 단백질들 중에서 선택됨으로써, 이들이 관련된 병적 상태 (예컨대， 암， 염증, 그 외 면역 질환 등)의 치료 (및 /또는 개선 및 /또는 경감)에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 측면에서, 상기 제 1 단백질은 치료하고자 하는 질병의 치료 타겟이 되는 단백질일 수 있다. 구체적으로， 상기 제 1 단백질은' 치료하고자 하는 질병에 대한 표적 치료제 또는 효과를 시험하고자 하는 치료제의 표적이 되는 단백질일 수 있다. 따라서, 상기 제 1 단백질은 치료하고자 하는 질병 또는 효과를 알고자 하는 치료제에 따라서 적절히 선택될 수 있다.

일 예에서, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직의 생체 신호전달경로 중 상위 경로에 관여하는 단백질 중에서 선택될 수 있으며， 약물의 치료 타겟으로서 유리하게 작용하기 위하여， 세포외 (ext racel lul ar ) 환경 (예컨대, 수성 환경)에 노출된 도메인을 갖고 세포막에 존재하는 세포막 단백질 중에서 1종 이상， 2종 이상 또는 3종 이상 (예컨대， 1종 내지 10종, 1종 내지 8종, 1종 내지 6종， 1종 내지 5종， 1종 내지 4종, 1종 내지 3종， 2종 내지 10종， 2종 내지 8종， 2종 내지 6종, 2종 내지 5종, 2종 내지 4종， 2종 내지 3종, 3종 내지 10종 3종 내지 8종， 3종 내지 6종, 3종 내지 5종， 또는 3종 내지 4종) 선택될 수 있다. 예컨대, 상기 제 1 단백질은 세포막에 존재하는 다양한 수용체, 마이크로필라멘트 (microfilaments)와 결합된 구조단백질 (structural proteins) , 세포부착분자 (cell adhesion molecules) , 세포막 효소 (membrane enzymes) , 세.포막 수용체 (membrane receptors) , 캐리어 단백질 (carrier proteins), 채널 단백질 (channel proteins), 운반 단백질 (transport proteins) , 지질 고정 단백질 ( 1 ip id一 anchored proteins) 등 모든 종류의 세포막 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 2종 이상 또는 3종 이상 (예컨대， 1종 내지 10종， 1종 내지 8종, 1종 내지 6종, 1종 내지 5종， 1종 내지 4종, 1종 내지 3종， 2종 내지 10종， 2종 내지 8종， 2종 내지 6종， 2종 내지 5종, 2종 내지 4종， 2종 내지 3종， 3종 내지 10종 3종 내지 8종， 3종 내지 6종, 3종 내지 5종， 또는 3종 내지 4종)일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 제 1 단백질은 수용체 티로신 카이네이즈류 (Receptor Tyrosine Kinase; RT ) (예컨대， 상피세포 성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor； EGFR; ErbBl) , HER2( Human E idermal growth factor Receptor 2 protein; ErbB2) , HER3( Human Epidermal growth factor Receptor 3 protein; ErbB3) , 간세포 성장인자 수용체 (hepatocyte growth factor receptor (HGF )； MET), 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors； PDGFR , 예컨대, PDGFR-alpha, PDGFR-beta 등), 혈관내피세포 성장인자 수용체 (vascular endothelial growth factors; VEGFR, 예컨대 VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3 등), 인슐린 -유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF1R) , 에프린 수용체 (ephrin receptors), 섬유아세포 성장인자 수용체 (Fibroblast growth factor receptor; FGFR, 예컨대ᅳ FGFR1, FGFR2 등)， 인슐린 -유사 성장인자 수용체 (Insulin— like Growth Factor Receptor; IGFR, 예컨대, IGF1R 등), c— KIT, RET receptor tyrosine kinase. Anaplastic lymphoma kinase (ALK) , 등); 틀—유사 수용체 (Toll— like receptor; 예컨대， TLRl ^' , TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10 , TLRll, TLR12 , TLR13); G_단백질 연결 수용체류 (G-protein- cou led receptors; GPCR)； 트랜스페린 수용체 (transferrin receptors)； 저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein; LDL) 수용체; R0S1; BCR-Abll 융합 단백질; 비수용체형 카이네이즈류 (예컨대, BRAF, MEK (Mitogen一 activated protein kinase kinase) , Src , PI3K (Phosphoinosi t ide 3_ kinase), CD (Cycl in-dependent kinases; 예컨대, CD 4, CDK6 등) 등); GTP 가수분해효소류 (GTPases.) (예컨대， KRAS 등); 호르몬 수용체류 (예컨대， 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 안드로겐 수용체 (AR) 등); 항 -아팝토시스 단백질류 (Anti-apoptotic proteins) (예컨대, BCL2 (B-cell lymphoma 2), BIM (Bcl-2-like protein 11)； 면역 체크포인트 단백질류 (Immune checkpoint proteins) (예컨대， CTLA— 4 (cytotoxic T— lymphocyteᅳ associated antigen 4)， PD-1 (programmed death 1), PD-L1

(programmed death-1 igand 1) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상, 2종 이상 또는 3종 이상 (예컨대， 1종 내지 10종， 1종 내지 8종， 1종 내지 6종, 1종 내지 5종, 1종 내지 4종， 1종 내지 3종， 2종 내지 10종， 2종 내지 8종， 2종 내지 6종 2종 내지 5종, 2종 내지 4종, 2종 내지 3종， 3종 내지 10종， 3종 내지 8종， 3종 내지 6종, 3종 내지 5종, 또는 3종 내직 4종)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 "간세포 성장인자 수용체 (MET 또는 c— Met)"은 간세포 성장인자와 결합하는 수용체 티로신 카이네이즈를 의미한다. 상기 c— Met 단백질은 모든 종에서 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대， 인간 c-Met (예컨대， NP— 000236.2)， 원숭이 c_Met (예컨대, Macaca mulatta, NP_001162100) 등과 같은 영장류 유래의 것, 또는 마우스 c-Met (예컨대， NP— 032617.2)， 래트 c_Met (예컨대, NP_113705.1) 등과 같은 설치류 유래의 것 등일 수 있다. 상기 단백질은 예를 들면， GenBank Aceession Number 匪— 000245.3에 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드， 또는 GenBank Aceession Number NP 300236.2에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 단백질， 또는 그의 세포외 도메인을 포함한다. 수용체 티로신 키나제 c-Met은 예를 들면, 암발생, 암전이， 암세포 이동， 암세포 침투， 신생혈관 생성 과정 등의 여러 가지 기작에 관여한다.

상기 "상피세포성장인자 수용체 (Epidermal growth factor receptor; EGFR)" , HER2( human e idermal growth factor receptor 2 protein) , 및 HER3( human Epidermal growth factor receptor 3 protein)는 각각 EGFR (HERD, HER2, HER3 및 HER4으로 구성되어 있는 HER 패밀리의 수용체 티로신 키나아제 (RTKs)의 일원이다. EGFR, HER2, 또는 HER3의 세포외 도메인에 대한 리간드의 결합은 다른 ErbB 수용체와의 리셉터 호모- 또는 해테로 -이량체화를 유도하며, 이는 특이적인 티로신 잔기의 세포내 자가인산화를 유발한다. EGFR 자가인산화는 세포 증식， 혈관신생 및 전이에 영향을 미치는 MAPK 및 PI3K/Akt 활성화를 포함한 다운스트림 신호전달 네트워크를 이끈다. EGFR, HER2, 및 /또는 HER3의 과발현， 유전자 증폭， 돌연변이, 또는 재배열은 여러 종류의 인간 악성 종양에서 빈번히 관찰되며， 암 치료의 불량한 예후 및 나쁜 임상적 결과와 관련 있다. 이러한 이유로, 이들 EGFR, HER2, 및 /또는 HER3는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. 상기 EGFR, HER2, 또는 HER3는 인간， 원숭이 등의 영장류， 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 EGFR은 GenBank Accession Nos. JQ739160, JQ739161, JQ739162, JQ739163, JQ739164, JQ739165, JQ739166, JQ739167, 画 _005228.3, 匪_201284.1， NM_201282.1, 또는 NM 201283.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대 상기 HER2는 GenBank Accession No. X03363.1 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다. 예컨대ᅳ 상기 HER3는 GenBank Accession Nc). 丽— 001982 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "혈관내피세포 성장 인자 수용체 (Vascular Endothelial Cell Growth Factor Receptor: VEGFR)' '는 혈관내피세포 성장 인자 정상세포에서도 존재하며, 특히 암세포에서 분비되는 혈관내피세포 성장인자 (VEGF)와 결합하여 혈관신생을 일으키며， 암세포에 필요한 양분올 공급한다. VEGFR의 과발현은 다양한 질병의 원인이되며， 특히 암의 발생뿐 아니라， 침습, 전이 등의 나쁜 예후에도 관여한다. 이러한 이유로, VEGF는 항암 요법에 있어서 중요한 표적이 된다. 상기 VEGFR은 인간., 원숭이 등의 영장류, 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 VEGFR은 GenBank Accession Number AF063657.2 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 혈소판유래 성장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptors; PDGFR)"는 표면 수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로， 세포증식, 세포분화， 세포성장 등의 조절 및 암을 일으키는 많은 질병과 관련 있다. 상기 PDGFR은 인간， 원승이 등의 영장류， 마우스, 래트 둥의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 PDGFR은 GenBank Accession Nos. NM— 006206.4 (PDGFR-A)， NM_002609.3(PDGFR-B)， NM— 016205.2(PDGFR-C) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "인슐린 -유사 성장인자 1 수용체 (Insulin-like Growth Factor 1 Receptor; IGF!R)"는 수용체 티로신 카이네이즈 증 하나로， 인슐린 -유사 성장인자 l(IGF-l)에 의하여 활성화되는 막통과 수용체이다. 상기 IGF1R은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 IGF1R은 GenBank Accession No. 匪— 000875.3 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "에프린 수용체 (ephrin receptors) "는 표면 수용체 티로신 카이네이즈 중 하나로， axon guidance , format ion of tissue boundaries, cell migration, segmentation 등의 배발생 과정을 조절한다. 상기 에프린 수용체는 인간, 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 에프린 수용체는 GenBank Accession Nos. 匪 _004440.3， NM— 004438.3， 匪— 004431.3, 匪 _004442.6, NM_017449.3, 匪_004093.3， 匪 _004441.4， 丽— 182472.2， 匪 _005232.4, NM— 005233.5, 匪_173641.2, 醒 _001099439.1, 蘭一 001080448.2, NM_001080448.2, 丽 _004443.3， 匪ᅳ 182689.1, NM_004428.2, 匪 _004439.5， NM_001962.2, NM— 004429.4， 匪— 182644.2， NM_004952.4, NM— 173655.2, 丽— 182690.2, 丽 _020526.3, NM_001406.3, 匪_005227.2， 丽— 182685.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "트랜스페린 수용체 (transferrin receptors) "는 트랜스페린의 캐리어 단백질로, 수용체—매개 엔도사이토시스를 통하여 철의 세포내 이동에 관여하며, 세포내 철 농도를 조절한다. 상기 트랜스페린 수용체는 인간， 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 트랜스페린 수용체는 GenBank Accession Nos. 匪 _001128148.1， 匪_003234.2， NM_001206855.1 , 匪_003227.3， BC001188.1, M11507.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "저밀도지질단백질 (Low-Density Lipoprotein; LDL) 수용체 "는 트랜스페린의 캐리어 단백질로, 수용체 -매개 엔도사이토시스를 통하여 철의 세포내 이동에 관여하며, 세포내 철 농도를 조절한다. 상기 LDL 수용체는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 트랜스페린 수용체는 GenBank Accession Nos. NM— 000527.4 , 醒 _001195802.1， 匪― 001195799.1， NM_001195803.1, NM X) 1195800.1 , NM_001195798.1 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "표면 분화 항원류 (cluster of differentiation; cluster of designation; CD)"는 수용체 또는 리간드로서 다양하게 작용하는 단백질로서， 인간의 경우 약 350 가지가 알려져 있고, 세포 신호화 (cell signaling), 세포 부착 등의 다양한 세포 과정에 관여한다. 상기 표면 분화 항원류는 인간， 원숭이 등의 영장류， 마우스, 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， 상기 표면 분화 항원류는 모든 CD 계열일 수 있으며, 특히 암 전이와 관련된 CD44, CD 147, 또는 이의 variant들일 수 있고， 보다 구체적으로 GenBank Accession Nos. (NM_000610.3, NM— 001728.3, X55150.1) 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 "G-단백질 연결 수용체 (G-prote in-coupled receptors;

GPCR)"는 막통과 수용체 단백질로， 신호 도입 경로 (signal transduction pathway) 및 세포 반응을 활성화하며 , 다양한 질병에 관여한다. GPCR은 거대한 단백질군으로 서열 상동성 및 기능적 유사성을 기초로 6개의 클래스로 분류될 수 있다: 클래스 A 또는 클래스 1 (Rhodopsin-like receptors)； 클래스 B 또는 클래스 2 (Secret in receptor family); 클래스 C 또는 클래스 3 (Metabotro ic glutamate/pheromone)； 클래스 D 또는 클래스 4 (Fungal mat ing pheromone receptors)； 클래스 E.또는 클래스 5 (Cyclic AMP receptors); 및 클래스 F 또는 클래스 6 (Frizzled/Smoothened). 상기 GPCR은 인간， 원숭이 등의 영장류， 마우스， 래트 등의 설치류 등의 포유류로부터 유래된 것일 수 있다. 예컨대， GPCR은 암 전이에 관련되는 케모카인 수용체 (chemokine receptors; Rhodopsin-like receptor subfamily), 예컨대, CXC 케모카인 수용체， CC 케모카인 수용체， CX3C 케모카인 수용체, 등일 수 있으며， 보다 구체적으로 GenBank Accession Nos. NM— 001123041.2, NM_005508.4 匪_005201.3， NM_016602.2 등에 제공된 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의해 암호화된 폴리펩타이드일 수 있다.

상기 제 2 단백질은 앞서 설명한 바와 같이 선택된 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직의 생체 신호전달경로의 하위 경로에 관여하는 단백질들 중에서 1종 이상， 2종 이상 또는 3종 이상 (예컨대， 1종 내지 10종， 1종 내지 8종， 1종 내지 6종， 1종 내지 5종, 1종 내지 4종， 1종 내지 3종， 2종 내지 10종, 2종 내지 8종， 2종 내지 6종, 2종 내지 5종， 2종 내지 4종， 2종 내지 3종， 3종 내지 10종， 3종 내지 8종， 3종 내지 6종， 3종 내지 5종， 또는 3종 내지 4종) 선택될 수 있다. 세포 또는 조직， 예컨대, 인간의 세포 또는 조직의 신호전달경로 및 여기에 관여하는 단백질들은 비교적 잘 정립되어 있으므로 (Untangling the ErbB signalling network, Nat. Rev. Mol . Cell Biol . 2， 127 (2001)； Cell signaling by receptor tyrosine kinases, Cell 141， 1117 (2010) 참조)， 제 1 단백질이 선정되면, 그 하류의 신호전달경로에 관여하는 단백질을 선정하는 것은 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 사항이라 할 수 있다.

또한, 상기 "제 2 단백질이 상기 제 1 단백질의 하위 신호전달경로에 관여한다' '고 함은 제 2 단백질이, 제 1 단백질이 상위에서 신호를 전달하는 신호전달경로 상에서， 게 1 단백질과 직접적으로 상호작용하는 단백질 및 하나 이상의 단백질을 매개로 제 1 단백질과 간접적으로 상호작용하는 단백질 모두로부터 선택되는 단백질임을 의미한다.

또한, 하나의 단백질이 다양한 생체 신호전달경로에 관여하여, 다수의 신호전달경로가 네트워크를 형성할 수 있음도 잘 알려져 있다. 따라서, 제 1 단백질이 2종 이상인 경우， 어느 하나의 제 1 단백질에 대한 제 2 단백질 중 하나 이상은 다른 제 1 단백질 (들)에 대한 제 2 단백질들 중 하나 이상과 중복될 수 있다 (즉， 제 1 단백질이 2개 이상인 경우， 이들 2개 이상의 제 1 단백질들에 대한 제 2 단백질들은 서로 다르거나, 일부 또는 전부가 동일할 수 있다).

일 구체예에서， 상기 제 1 단백질은 EGFR, MET, HER2, 및 HER3로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 각각의 제 1 단백질에 대한 제 2 단백질은 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로, 포스포리파아제 C (PLC) (예컨대, PLC— gamma (PLC-gamma 1) (예컨대, GenBank Accession No. NP_002651.2, NP— 877963.1, NP_037319.1 등), 또는 이의 SH2 도메인 (Src homology 2 domain: N— terminal SH2 domain 및 C- terminal SH domain 중 하나 이상을 포함; 예컨대, NP— 037319.1 중의 545번째부터 765번째까지의 아미노산 서열 부위 또는 NP_002651.2 중의 540번째 또는 545번째부터 765번째까지의 아미노산 서열 부위 등)， 성장인자 수용체 결합 단백질 (Growth factor receptor-binding protein: Grb; 예컨대， Grb2 (예컨대, GenBank Accession No. NP_002077.1 , NP_987102.1 등) 또는 이의 일부 (예컨대, SH2 도메인 (NP_002077.1의 57번째부터 155번째까지의 아미노산 서열 부위)， SH3_N-SH2 도메인 (NP_002077.1의 첫 번째부터 154번째까지의 아미노사 서열 부위)， SH2- SH3_C 도메인 (NP— 002077.1의 57번째부터 217번째까지의 아미노산 서열 부위)) , 포스파티딜이노시를 3-카이네이즈 조절 서브유닛 (Phosphatidyl inositol 3-kinase regulatory subuni t al ha; PIK3R1； p85- alpha; 예컨대, GenBank Accession No. NP— 001229395.1 , NP— 852556.2, NP_852664.1, NP_852665.1 , P26450.2 등) 또는 이의 SH2 도메인 (예컨대， P— 852664.1 (human p85a)의 SH2_N 도메인 (333번째부터 428번째까지의 아미노산 서열 부위), SH2)_C 도메인 (624번째부터 718번째까지의 아미노산 서열 부위)， 또는 tandem SH2 도메인 (333번째부터 718번째까지의 아미노산 서열 부위); 또는 P26450 (mouse p85a)의 SH2_N 도메인 (333번째부터 428번째까지의 아미노산 서열 부위)， SH2_C 도메인 (624번째부터 718번째까지의 아미노산 서열 부위) 또는 tandem SH2 도메인 (333번째부터 718번째까지의 아미노산 서열 부위)) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 제공된 구체예에서는, 폐암의 경우， 제 1 단백질로 EGFR, MET, HER2, 및 HER3의 조합을 사용하고, 이들 제 1 단백질의 공통된 거 12 단백질로서 PLC-ga誦 a 1, Grb2, 및 p85_alpha를 사용하였으며， 유방암의 경우, 게 1 단백질로 HER2 및 HER3의 조합을 사용하고, 이들 제 1 단백질의 공통된 제 2 단백질로서 PLC— gamma 1, Grb2, 및 p85-alpha를 사용하는 것을 예시하고 있으나， 이에 제한되는 것은 아니며， 앞서 설명한 내용에 기초하여 치료하고자 하는 질병 또는 효과를 알고자 하는 치료제에 따라서 적절하게 선택될 수 있고, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 사항이다.

본 명세서에서 제공되는 방법에서 수행되는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계는 분리된 세포 또는 조직에 대하여 생체 외 또는 세포 외 Un / /·ο)에서 수행되는 것일 수 있다.

상기 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계는 다음의 단계를 포함할 수 있다:

(1) 제 1 단백질을 포함하는 시험 시료를， 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계 ;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 (표지 물질이 결합된) 거 12 단백질을 첨가하여 반웅시키는 단계;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반웅물로부터 신호를 측정하는 단계

(단백질-단백질 상호작용 측정)； 및

(4) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 제 1 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계 . .

상기 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 제 1 단백질의 활성화 수준을 측정하는 단계 (4)는 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계일 수 있다.

일 예에서， 상기 단계 (4)는，

단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계를 통하여 수행하거나，

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질—단백질 상호작용 수준 측정) ; 및

(4-2) 상기 단계 (4—1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정)

를 포함

할 수 있다.

상기 측정된 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질—단백질 상호작용을 이용하여 소망하는 사항을 측정 (확인， 결정 또는 분석)하기 위하여， 상기 단계 (4) 이후에 ,

(5) 단계 (4)에서 얻어진 결과를 기준 시료에서 얻어진 결과와 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하， 상기 단계를 보다 상세히 설명한다:

단계 ( 1) : 제 1 단백질이 고정화된 기판 준비 단계

상기 단계 ( 1)은 제 1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기관에 가하여 거 11 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계이다.

상기 제 1 단백질은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 시험 시료는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 거 U 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 등을 시험하는데 사용 가능한 모든 생물 시료일 수 있다.

예컨대 , 상기 시험 시료는 개체로부터 분리된 세포， 조직， 세포 또는 조직의 용해물 파쇄물， 또는 추출물， 체액 (예컨대， 혈액 (전혈， 혈장, 또는 혈청), 타액 등)일 수 있다. 상기 개체는 게 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 시험, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 시험， 제 1 단백질 표적 .치료에 적절한 대상인지 여부의 결정, 제 1 단백질 표적 치료 효과의 모니터링, 및 /또는 효과적인 제 1 단백질 표적 치료제의 선정 등을 수행하고자 하는 모든 포유류 (예컨대， 인간 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 일 예에서ᅳ 상기 개체는 제 1 단백질과 관련된 질병을 갖는 환자일 수 있다. 상기 제 1 단백질과 관련된 질병은 제 1 단백질의 과발현 또는 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며, 예컨대, 암일 수 있다. 일 구체예에서， 상기 시험 시료는 개별 암환자 (예컨대， 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 정도 또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 시험하거나， 제 1 단백질 표적 치료에 적절한 대상인지 여부를 결정하거나, 또는 효과적인 게 1 단백질 표적 치료제의 선정하고자 하는 특정 개체)로부터 분리된 세포, 예컨대， 암 세포를 포함하는 것일 수 있다. 조직의 경우 분쇄를 위하여 최소 125 mm ³ 이상의 크기이면 족하고， 1회 측정에 필요한 조직 시료의 양은 위에서 언급한 조직의 양 (최소 125 議 ³ 이상)의 약 1/50 내지 약 1/75 범위로 할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 세포 (암세포)의 경우， 1회 측정에 필요한 세포 시료의 양은 약 10 cells 내지 10 ¹⁰ cells, 약 10 cells 내지 10 ⁷ cells, 약 10 cells 내지 10 ⁵ cells' 약 10 ³ cells 내지 10 ¹⁰ cells, 약 10 ³ cells 내지 10 ⁷ cells, 약 10 ³ cells 내지 10 ⁵ cells, 예컨대 약 10 ⁴ ±50 cells 정도일 일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니며, 세포주의 종류에 따라서 적절하게 정해질 수 있는 값이다.

일 예에서, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 예측 및 /또는 게 1.단백질 표적 치료에 적절한 대상의 선별 방법의 경우, 상기 시험 시료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료 (예컨대, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여)가 수행되지 않은 세포 또는 조직， 또는 상기 치료 (또는 약물의 투여)가 수행되지 않은 개체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있으며, 제 1 단백질을 표적으로 치료에 대한 반웅성을 모니터링하는 방법의 경우， 상기 시험 시료는 게 1 단백질을 표적으로 하는 치료 (예컨대, 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여)가 수행된 세포 또는 조직， 또는 상기 치료 (또는 약물의 투여)가 수행된 개체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다.

