LICHTBLATTBELEUCHTUNG

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe, insbesondere in der Lichtblatt-Mikroskopie.

Die SPIM-Technik (Single Plane Illumination Microscopy), bei der eine schichtweise Beleuchtung der Probe erfolgt, erlaubt eine schnellere und probenschonendere Erfassung von Bilddaten, als beispielsweise bei einer punktweisen Abtastung einer Probe. Ein bekanntes Einsatzgebiet der SPIM-Technologie ist der Bereich der Fluoreszenz-Mikroskopie, wobei Fluorophore in der Probe mit Laserlicht angeregt werden. Bei der SPIM-Technologie findet hierbei eine Anregung nur in einer von einem Beleuchtungslichtblatt (auch„Lichtstreifen" genannt) statt. Eine Schädigung der Probe durch Beleuchtungslicht in anderen Ebenen ist hierdurch vermieden. Eine nach dem SPIM-Verfahren arbeitende optische Vorrichtung ist in DE 102 57 423 AI beschrieben. Bei diesem Mikroskop wird eine Probe mit einem dünnen Lichtblatt beleuchtet, während die Beobachtung aus einer zu der Ebene des beleuchtenden Lichtblattes senkrechten Richtung erfolgt. Hierbei erfolgen die Beleuchtung und die Detektion über zwei separate optische Strahlengänge mit jeweils separater Optik. Das Lichtblatt wird von einer Zylinderlinse erzeugt. Für die Bildaufnahme wird die Probe durch das bezüglich des Detektors feststehende Lichtblatt bewegt, um schichtweise Fluoreszenz- und/oder Streulicht mit einem flächigen Detektor aufzunehmen. Die so gewonnenen Schichtbilddaten lassen sich anschließend zu einem aus einer dreidimensionalen Abbildung der Probe entsprechenden Datensatz zusammensetzen.

Aus DE 10 2007 015 063 AI ist eine optische Anordnung mit einer Lichtquelle zum Abstrahlen eines Lichtbündels und mit optischen Elementen zur Umwandlung dieses Lichtbündels in die Form eines Lichtblattes bekannt. Die optische Anordnung ist insbesondere geeignet zur Beleuchtung einzelner Ebenen einer dreidimensionalen Probe bei der Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM). Es sind Mittel zur Variation des Querschnittes des Lichtblattes, zur Variation der Länge des Lichtblattes und/oder zur Beeinflussung der Richtung, der innerhalb des Lichtblattes verlaufenden Strahlungsanteile vorhanden, um die Geometrie des Lichtblattes an die Beleuchtungserfordernisse bei der Beobachtung ein und derselben Probenebene mit mehreren verschiedenartigen Objektiven zu ermöglichen.

Alternativ zu einer direkten Probenbeleuchtung ist es auch möglich, die Probe evaneszent zu beleuchten. Hierbei wird das Anregungslicht an einer Grenzfläche zur Probe totalreflektiert, wobei die Anregung der Probe durch das mit der Eindringtiefe abklingende evaneszente elektromagnetische Feld erfolgt. Für diese Art der Probenuntersuchung hat sich der Begriff TIRF Microscopy bzw. TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie) eingebürgert.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe anzugeben, das bei verbesserter Abbildungsqualität eine gute Zugänglichkeit der Probe erlaubt.

Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das durch folgende Schritte gekennzeichnet ist:

a. Erzeugen eines Beleuchtungslichtbündels mit einer Lichtquelle, b. räumliches Aufspalten des Beleuchtungslichtbündels mit einem Aufspaltungsmittel in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel, c. Lenken der Teilbeleuchtungslichtbündel durch ein, für beide Teilbeleuchtungslichtbündel gemeinsames, Beleuchtungsobjektiv, d. Umlenken wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel, nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen haben, mit wenigstens einem Umlenkmittel derart, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel in einer Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene ein Beleuchtungsmuster entsteht, und e. Erzeugen einer Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zum Untersuchen einer Probe anzugeben, die bei verbesserter Abbildungsqualität eine gute Zugänglichkeit der Probe erlaubt.

Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gelöst, die

a. eine Lichtquelle, die ein Beleuchtungslichtbündel erzeugt, b. ein Aufspaltungsmittel, das das Beleuchtungslichtbündel räumlich in wenigstens zwei Teilbeleuchtungslichtbündel aufspaltet, c. ein Beleuchtungsobjektiv, das von den Teilbeleuchtungslichtbündeln durchlaufen wird, d. wenigstens ein Umlenkmittel, das wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel, nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen haben, derart umlenkt, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel in einer Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene ein Beleuchtungsmuster entsteht, und e. einem ortsauflösenden Detektor zum Erzeugen einer Abbildung eines von dem Beleuchtungsmuster beleuchteten Probenbereichs, wobei von dem Probenbereich ausgehendes Detektionslicht durch ein Detektionsobjektiv zu einem ortsauflösenden Detektor gelangt, beinhaltet.

Die Erfindung hat den ganz besonderen Vorteil, dass durch die Beleuchtung mit einem Beleuchtungsmuster, in der Lichtblatt-Mikroskopie und/oder in der TIRF- Mikroskopie eine Verbesserung der Abbildungsqualität erreicht werden kann. Dies zum einen dadurch, dass durch die Beleuchtung mit einem durch Interferenz wenigstens zweier Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugten Beleuchtungsmusters zumindest eine Hintergrundunterdrückung ermöglicht ist. Insbesondere kann jedoch auch, was weiter unten im Detail beschrieben ist, vorteilhaft sogar eine Auflösungssteigerung erreicht werden. Von ganz besonderem Vorteil ist hierbei, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel, die zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters zur Interferenz gebracht werden, dasselbe Beleuchtungsobjektiv durchlaufen, so dass im Bereich der Probe lediglich ein einziges Beleuchtungsobjektiv vorhanden zu sein braucht, was eine besonders gute Zugänglichkeit der Probe ermöglicht. Es ist zwar grundsätzlich bekannt, in der Weitfeldmikroskopie oder der TIRF- Mikroskopie die laterale Auflösung und den Bildkontrast in einem Mikroskop durch strukturierte Beleuchtung zu erhöhen. Eine Beleuchtung durch das Detektionsobjektiv hat jedoch den Nachteil, dass die möglichen Einfallswinkel und damit die möglichen Perioden des Interferenzmusters durch die numerische Apertur des Detektionsobjektivs sehr beschränkt sind. Eine in der Bildebene isotrope Auflösungssteigerung bzw. entlang aller 3 Raumrichtungen durch eine strukturierte Beleuchtung in der SPIM-Mikroskopie ist bislang unbekannt.

Im Allgemeinen gilt, dass die Auflösungssteigerung von der Periode des Gitters abhängt. Wenn eine Beleuchtung mit einem Gitter durch das Detektionsobjektiv erfolgt, geschieht dies zumeist in der Weise, dass das Beleuchtungslicht unter steilem Winkel gegenüber der optischen Achse in das Probenvolumen in zwei gegenläufigen Richtungen eingestrahlt wird, so dass als Interferenzmuster eine stehende Welle entsteht, deren Periode von dem Winkel 2a zwischen den beiden Strahlen abhängt. Der Winkel a = arcsin(NA/n) hängt dabei insbesondere durch die numerische Apertur (NA) des Detektionsobjektivs und den Brechungsindex des Mediums ab. Typischerweise ist NA < 1 ,2 und damit a < 65 Grad in Wasser (n = 1 ,33). In jedem Fall ist der Winkel a deutlich kleiner als 90 Grad, wobei ein Winkel von 90 Grad optimal wäre, um die minimale Periode des Interferenzmusters zu erreichen. Nachteiligerweise durchleuchten die interferierenden Strahlenbündel bevor und nachdem sie die Fokusebene des Detektionsobjektivs erreichen große Teile der Probe und regen dort, also ober- und unterhalb der Fokusebene des Detektionsobjektivs (außer bei TIRF) Fluoreszenz an, was ein starkes Hintergrundsignal im Bild bedingt, die Fluorophore der Probe dort unnötig bleicht und die Probe durch fototoxische Effekte schädigt.