상기 기판은 표면에 제 1 단백질을 고정시킬 수 있는 모든 재질 및 /또는 모든 구조를 갖는 것일 수 있다 (결정질 또는 비결정질 모두 사용 가능함) . 일 예에서, 상기 기판은, 표지 신호의 검출 용이성을 고려하여， 빛의 굴절를이 생체 물질의 많은 부분을 차지하는 물의 굴절률 (약 1 .3) 이상인 재질일 수 있다. 일 예에서, 상기 기판은 두께가 약 0. 1 내지 약 1 mm , 약 0. 1 내지 약 0.5 mm , 0 . 1 내지 약 0.25 mm , 또는 약 0. 13 내지 약 0.21 麵 정도일 수 있으몌 굴절를이 약 1.3 내지 약 2 , 약 1.3 내지 약 1.8 , 약 1 .3 내지 약 1 .6 , 또는 약 1 .5 내지 약 1 .54 정도인 것일 수 있다. 상기 기판은 상기 굴절를 범위를 만족시키는 모든 재질일 수 있으며, 예컨대 유리 (굴절률: 약 1.52) , 석영 등으로 이루어진 군에서 선택된 재질로부터 얻어진 것일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다ᅳ 상기 기판은 생물 시료 관찰에 통상적으로 사용되는 모든 형태를 갖는 것일 수 았으며, 예컨대, 웰 타입, 슬라이드 타입， 채널 타입， 어레이 형태, 미세유체칩, 미세관 (캐필러리) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 형광현미경 관찰시, 상기 시료가 적용된 기판 위에 커버글라스를 장착하여 관찰할 수 있으며， 커버글라스의 재질은 앞서 기판에서 설명한 바와 같고， 두께는 기판에서 설명한 범위 또는 이보다 얇을 수 있다 (예컨대, 굴절률 1.52， 두께 0. 17瞧일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아님) . 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제 1 단백질과 특이적으로 결합할 수 있는 모든 물질로부터 선택된 것일 수 있으며， 예컨대, 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원결합단편 (예컨대, 항체의 scFV, (scFv)2 , scFv-Fc, Fab , Fab ' 및 F(ab ' )2 등)， 압타머 (단백질 또는 핵산분자)， 소분자 화합물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 때， 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 제 1 단백질과 게 2 단백질과의 상호작용을 방해하지 않는 부위, 즉, 제 1 단백질과 제 2 단백질이 상호작용 (결합)하는 부위가 아닌 부위에서 게 1 단백질과 결합하는 것일 수 있다.

일 예에서 , 상기 기판은 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 (예컨대, 항체 등)을 표면에 포함 (고정)하기 위하여 적절히 표면개질되거나, 표면에 직접 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질이 고정된 것일 수 있다. 상기 기판이 표면개질된 경우, 상기 기판은 일면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 생물학적 물질 (예컨대, 항체 등)을 고정화시킬 수 있는 작용기를 갖는 모든 화합물로 처리 (예컨대， 도포)될 수 있으며, 예컨대, 알데히드기， 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물로 처리될 수 있다. 일 구체예에서， 상기 알데히드기 , 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물은 바이오틴 (biotin), 소혈청알부민 (Bovine serum albumin; BSA) , 바이오틴이 결합된 소혈청알부민 , 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol; PEG), 바이오틴이 결합된 PEG (풀리에틸렌글리콜 -바이오틴; PEGᅳ biotin), 폴리소베이트 (e.g., Tween20) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표면 처리된 기판은 뉴트라비딘 (neutravidin), 스트렙타비딘 (streptavidin), 아비딘 (avidin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 처리 (예컨대 , 도포)돨수 있다ᅳ

단계 (2): 제 1 단백질과 제 2 단백질을 반응시키는 단계

상기 단계 (2)는, 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에ᅳ 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반웅시키는 단계이다.

상기 제 2 단백질은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 표지된 제 2 단백질은 제 2 단백질이 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이., 예컨대， 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적), 재조합적, 또는 물리적으로， 결합되거나)， 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태를 의미할 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 통상적인 효소 반응， 형광 발광， 및 /또는 방사선 검출을 통하여 측정될 수 있는 모든 신호 (예컨대， 빛， 방사선 등)들 중에서 선택될 수 있다. 상기 표지 물질은 상기 표지 신호를 발생시킬 수 있는 모든 소분자 화합물, 단백질， 펩타이드， 핵산분자 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, 형광 염료 (소분자 화합물; Cyanine, Alex, Dylight, Fluoprobes 등), 형광 단백질 (예컨대， 녹색형광단백질 (GFP, enhanced GFP) , 황색형광단백질 (YFP)， 청록색형광단백질 (CFP) , 청색형광단백질 (BPF) , 적색형광단백질 (RPF) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 tag은 Hi s-tag I Ni-NTA 등과 같이 통상적으로 사용되는 모든 종류에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 표지 물질의 사용 농도는， 노이즈를 발생시키지 않고 정확하고 용이한 검출이 가능하도록 하기 위하여, 약 luM 이하의 범위에서 적절하게 정할 수 있으며， 예컨대 , InM 내지 ΙΟΟΟηΜ, InM 내지 500nM, InM 내지 ΙΟΟηΜ, ΙΟηΜ 내지 ΙΟΟΟηΜ , ΙΟηΜ 내지 500nM, 또는 ΙΟηΜ 내지 ΙΟΟηΜ 정도일 수 있으나, 이에 ^' 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 표지물질로부터 발생하는 신호는 이를 검출 또는 측정하는데 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단 (예컨대, 통상의 형광 현미경， 형광 카메라, 형광세기 측정 (정량) 장치 등)에 의하여 측정될 수 있다.

제 1 단백질과 제 2 단백질 간의 상호작용을 보다 정확하게 측정하기 위하여, 반웅시키는 단계 (단계 (2) )와 후속하는 단백질-단백질 상호작용 측정 단계 (단계 (3) ) 사이에， 상기 반웅이 일어난 기판을 통상적인 방법으로 세척하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

단계 (3) : 단백질-단백질 상호작용 측정 단계

상기 단계 (3)은 상기 단계 (2)에서 얻.어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계이다. 상기 신호 측정은 단계 (2)에서 사용된 표지 신호 (예컨대， 효소 반웅， 형광， 발광ᅳ 또는 방사선 검출 등의 통상적인 방법을 통하여 측정 가능한 신호)를 검출 (또는 측정 또는 확인)할 수 있는 모든 수단을 사용하여 수행될 수 있다.

- 일 예에서， 단계 (3)에서의 단백질-단백질 상호작용 측정은 실시간 분석에 의한 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 표지 신호가 형광 신호인 경우, 상기 신호 검출은 상기 형광 신호를 발생시키는 표지 물질이 흡수하는 광원을 공급하여 발생하는 형광 신호를, 예컨대， 형광 현미경, 형광 카메라ᅳ 및 /또는 형광 세기 측정 (정량) 장치 등을 사용하여, 영상화하거나 및 /또는 정량할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 신호는 형광 신호인 경우, 상기 형광 신호는 형광 카메라를 이용하여 영.상화 및 /또는 정량할 수 있다.

상기 신호가 형광 신호인 경우， 단계 (3) (단백질-단백질 상호작용 측정 단계)은 ( i ) 상기 단계 (2)의 반응물에 광원을 공급하는 단계; 및

( i i ) 상기 공급된 광원에 의하여 발생한 형광 신호를 검출하는 단계 를 포함할 수 있다ᅳ

상기 단계 ( i )의 광원을 공급하는 단계는 상기 단계 (2)에서 얻어진 제 1 단백질과 제 2 단백질의 반웅물에 광원을 공급하는 단계로서， 이와 같은 목적을 달성할 수 있다면， 광원의 공급 시기는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 상기 광원은 단계 ( 1) 이전, 동시, 또는 이후부터 단계 (2) 이후까지 지속적으로 공급되거나， 단계 (2) 직전， 동시， 또는 직후에 소정의 시간 동만 공급될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 광원은 형광 신호에 해당하는 파장을 갖는 모든 광원일 수 있으며, 예컨대, 레이저, 할로겐 램프 등일 수 있다.

상기 광원의 파장은 사용된 형광 신호에 따라서 조절될 수 있으며， 예컨대, 약 300nm 내지 약 600nm 또는 약 350nm 내지 약 560nm 범위에서 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, 녹색형광단백질은 약 480nm를 흡수하고, 황색형광단백질은 약 540nm를 흡수하고, 청색형광단백질은 약 375nm를 흡수하고, 청록색형광단백질은 약 425nm을 흡수하므로, 형광 신호로 녹색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 460 내지 약 500nm , 형광 신호로 황색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 520 내지 약 560nm , 형광 신호로 청색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 350 내지 약 400 , 형광 신호로 청록색 형광을 사용하는 경우 상기 광원의 파장은 약 400 내지 약 450訓 범위에서 선택될 수 있다.

일 구체예에서, 단계 (3)의 단백질—단백질 상호작용 측정 단계는 전반사 형광 현미경 (Total Internal Ref lect ion Fluorescence (TIRF) mi croscope) 또는 공초점 현미경 등을 사용하여 광원을 공급하고， 통상적인 방법으로 형광 신호를 관찰하여 수행될 수 있다. 다론 예에서， 상기 전반사 형광 현미경에 신호 영상화를 위한 형광 카메라, 예컨대 EMCCD (Elect ron-mul t iplying charge-cou led devi ce) 카메라 또는 CMOS (Compl ement ary metal oxi de semi conductor ) 카메라를 장착하여 사용함으로써， 광원 공급 및 형광 신호의 영상화 및 /또는 정량을 수행할 수 있다.

다음에서는 단계 (3)의 단백질-단백질 상호작용 측정 단계를 전반사 현미경 및 형광 카메라를 사용하여 수행하는 경우를 예를 들어 보다 상세히 설명한다: 가) 상기 단계 (1) 또는 단계 (2)의 기판을 전반사 현미경에 장착시킨다. 전반사 현미경에서 광원의 공급 위치는 통상적으로 아래쪽이며, 전반사 현미경 종류에 따라서， 형광 신호를 기판의 위 (이 경우, 아래에서 위 방향으로, 광원 공급부， 기판, 렌즈， 또는 기판, 광원 공급부, 렌즈의 순서로 위치할 수 있음) 또는 아래에서 (이 경우， 아래에서 위 방향으로, 렌즈， 광원 공급부, 기판, 또는 광원 공급부， 렌즈, 기판， 또는 렌즈， 기판, 광원 공급부의 순서로 위치할 수 있음) 관찰할 수 있다. 나) 광원은 레이저일 수 있으며, 광원의 세기는 약 0.5 mW 내지 약 5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 4.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 4 mW, 약 0.5 mW 내지 약 3.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 3 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2.5 mW, 약 0.5 mW 내지 약 2 mW, 약 1 mW 내지 약 5 mW, 약 1 mW 내지 약 4.5 mW, 약 1 mW 내지 약 4 mW, 약 1 mW 내지 약 3.5 mW, 약 1 mW 내지 약 3 mW, 약 1 mW 내지 약 2.5 mW, 약 1 mW 내지 약 2 mW, 약 1.5 mW 내지 약 5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 4.5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 4 mW, 약 1.5 mW 내지 약 3.5 mW, 약 1.5 mW 내지 약 3 mW, 약 1.5 mW 내지 약 2.5 mW, 또는 약 1.5 mW 내지 약 2 mW, 예컨대， 약 2 mW일 수 있으며， 광원의 파장은 앞서 설명한 바와 같이 형광 신호 또는 사용된 표지 물질, 및 /또는 장비의 구성 (예컨대 감쇄필터를 사용하는 경우 세기가 센 광원을 사용할 수 있음)에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.

다) 상기 광원 공급에 의하여 발생한 형광 신호를 형광 카메라로 촬영하여 영상화 및 /또는 정량할 수 있다.

상기 형광신호의 촬영 (또는 영상화)은， 표지 물질의 형광 신호 발생 유지 시간 (발광시간， lifetime)을 고려하여, 광원 공급과 동시 또는 상기 신호 발생 유지 시간 이내에 수행할 수 있다.

형광 카메라 (예컨대 , EMCCD 카메라)로 형광 신호를 촬영 (또는 영상화)함에 있어서, 1 프레임당 노출시간， 레이저 파워, 카메라 gain값, 총 촬영 프레임 등을 적절하게 조절할 수 있다. 예컨대， 1 프레임 당 노출시간이 짧을수톡 1 프레임에 누적되는 신호가 줄어들게 되며, 이를 상쇄하기 위하여 레이저 파워를 높이거나, 형광 카메라의 감도를 높일 수 있다. 일 예에서, 1 프레임 당 노출시간을 약 0.001초 내지 약 5초， 약 0.001초 내지 약 3초, 약 0.001초 내지 약 2초， 약 0.0이초 내지 약 1초, 약 0.001초 내지 약 0.5초， 약 0.0이초 내지 약 0.3초, 약 0.0이초 내지 약 0.1초, 약 0.01초 내지 약 5초， 약 0.01초 내지 약 3초， 약 0.이초 내지 약 2초, 약 0.01초 내지 약 1초, 약 0.01초 내지 약 0.5초， 약 0.01초 내지 약 0.3초， 약 0.이초 내지 약 0.1초, 약 0.05초 내지 약 5초， 약 0.05초 내지 약 3초， 약 0.05초 내지 약 2초， 약 0.05초 내지 약 1초, 약 0.05초 내지 약 0.5초, 약 0.05초 내지 약 0.3초, 약 0.05초 내지 약 0.1초ᅳ 약 0.07초 내지 약 5초， 약 0. 07초 내지 약 3초, 약 0. 07초 내지 약 2초， 약 ( 07초 내지 약 1초, 약 0. 07초 내지 약 0.5초, 약 0. 07초 내지 약 0.3초, 약 0.07초 내지 약 0.1초, 약 0.1초 내지 약 5초, 약 0.1초 내지 약 3초, 약 0.1초 내지 약 2초， 약 0.1초 내지 약 1초, 약 0.1초 내지 약 0.5초, 또는 약 0.1초 내지 약 0.3초， 예컨대 약 0.1초로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

예컨대, EMCCD 카메라를 사용하는 경우, 표지 물질 (예컨대, eGFP)로부터 생성된 광자 (photon)는 EMCCD의 소자를 통해 전자로 바뀌어 계측된다 (광전효과， photoelectric effect) . 이 때 , 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수를 gain 값을 통해 변경할 수 있다. 설정된 gain값이 높을수록 광자 1개 당 생성되는 전자의 개수가 늘어나서 , EMCCD의 감도가 높아지는 동시에 background noise도 함께 증가하므로 signal-to-noise 비율이 중요하다. 일 구체예에서， 우수한 signal-to-noise 비율을 얻기 위하여 , gain값을 약 10 내지 약 100, 약 10 내지 약 80, 약 10 내지 약 60， 약 10 내지 약 50, 약 20 내지 약 100, 약 20 내지 약 80, 약 20 내지 약 60, 약 20 내지 약 50, 약.30 내지 약 100， 약 30 내지 약 80， 약 30 내지 약 60, 또는 약 30 내지 약 50， 예컨대， 약 40 정도로 정할 수 있지만， 이에 한정되지 않고 카메라의 감도， 수명， 장비 구축 현황， 노이즈, 시험 조건 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있다.

총 촬영 프레임 개수와 노출 시간을 곱하면 총 촬영 시간이 얻어진다 (노출시간 * 총 촬영 프레임 개수 = 촬영 시간). 형광 물질의 발광 시간 (lifetime) 이후에는 형광 신호가 사라지므로， 상기 촬영 시간이 발광시간 내에 진행되도록 총 촬영 프레임 개수 및 /또는 노출 시간을 조절할 수 있다. 단백질—단백질 상호작용 측정 결과의 정확도를 높이기 위하여 , 상기 영상화를 하나 이상， 예컨대, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 5개 이상， 7개 이상, 또는 10개 이상 (상한값은 기판의 크기 및 영상화 가능한 면적에 따라서 결정됨)의 기판 또는 이를 포함하는 하나 이상의 채널 (각 채널은 2개 이상의 기판을 포함함)에서 수행하고， 신호가 나타난 spot (ΡΡΪ complex라고도 함)의 개수를 구하여, 상기 얻어진 형광 신호를 정량화할 수 있으며， 이는 단백질—단백질 상호작용을 정량화한 것으로 볼 수 있다..

다른 예에서, 단계 (3)에서 측정된 형광 세기를 통상적인 장치를 이용하여 수치화함으로써 단백질-단백질 상호작용을 정량할 수도 있다.

제 1 단백질 및 /또는 제 2 단백질을 2종 이상 사용하는 경우, 단계 ( 1) 내지 (3)은 각각의 제 1 단백질과 제 2 단백질 조합에 대하여 각각 수행될 수 있다 (즉, 단계 ( 1) 내지 (3)은 제 1 단백질과 제 2 단백질 조합의 수만큼 반복 수행될 수 있다) .

단계 (4) : 제 1 단백질의 활성화 수준 측정 단계

단계 (4)의 제 1 단백질의 활성화 수준 측정 단계는 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질의 단위량에 대한 신호값 (act ivat i on score)을 구하는 단계일 수 있다.

본 명세서에서， "제 1 단백질의 활성화 "는 제 1 단백질의 제 2 단백질과의 상호작용 (결합)을 의미하고， "제 1 단백질의 활성화 수준' '은 제 1 단백질의 제 2. 단백질과의 상호작용 (결합)의 정도를 의미하고， "활성화된 제 1 단백질 "은 제 2 단백질과 상호작용 (결합)한 제 1 단백질을 의미할 수 있다.

저 U 단백질의 단위량에 대한 신호값이라 함은 제 1 단백질의 단위 중량 또는 농도 (예컨대, lug/ml )에 대한 단계 (3)에서 측정된 신호값 (신호 또는 신호 세기의 정량화된 값)을 의미하는 것으로,

(a) 단계 (3)에서 측정된 신호값을 시험 시료 내의 제 1 단백질의 중량 또는 농도로 나누어 주거나,

(b) 시험 시료 내의 제 1 단백질 중량 또는 농도 증가에 따른 단계 (3)에서 측정된 신호값의 증가분 (즉 시험 시료 내의 게 1 단백질 중량 또는 농도를 X축으로 하고, 단계 (3)에서 측정된 신호값을 y값으로 하여 얻어진 그래프의.기을기)을 구하여 얻어질 수 있다.

본 명세서에서는 시료 내 제 1 단백질의 양보다， 활성화된 게 1 단백질의 비율이 상기 시료가 유래하는 개체에서의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물 반웅성에 보다 유의미한 상관관계를 나타냄을 제안한다. 즉， 시료 내 제 1 단백질의 수준이 낮아도 (즉， 양이 적어도) 활성화된 제 1 단백질의 비율 (활성화 수준: act ivat ion score)이 높은 경우에는 저 U 단백질 양이 많지만 활성화된 제 1 단백질의 비율이 낮은 경우와 비교하여 약물 반응성이 현저히 우수하다 (도 19 및 20 참조) . 따라서， 본 발명은 단백질-단백질 상호작용을 측정하여 이를 제 1 단백질 단위량에 대한 값으로 계산 (제 1 단백질 양으로 나누어줌)하여 약물 반웅성 판단에 보다 정확한 정보를 제공한다는 점을 특징으로 한다.

단계 (4)의 제 1 단백질의 활성화 수준 측정 단계는

( 1 ) 단계 (3)에서 측정된 신호값을 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질의 중량 또는 농도로 나누어 직접적으로 구하거나，

( i i ) 단계 (3)에서 측정된 신호값을 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료의 중량 또는 농도로 나누어 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정 단계) (4-1)， 및 상기 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 내의 제 1 단백질의 중량 또는 농도로 나누어 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정) (4-2)를 통하여 수행될 수 있다.

단.백질—단백질 상호작용 수준 측정 단계 (4-1)

단계 (4-1)의 단백질ᅳ단백질 상호작용 수준 측정 단계는 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계이다.

상기 단백질—단백질 상호작용 수준은 단백질-단백질 상호작용 세기 (PPI strength)로도 표현할 수 있으며, 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 구함으로써 시험 시료의 사용량 등의 시험 시료 조건에 의한 오차를 줄일 수 있다.

단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1).에서 첨가한 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계는 단계 (3)에서 측정된 신호를 시험 시료의 양 (농도 또는 중량)으로 나누거나, 단계 (3)에서 측정된 신호를 y축으로 하고 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료의 양 (농도 또는 중량)을 X축으로 하여 얻어진 그래프의 기울기를 구함으로써 수행될 수 있다.

제 1 단백질 및 /또는 제 2 단백질을 2종 이상 사용하는 경우， 상기 단백질ᅳ단백질 상호작용 수준 측정 단계는 각각의 단백질 조합에 대하여 수행될 수 있다.

제 2 단백질 (downst ream protein)이 2종 이상인 경우， 다음의 수식에 표현한 바와 같이， 각각의 제 2 단백질에 대하여 얻어진 PPI st rength의 합을 구하여, 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score)으로 결정할 수 있다: S Cum of _D P _D PI _T 제 ¹ 단백질 D T

시험시료 = V > ^ (PDPI s ₊ treng ₊ th、) _k 제 1단백질

k=：제 2단백질

제 1 단백질이 2종 이상인 경우, 각각의제 1 단백질에 대하여 얻어진 PPI score를 합한 값을 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score)으로 결정할 수 있다.

다른 예에서, 상기 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI strength 또는 PPI score)을 하기에 설명되는 기준 시료의 단백질—단백질 상호작용 수준이 1이 되도록 normalization하여， 시험 시료의 PPI strength를 기준 시료의 PPI strength에 대한 상대값으로 나타낼 수 있다.

활성화 수준 측정 단계 (단계 4 또는 4-2)

단계 (4) (앞서 설명한 단계 (4—1)의 단백질 _: 단백질 상호작용 수준 (PPI score) 측정 단계 없이 직접 활성화 수준을 측정하는 경우) 또는 단계 (4— 2)는 상기 단계 (3)에서 얻어진 신호값 또는 단계 (4—1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계이다. 본 명세서에서， 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 결과를 활성화 수준 (또는 activation score)이라고 칭한다.

상기 활성화 수준은 단계 (3)에서 얻어진 신호값 또는 단계 (4- 1)에서 얻어진 단백질—단백질 상호작용 수준을 시험 시료에 포함된 게 1 단백질의 양으로 나누어줌으로써 시험 시료에 존재하는 제 1 단백질의 양 및 /또는 분포 등에 의한 오차를 즐여서 보다 제 1 단백질의 활성화 정도를 보다 정확하게 측정할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 방법은 시험 시료 내의 제 1 단백질의 양을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시험 시료 내의 제 1 단백질의 양을 측정하는 단계는 단계 (4) 또는 단계 (4-2) 수행 전 또는 동시에 진행될 수 있다.

상기 제 1 단백질의 양은 통상적인 모든 방법으로 측정할 수 있으며 , 예컨대, 통상적인 면역블라팅법 (예컨대， quantitative western blotting), EL ISA (enzyme— 1 inked immunosorbent assay; direct assay, indirect assay sandwich assay 등) 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예에서, 제 1 단백질이 고정화된 기판에 표지된 검출 항체 (detecting antibody)를 첨가하고 표지에서 발생하는 신호를 측정함으로써 제 1 단백질을 정량할 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 거 U 단백질 및 /또는 제 2 단백질을 2종 이상 사용하는 경우， 상기 활성화 수준 측정 단계는 각각의 제 1 단백질과 게 2 단백질의 조합에 대하여 각각 수행될 수 있다. ^'

거 12 단백질 (downstream protein)이 2종 이상인 경우， 앞서 설명한 바와 같이 각각의 제 2 .단백질에 대하여 얻어진 PPI strength의 합 또는 상기 PPI strength의 합으로부터 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score)을 사용하여 활성화 수준 (activation score)을 결정하거나， 각각의 저 12 단백질에 대하여 얻어진 activation score의 합을 구하여， 상기 2종 이상의 제 2 단백질에 대한 활성화 수준 (activation score)으로 결정할 수 있다.

제 1 단백질이 2종 이상인 경우， 앞서 설명한 바와 같이, 각각의 제 1 단백질에 대하여 얻어진 PPI strength의 합 또는 상기 PPI strength의 합으로부터 얻어진 단백질—단백질 상호작용 수준 (PPI score)을 사용하여 활성화 수준 (activation score)을 결정하거나, 각각의 게 1 단백질에 대하여 얻어진 activation score의 합을 구하여, 상기 2종 이상의 제 1 단백질에 대한 활성화 수준 (activation score)으로 결정할 수 있다.

다른 예에서， 상기 얻어진 활성화 수준올 하기에 설명되는 기준 시료의 활성화 수준이 1이 되도록 normalization하여， 시험 시료의 활성화 수준을 기준 시료의 활성화 수준에 대한 상대값으로 나타낼 수 있다.

단계 (5): 기준 시료와 비교하는 단계

단계 (5)는 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-1) 또는 단계 (4ᅳ 2)에서 얻어진 결과 (단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score) 또는 활성화 수준 (Activation score))을 기준 시료에서 얻어진 결과 (단백질-단백질 상호작용 수준 (PPI score) 또는 활성화 수준 (Activation score))과 비교하는 단계이다.

상기 기준 시료는 발명의 목적에 따라서 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법의 경우， 상기 기준 시료는 (1) 정상 세포， 및 /또는 (2) 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진 (확인된) 세포 (예컨대， 정상 세포 또는 암세포), 및 /또는 (3) 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 알려진 (확인된) 개체로부터 분리된 세포 (예컨대, 정상 세포 또는 암세포)를 포함할 수 있다. 일 구체예에서， 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우， 그 개체로부터 분리된 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "정상 세포' '는 비-병리적 상태의 모든 세포를 의미할 수 있으며, 상기 "비-병리적 상태"는 질병 상태가 아니거나, 돌연변이， 종양 형성， 기능적 및 /또는 형태적 이상 등을 갖는 질병을 유발할 수 있는 상태가 아닌 것을 의미할 수 있다. 예컨대， 정상 세포는 제 1 단백질과 관련된 질병 또는 시험 대상 약물의 치료 대상 질병을 갖지 않는 세포일 수 있으며， 시험 시료가 유래한 개체 또는 조직과 동종 또는 동일한 개체 또는 조직으로부터 유래한 것일 수 있다.

또한, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성을 예측하는 방법 또는 예측에 정보를 제공하는 방법의 경우， 상기 기준 시료는 정상 세포 또는 상기 약물에 대한 반응성이 알려진 (확인된) 세포 (예컨대， 암세포)를 포함하거나, 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우, 암세포와 동일 조직 .또는 동일 기관의 정상 세포를 포함하는 것일 수 있다.

또한， 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법의 경우， 상기 기준 시료는 정상 세포 또는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과가 알려진 (확인된) 세포 (예컨대, 암세포)를 포함하거나, 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 ^' 경우, 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를 포함하는 것일 수 있다.

단계 (5)를 수행하기 위하여, 상기 방법들은, 단계 (5) 이전에， 상기 기준 시료에 대하여 다음의 단계 (1')， (2'), (3'), 및 (4'), 또는 (I ¹ ), (2' )ᅳ (3' ) , (4-1' ), 및 ( ⁴ — ² ' )를 추가로 포함할 수 있다:

(1') 제 1 단백질을 포함하는 기준 시료를， 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 고정된 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을 준비하는.단계 ;

(2') 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반응시키는 단계 ;

(3') 상기 (2') 단계에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질—단백질 상호작용 측정); 및

(4') 상기 측정된 신호를 이용하여 상기 (I ¹ ) 단계에서 첨가한 기준 시료에 포함된 제 1 단백질의 양으로 나누는 단계 (활성화 수준 측정)

(또는 (4ᅳ1 ' ) 상기 측정된 신호를 이용하여 상기 ( 1 ' ) 단계에서 첨가한 기준 시료의 중량 또는 농도로 나누는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정 단계) 및 (4-2 ' ) 상기 단계 (4-1 ' )에서 얻어진 결과를 기준 시료에 포함된 제 1 단백질의 양으로 나누는 단계 (활성화 수준 측정) ) . 각 단계의 상세한 사항은 앞서 시험 시료에 대한 각 단계에서 설명한 바와 같다.

단계 (6)

본 명세서에서 제공되는 방법은， 상기 단계 (5) 이후에， 단계 (5)에서 얻어진 비교 결과로부터 목적하는 사항을 확인 (결정)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이를 보다 구체적으로 살펴보면'다음과 같다:

( i ) 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정 (또는 확인 또는 결정 또는 분석) 방법 또는 활성화 측정에 정보를 제공하는 방법

단계 (6)은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

단계. (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질—단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준보다 높은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 정상 세포의 활성화 정도 또는 기준시료에서 알려진 (확인된) 활성화 정도보다 높다고 확인 (결정)하는 단계 ;

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 동등한 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 정상 세포의 활성화 정도 또는 기준시료에서 알려진 (확인된) 활성화 정도와 동등하다고 확인 (결정)하는 단계; 및 /또는 ^'

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준보다 낮은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질이 관여하는 신호전달경로의 활성화 정도가 정상 세포의 활성화 정도 또는 기준시료에서 알려진 (확인된) 활성화 정도보다 낮다고 확인 (결정)하는 단계. ( i i ) 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성을 예측하는 방법 또는 예측에 정보를 제공하는 방법

단계 (6)은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있다:

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백잘 상호작용 수준 또는 활성화 수준보다 높은 경우， 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성이 기준시료의 약물 반응성 보다 높다고 확인 (결정)하는 단계;

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 동등한 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 기준시료의 약물 반응성과 동등하다고 확인 (결정)하는 단계; 및 /또는

단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준보다 낮은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 기준 시료의 약물 반응성보다 낮다고 확인 (결정)하는 단계 .

기준 시료를 시험 대상 개체에 요구되는 정도의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 갖는 세포를 포함하도록 선정하여， 상기 약물이 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래한 시험 대상 개체에 소망하는 효과를 갖는지 여부를 조사하거나， 기준 시료를 정상세포로 선정하여 상기 약물이 시험 시료 또는 시험 대상 개.체에서 정상 세포보다 제 1 단백질과 관련된 질병에 특이적으로 작용하는지 여부를 조사할 수 있다. 예컨대， 시험 대상 개체에 요구되는 정도의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성을 갖는 세포를 상기 기준 시료로 선정하는 경우, 단계 (6)은 단계 (4) 또는 (4 2)에서 측정된 시험 시료의 단백질—단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질—단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 비교하여 동등 이상， 예컨대， 높은 경우， 시험 시료 또는,상기 시험 시료가 유래하는 개체의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성이 우수하거나， 및 /또는 상기 약물이 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에 효과를 갖는다고 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성을 예측하는 방법 또는 예측에 정보를 제공하는 방법에 있어서, 단계 (6)에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체의 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성이 우수하거나， 및 /또는 상기 약물이 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에 효과를 갖는다고 결정된 경우， 상기 개체에게 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 상기의 결정 내용을 기초로 각 개체에 적합한 개별 맞춤 치료 수단이 제공된다. 일 예는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 유효성분으로 포함하는, 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성이 우수하거나， 및 /또는 상기 약물이 효과를 갖는다고 결정된 개체에서의 게 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의， 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성이 우수하거나， 및 /또는 상기 약물이 효과를 갖는다고 결정된 개체에서의 게 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 상기 단계 _. (6)에서 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반옹성이 우수하거나， 및 /또는 상기 약물이 효과를 갖는다고 결정된 개체에게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다.

( i i i ) 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법

상기 기준 시료는 정상 세포 또는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과가 알려진 (확인된) 세포 (예컨대, 암세포)를 포함하거나, 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우, 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를 포함하는 것일 수 있다.

단계 (6)은 단계 (4) 또는 (4-2)에서 측정된 시험 시료의 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 비교하여 동등 이상， 예컨대， 높은 경우， 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체를 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 환자로 확인 (결정)하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료는 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및 /또는 투여하는 것을 의미할 수 있다.

상기 기준 시료는 게 1 단백질을 표적으로 하는 치료가 효과를 갖는 세포를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법에 있어서, 단계 (6)에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체가 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 환자로 확인 (결정)된 경우, 상기 개체에게 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료를 수행 (예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및 /또는 투여)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 상기의 확인 (결정) 내용을 기초로 각 개체에 적합한 개별 맞춤 치료 수단이 제공된다. 일 예는 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 유효성분으로 포함하는， 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 것으로 확인된 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 상기 저 U 단백질을 표적으로 하는 약물의， 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 것으로 확인된 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 상기 단계 (6)에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 것으로 확인된 개체에게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료를 수행 (예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및 /또는 투여)하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다.

( iv) 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과 (제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 반응성 )을 모니터링하는 방법 또는 모니터링에 정보를 제공하는 방법

상기 기준 시료는 정상 세포 또는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과가 알려진 (확인된) 세포 (예컨대， 암세포)를 포함하거나, 상기 시험 시료가 개체로부터 분리된 암 세포를 포함하는 경우 암세포와 동일 조직 또는 동일 기관의 정상 세포를 포함하는 것일 수 있다.

단계 (6)은 단계 (4) 또는 (4ᅳ 2)에서 측정된 시험 시료의 단백질ᅳ 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료에서 측정된 단백질- 단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준과 비교하여 동등 이상, 예컨대 , 높은 경우, 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체를 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료가 효과를 발휘하고 있는 것 (예컨대, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여 후, 투여받은 개체에서 상기 약물에 대한 반응성이 유지되고 있는 것 또는 투여받은 개체에서 상기 약물에 대한 저항성이 발생하지 않은 것)으로 확인 (결정)하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및 /또는 투여하는 것을 의미할 수 있다.

상기 기준 시료는 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료가 효과를 갖는 세포를 포함하는 것일 수 있다.

상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과를 모니터링 하는 방법 또는 모니터링에 정보를 제공하는 방법에 있어서 단계 (6)에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과가 발휘되고 있는 것으로 확인 (결정)된 경우, 상기 개체에 ^' 게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료를 계속적으로 수행 (예컨대, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 처방 및 /또는 투여)하는 단계 또는 단계

(6)에서 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료의 효과가 발휘되지 않는 것 (예컨대 , 치료 효과 (약물 반응성) 감소 또는 저항성 획득 등)으로 확인 (결정)된 경우, 상기 개체에게 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료를 중단하는 단계 및 /또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 다른 약물을 투여하거나 상이한 저 U 단백질을 표적으로 하는 치료를 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. .

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질—단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하류 단백질이고, 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 2개 이상의 제 1 단백질에 대하여 수행하는, 상기 세포 또는 조직 또는 상기 세포 또는 조직이 유래하는 개체 (개별 환자)에 적용하기에 적합한 치료 표적으로서의 제 1 단백질 또는 이를 표적으로 하는 약물을 선별하는 방법 또는 선별에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법은,

( 1) 제 1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계 ;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반웅시키는 단계 ;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 측정)； 및

(4) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1 )에서 첨가한 시험 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정) ; 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정)， 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정) ; 및

(5) 2 이상의 제 1 단백질에 대하여 상기 단계 (4) 또는 단계 (4- 2)에서 얻어진 결과를 서로 비교하는 단계

를 포함할 수 있다.

이 때， 상기 제 1 단백질로서 세포 또는 조직의 신호전달경로에 관여하는 단백질 중에서 선택되는 2종 이상이 사용되고，

단계 ( 1 ) , (2) , (3) 및 (4) , 또는 단계 ( 1 ) , (2) , (3)， (4-1 ) , 및 (4-2)는 2종 이상의 제 1 단백질 각각에 대하여 수행되며,

단계 (5)의 비교하는 단계는 2종 이상의 게 1 단백질에 대하여 얻어진 결과를 서로 비교하는 것일 수 있다. .

상기 단계 (5)에서의 비교 결과, 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 높은 제 1 단백질을 상기 시험 시료 또는 시험 시료가 유래한 개체의 치료 표적으로 선택하거나, 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물을 시험 시료 또는 시험 시료가 유래한 개체의 치료를 위한 후보 약물로 선택하는 단계 (단계 (6) )를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계 ( 1) 내지 (6) 및, 시험 시료, 제 1 단백질, 제 2 단백질 등의 용어 설명은 앞서 기재한 바와 같다.

다른 예는 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내와 신호전달경로에 관여하는 단백질이고, 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 신호전달경로 중에서 상기 제 1 단백질의 하류 단백질이고, 상기 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 후보 물질 처리 전 및 처리 후에 수행하는， 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법을 제공한다.

상기 방법은,、

시험 시료에 후보 화합물을 처리하는 (예컨대, 접촉시키는) 단계， 및 상기 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료 각각에 대하여 하기의 단계 ( 1)， (2)， (3) , 및 (5)， 또는 ( 1) , (2) , (3) , (4)， 및 (5)， 또는 ( 1) , (2) , (3)， (4-1)， 및 (5)， 또는 ( 1)， (2)， (3) , (4-1) , (4-2)， 및 (5)를 수행하는 단계를 포함할 수 있다:

( 1) 제 1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계 ;

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반웅시키는 단계 ;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 측정) ; 및

(4) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정 )； 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 ( 1)에서 첨가한 시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정) , 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정) ; 및

(5) 상기 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료 및 처리된 시험 시료에 대하여 상기 단계 (3) , 단계 (4)， 단계 (4-1) , 또는 단계 (4- 2)에서 얻어진 각각의 결과를 서로 비교하는 단계.

상기 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료와 처리된 시험 시료는 각각 후보 화합물의 처리 전 시험 시료 및 처리 후 시험 시료를 의미하거나, 시험 시료를 분량하여 상기 후보 화합물을 처리한 일부의 시험 시료 및 상기 후보 화합물을 처리하지 않은 다른 일부의 시험 시료를 의미할 수 있다.

상기 단계 (5)에서의 비교 결과, 후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 높은 경우, 상기 후보 화합물을 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하거나, 상기 후보 화합물이 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물로서 효과가 있는 것으로 확인할 수 있다.

따라서， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법 또는 게 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 효능 확인 방법은， 상기 단계 (5) 이후에, 상기 단계 (5)에서의 비교 결과， 후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 높은 경우， 상기 후보 화합물을 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하거나， 상기 후보 화합물이 제 1 단백질을 표적으로 하는 _ᅵ 약물로서 효과가 있는 것으로 확인하는 단계 (단계 (6))를 추가로 포함할 수 있다.

상기 후보 화합물은 제 1 단백질의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대， 소분자 화학 약물 (small molecular chemicals), 단백질 (예컨대， 항체， 항체 단편, 또는 이의 유사체 등)， 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대， DNA, RNA (예컨대， siRNA, microRNA, shRNA 등)， PNA (peptide nucleic acid), 앱타머， 등)， 식물 추출물, 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 시험 시료는 제 1 단백질이 과발현 및 /또는 (과)활성화된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대， 조직 용해액 등), 또는 제 1 단백질과 관련된 질병 또는 선별하고자 하는 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용 (치료) 대상 질병과 관련된 분리된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대， 조직 용해액 둥)일 수 있으며, 일 예에서， 확립된 세포주 또는 상기 질병 (예컨대, 암)을 앓는 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다. 예컨대， 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 (상기 암은 제 1 단백질의 과발현 및 /또는 (과)활성화와 관련된 것일 수 있다).

상기 단계 (1) 내지 (6)은 in / ro에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 단계 (1) 내지 (6) 및 제 1 단백질, 제 2 단백질 등의 용어 설명은 앞서 가재한 바와 같다.

상기한 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법은 거 U 단백질의 표적으로 하는 신약 개발에 있어서， 후보 약물로 개발된 약물의 효능 검정 (또는 확인 또는 시험)에 유용하게 적용될 수 있다.

_. 후보 화합물이 처리된 시험 시료의 단백질ᅳ단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 후보 화합물이 처리되지 않은 시험 시료에서보다 높은 경우， 상기 후보 화합물을 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물로 선택하는 단계 (단계 (6))를 추가로 포함할 수 있다.

상기 후보 화합물은 제 1 단백질의 표적 약물로 사용 가능한 모든 생체적합성 물질 _. 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대， 소분자 화학 약물 (small molecular chemicals), 단백질 (예컨대， 항체， 항체 단편， 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대 DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머， 등)， 식물 추출물, 동물 추출물， 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택될 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 시험 시료는 제 1 단백질이 과발현 및 /또는 (과)활성화된 세포 (예컨대, 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대， 조직 용해액 등)， 또는 거 U 단백질과 관련된 질병 또는 선별하고자 하는 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 적용 (치료) 대상 질병과 관련된 분리된 세포 (예컨대， 세포 용해액 등) 또는 조직 (예컨대, 조직 용해액 등)일 수 있으며， 일 예에서， 확립된 세포주 또는 상기 질병 (예컨대， 암)을 앓는 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다. 예컨대, 상기 시험 시료는 확립된 암 세포주 또는 암 환자로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다 (상기 암은 제 1 단백질의 과발현 및 /또는 (과)활성화와 관련된 것일 수 있다).

상기 단계 (1) 내지 (6) 및 제 1 단백질， 제 2 단백질 등의 용어 설명은 앞서 기재한 바와 같다.

상기한 제 1 단백질을 표적으로 하는 후보 약물의 선별 방법은 제 1 단백질의 표적으로 .하는 신약 개발에 있어서, 후보 약물로 개발된 약물의 효능 검정 (또는 확인 또는 시험)에 유용하게 적용될 수 있다.

다른 예는 제 1 단백질과 게 2 단백질 간 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 단계를 포함하고, 상기 제 1 단백질은 세포 또는 조직 내의 신호전달경로에 관여하는 단백질이고， 제 2 단백질은 상기 세포 또는 조직 내의 .신호전달경로 중에서 상기 게 1 단백질의 하류 단백질 중에서 선택된 1종 이상인， 게 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료 표적을 선정하는 방법 또는 상기 선정에 정보를 제공하는 방법, 또는 제 1 단백질의 표적 약물과 병용 투여하기 위한 병용 약물을 선정하는 방법 또는 상기 선정에 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

상기 방법은， (1) 제 1 단백질을 포함하는 시험 시료를 표면에 상기 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 기판에 가하여 제 1 단백질이 고정된 기판을 준비하는 단계 ; ^■

(2) 상기 준비된 제 1 단백질이 고정된 기판에 표지된 제 2 단백질을 첨가하여 반웅시키는 단계 ;

(3) 단계 (2)에서 얻어진 반응물로부터 신호를 측정하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 측정); 및

(4) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 포함된 제 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 ^' 측정) _. 단계; 또는

(4-1) 단계 (3)에서 측정된 신호를 이용하여 단계 (1)에서 첨가한 시험 시료 의 단위량에 대한 신호값을 구하는 단계 (단백질-단백질 상호작용 수준 측정)， 및 (4-2) 단계 (4-1)에서 얻어진 시험 시료의 단위량에 대한 신호값을 이용하여 시험 시료에 포함된 게 1 단백질의 단위량에 대한 값을 구하는 단계 (활성화 수준 측정); 및

(5) 상기 단계 (3)， 단계 (4), 단계 (4-1)， 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 결과를 비교하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기.단계 (5)의 비교하는 단계는,

(a) 시험 시료에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 결과를 기준 시료에 대하여 얻어진 결과와 비교하거나 (이 경우， 상기 방법은 기준 시료는 앞서 설명한 바와 같고， 기준 시료에 대하여 앞서 설명한 단계 (2'), (3')， 및 (4')， 또는 (2'), (3'), (4— 1'), 및 (4— 2')를 추가로 포함할 수 있다)，

(b) 2종 이상의 제 2 단백질에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 결과를 서로 비교하여 수행될 수 있다.

상기 단계 (5)의 비교 결과,

(a) 시험 시료에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 단백질—단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료보다 높은 경우, 상기 제 2 단백질을 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료 표적으로 선정하거나， 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 약물올 게 1 단백질의 표적 약물과 병용투여하기 위한 약물로 선정하거나;

(b) 2종 이상의 거 12 단백질 중 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 가장 높은 제 2 단백질을 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 병행 치료 표적으로 선정하거나, 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 약물을 제 1 단백질의 표적 약물과 병용투여하기 위한 약물로 선정할 수 있다.

따라서， 상기 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 위한 병행 치료 표적을 선정하는 방법 (또는 상기 선정에 정보를 제공하는 방법)， 또는 제 1 단백질의 표적 약물과 병용 투여하기 위한 병용 약물을 선정하는 방법

(또는 상기 선정에 정보를 제공하는 방법)은， 상기 단계 (5) 이후에，

(6-1) 시험 시료에 대하여 얻어진 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)의 단백질 ,-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 기준 시료보다 높은 경우, 상기 제 2 단백질을 제 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 병행 치료 표적으로 선정하거나， 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 약물을 제 1 단백질의 표적 약물과 병용투여하기 위한 약물로 선정하는 단계 ; 또는

(6-2) 2종 이상의 제 2 단백질 중 상기 단계 (4) 또는 단계 (4-2)에서 얻어진 단백질-단백질 상호작용 수준 또는 활성화 수준이 가장 높은 제 2 단백질을 게 1 단백질의 표적 치료와 병행하기 병행 치료 표적으로 선정하거나, 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 약물을 제 1 단백질의 표적 약물과 병용투여하기 위한 약물로 선정하는 단계

를 추가로 포함할 수 있다.

다른 측면에서, 상기의 결정 내용을 기초로 한 병용 치료 수단이 제공된다.. 일 예는 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물 및 상기 단계 (6-1) 또는 (6-2)에서 병행 치료 표적으로 선정된 제 2 단백질을 표적으로 하는 (예컨대, 저해하는) 약물을 포함하는， 게 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 병용 투여용 약학 조성볼을 제공한다. 상기 약학 조성물은 상기 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체에서의 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 병용 투여 용도로 사용될 수 있다. 다른 예는 상기 게 1 단백질을 표적으로 하는 약물 및 상기 단계 (6-1) 또는 (6-2)에서 병행 치료 표적으로 선정된 제 2 단백질을 표적으로 하는 (예컨대, 저해하는) 약물의 게 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 위한 병용 치료에 사용하긴 위한 용도를 제공한다. 다른 예는 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료를 필요로 하

는 환자에게 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료 (예컨대， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 투여) 및 상기 단계 (6ᅳ 1) 또는 (6-2)에서 병행 치료 표적으로 선정된 제 2 단백질을 표적으로 하는 치료 (예컨대， 상기 제 2 단백질을 표적으로 하는 (예컨대, 저해하는) 약물의 투여)를 동시에 또는 순서에 상관 없이 연속하여 수행하는 단계를 포함하는， 제 1 단백질과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다. 상기 환자는 상기 시험 시료 또는 상기 시험 시료가 유래하는 개체일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "제 1 단백질을 표적으로 한다" 함은 제 1 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 것을 의미할 수 있으며, 예컨대， 게 1 단백질의 활성을 저해하는 것을 의미할 수 있다. 제 1 단백질의 활성의 저해는 제丄 단백질과 결합하거나， 및 /또는 게 1 단백질을 분해 및 /또는 구조적 변형시켜 고유의 기능， 예컨대， 세포 및 /또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 ¹¹ 약물' '은 약리적 효과를 나타내는 모든 물질， 예컨대， 소분자 화합물， 단백질 (예컨대, 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대， DNA, RNA (예컨대， siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머， 등)， 식물 추출물, 동물 추출물， 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 1종 이상 선택되는 것일 수 있다.

본 명세서에 사용된 ^' 바로서， 용어 "제 1 단백질을 표적으로 하는 약물' '은 제 1 단백질의 활성을 저해하는 모든 물질， 예컨대， 제 1 단백질의 활성을 저해하는 소분자 화합물 (small molecule), 단백질 (예컨대， 항체, 항체 단편, 또는 이의 유사체 등)， 펩타이드， 핵산 분자 (예컨대， DNA, RNA (예컨대， siRNA (small interfering RNA), shRNA (small hairpin RNA), miRNA (microRNA), 등)， PNA (peptide nucleic acid), 앱타머， 등)， 식물 추출물, 동물 추출물， 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로， "제 1 단백질을 표적으로 하는 약물"은 제 1 단백질과 결합하거나, 및 /또는제 1 단백질을 분해 및 /또는 구조적 변형시켜 고유의 기능, 예컨대， 세포 및 /또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 모든 물질， 예컨대, 제 1 단백질의 활성을 저해하는 소분자 화합물， 단백질 (예컨대, 항체， 항체 단편, 또는 이의 유사체 등), 펩타이드, 핵산 분자 (예컨대， DNA, RNA (예컨대, siRNA, microRNA, shRNA 등), PNA (peptide nucleic acid), 앱타머， 등), 식물 추출물， 동물 추출물, 세포 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 "제 1 단백질을 표적으로 하는 약물"은 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료제， 예컨대， 제 1 단백질의 표적 저해제를 의미하는 것일 수 있다. 일 예에서， 상기 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물은， EGFR 표적 치료제 (cetuximab, gefitinib, erlotinib, afatinib, osimertinib (AZD9291), 각종 항 -EGFR 항체 등)， MET 표적 치료제 (각종 항— MET 항체, Crizotinib, Cabozantinib 등)， HER2 표적 치료제 (trastuzumab, Trastuzumab, Pertuzumab, Lapat inib 등)， HER3 표적 치료제 (각종 항 -HER3 항체 등), FGFR(1, 2) 표적 치료제 (Lerwatinib, Nmtedanib Regorafenib 등), VEGFR(1, 2, 3) 표적 치료제 (Bevacizuniab, Axitinib, Lenvatinib 등) , PDGFR 표적 처료제 (Axitinib, Gefitinib, Imatinib 등)， IGF1R 표적 치료제 (Ceritinib 등)， . c— KIT 표적 치료제 (Axitinib, Cabozantinib, Dasat inib 등), RET 표적 치료제 (Vandetanib 등), BRAF 표적 치료제 (Vemurafenib, Dabrafenib 등), MEK 표적 치료제 (Trameti.nib 등), Src 표적 치료제 ^■ (Bosutinib, Dasatinib, Ponat inib, Vandet nib 등)， PI3K 표적 치료제 (Crizotinib, Cabozantinib 등)， CDK(4, 6) 표적 치료제 (Palbociclib, Sorafenib 등)， R0S1 표적 치료제 (Ceritinib, Crizotinib 등), ALK 표적 치료제 (Ceritinib, Crizotinib 등)， BCR-Abll 표적 치료제 (Bosutinib, Dasatinib, Imatinib, Nilotinib 등)， AR 표적 치료제 (Abiraterone, Enza kit amide 등)， CTLA4 표적 치료제 ( Ipi 1 i隱 mat), Tremelimumab 등)， P으 1 표적 치료제 (Nivolumab 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "제.1 단백질을 표적으로 하는 치료' '는 제 1 단백질의 활성을 저해하는 모든 의학적 및 /또는 약학적 행위를 의미할 수 있으며， 예컨대， 앞서 설명한 바와 같은 제 1 단백질의 활성을 저해하는 약물을 제 1 단백질의 활성을 저해하는 것을 필요로 하는 대상에게 처방 및 /또는 투여하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, "제 1 단백질을 표적으로 하는 치료' '는 제 1 단백질과 결합하거나, 및 /또는 제 1 단백질을 분해 및 /또는 구조적 변형시켜 고유의 기능， 예컨대， 세포 및 /또는 조직에서의 고유의 생체 신호전달 기능을 감소시키거나 제거하는 약물을 이를 필요로 하는 대상에게 처방 및 /또는 투여하는 것일 수 있다.

상기 투여는 경구 또는 비경구 경로로 수행될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여， 병변 부위 국소 투여， 비내 투여, 폐내 투여， 또는 직장내 투여 등의 경로로 수행될 수 있다.

상기 개체, 환자 또는 대상은 모든 포유류， 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스， 래트 등의 설치류 등일 수 있고, 예컨대 거 U 단백질과 관련된 질병을 갖는 환자일 수 있다. 상기 제 1 단백질과 관련된 질병은 제 1 단백질의 과발현 또는 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 질병일 수 있으며, ^' 예컨대， 암， 염증， 그 외 면역질환 등일 수 있다. 구체예에서， 상기 개체, 환자 또는 대상은 암환자일 수 있다.

상기 암은 모든 고형암 및 혈액암 중에서 선택될 수 있으며， 예컨대 제 1 단백질의 과발현 또는 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화와 관련된 암일 수 있다. 예컨대, 상기 암은 편평상피세포암， 소세포폐암, 비소세포폐암， 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암， 피부 또는 안구내 혹색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암， 부갑상선암， 부신암, 연조직 육종, 요도암， 만성 또는 급성 백혈병， 림프구 림프종 위암， 췌장암， 교아종, 경부암， 난소암， ^. 방광암, 유방암， 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암， 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암， 뇌암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 암은 원발성 암뿐 아니라 전이성 암을 포함할 수 있다. 또한， 상기 암은 기존의 항암 치료에 대하여 저항성을 갖거나 획득한 암일 수 있다 .

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 "약물에 대한 반응성 "은 약물올 투여받은개체에서 상기 약물이. 효과를 발휘하는 정도를 의미할 수 있다.

본 명세서에 사용된 바로서， 용어 "효과''는 약물 또는 치료가 처치 대상에서 달성하고자 하는 의학적 및 /또는 약학적 효과를 의미하는 것.으로 , 처치 대상이 갖는 질병의 예방 및 /또는 치료， 및 /또는 증상의 완화 및 /또는 개선. 등을 의미하는 것일 수 있다. 예컨대， 상기 약물이 항암제이고 치료가 항암 치료이고， 상기 처치 대상이 암환자인 경우, 상기 효과는 항암 효과 (암의 예방 및 /또는 치료 효과)일 수 있고， 상기 항암 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라， 이동 (migrat i on) , 침습 ( invas ion)， 및 /또는 전이 (metastas i s) 등을 억제 , 및 /또는 암의 악화를 억제,, 및 /또는 저항성을 감소 또는 제거하는 효과 등을 포함하는 것일 수 있다.

다른 예에서, 앞서 설명한 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성 예측 방법, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성 모니터링 방법, 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법， 및 /또는 약물의 스크리닝 방법에 사용하기 위한 ^■ 단백질—단백질 상호작용 측정용 장치를 제공한다. 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정용 장치, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성 예측 및 /또는 모니터링용 장치， 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하기 위한 장치， 및 /또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 효능 확인용 장치로서 적용 가능하다.

상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 앞서 설명한 세포 또는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반응성 예측 방법， 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성 모니터링 방법, 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하는 방법， 및 /또는 약물의 스크리닝 방법에 적용됨으로써, 소량의 시료에서의 생체 분자 간 상호 작용도 정확하고 효율적으로 관찰， 분석 , 검출， 및 /또는 측정할 수 있다는 이점을 갖는다. 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대, needle biopsy) 시료와 같이 매우 소량의 시료에 대해서도 유용하고 효과적으로 적용될 수 있다.' 또한， 상기 단백질—단백질 상호작용 측정용 장치 또는 이를 이용하는 분석 방법은 다양한 생체 분자 (예컨대, 단백질， 핵산 등) 간의 상호작용을 소량의 시료를 이용하여 정확하고 효율적으로 관찰， 분석, 검출， 및 /또는 측정할 수 있다.

상기 단백질—단백질 상호작용 측정용 장치는，

게 1 단백질에 특이적으로 결합하는 게 1 단백질의 포획용 물질을 포함하는 멀티 웰, 및

신호검출 수단

을 포함할 수 있다.

상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 상기 제 1 단백질과 상호작용하는 (예컨대 , 상기 제 1 단백질이 관여하는 세포 또는 조직의 생체 신호전달경로의 하위 경로에 관여하는) 단백질 (제 2 단백질)을 추가로 포함할 수 있으며, 일 예에서, 상기 제 2 단백질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되거나 (표지 물질이, 예컨대， 화학적 (예컨대， 공유적 또는 비공유적) , 재조합적， 또는 물리적으로， 결합되거나)， 표지물질이 결합될 수 있는 tag이 부착된 형태일 수 있다. 또 _. 한， 상기 단백질 _단백질 상호작용 측정용 장치는 신호 검출 수단에서 측정된 신호값을 제 1 단백질의 수준으로 정상화 (normal i zat i on)시키기 위하여， 제 1 단백질에 결합하는 탐지용 물질 및 상기 탐지용 물질에 결합하는 표지용 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 제 1 단백질에 결합하는 탐지용 물질은 앞서 설명한 멀티 웰에 포함된 제 1 단백질의 포획용 불질과 상이한 부위에서 제 1 단백질과 결합하는 생물 분자 (예컨대， 항체)일 수 있으며， 상기 표지용 물질은 검출 가능한 신호를 발생시키는 표지 물질로 표지되고 (표지 물질이， 예컨대， 화학적 (예컨대, 공유적 또는 비공유적으로 결합) 상기 제 1 단백질에 결합하는 탐지용 물질에 결합 가능한 생물 분자 (예컨대， 항체)일 수 있다 (도 6 참조) .

일 실시예에 따른 단백질—단백질 상호작용 측정용 장치에 포함된 멀티 웰은 일면이 개방된 복수의 관을 포함하거나, 지지 플레이트에 이격 형성된 복수의 비관통형 홀 (예컨대, 지지 플레이트에 형성된 홈 형태)을 포함하는 구조로서， 상기 일면이 개방된 관 또는 비관통형 홀을 웰로 정의할 수 있으며, 상기 웰이 제 1 방향으로 2개 이상 배치된 일렬 구조가 상기 제 1 방향과 교차하는 제 2 방향으로 하나 존재하거나， 2개 이상 배치 (격자 구조)된 구조체를 의미할 수 있다 (도 30 참조) . 이 때 , 상기 멀티 웰은 상기 관 또는 비관통형 홀의 개방된 일면에 위치하는 시료 주입부, 상기 관 또는 비관통형 홀의 내부의 단백질-단백질 상호작용 (예컨대, 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 상호작용)이 일어나는 반응부， 및 상기 관 또는 비관통형 홀의 내부와 접촉하는 적어도 일부의 내벽의 표면에 제 1 단백질의 포획용 물질 (예컨 ， 제 1 단백질에 특이적.으로 결합하는 물질 (예컨대, 항체) )이 고정화되거나 고정화 가능한 제 1 단백질의 포획 ^' 부 (또는 기판)를 포함할 수 있다. 일 구체예에서， 상기 멀티 웰은 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 상호작용이 일어나는 반웅부 (제 1 단백질과 제 2 단백질와 반웅부: 게 1 반웅부)를 포함하는 하나 이상의 웰 및 제 1 단백질과 제 1 단백질에 결합하는 탐지용 물질이 결합하는 반웅부 (제 1 단백질 탐지부: 제 2 반웅부)를 포함하는 하나 이상의 웰을 포함할 수 있다. 상기 거 U 단백질에 결합하는 탐지용 물질은 앞서 설명한 바와 같다. 상기 제 1 단백질 탐지부는 시험 시료 내의 제 1 단백질 수준을 측정하여， 장치에 포함된 신호 검출 수단에서 측정된 신호값을 제 1 단백질의 수준으로 정상화 (normal i zat i on)하는데 사용될 수 있다. . 일 구체예에서, 상기 멀티웰은 제 1 방향을 따라 연장된 지지 플레이트, 상기 지지 플레이트 상에 배치되며， 상기 제 1 방향을 따라 서로 이격 배치된 복수의 수용부， 상기 복수의 수용부 각각에 형성되며， 상기 제 1 방향과 교차하는 제 2 방향을 따라 상기 수용부를 관통하는 관통홀 및 상기 복수의 수용부 위에 배치되어 상기 관통홀의 일측 단부를 덮으며， 상기 관통홀을 향하는 일면이 표면 처리된 기판을 포함할 수 있다 (도 27 참조) . 이 경우， 이격 배치된 관통홀과 ,그 일측 단부를 덮는 기판이 이루는 공간을 웰로 정의할 수 있으며， 앞서 설명한 바와 같이, 멀티 웰은 상기 웰이 제 1 방향으로 2개 이상 배치되거나 (일렬구조) 또는 제 1 방향 및 상기 제 1 방향과 교차하는 제 2 방향으로 2 이상 배치 (격자 구조)된 구조체를 의미할 수 있다.

상기 멀티 웰은 1종 이상 또는 2종 이상의 제 1 단백질의 포획용 물질을 각각 포함하는 다수의 웰을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 멀티 웰이 2종 이상의 게 1 단백질과 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 경우, 2종 이상의 제 1 단백질과 특이적으로 결합하는 물질을 각각 포함하는 웰들은 제 1 방향 또는 게 1 방향과 교차하는 제 2 방향으로 서로 다른 저 U 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하도록 배치될 수 있다.

상기 제 1 단백질 포획부 또는 기판의 일면의 표면은 제 1 단백질 포획 물질 (제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질， 예컨대， 항체 등)을 기판 일면에 고정화시킬 수 있는 작용기를 갖는 모든 화합물로 표면처리된 것일 수 있으며， 예컨대， 알데히드기， 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 1종 이상의 화합물로 처리된 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 알데히드기， 카르복실기 및 아민기로 이루어진 군에서 선택된 작용기를 포함하는 화합물은 바이오틴 (bi ot in) , 바이오틴이 결합된 소혈청알부민 (Bovine serum al bumin) , 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol ; PEG) , 바이오틴이 결합된 PEG (폴리에틸렌글리콜 -바이오틴; PEG- biot in) , 폴리소베이트 (e . g . , Tween20) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 표면 처리된 기판에 뉴트라비딘 (neut ravi din) , 스트렙타비딘 (streptavidin) , 아비딘 (avi din) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 처리 (예컨대, 도포)될 수 있다.

서로 마주보는 상기 기판과 상기 수용부 사이에는 접착제가 개재될 수 있다. 상기 접착제는 에폭시 (예컨대, UV 에폭시)를 포함할 수 있다.

상기 기판과 상기 수용부가 접촉하는 영역에 인접하여， 상기 기판과 상기 수용부를 둘러싸는 접착제를 포함할 수 있다.

상기 접착제는 에폭시를 포함할 수 있다.

상기 복수의 지지 플레이트는， 상기 제 1 방향 및 상기 제 2 방향과 교차하는 제 3 방향을 따라 서로 이격되어 배치될 수 있다.

상기 관통홀의 단면은 원형 형상을 가질 수 있다.

상기 수용부는, 상기 지지 플레이트 상에 돌출된 형상을 가질 수 있다.

상기 수용부와 상기 지지 플레이트는 일체로 형성될 수 있다.

상기 수용부와 상기 지지 플레이트는 아크릴을 포함할 수 있다.

상기 기판은 유리를 포함할 수 있다. ^■

상기 신호검출 수단은 사용된 표지 물질에서 발생시키는 신호에 따라서 통상적으로 사용되는 모든 신호 검출 수단일 수 있다. 예컨대， 상기 신호 검출 수단은 신호 자극부 및 신호 검출부를 포함할 수 있으며， 여기에 더하여 측정된 신호를 분석 (예컨대， 정량 또는 영상화)하는 신호 분석부를 추가로 포함할 수 있다. 일 예에서, 신호 자극, 신호 검출， 및 신호 분석은 각각 다른 부위에서 수행되거나, 이들 중 적어도 두 가지 이상이 하나의 부위에서 동시에 또는 연속하여 ^' 수행될 수 있다ᅳ 일 예에서， 상기 표지가 형광물질인 경우, 상기 신호 검출 수단은 형광 신호를 발생 및 검출할 수 있는 모든 수단들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대， 형광 신호 자극부 (예컨대, 광원) , 및 형광 신호 검출부, 및 /또는 형광 신호 분석부를 포함할 수 있다. 일 구체예에서， 상기 신호 검출 수단은 전반사 형광 현미경 (Total Internal Ref lect i on Fluorescence (TIRF) mi croscope) 또는 공초점 현미경 (광원 및 형광신호 검출용)을 포함하거나， 여기에 더하여， 형광 ^！"메라, 예컨대 EMCCD (El ectron-mul t iplying charge-cou led devi ce) "메라 또는 CMOS (Complementary metal oxi de semi conductor ) 메라를 추가로 포함하여, 광원 공급 및 형광 신호의 영상화 및 /또는 정량을 수행할 수 있다. 상기 광원의 파장， 세기， 형광 카메라 측정 조건 (예컨대， 1 프레임당 노출시간， 레이저 파워， 카메라 gain값， 총 촬영 프레임 등)은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 제 1 단백질， 기판， 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 물질， 제 2 단백질, 표지 물질, 상기 표지 물질에 따른 신호 검출 수단은 앞서 설명한 바와 같다.

상기 단백질—단백질 상호작용 측정용 장치를 도 27 내지 30에 예시적으로 나타내었으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치의 제조 방법은, 제 1 방향을 따라 연장되며， 상기 제 1 방향을 따라 서로 이격 배치되는 복수의 수용부가 위에 배치되는 지지 플레이트를 마련하는 단계 및 상기 지지 플레이트 위에 표면 처리된 기판을 부착하는 단계를 포함하며， 상기 복수의 수용부 각각에는 상기 제 1 방향과 교차하는 제 2 방향을 따라 상기 수용부를 관통하는 관통홀이 형성되며， 상기 표면 처리된 상기 기판의 일면이 상기 관통홀을 향하도록 상기 기판의 일면이 상기 관통홀의 일측 단부를 덮을 수 있다.

상기 기판의 표면 처리는 앞서 설명한 바와 같으몌 일 구체예에서 폴리에틸렌글리콜 (PEG, polyethyl ene glycol )과 바이오틴 (bi ot in)을 혼합물을 처리하여 수행될 수 있다.

상기 폴리에틸렌글리콜과 바이오틴의 비율은, 중량 기준으로, 100 : 1 내지 100 : 3 (폴리에틸렌글리콜 중량:바이오틴 중량)일 수 있다.

상기 표면 처리된 기판 위에는 뉴트라비딘 (neutfavidin) , 스트랩타비딘 (st reptavidin) , 아비딘 (avi din) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 도포될 수 있다.

상기 지지 플레이트 위에 상기 기판을 부착하는 단계는, 상기 기판과 마주보는 상기 수용부의 상면에 UV 에폭시를 도포하는 단계， 상기 수용부 위에 상기 기판을 덮는 단계 및 상기 기판에서 상기 수용부를 향해 UV를 조사하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 UV를 조사하는 단계에서, 상기 관통홀과 대웅하는 .상기 기판의 영역으로 상기 UV가 통과하는 것을 차단하는 마스크를 사용할 수 있다.

상기 지지 플레이트 위에 상기 기판을 부착하는 단계는， 상기 수용부 위에 상기 기판을 덮는 단계 및 상기 기판과 상기 수용부가 접촉하는 영역에 인접하여， 상기 기판과 상기 수용부를 둘러싸도록 실링재를 도포하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 실링재는 에폭시를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 단백질ᅳ단백질 상호작용 측정용 장치는 다양한 생체분자 (예컨대， 단백질, 핵산 등) 간의 상호작용 (예컨대， 단백질-단백질 상호작용 등)을 관찰, 분석, 검출 및 /또는 측정하는데 유용하게 적용될 수 있다.

따라서 , 다른 예는 분석하고자 하는 생체분자 (예컨대， 제 1 단백질)를 포함하는 시료를 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치 또는 상기 장치에 포함된 멀티 웰에 접촉시키는 단계를 포함하는 생체분자 간 상호작용 (예컨대, 단백질—단백질 상호작용) 분석 방법을 제공한다. 상기 분석 방법은， 상기 접촉시키는 단계 이후에， 시료에서 발생하는 신호를 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이 때， 상기 신호는 생체분자 분석에 통상적으로 사용되는 모든 신호들 (예컨대, 형광， 발광， 등) 중에서 적절하게 선택될 수 있고, 상기 신호의 측정은 사용된 신호의 종류에 따라서 통상적으로 사용되는 모든 방법들 중에서 적절하게 선택하여 수행할 수 있다. 상기 생체분자는 생체로부터 분리된 단백질， 핵산, 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 예컨대 단백질일 수 있다. 상기 생체분자가 단백질인 경우， 단백질-단백질 상호작용 분석에 사용되는 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치에 포함된 멀티 웰은 표면에 분석 대상 단백질 중 어느 하나에 특이적으로 결합하는 분자 (예컨대 , 항체)가 고정된 것일 수 있다.

이하, 첨부한 도면을 참고로 하여 본 발명의 실시예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며， 명세서 전체를 통하여 동일 또는 유사한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 붙였다.

또한， 도면에서 나타난 각 구성의 크기 및 두께는 설명의 편의를 위해 임의로 나타내었으므로, 본 발명이 반드시 도시된 바에 한정되지 않는다. ^'

도면에서 여러 층 및 영역을 명확하게 표현하기 위하여 두께를 확대하여 나타내었다. 그리고 도면에서 설명의 편의를 위해， 일부 층 및 영역의 두께를 과장되게 나타내었다. 층, 막, 영역, 판 등의 부분이 다른 부분 "위에" 또는 "상에 " 있다고 할 때， 이는 다른 부분 "바로 위에 " 있는 경우뿐 아니라 그 중간에 또 다른 부분이 있는 경우도 포함한다.

또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 명세서 전체에서, "~상에' '라 함은 대상 부분의 위 또는 아래에 위치함을 의미하는 것이며, 반드시 증력 방향을 기준으로 상 측에 위치하는 것을 의미하는 것은 아니다.

이하， 도 27을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치에 포함된 멀티 웰에 대해 예시적으로 설명하지만, 상기 장치가 이 구조에 제한되는 것은 아니다ᅳ

도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질—단백질 상호작용 측정용 장치에 포함된 멀티 웰을 개략적인 나타낸 사시도이다. 도 27을 참조하면， 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치에 포함된 멀티 웰의 일 예는, 지지 플레이트 (155, 165, 175), 복수의 수용부 (153)， 관통홀 (151) 및 기판 (300)을 포함할 수 있다. 본 실시예에서는, 지지 플레이트 (155， 165， 175)에 형성된 복수의 수용부 (153) 각각에 관통홀 (151)이 형성되고, 관통홀 (151)의 일측 단부를 바이오틴 (biotin)으로 표면 처리된 기판 (300)이 덮을 수 있다.

지지 플레이트 (155， 165, 175) 각각은 게 1 방향 (X축 방향)을 따라 연장된 판형 부재이다. 복수의 지지 플레이트 (155， 165, 175)는 제 3 방향 (Y축 방향)을 따라 미리 정해진 간격으로 서로 이격되어 배치될 수 있다. 본 실시예에서는, 지지 플레이트 (155, 165， 175)가 3 개인 것으로 설명되나, 이에 한정되지 않고 지지 플레이트는 1 개만 배치될 수도 있고, 4 개 이상 배치될 수도 있다.

복수의 지지 플레이트 (155, 165， 175)의 양측 단부는 한 쌍의 지지대 (110， 130)에 고정 결합될 수 있다. 이에 의해， 복수의 지지 플레이트 (155， 165， 175)는 서로 일정한 간격을 유지한 채 고정될 수 있다. 복수의 지지 플레이트 (155， 165, 175) 각각에는 복수의 수용부 (153)가 배치될 수 있다. 복수의 수용부 (153)는 지지 플레이트 (155, 165, 175) 상에 게 1 방향 (X축 방향)을 따라 서로 이격되어 배치될 수 있다. 구체적으로， 복수의 수용부 (153)가 지지 플레이트 (155， 165, 175) 위에 제 1 방향 (X축 방향)을 따라 일정한 간격으로 이격되어 배치될 수 있다.

복수의 수용부 (153)는 돌출 형상으로 이루어질 수 있다. 예를 들어， 복수의 수용부 ( ₁₅₃ )는 지지 플레이트 (155, 165, 175) 위에 돌출되어 형성될 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 복수의 수용부 (153)는 육면체 형태로 지지 플레이트 (155， 165, 175) 위에 형성될 수 있다. 그러나, 복수의 수용부 (153)의 형상은 이에 한정되지 않고, 다양한 형태로 배치될 수 있다. 본 실시예에서는 지지 플레이트 (155, 165, 175)와 복수의 수용부 (153)는 일체로 형성될 수 있다. 예를 들어, 지지 플레이트 (155， 165, 175)와 복수의 수용부 (153)는 하나의 판형 부재를 레이저로 가공하여 제조될 수 있다.

복수의 수용부 (153) 각각에는 수용부 (153)를 관통하는 관통홀 (151)이 형성될 수 있다. 관통홀 (151)은 제 2 방향 (Z축 방향)을 따라 형성될 수 있다. 구체적으로, 관통홀 (151)은 도 1에서 위에서 아래 방향으로 관통되는 형상을 가질 수 있다. 다만, 관통홀 (151)의 일측 단부는 기판 (300)에 의해 막힐 수 있다. 관통홀 (151)은 원형의 단면 형상을 가질 수 있다.

전술한 바와 같이， 관통홀 (151)의 일측 단부가 막힘에 따라， 수용부 (153)는 원통형의 용기 (well) 형상을 가질 수 있다. 복수의 수용부 (153) 각각에 형성된 관통홀 (151)에 의해， 복수의 수용부 (153) 내부에는 시료, 예를 들어 단백질이 수용될 수 있다.

일 구체예에서， ^' 복수의 지지 플레이트 (155, 165, 175) 각각에 복수의 수용부 (153)가 형성되어， 각각의 수용부 (153)에 관통홀 (151)이 형성됨에 따라， 멀티 웰 (multi well) 구조가 형성될 수 있다. 상기 웰의 개수는 기판의 크기， 지지 플레이트 및 /또는 수용부의 개수에 따라 적절히 조절할 수 있다. 각 웰의 크기는 특별한 제한이 없으나, 생체 분자 간 상호작용 검출에 용이하도록 하기 위하여, 각 웰의 지름은 약 2mm 이상, 예컨대， 2 내지 10隱， 2 내지 8讓， 2 내지 6瞧, 2 내지 5隱, 2 내지 4隱， 또는 약 3 睡이고， 각 웰의 깊이는 지름의 약 1/2배 이상， 예컨대, 지름의 1/2 내지 5배， 1/2 내지 3배, 1/2 내지 2배， 1 내지 5배, 1 내지 3배, 1 내지 2배일 수 있다. 또한, 각 웰의 또한, 반응 신호의 누출 (leakage) 및 /또는 간섭을 방지하기 위하여, 이웃한 웰 간의 간격은 웰 중심 간 거리를 기준으로 약 5mm 이상으로 하고, 웰의 지름을 고려하여 적절히 정할 수 있다.

한편, 복수의 수용부 (153) 위에는 기판 (300)이 배치될 수 있다. 기판 (300)은 투명 재질로 이루어질 수 있는데, 예를 들어 기판 (300)은 유리 기판일 수 있다.

기판 (300)은 복수의 수용부 (153)에 형성된 관통홀 (151)의 일측 단부를 덮을 수 있다. 이에 의해, 관통홀 (151)의 일측이 기판 (300)에 의해 막히게 되어， 전술한 바와 같이 수용부 ( ₁₅₃ )는 용기 ( _we ll) 형상을 가질 수 있다.

일 예에서, 기판 (300)과 수용부 (153)는 접착제 (E)에 의해 서로 부착될 수 있다. 접착제 (E)는 에폭시일 수 있다.

접착제 (E)는 기판 (300)과 수용부 (153)가 서로 접촉하는 영역에 인접하여 도포되는데, 기판 (300)과 수용부 (153)를 둘러싸도록 배치될 수 있다 (예컨대, 접착제 (E)가 관통홀 내부로 침투하지 않도록， 접착제 (E)를 수용부 (153)의 외부 가장자리에 적용함). 수용부 (153)와 기판 (300)을 서로 결합시키는 과정에서, 기판 (300)과 수용부 (153)가 서로 접촉하도록 기판 (300)을 수용부 (153) _. 위에 배치시키고, 접착제 (E)를 기판 (300)과 수용부 (153)를 둘러싸도록 도포할 수 있다.

접착제 (E)를 기판 (300) 및 수용부 (153)를 둘러싸도록 도포함으로써, 접착제 (E)가 관통홀 (151) 내부로 침투하는 것을 방지할 수 있다. 전술한 바와 같이 접착제 (E)가 에폭시로 이루어지는 경우, 에폭시가 관통홀 (151) 내부로 침투하면， 에폭시가 관통홀 (151) 내부에 수용되는 시료와 접촉할 수 있다. 이에 의해， 단백질과 같은 시료 등이 에폭시와 반웅하게 되어, 시료- 등이 비특이적으로 흡착될 수 있다. 따라서, 본 실시예에서는， 관통홀 (151) 내부에 수용되는 시료 등이 접착제 (E)인 에폭시 등과 접촉하여 변형되는 것을 방지할 수 있다.

또한, 지지 플레이트 (155， 165, 175) 위에 형성되는 수용부 (153)가 서로 이격되어 배치되어， 각각의 수용부 (153) 둘레를 따라 접착제 (E)를 용이하게 도포할 수 있다.

한편, 본 실시예의 변형예에서는, 수용부 (153)와 기판 (300) 사이에는 접착제 (E)가 개재될 수도 있다. 이때, 수용부 (153)와 기판 (300)을 서로 접촉시키기 전에， 수용부 (153) 또는 기판 (300)에 접착제 (E)를 도포시킨다. 그리고 나서， 수용부 (153)와 기판 (300)을 서로 접촉시키고， UV를 조사하면 접착제를 신속하게 경화시킬 수 있다. 상기 사용되는 접착제 (E)는 UV 에폭시일 수 있다.

수용부 (153)와 기판 (300) 사이에 위치하는 접착제 (E)는 관통홀 (151) 내부에는 배치되지 않는다. 즉， 접착제 (E)는 관통홀 (151)의 내면으로부터 일정한 간격 (L1.)만큼 들어가도록 배치될 수 있다. 접착제 (E)가 일정한 간격 (L1)만큼 내부로 들어감에 따라， 관통홀 (151) 내부에 수용되는 시료가 접착제 (E)와 접촉하는 것을 감소시킬 수 있다. 이때， 기판 (300)의 두꺼 KH)는 0.17 隱 ~ 0.19 删 일 수 있다. 접착제 (E)에 의해， 수용부 ( 153)와 기판 (300)을 부착하는 구체적인 과정에서 대해서는， 단백질- 단백질 상호작용 측정용 장치의 제조 방법에서 설명하기로 한다.

전술한 바와 같이， 접착제 (E)를 기판 (300) 및 수용부 ( 153)를 둘러싸도톡 도포함으로써， 접착제 (E)가 관통홀 ( 151) 내부로 침투하는 것을 방지할 수 있다. 접착제 (E)가 에폭시로 이루어지는 경우， 에폭시가 관통홀 ( 151) 내부로 침투하면, 에폭시가 관통홀 ( 151) 내부에 수용되는 시료와 접촉할 수 있다. 이에 의해, 단백질과 같은 시료 등이 에폭시와 반응하게 되어, 시료 등이 변형될 수 있다. 따라서， 본 실시예에서는, 관통홀 ( 151) 내부에 수용되는 시료 등이 접착제 (E)인 에폭시 등과 접촉하여 변형되는 것을 방지할 수 있다.

기관 (300)과 수용부 ( 153) 사이에 개재되는 접착제 (E)가 관통홀 ( 151) 내부에 배치되지 않도록， 기판 (300)과 접촉하는 수용부 ( 153)에만 접착제 (E)를 도포한다.

UV 에폭시가 경화하는 과정에서 관통홀 ( 151) 내부로 침투하지 않고 신속하게 경화하도록, UV 에폭시에 UV를 조사한다. 이때, UV를 조사하면， UV 에폭시가 경화되는 시간을 단축할 수 있다.

본 실시예에서는， uv를 조사할 때, 마스크 (500)를 사용할 수 있다. 마스크 (500)는 관통홀 ( 151)에 대응되는 기판 (300) 영역에 UV가 통과하는 것을 차단할 수 있다. 보다 자세히， 도 26에 도시된 바와 같이, 마스크 (500)에는 관통홀 ( 151)에 대응되는 위치에 UV 차단 영역이 형성되어 있다. 이러한 UV 차단 영역에 의해, UV가 관통홀 ( 151)에 대응되는 기판 (300) 영역에 조사되는 것을 차단할 수 있다. - 전술한 바와 같이， 관통홀 ( 151)에 대웅되는 기판 (300) 표면에는 폴리에틸렌글리콜 (PEG, polyethyl ene glycol )과 바이오틴 (biot in)을 흔합하여 표면 처리가 이루어질 수 있다. 가령, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)과 바이오틴 (bi ot in)으로 표면 처리된 기판 (300)을 접착제 (E)를 이용하여 수용부 ( 153)와 부착한 후, UV를 조사하면 표면 처리된 기판 (300)이 변형 또는 손상될 수 있다. 관통홀 ( 151) 내에 배치된 기판 (300)에 UV가 조사되면, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 바이오틴 (bi ot in)이 UV에 의해 손상되에 기판 (300)에 뉴트라비딘 (neutravi din)이 고정될 수 다.

기판 (300)에 뉴트라비딘이 고정되지 않으면， 기판 (300)에 특정 바이오틴一항체가 부착되기 어렵다. 결국, 특정 항체인 바이오틴ᅳ항체와 결합할 수 있는 특정 항원을 포획 (capture)할 수 없게 된다. 즉， 본 변형예에 따르면 , UV 에폭시를 신속하게 경화시키기 위해 UV를 사용할 때 , 관통홀 ( 151)에 대웅되는 기판 (300)의 영역에 UV가 조사되는 것을 차단하면, 관통홀 ( 151) 내부에 수용되는 시료， 예를 들어 특정 단백질이 기판 (300) 표면에 잘 부착되게 할 수 있다.

도 31은, 관통홀 ( 151 )에 대응되는 기판 (300) 영역에 UV가 조사되는 것을 차단하는 경우 (본 변형예 (A) )와， UV가 조사되는 것을 차단하지 않은 경우 (비교예 (B) )를 실험한 결과이다. 도 31의 가로축 결과값은, 기판 (300) 표면에서 검출되는 GFP(Green Fl uorescent Protein)의 개수를 상대적으로 나타낸 값이다.

도 31 (A) , (B)를 참조하면， 해당 기판 (300) 영역에 UV가 조사되는 것을 차단하는 경우에， 차단하지 않는 경우에 비해 항원인 GFP(Green Fluorescent Prot e in)가 다량 검출됨을 확인할 수 있다.

도 31(A)와 같이， 기판 (300) 영역에 UV가 조사되는 것을 차단하면, 기판 (300)에 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 바이오틴 (biot in)이 손상되지 않고 도포될 수 있다. 이에 따라， 기판 (300)에 뉴트라비딘 (neutravidin) 또한 고정될 수 있다. 결국， 기판 (300)에 항체 (GFP 항체)가 고정되고, 항원인 GFP를 포획할 수 있다.

반면에, 도 31(B)와 같이， 기판 (300) 영역에 UV가 조사되면, 기판 (300)에 도포될 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 바이오틴 (bi ot in)이 손상될 수 있다. 이에 따라， 기판 (300)에 뉴트라비딘 (neutravi din) 또한 고정되기 어렵게 된다. 결국, 기판 (300)에 항체 (GFP 항체)가 고정될 수 없게 되어, 항원인 GFP 또한 포획할 수 없게 된다.

다른 예에서， 앞서 설명한 바와 같은 제 1 단백질에 특이적으로 결합하는 제 1 단백질의 포획용 물질을 포함하는 멀티 웰을 포함하는 단백질ᅳ단백질 상호작용 측정용 키트가 제공된다. 상기 단백질-단백질 상호작용 측정용 키트는 조직 내의 신호전달경로의 활성화 측정용 키트, 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물에 대한 반웅성 예측 및 /또는 모니터링용 키트 제 1 단백질을 표적으로 하는 치료에 적합한 개체를 선별하기 위한 키트, 및 /또는 제 1 단백질을 표적으로 하는 약물의 효능 확인용 키트로서 적용 가능하다.

본 명세서에 제공된 단백질-단백질 상호작용 측정용 장치는 소량의 시료에서의 생체 분자 간 상호 작용도 정확하고 효율적으로 관찰， 분석 , 검출， 및 /또는 측정할 수 있다는 이점이 갖는다. 따라서， 상기 멀티 웰 또는 이를 이용하는 분석 방법은 생검 (예컨대, needl e bi opsy) 시료와 같이 매우 소량의 시료에 대해서도 유용하고 효과적으로 적용될 수 있다.

【발명의 효과】

본 명세서에서 제공되는 방법은 특정 표적 치료가 개개의 환자에서 어떠한 반웅을 나타낼 것인지의 예측 또는 개별 환자에게 적합한 표적 치료의 선정이 가능하게 하므로 , 환자 개개인의 맞춤형 치료 전략 개발을 위한 플랫품으로 유용할 것으로 기대된다. 【도면의 간단한 설명】

도 1은 단분자 단백질 상호작용 측정방법에 관한 모식도이다.

도 2는 기판에 고정된 표적단백질 (제 1 단백질) 확인 결과를 보여주는 그래프이다. - 도 3은 형광표지된 상호작용 단백질 (제 2 단백질) 주입 후 단백질 상호작용을 나타낸 형광 이미지이다.

도 4는 도 3에서 관측된 PPI complex의 개수를 정량화한 그래프이다. 도 5는 주입된 세포 용해액 양에 따른 PPI comp l ex 개수 변화를 보여주는 그래프이다.

도 6은 단분자 sandwi ch ELISA를 통하여 제 1 단백질을 정량하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 7은 단분자 sandwi ch ELISA 방법을 통하여 얻어진 특이도 (spec i f i ci ty) 결과를 보여주는 그래프이다.

도 8은 세포주 종류 (빨간색① vs 하늘색③) 및 상태 (빨간색① vs 검은색②)에 따른 PPI comp lex 개수의 변화를 보여주는 그래프이다.

도 9는 세포의 상태에 따른 다양한 표적 RTK (제 1 단백질) 별로 PPI comp l ex 개수 변화를 보여주는 그래프이다.

도 10은 EGFR 변이 상태에 따른 PPI comp l ex 의 변화 및 이를 토대로 세포 당 활성화된 EGFR의 비율 계산한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 11은 도 10에서 EGFR에 대하여 수행한 방법을 HER2 , HER3에 대해서 동일하게 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 12는 각각의 세포주에 대해 EGFR, MET, HER2 , HER3 (제 1 단백질) 와 하위신호전달 단백질 (제 2 단백질) 사이의 상호작용을 모두 측정하여 heatmap 형식으로 표시한 결과를 보여준다. 도 13은 도 12의 결과를 정량적으로 나타낸 그래프 (좌측 및 중간) 및 EGFR 표적항암제의 일종인 AZD9291의 반웅성 결과를 보여주는 그래프 (우측)이다.

도 14는 EGFR 표적 항암제 (AZD9291)의 반웅성 (좌측, y축)과 Activation score (좌측, x축) 사이의 상관관계 및 유전자 타입에 따른 표적 항암제 반응의 다양성 (우측)을 보여주는 그래프이다.

도 15는 유방암 세포주에서 HER2와 HER3 신호의 세기를 나타낸ᅳ heatmap이다.

도 16은 유방암 세포주에서 기존에 trastuzLimab 항암제의 반웅성을 예측하기 위해 사용되는 biomarker인 HER2 (상단), HER3 (중간) 발현량을 측정한 결과 및 trastuzumab에 의해 세포 성정이 억제되는 정도 (하단)를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 17은 HER2 또는 HER3 신호를 이용하여 PPI. score를 측정한 결과와 trastuzumab 반응성 (logGI50) 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. 도 18은 PDTX 마우스 모델에서 측정한 EGFR, MET, HER2, 및 HER3의

3종의 하위 신호 단백질과의 PPI complex 신호 결과를 각각 보여주는 heatmap이다.

도 19는 PDTX 마우스 모델에서 EGFR의 발현량 (상단) 및 상기 EGFR의 발현량 도 18의 결과를 이용하여 activation score를 계산한 결과 (하단)를 보여주는 그래프이다.

도 20은 PDTX 마우스 모델에 gefitinib을 투여하여 종양크기의 변화를 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 21은 PDTX 마우스 모델에서 gefitinib에 의한 종양크기 억제 (tumor growth inhibition) 정도와 EGFR activation score 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다.

도 22는 PDTX 마우스 모델에서 gefitinib을 처방하기 전, 후의 ^' 조직에서 각각 측정된 EGFR PPI complex 개수 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

장치도 23a 내지 23 i는 폐암 PDTX 모델에서의 EGFR 표적 저해제 반응성을 보여주는 것으로,

23a는 PDTX 모델 생성 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이고,

23b는 비히클 또는 표시된 EGFR—특이적 억제제 처리시의 PDTX에서의 종양 부피 변화를 보여주는 그래프로서， 폐선암종 PDTXs (PDTX-A1-A3)에는 오시머티닙 (Osimertinib; 5 mg per 1 kg of wei ht daily)을 처리하고， 폐편평세포암 (SQCC) PDTXs (PDTX-S1~S5)에는 게피티닙 (gefitinib; 50 mg per 1 kg of weight daily)을 처리하여 얻어진 종양크기 변화를 보여주며 (각 PDTX당 시험 개체수는 3 이상임)，

23c는 표시된 수용체 타이로신 카이네이즈 (RTK; EGFR, HER2, HER3 및 MET)의 하위신호단백질에 대한 PPI complex counts (PPI complex의 수)를 보여주는 그래프이고，

. 23d는 8마리의 PDTX (A1-A3 및 S1 S5) 개체에서의 EGFR 발현 수준을 A549 세포 (대조군)에서의 EGFR 발현 수준으로 normal izat ion한 결과를 보여주는 그래프이며,

23e 및 23f는 종양 성장 억제율 (%)을 y축으로 하고, 폐선암종 PDTX 모델 (E) 및 SQCC PDTX 모델 (f)로부터 얻어진 EGFR PPI 합계를 EGFR 수준으로 나눈 값을 X축으로 하여 나타낸 그래프이고,

23g는 gefitinib을 15일 동안 매일 처리한 경우의 PPI complex counts (EGFR와 x축에 기재된 게 2 단백질 간 PPI complex의 수)의 변화를 보여주는 그래프이며，

23h는 PDTX-Sl(n=2)에 gefitinib과 BKM120을 15일간 병용 처리한 경우의 종양 성장 정도를 단독 처리시와 비교하여 보여주는 그래프이고，

23i는 8마리의 PDTX (A1-A3 및 S1 S5) 개체 모두에서 얻어진 EGFR 수준으로 PPI 합계를 나눈 값을 X축으로 하고 종양 성장 억제율 (%)를 y축으로 하여 나타낸 그래프이다 (Error bars: s.d.).

도 24a 내지 24d는 단분자 (single—molecule) co-IP 및 단분자 면역표지법 (single-molecule i誦 unolabel ing)을 인간 종양 시료에 적용한 예를 보여주는 것으로,

24a는 두 종양 환자 (P1 및 P2)의 종양 절제 수술로 얻어진 인간 종양 조직을 보여주며，

24b는 단분자 면역표지법에 의하여 얻어진 10개 단백질의 발현량과 PTM 수준 (Immuno label ling level) 및 고효율 단분자 영상화 시스템을 사용하여 각 시료를 단분자 co-IP에 의하여 얻어진 10개의 단백질-단백질 쌍의 PPI 수준을 보여주는 그래프로서, 양성대조군으로서 PC9 세포 (for EGFR) , HCC827 세포 (for MET), 및 SKBR3 세포 (for HER2 및 HER3)가 각각 사용되었으며,

24c는 P1 및 P2에서의 표시된 RTK에 대한 PPI complex counts를 보여주는 그래프이고,

24d는 표면 상에서 EGFR을 pulling down한 후 PTPN1 처리한 경우의 PLC _{g aSH} 2 및 Grb2의 PPI complex count 변화를 보여주는 그래프이다 (Error bars: s .d. ) .

도 25a 내지 25h는 PDTX-model(n=3)의 특성을 보여주는 것으로，

25a 내지 25c는 MET 수준 (a), HER2 수준 (b), 및 HER3 수준 (c)을 HCC827 세포 (for MET) 및 SKBR3 세포 (for HER2 및 HER3)에서의 MET, HER2 및 HER3의 수준과 비교한 결과를 보여주는 그래프로서 (Error bars: s.d.； n=5), 이들 RTK 중 어느 것도 과발현되지 않았음을 확인할 수 있고，

25d는 대표적으로 5 마리의 SQCC PDTX에서 측정된 EGFR의 면역조직화학염색 (IHC) 결과를 보여주는 이미지이며 , EGFR의 발현은 magnification rule로 EGFR H—score를 계산하여 산정하였고，

25e는 단분자 면역표지법에 의해 결정된 EGFR 수준과 EGFR H-score 간의 상관 관계를 보여주는 산포도로서, IHC H-score는 단분자 면역표지법에 의해 결정된 전체 EGFR 발현 수준과 완전한 선형 상관 관계를 나타내는 것으로 확인되었으며，

25 f 및 25g은 SQCC PDTX의 EGFR 수준 (g) 및 PPI 합계 (h)와 종양 성장 억제의 상관관계를 보여주는 산포도이고,

25h는 vehicle 또는 gefitinib 처리한 PDTXᅳ S2의 I瞧 unoblot 분석 결과를 보여주는 것으로， 15일 gefitinib 처리 후 EGFR의 1068번째 잔기인 티로신의 인산화 (pEGFR)가 완전히 사라지고， gefitinib 처리에 의하여 AKT 및 S6K의 인산화 (각각 pAkt와 pS6K)도 억제됨을 보여주며, 이러한 결과는 PDTX— S2에서의 종양 성장 억제 효과가 gefitinib 처리에 의한 EGFR/AKT/mT0R/S6 신호전달 경로를 억제함으로써 얻어지는 것임을 보여준다.

도 26a 및 26b는 PDTX-S1 및 PDTX-S2에서의 gefitinib 처리 효과를 보여주는 것으로,

26a는 15일 동안 gefitinib 처리한 경우의 EGFR 수준 변화를 보여주는 그래프이고 (Error bars: s.d.； n=5) ,

26b는 gefitinib 처리에 의한 EGFR PPI 억제 정도를 보여주는 그래프로, A549 세포의 EGFR PPI complex count를 음성대조군으로 나타내었다 (Error bars: s.d.； n=5) .

도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 멀티 웰을 개략적인 나타낸 사시도이다.

도 28는 멀티 웰을 뒤짚어 나타낸 도면이다

도 29 및 30은 멀티 웰을 제조하는 과정을 나타낸 도면이다.

도 31은 본 실시예와 비교예에 의해 각각 제조된 멀티 웰 내에 존재하는 GFP를 측정한 결과이다 (Y축: GFP counts) .

도 32 및 도 33은 항체가 고정화되지 않은 일 실시예의 멀티 웰 A (도 32) 및 비교예의 멀티 웰 B (도 33)에서의 GFP 개수 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

도 34는 일 실시예의 멀티 웰 A에서의 항체 고정화 여부에 따른 GFP 개수 측정 결과를 보여주는 그래프이다.

도 35는 일 실시예의 멀티 웰 A에서의 세포 시료 양에 따른 GFP 개수 측정 결과를 보여주는그래프이다.

도 36 및 도 37은 일 실시예의 멀티 웰 A에서의 항체 고정화 여부에 따른 GFP 개수 측정 결과를보여주는 그래프이다.

도 38은 일 실시예의 멀티 웰 A의 넘버링된 상태를 보여준다.

【발명의 실시를 위한 형태】

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다. 실시예 1: 제 1단백질 (EGFR, MET, HER2, 및 HER3) 준비

제 1 단백질로서 EGFR, MET, HER2 , 및 HER3를 선정하였으며, 이를 포함하는 세포주 (예컨대， 암 세포주) 또는 암세포 조직을 용해하여 얻어진 용해물 ( lysate)로부터 상기 제 1 단백질을 얻었다. 본 과정을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다:

1.1. 세포용해물준비

1.1.1. 세포주준비

세포주를 배지 (RPMI1640 , high glucose (Thermo 11965-092) ) 에 2 x 10 ⁶ eel I s의 양으로 분주하여 배양하였다. 100— pi cul ture dish에서 90% conf luency 이상일 때 상가세포주를 수집하여 2개의 L 5 ml 류브에 나누어 넣었다. 상기 튜브를 원심분리 (5 min X 15,000g) 하여 배양 배지를 제거한후 세포만남기고 -80C：에 얼려서 보관하였다.

준비된 세포주를 아래의 표 1에 정리하였다:

55 정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR [표 1]

1.1.2. 세포 용해물 준비

50 mM Tris-HCl (pH 7.4), l%(v/v) Triton X-100, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 10%(v/v) glycerol , protease inhibitor cocktail (Sigma, P8340) 100X, 및 tyrosine phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, P5726) 100X의 조성을 갖는 세포 용해 버퍼를 준비하였다.

상기 실시예 1.1.1에서 준비된 세포주 시료를 피펫팅하여 뭉쳐있는 세포들을를 피펫으로 풀어주었다. 상기 피펫팅한 세포주 시료에 상기 준비된 세포 용해 버퍼를 각 튜브 당 200ul의 양으로 넣고, 얼음 위에 을려진 cold block (0-4 ^° C)에 보관하면서 총 30분 반응시켰다. 이 때 10분 간격으로 주기적인 피펫팅을 통해 물리적으로 섞는 과정을 반복하여 계면활성제에 의한 세포 용해 반응이 활발하게 일어나도록 하였다.

상기한 바와 같이 30분 반응 후， 원심분리를 수행하였다 (10 min, 15,000g, 4 ^° C). 그 후, 가라 앉은 부분 (pel let)은 버리고, 상청액 (supernatant)만을 취하여 0.2um 크기 기공을 갖는 멤브레인을 사용하여 여과시켜 상기 멤브레인을 통과한 부분을 새로운 튜브에 옮겨 담아, 다음 시험에 사용시까지 보관하였다.

전체단백질 계량법 (Bradford, BCA, DC protein assay 등)을 이용하여 상기 반응 결과물 내의 전체 단백질 농도를 측정한 결과, 단백질 농도가 약 5-10 mg/ml 정도로 측정되었다.

1.2. 조직 용해액 준비

1.2.1. 환자유래 종양 이종이식 모델 준비

폐편평세포암 (Lung squamous cell carcinoma; SQCC) 환자 유래의 tumor xenograft를 연세대학교 연구팀으로부터 입수하였다. Patient- derived tumor xenograft (PDTXs) 제작 과정을 간략히 살피면 다음과 같다: 6 내지 8주령의 암컷 중증 복합 면역 결핍증 마우스 (severe combined itnmunodef icient mice； NOG) 및 누드 마우스 (nu/nu mice; OrientBio)를 준비하였다. 모든 동물 시험은 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)에 의하여 승인된 가이드라인에 따라서 수행하였다. 환자에서 유래한 임상 종양 샘플을 3mm 이하의 크기의 절편으로 절단하 후 상기 준비된 N0G 마우스의 옆구리에 피하 이식하였다. 종양 크기는 캘리퍼스로 주 2회 측정하여 피하 조직에서의 성장률을 측정하였다. 종양 크기가 직경 1.5 cm 정도가 되면, 종양 조직을 적출하고 작은 절편 (한 면 길이가 약 5誦인 육각형)으로 절단하였다. 그 후, 절단된 조직을 다른 마우스에 재이식하여 연속적으로 subsequent tumor를 포함하는 개체들을 얻었다. 이렇게 얻어진 환자—유래 종양을 갖는 마우스를 F0라고 명명하고, 이로부터 연속적으로 유래된 subsequent tumor를 갖는 마우스들을 일련번호를 붙여서 Fl, F2, F3, F4 등으로 칭하였다. 3세대 subsequent tuijior를 갖는 마우스 (F3)에 비히클 (PBS) 또는 게피티닙 (gefitinib)를 투여하여 시험에 사용하였다. 상기 준비된 PDTXs에 50 mg/kg의 게피티닙 또는 비히클을 하루 한 번 복강내 (intraperitoneal) 투여하였다. 게피티닙 투여로부터 15일 후 PDTX로부터 종양 조직을 수거하여 하기하는 PPI 및 발현수준 변화 모니터링에 사용하였다.

1.2.2. 조직 용해액 준비

상기 실시예 1.2.1.에서 얻어진 종양조직을 20 mm ³ 정도 양으로 준비하였으나, 이보다 큰 경우라도 무방하다.

상기 준비된 종양조직 20 mm ³ 당 앞서 실시예 1.1.2에서 준비된 용해 버퍼를 약 300 uL 정도 첨가하고, 4 ^° C 냉장고에서 1시간 동안 계속 회전시키며 반응시켰다. 이 때， 수술용 가위를 이용하여 조직의 크기를 최대한 잘게 만들어, 단위 부피 당 표면적을 넓게 하여, 용해 버퍼 내의 계면활성제에 의한 화학반웅이 최대한 효율적으로 일어날 수 있도록 하였다. 상기한 바와 같이 1시간 반응 후, 원심분리를 수행하였다 (10 min, 15,000g, 4 ^° C). 그 후， 가라 앉은 부분 (pellet)은 버리고, 상청액 (supernatant)만을 취하여 0.2誦 크기 기공을 갖는 멤브레인을 사용하여 여과시켜 상기 멤브레인을 통과한 부분을 새로운 튜브에 옮겨 담아， 다음 시험에 사용시까지 보관하였다.

전체단백질 계량법 (Bradford, BCA, DC protein assay 등)을 이용하여 상기 반응 결과물 내의 전체 단백질 농도를 측정한 결과， 단백질 농도가 약 5-10 mg/ml 정도로 측정되었.다 . 실시예 2: 제 2 단백질 준비

본 실시예에서는 상기 실시예 1에서 준비된 제 단백질의 하위신호전달 단백질에 형광 단백질이 부착된 형태의 제 2 단백질의 준비 과정이 예시된다.

본 실시예에서 예시되는 제 2 단백질을 아래의 표 2에 정리하였다:

[표 2]

또는 SH2-SH3 (57-217) 아미노산 부분을

암호화하는 핵산분자를 cloning 하여

사용

Human p85a (NP_852664.1) 전체

sequence 또는 N— SH2 (333-428), C— SH2

(624-718) 또는 tandem SH2 (333-718)을

암호화하는 핵산분자를 cloning하여

P85-alpha .사용하거나, _{mouse P} 85a (P26450) 전체

sequence 또는 N-SH2 (333-428), C-SH2

(624-718) 또는 tandem SH2 (333-718)

을 암호화하는 핵산분자를 cloning하여

사용

상기 제 2 단백질의 준비를 위하여, 상기 실시예 1에서 준비된 제 1 단백질의 발현이 적은 세포주인 HEK293 세포 (ATCC) 및 HeLa 세포 (ATCC)를 준비하였다.

^' 상기 표 2에 기재된 제 2 단백질 각각에 대한 발현백터를 상기 준비된 HEK293 세포 또는 HeLa 세포에 주입하고 배양하여， 제 2 단백질을 발현시켰다. 24시간 배양 후 세포를 수집한 후， 적절한 양으로 분배하여 - 80 ^° C에 보관하였다.

상기 세포에 용해액 ((50 mM Tris-HCl ( H 7.4), 1% Triton X-100, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 10% glycerol , protease inhibitor cocktail (Sigma, P8340) 100X, tyrosine phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, P5726) 100X))을 넣어 주었다. 높은 농도의 계면활성제 (Triton X-100)는 단백질 상호작용을 방해할 수 있으므로， 우선 5xl0 ⁵ .cells에 대하여 60 uL의 ^■ 용해액을 투입하였다.

파이펫팅을 통해 뭉쳐있는 상기 얻어진 반응 흔합물 내의. 세포를 모두 풀어준 후， 이를 얼음 위에 을려진 cold block (0-4 ^° C)에 보관하면서 총 30분 반응시켰다. 이 때 10분 간격으로 주기적인 파이펫팅을 통해 물리적으로 섞는 과정을 수행하여 계면활성제에 의한 용해 반응이 활발하게 일어나도록 하였다.

30분 반응 후, 원심분리를 수행하였다 (10 min, 15,000g, 4 ^° C). 가라 앉은 부분은 버리고 (pellet), 수용액만 (supernatant) 실험을 위해 새로운 튜브에 옮겨 담았다.

상기 얻어진 수용액 60 uL를 취하여 140 uL의 PBS에 첨가해주었다. 이렇게 되면 최종적으로 0.3% Triton X-100이 포함된 제 2단백질의 용해액을 얻을 수 있다. Fluoremeter를 이용하여 제 2단백질에 부착된 형광단백질의 농도를 측정하였다. 그 결과 사용된 3종의 게 2 단백질의 농도가 대략 400 내지 ΙΟΟΟηΜ 범위 내로 측정되었다. 실시예 3: 기판의 준비

Coverslip을 K0H 1M 용액에 침지시킨 후， sonicator에 담아서 세척하였다 (20-30 min). 그 후， 3차 증류수로 잘 씻은 후， piranha solution (황산：과산화수소 = 2:1 ~ 3:1 (v/v))을 이용하여 세척하였다. 세척한 coverslip 표면에 대하여 aminopropylsi lane와 PEG를 차례로 처리하여 코팅을 수행하였다.

2시간 반웅 후, 3차 증류수로 세척한 뒤 PEG 코팅된 면이 접촉되지 않게 하여 -20 ^° C에서 사용시까지 보관하였다.

동시에 석영 재질의 channel 형태의 기판 또는 아크릴 재질의 well 형태의 기판을 준비하였다. 석영 재질의 기판의 경우， 앞서 설명한 coverslip 처리 과정을 참조로 세척 및 PEG 코팅 과정을 수행하였다.

아크릴 재질의 기판의 경우, 제작 후 3차 증류수에 침지시킨 후 sonication하여 세척하였다. 세척된 아크릴 재질의 기판을 5% BSA 용액에 침지시키고 2시간 반응시켜 비특이적 단백질 흡착 (nonspecific protein adsorption)을 방지하고, -20 ^° C에서 사용시까지 보관하였다.

하기 시험에서는 상기 준비된 covers lip과 아크릴 재질의 기판을 사용하였으며, 시험 전에 상기 coverslip과 아크릴 재질의 기판을 해동하여 조립하거나 PEG 코팅이 끝난 뒤 미리 조립하고， 조립된 형태로 — 20 ^° C에 보관하여 사용 전에 해동하여 사용하였다. 실시예 4: 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 단백질-단백질 상호 작용이 이미징

상기 준비된 기판에 Avidin 계열의 단백질인 Neutravidin (Thermo, A2666)을 0.1 mg/ml 농도로 투입하였다. 상온에서 5분 반응 시킨 후 PBS buffer 30 ul를 이용하여 2회 기판을 세척하였다.

상기 .준비된 기판에 표적이 되는 제 1단백질에 대한 항체를 투입하였다. 이 때， 사용되는 항체는 biotin이 접합된 형태인 것으로 준비하였다. 항체의 농도는 항체-항원의 affinity (dissociation constant, D)에 따라 적절히 조절될 수 있으며， 본 실험예에서는 2 ug/ml 정도로 사용하였으몌 반웅시간은 5분 정도로 하였다. 만약 Bi ot in이 접합되어 있지 않은 항체를 사용하는 경우에는 이차 항체를 이용하여 제 1단백질의 항체를 부착할 수 있다.

이 때 사용된 제 1 단백질에 대한 항체를 다음의 표 3에 정리하였다:

[표 3]

상기 항체가 처리된 기판을 PBS buf fer 30 . u l를 이용하여 2회 세척하였다. 상기 준비된 기판에 앞서 실시예 1에서 준비한 제 1단백질을 포함하고 있는 세포 용해액 또는 조직용해액을 투입하였다. 항원 -항체 반웅의 경우 15분까지는 계속 증가할 수 있고 15분을 초과하면서 시간대비 항원 -항체 반응 효율이 낮아질 수 있어서， 반응시간을 15분 정도로 설정하였다. ·

반웅 후, 기판을 PBS에 tween 20이 0 .05%(v/v) 포함된 버퍼를 이용하여 세척하였다. Tween 20 0.05%는 nonspeci f i c binding을 줄여주는 동시에， 막단백질의 hydrophobi c region이 망가지지 않도록 도와준다.

그 후, 상기 기판에 실시예 2에서 얻어진 제 2단백질 용해액을 투입하였다. 사용된 제 1 단백질 용해액 내 제 2 단백질의 농도는 형광단백질 기준으로 1-50 nM 사이의 값 (약 30nM)으로 하였다. 제 2 단백질 농도가 100 nM 이상이 되면 형광현미경에서 background noi se가 커지게 되어 정확한 형광신호를 측정하는데 방해가 된다.

형광현미경에 기판을 고정시키고 이미징하여, 각각의 제 1 단백질 /제 2 단백질에 대한 데이터를 얻었다. 실시예 5 : 단백질 복합체 (PPI complex) 분석

Mat l ab 프로그램 (MathWorks 제공)에서 제공되는 toolki t에 기반하여 단백질 복합체를 분석하였다.

상기 실시예 4에서 얻어진 형광미지는 16b i t uns igned integer 형식으로 저장하였다. 형광 신호는 eGFP (enhanced green f luorescent protein)로부터 얻었으며， 상기 신호를 관측하기 위하여 레이저의 파장을 488nm로 하였고, eGFP의 발광시간을 11초 정도 유지시키기 위하여 레이저 파워를 2mW로 조절하여 사용하였다. 전체 프레임 (30 프레임) 중， 초반 프레임을 버리고， 3개 프레임 (22-25번째 프레임)의 이미지를 평균하여 하나의 이미지를 생성하였으며， 이와 같은 과정을 well 안에서 위치를 옮겨가며 반복 수행하여 총 5개의 이미지를 획득하여 아래 과정을 수행하였다. 초반 20 프레임 정도를 버리는 이유는, 아무것도 없는 기판의 표면에서 발생하는 불필요한 신호 (autofluorescence)가 사라지고， eGFP 신호가 유지되는 구간을 선별하여 사용하기 위함이다. ^' 이와 같이 선별되는 구간은 이미징 조건 /장비구축 상태에 따라서 달라질 수 있다. 본 실시예에서는 EMCCD (Electron-mul t iplying charge-cou led device; Andor iXon Ultra 897 EX2 (DU-897U-CS0-EXF) ) 카메라를 사용하여 1프레임당 노출시간을 0.1초로 하고， EMCCD gain 값은 40으로 하여 형광 이미지를 얻었다.

노이즈를 제거하기 위해, 각 프레임 마다 아래와 같은 절차를 수행하였다:

(a) 최초 시작은 왼쪽 상단에서 시작한다. 1 프레임은 512x512 개의 픽셀로 구성되어 있다. 기준 픽셀을 기준으로 오른쪽으로 11개 , 아래쪽으로 11개인 11x11개의 픽샐에서 median 값을 구하고， 이 median 값을 기준 픽셀의 수치에서 빼주었다 [(Intensity_pixel)—

(medianIntensity_llxllneighborhood)] . 512x512의 모든 픽셀에 대해서 위 절차를 수행하였다. Median filtering을 통해서 pepper & salt noise를 제거하였다.

(b) 위의 처리된 이미지에서 sigma=0.7, size=5x5의 Gaussian smoothing을 수행하여， 이미지를 부드럽게 만들어 주었다.

(c) Threshold를 설정하였다. Threshold는 전체 이미지에서 pixel intensity가 threshold 이하가 되는 pixel의 값을 threshold 값으로 모두 만들어 준다 (Mat lab toolkit에서 local maxiinum을 찾는 알고리즘을 사용함). 이를 통해 이미지에서 형광신호에 의해서 만들어지지 않은 국소 극대값 (local maximum)을 제거할 수 있다. 본 실시예의 이미징 조건에서 사용되는 threshold 값은 70이다.

형광단백질로부터 나오는 신호는 특정 위치에 모여있는 형태 (localized point spread function (PSF))로 발생하는데， 이 PSF 개수 (물리적인 값)를 측정하고자 하는 제 1 단백질과 게 2 단백질 간의 PPI complex 숫자 (생물학적인 값)이다. 상기 PSF 값은 아래와 같은 과정을 거쳐서 생물학적인 값인 PPI complex 값으로 전환시켰다:

(a) Local maximum의 위치를 구하였다 (예를 들어, i번째 row, j번째 column pixel). 앞서 기술한 바와 같이， 단분자 형광신호는 512x512 픽셀 중에서 특정 위치 (현재 관측장비 하에서 대략 5x5 픽셀 사이즈 1 pixel = 0.167 마이크로미터)에 모여 형성되므로, local maximum을 찾으면 개별 PSF를 선별할 수 있다. 이는 Mat lab에서 제공되는 toolkit을 이용하여 구할 수 있다.

(b) 상기 (a)에서 구한 local maximum이 실제 PSF로부터 발생한 것인지에 대한 판별과정을 거친다. 우선 local maximum의 최소값 (minimum intensity value)을 정의하고, 상기 얻어진 local maximum 중에서 이 최소값보다 큰 경우만 분석에 사용하였다. 본 실시예에서 사용된 최소값은 75이고， 이 값은 레이저 파워 /노출시간 /장비구축 상황에 따라서 달라질 수 있다ᅳ 최종적으로 얻어진 i _oca i maximum 좌표를 중심으로 5x5 픽셀의 정보를 불러온 후, 이 5x5 픽셀에서 밝기에 대한 중심을 구하였다 (centroid of intensity) . 이 때， 구해진 밝기 중심이 기존 local maximum 좌표에 대하여 0.5 pixel 이상 벗어나게 되면 (PSF 모양에 대한 2D 대칭이 사라지면), 정상적이지 않은 형광신호라고 판단하고 분석에서 제외시켰다.

(c) 모든 조건을 통과한 PSF 만 최종적으로 선별하여 좌표와 전체 개수를 구하였다. 이 때 얻어진 PSF 전체 개수가 PPI complex의 개수가 된다丄

같은 조건하에서 촬영된 모든 파일에 대하여 상기 과정을 수행하여 PSF 개수를 구한 후, 이를 취합하여 평균과 표준편차를 구하였다. 이 값이 최종적으로 특정 조건에서 PPI complex의 개수를 나타내는 값이 된다 (도면중에 "Number of single PPI complexes"로 표시됨). 실시예 6: PPI 세기， PPI 스코어 (PPI score), 및 활성화 스코어 (Activation score)의 결정

세포 용해물 (실시예 1.1.2 참조)의 농도를 X축으로 하고， 각 세포 용해물에서 측정된 PPI com lex 값 (실시예 5 참조)을 y축으로 하여 얻어진 그래프의 기울기, 즉， [(PPI complex)/ (세포 용해액 단위 농도 (1/zg/ml) 당 PPI complex 개수)]를 상기 세포에서의 제 1 단백질과 제 2 단백질 간 PPI 세기 (또는 PPI slope)로 정의하였다. 각 세포주 별로 얻어진 모든 PPI 세기를 합하여 PPI 세기 총합을 구하였으며, 이 값을 그 세포주에 대한 PPI 스코어 (PPI score)로 정의하였다. 상기 PPI 세기 총합 (또는 PPI 스코어)은 각 세포주의 세포 용해물 단위 농도에서의 시험된 제 1 단백질과 제 2 단백질의 총 PPI 정도를 나타낸다.

상기 PPI 세기 총합을 구하는 방법을 수식으로 표현하면 다음과 같다:

(제 1 단백질: RTK (폐암의 경우, EGFR, MET, HER2, 또는 HER3; 유방암의 경우 HER2 및 HER3);

제 2 단백질: downstream protein (PLOga隱 a_SH2， Grb2, p85— alpha)). 또한， 세포주들 간 상대적인 PPI 스코어를 나타내기 위하여， 특정 세포주 (이하， '기준 세포'라 칭함; 본 시험예에서， 폐암 세포주 중에서는 PC9 세포를, 유방암 세포주 중에서는 SKBR3 세포를 각각 사용함)의 PPI 스코어가 1이 되도록 다른 세포 (상기 기준 세포를 제외한 세포로서, 이하 '시험 세포'라 칭함)에서 얻어진 PPI 스코어들을 normalization하였으며 , 이 때 각각의 세포주에 대하여 얻어진 값을 그 세포주에 대한 normalized PPI 스코어로 정의하였다.

또한, 각 세포 용해물 내의 제 1 단백질 (예컨대， RTK (폐암의 경우, EGFR, MET, HER2, 또는 HER3; 유방암의 경우 HER2 및 HER3)의 총량을 측정하였다. 상기 제 1 단백질의 총량은 앞서 기재한 각각의 항체 (표 3 참조)를 사용하는 Sandwich EL ISA 또는 quantitative western blot 등을 통하여 정량한 후， 세포 용해물의 중량 (세포 용해물 내의 총 단백질 중량)으로 나눈 값으로 정하였다.

상기 얻어진 PPI 스코어 또는 normalized PPI 스코어를 제 1 단백질의 총량으로 나누어 얻어진 값을 활성화 스코어 (activation score)로 정의하였다. 이 때， 세포주들 간 상대적인 활성화 스코어를 나타내기 위하여， 기준 세포 (폐암 세포주: PC9 세포， 유방암 세포주: SKBR3 세포)의 활성화 스코어가 1이 되도록 시험 세포에서 얻어진 활성화 스코어들을 normalization하였으며, 이 때 각각의 세포주에 대하여 얻어진 값을 그 세포주에 대한 normalized 활성화 스코어로 정의하였다.

PDTX (patient-derived tumor xenogrft) 마우스 모델에서 PPI 스코어를 구하는 경우, 상기 방법으로 얻어진 값에서 negative background 값을 측정하여 이를 공제하여 background noise를 줄일 수 있다. 이 경우, negative background는 동일 환자의 정상조직 또는 EGFR이 정상인 암세포 용해물을 사용할 수 있다. 일 예로 EGFR 유전자가 정상상태인 A549 세포에서 EGFR과 각 하위 단백질 사이의 상호작용 정도를 측정하여 PPI 스코어를 구한다. 이를 negative background 로 설정하여 각 PDTX 마우스 모델에서 얻어진 PPI 스코어에서 negative background 를 빼서 최종 PPI 스코어를 산출한다. 실시예 7: Heatraap 작성

Data를 실시예 5에서 수치화한 것에 더하여, 이의 분석에 보충적 판단을 추가하기 위하여 Heatmap을 작성하였다. iieatmap는 data를 보여주는 한 방법일 뿐이며, data 해석을 특별히 제한하기 위한 것은 아니다.

X축과 γ축 중， 한쪽 축은 제 2 단백질 (하위신호 단백질)로 하고， 다른 축은 세포 종류로 하여 3xl6(제 2 단백질 개수 (총 3개: 표 2 참조 (p85— alpha, Grb2, PLC— ga隱 a-SH2 ) ) x 세포주 개수 (총 15개 (폐암 세포주) 또는 총 11개 (유방암 세포주): 표 1 참조))의 격자체를 만들었으몌 이러한 격자체는 제 1 단백질 별로 총 4개 (EGFR, MET, HER2ᅳ 및 HER3; 폐암)， 또는 총 2개 (HER2 및 HER3; 유방암)를 만들었다 (단, 3의'경우 제 2 단백질로서 p85ᅳ alpha만 사용함). 그 후, 해당 세포에서 얻어진 제 1 단백질과 제 2 ^' 단백질 간의 PPI 세기에 따라서 색과 밝기를 변화시키며 Heatmap을 작성하였다 (예컨대， PPI 세기가 높아질수록 어둡고 검은색에서 중간 밝기의 붉은색, 밝은 녹색 순서로 표시될 수 있는테, 이는 각 시험마다 시험자가 정하는 값으로 정해진 값은 아니다). 어떠한 세포를 기준으로 삼더라도 세포주 사이의 상대적인 차이는 변하지 않는다. 실시예 8: 약물 반응성과, PPI 스코어 및 활성화 스코어 간의 상관관계

상기 실시예 1 내지 7에 기재된 방법으로 시험한 결과를 도면을 들어 아래에 설명하였다:

도 1은 단분자 단백질 상호작용 측정방법에 관한 모식도이다. 좌측은 Polyethylene glycol 이 코팅된 기판에 Neutravidin, RTK 항체, 및 분석하고자 하는 세포 용해액 또는 조직 용해액을 순서대로 주입한 후， 세척하는 방법을 모식적으로 보여주고, 중간은 이를 통해 표적 RTK 단백질을 기판에 고정하는 모습을 보여주 ^' 며. 우측은 기판에 형광표지된 상호작용 단백질을 주입하여 형광신호를 관측 및 계량하여 단분자 단백질 상호작용 정도를 측정하는 모습을 보여준다 .

도 2는 기판에 고정된 표적단백질 (제 1 단백질) 확인 결과를 보여주는 그래프이다. 실시예 4 및 5에 기재된 방법을 참조하여 시험하였다. EGF은 lOOng/ul의 양으로 3분간 처리하였으며， 도 2의 왼쪽 그래프는 H1666을 사용하고 EGFR의 extracellular domain에 결합하는. antibody (MA5- 13266, Thermofisher)를 통해 기판에 부착하고, EGFR의 intracellular domain (#4267， Cell signaling technology) 대한 antibody를 넣어 부착 확인한 결과이고, 도 2의 가운데 그래프는 EGFR이 HER2와 dimer를 형성하는지 여부를 HER2의 antibody를 넣어서 확인한 결과이고, 도 2의 ^ᅵ 오른쪽 그래프는 EGFR이 Shcl과 dimer를 형성하는지 여부를 Shcl의 항체를 넣어서 확인한 결과를 보여준다.

기판의 항체 주입 여부에 따라 표적 RTK 단백질 (제 1 단백질)이 고정되거나 (+로 표시)， 고정되지 않게 된다 (—로 표시). 이를 통해 적절한 항체 선별을 거쳐 다양한 표적단백질을 기판에 부착할 수 있다. 또한 EGFR-HER2나 EGFR-Shcl의 경우와 같이 단일 표적 단백질뿐만 아니라 생체 내 존재하던 단백질 결합체 형태로도 기판에 고정할 수 있음을 확인할 수 있다.

도 3은 제 1 단백질이 고정화된 기판에 형광표지된 상호작용 단백질

(제 2 단백질) 주입 후 단백질 상호작용을: 나타낸 이미지이다. 실시예 5에서 설명한 방법으로 관측된 PPI complex는 Point spread function (PSF) 형태로 나타나며, 컴퓨터 알고리즘을 통해 PPI complex를 선별하였다. 하위 신호전달단백질이 주입된 상태에서만 형광신호가 발생하는 것을 볼 수 있다. 초록색 원형은 관찰된 PPI complex를 나타낸 것이다.

도 4는 도 3에서 관측된 PPI complex의 개수를 정량화한 그래프이다. 하위 신호전달 단백질 (제 2 단백질 _. )이 주입된 경우 (X축에서 PLCga隱 aSH2, Grb2, 및 p85-alpha로표시 )에만 선택적으로 높은 PPI complex가 관측된 것을 확인할 수 있다. 반면 표적 RTK 단백질 (제 1 단백질 (EGFR)의 항체가 없거나 (검은 막대), 주입된 하위 신호전달단백질이 없는 경우 (X축의 buffer)에는 관측되는 신호가 매우 작은 것을 볼 수 있다. 두 경우에도 관측되는 것은 background noise로 해석할 수 있다.

도 5는 주입된 세포용해액 양에 따른 PPI complex 개수 증가를 보여주는 그래프이다. 표적 RTK 단백질 (제 1 단백질: EGFR)을 포함하는 세포 용해액의 양이 증가함에 따라 (X축)， 관측되는 PPI complex 의 양 (y축)도 선형적으로 증가함을 볼 수 있다. 이를 통해 특정 세포 용해액의 양에서 시료 간의 PPI complex의 정량적 비교가 가능하다:

도 6은 단분자 sandwich ELISA를 통하여 제 1 단백질을 정량하는 과정을 보여주는 모식도이다. 기판의 ^' 표면에 표적 RTK 단백질 (제 1 단백질)을 부착하는 과정은 도 1과 동일하다. 형광표지된 하위 신호단백질 (제 2 단백질) 대신, 표적 RTK 단백질을 인식하는 제 2 항체를 주입하여 표적 RTK 단백질의 양을 측정할 수 있다. 이 때 사용되는 제 2 항체 (detection antibody)는 표적 RTK 단백질을 기판의 표면에 고정시키기 위해 사용된 게 1 항체 (pull down antibody)와 표적 RTK 단백질 상에서 서로 다른 항체인식부위 (epitope)를 가지고 있어야 한다. 제 2 항체를 인식하는 형광표지된 항체 (labeled antibody)를 통해 기판의 표면에 고정된 RTK 단백질의 양을 단분자 기법 (실시예 5 참조)을 통해 측정할 수 있다.

도 7은 단분자 sandwich ELISA 방법을 통하여 얻어진 특이도

(specificity) 결과를 보여주는 그래프이다: 도 6의 모식도에 나타난 구성 요소 중에서 하나의 구성요소만 빠져도 단분자 sandwich ELISA 신호 결과가 억제됨을 볼 수 있다.

도 8은 세포주 종류 (빨간색① vs 하늘색③) 및 상태 (빨간색① vs 검은색②)에 따른 PPI complex 개수의 변화를 보여주는 그래프이다. 세포에 존재하는 표적 RTK 단백질 (제 1 단백질; EGFR)이 해당 리간드에 의해 활성화되었을 때 (EGF+), 그렇지 않은 경우와 비교하여, 동일 주입량에서 높은 PPI complex가 관측됨을 볼 수 있다. 또한 표적 RTK에 활성변이가 존재하면 (PC9, 하늘색)， 관측되는 표적 RTK의 PPI complex 개수가 증가함을 확인할 수 있다.

도 9는 세포의 상태에 따른 다양한 표적 RTK (제 1 단백질) 별로 시료의 ^ᅵ 단위농도 당 PPI complex 개수 변화 (PPI slope)를 보여주는 그래프이다. 실시예 6에 기재된 단분자 Co- IP 기술을 이용하여 EGFR, MET, HER2, HER3 각각의 표적 단백질 (제 1 단백질)에 대하여 ligand stimulation 하였을 때 (회색)와 그렇지 ¾은 상태 (검은색)에서 PPI complex 개수가 달라지는 것을 정량적으로 측정하였다. 이를 바탕으로 PPI complex 정량을 통해 표적 RTK의 활성도를 측정할 수 있다.

도 10은 EGFR 변이 상태에 따른 PPI complex 의 변화 및 이를 토대로 세포 당 활성화된 EGFR의 비율 계산한 결과를 보여주는 그래프이다. 상단은 PPI comp l ex 측정법을 통해 개별 세포 별로 EGFR과 하위신호전달 단백질 사이의 상호작용을 측정한 결과를 보여주는 것이고， 하단은 단분자 sandwi ch EL ISA (도 6 참조)를 통해 세포 당 EGFR 발현량을 측정한 후 두 값을 나누어 각 세포 당 활성화된 EGFR의 양을 계량한 결과 (Absolute occupancy (%) )를 보여준다.

도 11은 도 10에서 EGFR에 대하여 수행한 방법을 HER2ᅳ HER3에 대해서 동일하게 수행하여 얻어진 Absolute occupancy (%) 결과를 보여주는 그래프이다. HER2의 경우 활성도가 매우 낮은 반면, HER3는 매우 높은 활성비율을 나타낸다.

도 12는 폐암 세포주에 대해 EGFR, MET, HER2 , HER3 (제 1 단백질) 와 하위신호전달 단백질 (제 2 단백질) 사이의 상호작용 (신호 세기)을 모두 측정하여 heatmap 형식 (실시예 7)으로 표시한 결과를 보여준다. 각 신호 세기에 대한 color indi cator는 아래에 표시되어 있다.

도 13은 도 12의 결과 중에서 EGFR (제 1 단백질)과 3종의 제 2 단백질 간의 신호 세기를 각각 정량한 수치를 더한 값을 나타낸 그래프 (좌측 및 중간) 및 각 세포주의 EGFR 표적항암제의 일종인 AZD9291(0s imert ini b)에 대한 반응성 ( IC50 ; 세포 생존률이 처리 전과 비교하여 50%가 되는 처리 농도) 결과를 보여주는 그래프 (우측)이다.

각 막대의 색은 EGFR 유전자 변이 상태에 따라 우측에 표시된 그룹으로 구별된다. PPI score와 비교하여， Act ivat i on score가 약물 반응성 ( IC50)과 보다 유의미한 상관관계를 보임을 확인할 수 있다 (Act ivat i on score가 높을수록 IC50값이 낮아짐 (약물 반응성이 높아짐) ) . 도 14는 EGFR 표적 항암거 KAZD9291)의 반웅성 (y축)과 Act ivat ion score (x축) 사이의 상관관계 (좌측) 및 유전자 타입에 따른 표적 항암제 반응의 다양성 (우측)을 보여주는 그래프이다. Act ivat i on score는 AZD9291의 반응성에 대하여 높은 상관관계 (r=0.85)를 보이며, 기존 EGFR 유전자 검사에서는 동일한 유전자형을 가지고 있다고 하더라도 약물 반응성이 다르게 나타날 수 있음을 볼 수 있다.

도 15는 유방암 세포주에서 HER2 및 HER3(제 1 단백질)와 하위신호전달 단백질 (제 2 단백질) 간의 신호의 세기 (상호작용)를 heatmap 형식 (실시예 7)으로 나타낸 그림이다.

도 16은 유방암 세포주에서 기존에 trastuzumab 항암제의 반웅성을 예측하기 위해 사용되는 biomarker인 HER2 (상단)， HER3 (중간) 발현량을 측정한 결과 및 trastuzumab에 의해 세포 성정이 억제되는 정도 (하단)를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 17은 HER2 또는 HER3 신호를 이용하여 PPI score를 측정한 결과와 trastuzumab 반웅성 (logGI50) 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. PPI score(r=0.91)는 기존의 biomarker인 HER2(r=0.54)나 pHER2(r=0.44) 발현량 (하단)과 비교하여 trastuzumab 반웅성과 보다 높은 상관관계를 보임을 확인할 수 있다.

도 18은 PDTX 마우스 모델에서 얻어진 조직 용해액 (실시예 1.2) (n=5; PDTX-1, -2, —3， -4， 및 -5로 표시)에서 측정한 EGFR, MET, HER2, 및 HER3의 3종의 하위 신호 단백질과의 PPI complex 신호 결과를 각각 보여주는 heattnap이다.

도 19는 PDTX 마우스 모델에서 얻어진 조직 용해액 (실시예 1.2)에서 EGFR의 발현량 (상단) 및 상기 EGFR의 발현량 (도 18의 결과)를 이용하여 activation score를 계산한 결과 (하단)를 보여주는 그래프이다.

도 20은 PDTX 마우스 모델 (실시예 1.2JL)에 gefitinib(50mg/kg)을 투여하여 종양크기의 변화를 측정한 결과를 Vehicle (PBS) 투여군에서의 결과와 비교하여 보여주는 그래프이다. PDTX-2의 경우, EGFR 발현 수준은 높지 않지만 activation score는 높게 나타났으며 (도 19 참조), 항종양 효과 역시 우수하게 나타남 (도 20 참조)을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 EGFR 발현 수준보다는 활성화된 activation score (즉 활성화된 EGFR 비율)이 약물 반웅성과 보다 밀접한 상관 관계를 나타냄을 확인시켜 준다. 도 21은 PDTX 마우스. 모델 (실시예 1.2.1)에서 gefitinib에 의한 종양크기 억제 (tumor growth inhibition) 정도와 EGFR activation score 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다. 앞서 설명한 바와 같이 gefitinib에 의한 종양크기 억제 (tumor growth inhibition) 정도와 EGFR activation score 사이에 유의미한 상관관계 (r=0.96)가 있음을 확인할 수 있다.

도 22는 PDTX 마우스 모델 (실시예 1.2.1)에서 gefitinib(50mg/kg)을 투여하기 전, 후의 조직 용해액 시료에서 각각 측정된 시료의 단위 농도당 EGFR PPI complex 개수 측정 결과를 보여주는 그래프이다. Gefitinib을 처리한 후 얻은 조직에서는 EGFR PPI complex가 현저히 줄어든 것을 볼 수 있다. 이는 gefitinib에 의해서 EGFR 신호가 억제된 증거가 될 수 있다. 실시예 9

9.1. 항체 및 시약 준비

각각의 해당 단백질의 pulling down 을 위하여， 다음의 항체를 사용하였다: 항 -EGFR 항체 (MS-378-B0 ThermoFisher) , 항 -MET 항체 (ab89297 Abeam) , 항 -HER2 항체 (BMS120BT ThermoFisher), 항— HER3 항체 (BAM348 R&D systems) mCherry (ab34771 Abeam) , 및 항—KRas 항체 (sc-521 Santa Cruz) .

각각의 해당 단백질 및 PTMs(post-translational modi f icat ions)에 대한 검출 항체로서 다음의 항체를 사용하였다:. 항 -EGFR 항체 (4267 Cell signaling), 항— EGFR(pTyr 1068) 항체 (ab32430 Abeam) , 항ᅳ EGFR(pTyr 1086) 항체 (ab32086 Abeam) , 항 -EGFR(pTyr 1173) 항체 (4407 Cell signaling), 항 -MET 항체 (8494 Cell signaling), 항 -HER2 항체 (MA5- 15050 ThermoFisher), 항 -HER2(pTyr 1221/1222) 항체 (2243 Cell signaling), 항- HER3 항체 (ab32121 Abeam) , 항 -HER3 (pTyr 1289) 항체 (CeU signaling technology, cat. No. 4791), 항 _Grb2 항체 (ab32037 Abeam) , 항 -Shcl 항체 (ab33770 Abeam) , 항ᅳ Shc pTyr 239/240) 항체 (abl09455 Abeam) , 항 -HSP90 항체 (PA3-013 ThermoFisher), 항ᅳ MIG6 항체 (11630— 1—AP Proteintech) , 항一 GAPDH 항체 (3906 Cell signaling), 및 항 -c-Cbl 항체 (2179 Cell signal ing) .

바이오틴 (biotin) 접합된 항-마우스 면역글로불린 G (IgG) (405303 BioLegend) 및 Cy3 접합된 항 -래빗 IgG (111-165-046 Jackson ImmunoResearch) 항체들을 secondary antibody로 사용하였다 .

웨스턴블라팅은 다음의 항체들을 사용하여 수행하였다: 항 -EGFR(pTyr 1068) 항체 (2234 Ce l signaling), 항 -EGFR 항체 (2232 Cell signaling), 항 -Erk(pThr202/Tyr204) 항체 (9106 Cell signaling), 항— Erk 항체 (4696 Cell signaling), 항— Akt ( _P Ser473) 항체 (4060 Cell signaling), 항— Akt 항체 (4691 Cell signaling), 항— S6K(pSer235/236) 항체 (4858 Cell signaling), 항— S6K 항체 (2217 Cell signaling), 및 항 -act in 항체 (ab8227 Abeam)를 사용하였다.

lOOng/ml EGF (PHG0311L Life technologies)를 사용 (3 분간)하여 EGFR를 자극하였다.

Gef itinib (S1025 Sel leckchem) , Osimert inib (S7297 Sel leckchem) , BKM120 (S2247 Sel leckchem) , Dabrafenib (S2807 Sel leckchem) , 및 Trastuzumab (A1046 BioVision)를 폐선암 (lung adenocarcinoma) 세포에서의 PPI 변화 및 유방암 세포에서의 HER2-/HER3— PPI 측정， ΜΊΤ as say에 의한 세포 생존률 측정， 및 PDTX 모델에서의 종양 성장 측정에 사용하였다.

9.2. 세포 배양

모든 세포주들은 10%(w/v) 우태아혈청 (26140—079 Life technologies) , 10 g/ml gent ami c in (15710-063 Life technologies) , 100 units/ml 페니실린, 및 100 /g/ml 스트렙토마이신 (15140-122 Life technologies)이 보층된 RPM 11640 배지 (22400-105 Life technologies)에서 배양하였다. PC9-GR (gefitinib 내성 세포주; Accession No. CVCL_S706) , HCC827-GR5 (gefitinib 내성 세포주; Accession No. CVCL— V622), 및 HCC4006-ER (erlotinib 내성 세포주; Accession No. CVCL_S746) 세포주들은 각각 100 nM의 gefitinib 또는 erlotinib의 존재하에서 배양하였다. 모든 세포주들은 37 ^° C 및 5% C0 ₂ 조건의 가습 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포를 찬 phosphate buffered saline (PBS)로 행구었다. 찬 PBS 1ml와 scraper (90020 SPL Life Science)를 사용하여 세포를 신속하게 수집하였다. 하나의 p _etr i dish (직경 100 隱)로부터 얻어진 세포 현탁액을 3—4 aliquots로 분량하였다. 이 분액을 4 ^° C에서 3,000xg로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고 얻어진 펠렛을 80 ^° C에서 보관하고， 이후 분석에 사용하였다.

9.3. eGFP 표지된 prey protein의 제작 및 형질감염 (transfections)

Bglll and EcoRI 를 사용하여 tandem SH2 도메인 (542 to 765 amino acids of NM— 013187.1)을 포함하는 Rat PLC y _S H ₂ cDNA를 Rat cDNA library로부터 직접 분리하였다. Grb2 (인간 Grb2; Addgene 46442) , _P 85 α (마우스 ρ85α Addgene 1399), Shcl (인간 Shcl, Addgene 73255)， Eat2 (인간 Eat2, Addgene 46423) , APCS (인간 APCS, Addgene 46477) , Nckl (인간 Nckl, Addgene 45903) 및 S0S1 (인간 S0S1, Addgene 32920)의 cDNA들을 각각의 원래의 플라스미드에 포함된 제한부위에 대응하는 제한효소들을 사용하여 절제하였다. eGFP-tagged CARM1 (인간 CAR 0 및 EGFR유전자는 각각 서을대학교 (한국)와 KAIST (한국)으로부터 제공받았다. 모든 cDNA를 pEGFP— CI (Clontech Laboratories)에 클로닝하여 상응하는 eGFP- labeled prey pfotein들을 제작하였다. Grb2 유전자에 W36K, R86M 및 W193 점돌연변이를 각각 도입하여 Grb2 변이체인 N*_, SH2*-, 및 0_ construct를 각각 제작하였다. EGFR 유전자에서 E746— A750을 결실 시키거나 858번째 잔기인 라이신을 아르기닌으로 치환하여 EGFR 변이체를 제작하였다.

상기 얻어진 플라스미드를 Neon transfection system (MPK5000 Life technologies)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 electroporat ion을 통해 HEK293 세포에 도입하였다. 플라스미드 DNA 30 를 ~ 2χ10 ⁶ 세포를 함유한 ΗΕ 293 세포현탁액 100 ^와 흔합하였다. 2번의 950V 전기펄스 (with a duration of 35 ms for each pulse)를 HEK293 세포에 적용하였다. 형진감염 후 24시간 경과 후에 형질감염된 세포를 수확한 후 -80 ^° C에서 보관하였다ᅳ

9.4. 폐암 환자 유래의 종양 이종이식 모델

모든 동물 연구는 Institutional Animal Care and Use Committee

(IACUC)으로부터 승인받은 지침에 따라 수행하였다. 6 내지 8주령의 암컷 마우스 (severe combined immunodef icient (NOG) and nude (nu/nu) mice; OrientBio)를 사용하였다. 임상 종양 샘플 (폐선암종 (lung adenocarcinoma) 환자 유래 또는 폐편평상피암 (lung squamous cell carcinoma; SQCC) 환자 유래)을 ~3 誦 ³ 크기의 조각으로 절단한 후， 상기 N0G 마우스의 옆구리 내부로 피하 이식 (subcutaneous im lantation) 하였다. 이식 후 1~4 개월 경과 후, 이식된 부위에서 종양이 관찰되었다. caliper로 주 2회 종양의 체작을 측정하여 종양의 피하 성장률을 측정하였다. 종양 크기가 직경 1.5cm에 도달하였을 때， 종양 조직을 절제하고 작은 절편 (대략 5 mm ³ 크기)으로 절단하였다. 상기 절단된 조직을 다른 마우스 집단에 재이식하여 속발성 종양 (subsequent tumors)을 얻었다. 환자 유래 종양을 갖는 마우스 세대를 F0이라 명명하고， 이후의 후속 세대는 차례대로 번호를 매겼다 (Fl, F2, F3 등) (도 23a 참조). 3세대 (F3) 마우스를 vehicle (Phosphata buffered saline, PBS) , osimert inib, 또는 gef it inib 처리 시험에 사용하였다.

상기. 얻어진 환자 유래 종양 이종이식 마우스 (patient -derived tumor xenograft； PDTX) 중에서 , 폐선암종 환자 유래 종양이 이식된 마우스 (F3; n=3)을 PDTX-A1, PDTX-A2, 및 PDTX- A3으로 명명하고， lung SQCC 환자 유래 종양이 이식된 마우스 F3; n=5)을 PDTX-S1, PDTX-S2, PDTX-S3, PDTX- S4, 및 PDTX-S5로 명명하였다.

상기 얻어진 환자 유래 종양 이종이식 마우스 (pat lent -derived tumor xenograft； PDTX)에 체중 (kg) 당 5mg의 osimertinib 또는 50mg의 gefitinib 또는 vehicle를 각각 1일 1회 복강내 주사로 주입하였디-. 상기 약물 처치 후 15일 경과 후에 PDTX로부터 종양 조직을 절제하여 PPI 및 발현 수준 변화를 모니터링하였다.

9.5. 단분자 co-IP (Single-molecule co-IP) 및 면역 표지 이미지화 ( immuno label ing imaging)

단분자 co-IP 및 i隨 unolabeling 이미지화에 대한 자세한 프로토콜은 "Lee, H. W. et al . Realᅳ time single-molecule coimmunoprecipi tat ion of weak protein-protein interactions. Nat . Pro toe. 8, 2045-2060 , (2013)"를 참조하였다. NeutrAvidin (10 !Λ of 0.1 mg/ml； A2666 Life technologies)을 각각의 개별 반응 챔버에 넣었다. 10 분간 인큐베이션 후, 미결합 NeutrAvidin을 제거하였다. Miniaturized imaging chamber를 PBS가 채워진 reservoir에 담갔다가 100번 정도 측면방향으로 흔들어서 완전히 씻어주었다. PBS를 완전히 제거한 후， biotinylated pull down antibodies를 NeutrAvidin 코팅된 표면에서 10 분간 배양하여 층을 만들었다. MET 항체의 경우, biotinylated secondary antibody (alpha- mouse IgG)를 사용하여 1차 항체를 결합시켰다. PBS로 챔버를 세척한 후, 암 세포 또는 종양 조직 추출물을 항체가 코팅된 표면에 적용하였다. 15분 후， 미결합 추출물을 제거하고， 챔버를 0.0 (v/v) Tween 20이 보층된 PBS로 채워진 reservoir에 담갔다.

single-molecule co-IP imaging을 위하여, 형질전환된 HEK293 세포 추출물을 30 nM (eGFP- tagged probe protein)으로 희석시킨 후， imaging chamber에 로딩시켰다.. 챔버를 TIRF 현미경 상에 위치시키고 eGFP 형광을 EMCCD으로 기록하였다 (20 프레임; 100— ms 노출).

single-molecule immuno label ing imaging의 경우, 5 프레임 동안 eGFP- labeled probe protein을 대신하여 dye- labeled 검출 항체를 사용하였다. 검출 및 풀다운 항체 간의 중복을 피하기 위하여， 검출 항체는 세포질 키나아제 부위 또는 말단 (tail) 상의 티로신 잔기 내에 에피토프를 갖는 것으로 선정하였다. 검출 항체는 Alexa488 (MET 항체)로 직접 표지하거나, Cy3-표지된 2 차 항체 (EGFR, HER2, HER3 및 pTyr 항체 )로 간접적으로 가시화하였다. TIFF stack에서의 5 또는 20 프레임의 형광 (0.1 초 노출)을 기록한 후, 형광 스팟의 개수를 카운팅하여, 단분자 PPI complex .또는 면역표지된 G隱 unolabeled) 단백질의 수를 측정하였다. 단분자수 (single-molecule counts)의 평균 및 표준 편차는 동일한 반웅 챔버 내에서 10 개의 상이한 위치로부터 구하였다. 실시예 9.6. Counting PPI complex 및 면역표지된 단백질의 counting 형광 이미징하여 얻어진 TIFF 파일올 custom GUI (written in Mat lab (Mat lab 2016a, MathWorks))로 분석하였다. 세 개의 프레임 (eGFP의 경우 17-19， Cy3 및 Alexa488의 경우 3ᅳ5)을 사용하여 단일 PPI 복합체 또는 면역표지된 단백질을 대표하는 세기 (intensity)의 local maxima를 확인하였다. background 보정을 위하여， spatial median-filtering (11x11 pixel)으로 얻은 이미지를 원본 이미지에서 프레임별로 공제 (subtracted)하였다. 얻어진 이미지.는 평균화하여 thresholding 후 local maxima를 검출하는데 사용하였다 (custom Mat lab GUI 사용). 실시예 10： EGFR 표적 억제제에 대한 PDTX의 반웅성 예측

10.1. 폐선암 이종이식된 PDTX에서의 Osimertinib에 대한 반웅성 예측

HER ^' 계열 수용체의 PPI 측정 지표가 암의 약물 반응성과 밀접하게 연관되어 있음을 확인하였으며, HER 계열 수용체 표적 치료에 반웅성을 갖는 (HER 계열 수용체 표적 치료가 항암 효과를 ^' 보이는) 특정 암을 스크리닝에 single-molecule immunolabel ing 또는 co-IP analysis를 적용할 수 있는지 조사하였다. 이를 위하여, 상기 실시예 9에서 기술한 방법으로 3 종의 폐선암종 환자 유래 종양 이종이식 마우스 (PDTXs; 도 23의 PDTX- A1~A3)를 제작하였다.

이들 폐선암종 PDTX는 EGFR 유전자에서 활성화 돌연변이 (exon 19 또는 L858R 돌연변이)를 갖는 것으로 확인되었다.

상기 폐선암종 PDTXs (PDTX-A1-A3; 각각의 개체수는 3 이상이며 하기 결과는그 평균값으로 나타냄)에 대하여 30일동안 osimertimb(5 mg per 1 kg of weight daily)을 처리하고 종양 크기를 측정하여， 대조군 (vehicle 투여군)과 비교하여， 그 결과를 도 23b 좌측에 나타내었다. 도 23b 좌측 결과로부터 알 수 았는 바와 같이, PDTX-A1-A3는 osimertinib 처리에 의하여 현저한 종양 크기의 감소를 보였다 (A1>A2>A3).

또한 각 PDTX(PDTX— A1~A3)에서 EGFR, HER2, HER3 및 MET 수용체 각각과 하위신호단백질인 PLCga瞧 aSH2, Grb2, 및 p85-alpha 각각 간의 PPI com lex (도 23c에서 PPI count로 표시됨)를 측정하여, 도 23c 좌측에 나타내었다. 도 23c에 나타난 바와 같이, EGFR과 3종의 하위신호단백질 간의 PPI complex count는 A1>A2>A3 순서로 나타났으며, 이는 도 23b에 나타난 EGFR 저해제인 osimertinib 처리시의 종양 크기 감소 효과 양상과 동일함을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 폐선암종의 PDTX 모델에서 표적단백질과 하위신호단백질 간의 PPI complex count가 상기 표적단백질을 표적으로 하는 표적치료제의 항암 효과와 유의미한 상관관계를 나타냄을 보이는 것이다.

또한, 8마리의 PDTX (A1-A3 및 S1-S5) 개체에서의 EGFR과 다른 수용체 (MET, HER2 및 HER3)의 발현 수준을 측정하고, 상기 각각의 수용체의 발현수준을 대조군 (EGFR: A549 세포, MET: HCC827-GR5, HER2 및 HER3: SKBR3)에서의 발현 수준으로 normalization하여 그 결과를도 23d 및 도 25a— c에 나타내었다.

도 23c에 나타난 바와 같이, 시험된 PDTX 모델 (A1~A3)는 모두 MET, HER2 및 HER3 수용체에 대해 유의미한 PPI complex 수치를 나타내지 않았지만, EGFR에 대해서는 어느 정도 유의미한 PPI complex 수치를 나타내었다. 이러한 결과는 PDTXs가 단백질과 PPI 수준에서 EGFR signaling에 종양 유전자 중독 (oncogene addict ion)을 나타냄을 의미하는 것이라 할 수 있다.

다음으로, normalized PPI count (제 1 단백질의 단위 농도당 PPI complex 수; activation score 해당)에 의하여, 폐선암종 세포주에서 입증된 바와 같이， osimertinib 치료에 대한 PDTX의 반응성을 예측할 수 있는지를 조사하였다. 상기에서 PDTX 모델 (A1-A3)에 30일동안 osimert inib(5 mg per 1 kg of weight daily)을 처리하여 얻어진 각 모델에서의 종양성장억제율 ( _tumor growth inhibition(%) = [( AVKeA/c/^- Δ Vgefi t inib) / Δ V vehicle] x 100； vehicle- vehicle 처리 전후의 종양 부피 변화; l ^gefitinib ^' . gefitinib 처리 전후의 종양 부피 변화)을 y축으로 하고, PPI s圏 /EGFR level (PPI sum: PPI score이고, PPI sum/EGFR level： Activation score)를 x축으로 하여 도 23e에 나타내었다. 도 23e에 나타난 바와 같이, normalized PPI count (PPI sum/EGFR level; Activation score)가 실제로 osimertmib에 의한 종양 성장 억제와 높은 상관 관계 (r=l)를 나타냄을 확인할 수 있다. 10.2. lung SQCCdung squamous cell carcinoma) 이종이식 PDTX에서의

Osimertinib에 대한 반응성 예측

폐선암의 29%가 EGFR의 감작 돌연변이와 관련되어 있는 반면, lung SQCC의 0.5%만이 EGFR의 감작 돌연변이를 가지고 있다. 따라서, 현재로서는 lung SQCC에서 EGFR 표적 치료를 위한 적절한 바이오 마커가 없는 실정이다.

본 실시예에서는 hmg SQCC 환자 조직으로부터 5 마리의 PDTX(PDTX- S1~S5)를 제작하고 단분자 면역 표지 및 co-IP 프로파일링 (실시예 9.5)을 수행하였다. 5마리의 PDTX(PDTX-S1~S5)가 모두 MET, HER2 및 HER3 수용체 단백질 및 이들과 관련된 PPI complex가 최소 수준을 나타냄을 확인하였다 (도 23c, 우측 및 도 25a-c).

한편， 총 EGFR count (EGFR level)와 EGFR PPI complex count가 상당한 수준으로 검출됨을 확인하였다 (도 23c 및 23d, 및 도 25d 및 25e). 이러한 결과는 lung SQCC가 증식 신호에 있어서 종종 EGFR에 의존하기 때문인 것으로 예상된다.

10.3. lung SQCCdung squamous cell carcinoma) 이종이식 PDTX에서의 gefitinib에 대한 반응성 예측

5마리의 PDTX(PDTX— S1~S5)를 모두 15일동안 gefitinib를 투여하고, 종양 성장 .정장 정도를 측정하여 도 23b 우측에 나타냈다. PDTX-S1-S5 중에서 S1과 S2에서 현저한 종양 억제 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 시험된 다양한 PDTX 개체들 중에서，. EGFR 수준으로 normalized된 PPI complex count (Activation score)가 종양 성장 억제와 매우 높은 상관관계 (Spearman correlation of 0.9)를 가짐을 다시 한번 확인하였다 (도 23f 및 도 25f-h).

상기 얻어진 결과들은 normalized PPI count가 비소세포 폐암 (non- small cell lung cancer)의 EGFR 표적 억제제에 대한 반응성과 밀접한 상관 관계가 있음을 보여준다. PPI 수치의 합계가 아닌 normalized PPI 수치가 항종양 약물에 대한 반웅성과 보다 높은 관련성을 갖는지 이해하기 위하여 , 고유한 signaling phenotype과 gefitinib 반웅성을 보인 2마리의 lung SQCC PDTX (PDTX-S1 및 S2)를 집중적으로 관찰하였다.

gefitinib 처리 전 (Before)과 처리후 15일 경과 후 (After), PDTXᅳ SI과 PDTX— S2에서의 PPI complex count를 측정하여 도 23g 및 도 26aᅳ b에 나타내었다.

상기 결과에서 보여지는 바와 같이， PDTX-S1은 특히 PI3K의 :절 ρ85α 서브유닛에서 검출가능한 수준의 EGFR PPI complex counts를 유지하였다. 반면, PDTX— S2는 A549 세포를 사용한 음성 대조군과 비교하여 감소하거가 구별되지 않는 정도의 EGFR PPI complex counts를 나타냈다 (도 23g 및 도 26) . 따라서, 시험에 사용된 gefitinib 투여량 (50 mg/kg)은 PDTX-S2에서 EGFRs의 hyperactive but smaller pool을 완전히 억제하여 해당 암의 위축 (shrinkage)을 유도한다고 할 수 있다. 반면.， 동일한 gefitinib 투여량은 PDTX-S1에서 EGFR 활성을 억제하지 못하고 상당한 EGFR 과발현을 나타내었다. 이러한 결과는 높은 normalized PPI count를 갖는 PDTX-S2가, 높은 EGFR 수준과 total PPI count를 갖는 PDTX—S1과 비교하여， gefitinib에 대하여 보다 우수한 반응성을 보이는 이유를 제안한다고 할 수 있다.

상기 결과에서 PDTX-S1이 증가된 EGFR-p85 a 결합을 보인다는 사실에 기초하여， PDTX-S1을 PI3 inhibitor인 BKM120(50 mg/kg)으로 처리하였다 (도 23h).

상기 결과에서 보여지는 바와 같이， BKM120는 동일한 투여용량 (50 mg/kg)에서 gefitinib보다 강력한 종양 성장 억제 효과를 보였다. 또한, gefitinib과 BKM120의 병용 _. 치료 (gefitinib (50mpk(mg per lkg weight(mpk))/BKM120(50mpk))는 종양을 위축시켰다. 이러한 결과는 상이한 다운스트림 단백질을 사용하여 PPI를 검사하는 single-molecule co-IP profiling이 표적 신호화 경로의 선택 및 복수의 약물의 병용 치료 전략을 설계하는데 유용하게 사용될 수 있음을 제안한다.

10.4. 비소세포성 폐암 이종이식 PDTX에서의 반웅성 예측

두 종류의 비소세포성 폐암 이식 모델인 PDTX-A1-A3 및 PDTX- S1~S5로부터 얻은 normalized PPI complex counts를 풀링하고 단일 플롯을 비교하였다 (도 23i).

유전체 변이 양상 및 암 서브타입에서의 모든 차이에도 불구하고， data points는 일정한 양상을 보이며， Spearman 상관 관계가 0.95인 종양 성장 억제와 잘 일치하는 모양을 형성하였다.

이러한 결과는 normalized PPI complex count가 EGFR—표적 요법에 대한 효능예측 마커로서 작용할 수 있는 EGFR 신호 강도의 척도 (gauge)임을 제안한다. 실시예 11. 인간 환자 시료에 대한 단분자 면역 표지 (Single- molecule immuno label in) 및 co-IP 프로파일링 (c으 IP profiling)

본 발명에서 제시되는 마이크로 챔버와 고성능 단분자 영상 시스템 (high— throughput single— molecule imaging system)을 사용하여 인간 환자의 종양 조직을 특성화하였다 (도 24).

PDTX 표본 (specimens)에 대하여 개발된 통상적인 극저온 용해 프로토콜 (cryogenic lysis protocol)을 폐선암종 환자로부터 외과적 절제로 얻은 두 개의 폐선암종 환자 조직 (연세대 세브란스병원)에 적용하였다 (도 24a, PI 및 P2라고 함) .

간략히 설명하면， 상기 준비된 환자 조직을 분쇄 (~0.6cm)하고， 액체 질소에 침지시킨다. 추가 분쇄 후 PBS를 투여하여 완전히 용해시키고， 원심분리하여, 펠렛을 취하였다. 이후 PBS를 투여하고, 계속적으로 섞어주면서 4 ^° C에서 배양하였다. 그 후， 원심분리하여 상청액을 취하였다. 크기가 15瞧 ³ (P1) 및 18隱 ³ (P2)인 조직을 사용하여， 상기 기재한 방법으로 얻어진 각 조직 용해물에 대하여 10개의 서로 다른 PPI level (positive control에서의 PPI complex를 1.0으로 하였을 때의 P1 및 P2에서의 PPI complex의 상대값) 및 10개의 서로 다른 단백질 및 PTM(post- translational modifications) 수준 (발현량)을 측정 (실시예 9.5의 i麵 uno labeling 참조)하였다 (도 24b). 양성 대조군으로서 PC9 세포 (for EGFR) , HCC827 세포 (for MET), 및 SKBR3 세포 (for HER2 및 HER3)가 각각 사용하였다.

두 종양 조직 (P1 및 P2) 모두 EGFR 유전자에 exonl9 돌연변이 (exonl9 결실 변이)를 갖고 있었지만， 샘플 P1만이 유의미한 EGFR PPI complex counts를 나타냈다 (도 24b, c 및 표 4).

[표 4] Biopsy type Depositedate E6FR genotype Treatment Response

PR: 2014,11.25 ~ 2016.03.28

Patient P1 2013.12.27 Gefitinib

Surgical PD : 2016.07.19

Aexon19

resection SD : 2014.04,16 - 2015.05.15

Patient P2 2014.02.11 Erlotinib PD: 2015.05,21

(PR^Part ial response, PD=Progressive di sease)

다른 수용체인 HER 수용체와 MET 수용체에 대해서는 두 샘플 모두에서 의미있는 PPI counts가관찰되지 않았다 (도 24b, c) .

Pat ient PI은 진행성 질환 (progressive disease ; PD) 진단 전에 약

1년 반 동안 gef it inib 치료에 대한 부분적 반웅성 (part ial response; PR; 고형 종양에서의 반웅성 평가 기준 (response evaluat ion cri teria in sol id tumors ; RECIST)에 따른 부분적 반응성)을 유지한 반면, Pat ient P2는 PD designat ion 전에 1년 동안 stable di sease (SD) di agnosis를 유지하였다.

마지막으로, 가장 높은 활성의 EGFR 신호를 보이는 PDTX-A1 및 인간 환자 샘플 P1으로부터 유래된 mutant EGFR (exon 19 결실)에 대하여 PTPN1를 처리하여 in vitro탈인산화를 수행하였다 (도 24d) .

탈인산화 후， eGFP-labeled PLCga誦 a _SH 2 및 Grb2와, mutant EGFR 복합체와의 결합을 측정하여 도 24d에 나타내었다. 도 24d에 나타난 바와 갈이, 탈인산화 (+F PN1)에 의하여， pTyr— SH2 도메인 상호작용에 전적으로 의존하는 PLCgamma _SH2 의 결합은 거의 완전하게 중지되는 반면, Grb2 binding counts의 경우에는 50% 이상 및 80% 이상이 탈인산화 후에도 유지되었다. 이러한. 결과는 mutant EGFR의 pTyr- independent signal ing mechani sm°l PDTX모델과 외과적 종양조직에서 실제로 작동함을 제안한다. 실시예 12: 접착제 적용 형태에 따른 영향시험

접착제 (E; UV 에폭시)가 수용부 (153)와 기판 (300) 접촉면의 외부 가장자리에 도포된 멀티 웰 (멀티 웰 A; 시험군)과 접착제 (E; UV 에폭시)가 수용부 ( 153)와 기판 (300) 접촉면 전체에 도포된 멀티 웰 (멀티 웰 B; 비교군)를 각각 제작하고 도 38과 같이 넘버링하였다:

79 정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR

모든 웰은 바이오틴으로 표면처리하고 항체는 고정화시키지 않았다. 상기 웰에 GFP(green f luorescent protein) (Clontech)으로 태깅된 Grb2 단백질 (NF_002077. 1)올 30nM의 양으로 첨가하고， 상온 (23~27°C )에서 5~10분간 반웅시키고， PBS(with 0.05%(v/v) Tween 20)를 포함하는 세척용액으로 세척한 후, 이미징하여, 웰에 남아있는 GFP 개수 (GFP counts)를 측정하여 Grb2 단백질을 정량하였다. 이때， 상기 세척은 낮은 농도 (예컨대 약 0. 1%(v/v) 이하)의 비이온성 계면활성제 (예컨대, Tween20 Triton x-100 등)를 포함하는 세척 용액을 사용하여 수행하는 것이 좋다 (이하 단백질 정량 과정에 동일하게 적용가능함) . GFP 개수는 EMCCD ^' (Electron-mul t iplying charge-cou led devi ce ; Andor iXon Ul tra 897 EX2 (DU-897U-CS0-EXF) ) 카메라를 사용하여 1프레임당 노출시간웁 0. 1초로 하고 EMCCD gain 값은 40으로 하여 얻은 형광 이미지 상의 형광 spot 개수를 계수하여 측정하였다.

상기와 같이 GFP 개수를 측정한 결과를 도 32 (멀티 웰 A) 및 도 33

(멀티 웰 B)에 나타내었다. 도 32 및 도 33에서 각 # 슷자는 상기에서 넘버링 된 웰의 위치를 의미한다.

도 32에 나타난 바와 같이, 멀티 웰 A의 경우, 세척 후 웰에 남아있는 GFP 개수가 모든 웰에서 유사한 수준으로 낮게 나타난 반면, 도 33에 나타난 바와 같이， 멀티 웰 B의 경우에는, 세척 후 웰에 남아있는 GFP 개수가 일부 웰 (#5, #6. #7)에서 약 15배 내지 20배 이상 많게 나타났다. 웰에 항체를 고정화시키지 않았으므로, 세척 후 웰에 남아있는 GFP는 비특이적 결합에 의한 것이라고 할 수 있으므로， 도 32 및 도 33의 결과는 접착제가 수용부의 외부 가장자리에 적용된 멀티 웰 A의 경우， 접착제가 수용부의 기판과 접촉하는 면 전체에 적용된 멀티 웰 B경우와 비교하여, 단백질의 비특이적 결합 수준이 매우 낮음을 보여주는 것이다. 멀티 웰

80 정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR B에서 단백질의 비특이적 결합 수준이 높게 나타난 것은, 수용부의 기판과 접촉하는 면 전체에 적용된 접착제 (에폭시) 일부가 반웅이 일어나는 관통홀 내부로 침투하여 에폭시의 점착성에 의해 단백질-단백질 반응에 의도하지 않은 영향을 미쳐서 비특이적 결합을 유도하는 것에 기인한다고 할 수 있다. 반면, 멀티 웰 A의 경우에는 접착제가 수용부의 외부 가장자리에 적용되어 관통홀 내부로 침투하지 않거나 매우 소량만 침투하여 단백질—단백질 반응에 영향을 미치지 않거나 그 정도가 매우 미미하므로, 단백질의 비특이적 결합 수준이 매우 낮아지게 된다.

멀티 웰 A에서 단백질의 특이적 반응이 유도됨을 추가로 확인하기 위하여ᅳ #1, #5， 및 #9의 3개의 웰에는 GFP 항체를 고정화시키지 않고, 나머지 #2， #3, #4, #6， #7, #8， #10, #11, 및 #12의 9개 웰에는 GFP 항체를 고정화시켜서， 상기 시험을 다시 수행하고, GFP 개수를 측정하였다. 상기와 같이 얻어진 GFP 개수 측정 결과를 도 34에 나타내었다. 도 34에 나타난 바와 같이, GFP 항체가 고정화되지 않은 #1, #5， 및 #9의 3개의 웰과 비교하여, GFP 항체가 고정화된 #2, #3， #4, #6， #7， #8， #10， #11, 및 #12의 9개 웰에서의 GFP 개수가 현저하게 높은 수준임을 확인할 수 있다. 이러한 결과는 접착제가 수용부의 외부 가장자리에 적용된 멀티 웰 A에서 특이적 단백질 반응이 유도됨을 재차 확인시켜주는 것이라고 할 수 있다. 실시예 13: 단백질-단백질 상호작용 측정 예

실시예 12에서와 동일한 방법으로 멀티 웰 A를 준비한 후, 표면에 항 -EGFR항체 (MS— 378-BO, Thermo)를 고정화시켰다. 항체가 고정화된 각 웰에 EGFR을 많이 발현하는 세포주 (H1666; ATCC, #CRLᅳ 5885)를 세포주 용해 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 (ν/ν) Triton X— 100, 150 mM NaCl , 1 mM EDTA, 10 (v/v) glycerol , protease inhibitor cocktail (Sigma, P8340) 100X, tyrosine phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, P5726)

100X)에 용해시켜 얻어진 세포 시료를 첨가하고, 상온 (23~27 ⁰ C ⁰ C)에서

15분간 반웅시킨 후， PBS(with 0.05%(v/v) Tween 20)를 포함하는 세척용액으로 세척 하여， 웰 표면에 EGFR을 포획하였다. 표면에 EGFR이 포획된 각 웰에 GFP 태깅된 p85-a 단백질 (NP_852664.1)을 첨가하고, 이미징하였다. 실시예 12의 방법을 참조하여， 웰에 남아있는 GFP 개수 (GFP count s)를 측정하여 EGFR과 p85— a 간 단백질-단백질 상호작용을 시험하였다. 세포 시료의 양에 따른 GFP 개수 (5회 측정한 데이터의 평균값)를 도 35에 나타내고, GFP 개수 (5회 측정한 데이터의 평균값)과 표준편차를 표. 5에 나타내었다:

[표 5]

도 35 및 표 5에 나타난 바와 같이, 멀티 웰 A를 사용하는 경우, 세포 시료 농도와 선형의 정비례 상관성을 보이는 단백질-단백질 상호작용이 명확하게 측정되며， 반복 시험시 얻어지는 결과들이 비교적 낮은 수준의 표준 편차를 보임을 확인할 수 있다.

한편, 실시예 12에서와 동일한 방법으로 멀티 웰 A를 2개 준비하고， 하나 (bl ank)는 웰 표면에 GFP 항체를 도포하지 않고， 다른 하나 (GRB2- GFP)는 GFP 항체를 도포하여 준비하고, 각각에 GFP-GRb2 를 100 pM 주입 후， 실시예 12과 동일한 방법으로 신호를 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 36 및 37에 나타내었다. 도 36 및 37에 나타난 바와 같이, 멀티 웰 A의를 사용하는 경우 표적 단백질 (GFP)을 포획하는 항체가 도포되지 않았을 경우에는 신호가 거의 나타나지 않는 반면 (Bl ank) , 항체가 도포된 경우에는 신호가 낮은 표준편차를 나타내며 매우 잘 검출되었다 (GRB2ᅳ GFP) . 이러한 결과는 멀티 웰 A를 사용하는 경우 위양성 결과 (Fal se posi t ive resul t )가 거의 나타나지 않음을 의미한다ᅳ

【부호의 설명】

100 멀티 웰

110 , 130 지지대

155 , 165 , 175 지지 플레이트

151 관통홀

153 수용부

300 기판