Diese Nachteile sind erfindungsgemäß, insbesondere bei einer SPIM-Untersuchung einer Probe, vorteilhaft vermieden bzw. reduziert. Hierbei ist es, insbesondere zur Erzielung einer Auflösungssteigerung, sogar möglich, das Beleuchtungsmuster durch Überlagerung von 2, 3 oder einer noch höheren Zahl von Teilbeleuchtungslichtbündeln zu erzeugen, ohne dass eine gleichhohe Anzahl von Beleuchtungsobjektiven nötig wäre. Die Verwendung einer Vielzahl von Beleuchtungsobjektiven wäre teuer, kompliziert und störungsanfällig. Abgesehen davon ist es kaum möglich, ein zur Erzielung hoher Auflösungen notwendiges Detektionsobjektiv mit mehreren, beispielsweise vier Beleuchtungsobjektiven räumlich so zu kombinieren, dass die Beleuchtungsobjektive die erforderlichen Beleuchtungsteillichtbündel in die Fokusebene des Detektionsobjektivs fokussieren können, weil hochaperturige Objektive einen großen Durchmesser aufweisen und einen kurzen Arbeitsabstand erfordern, so dass es zu einer räumlichen Kollision der Objektive kommet, wenn nicht spezielle und dadurch teure Beleuchtungsobjektive mit besonders großem Arbeitsabstand und typischerweise geringer numerischer Apertur verwendet werden.. Eine weitere Schwierigkeit würde bei der Verwendung einer Vielzahl von Beleuchtungsobjektiven darin bestehen, dass hochaperturige Objektive auch die Polarisation des Lichts manipulieren, so dass es zu einer nicht vollständigen Interferenz der Teilbeleuchtungslichtbündel führt, wodurch zum Beispiel Nullstellen des Beleuchtungsmusters weniger stark ausgeprägt sind und/oder der Kontrast des Beleuchtungsmusters insgesamt abnimmt, was für die Bildqualität nachteilig wäre. Diese Nachteile vermeidet die vorliegende Erfindung.

Insbesondere um eine in der Bildebene isotrop überaufgelöste Abbildung zu erzeugen, können in der Beleuchtungsebene zeitlich nacheinander unterschiedliche und/oder unterschiedlich positionierte und/oder unterschiedlich ausgerichtete Beleuchtungsmuster erzeugt werden, mit denen jeweils derselbe Probenbereich beleuchtet wird. Die Daten der auf diese Weise erzeugten Abbildungen können danach miteinander verrechnet werden, um insgesamt eine Auflösungssteigerung zu erreichen. Hierzu kann ein Beleuchtungsmuster, beispielsweise hinsichtlich einer Gitterkonstanten und/oder hinsichtlich seiner Position und/oder hinsichtlich seiner Ausrichtung, auf unterschiedliche Weise verändert werden, um jeweils ein verändertes Beleuchtungsmuster zu erzeugen.

Beispielsweise ist es möglich, die relative Phase der Teilbeleuchtungslichtbündel zu verändern. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der optische Lichtweg einer Untermenge der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel verändert wird. Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, die Einfallsrichtung der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel zu ändern. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils mit unterschiedlich angeordneten Umlenkmitteln oder unterschiedlich angeordneten Umlenkelementen eines Umlenkmittels umgelenkt werden, bevor sie interferieren, so dass die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils aus unterschiedlichen Richtungen einfallen, was weiter unten noch im Detail erläutert ist.

Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, dass der Einfallswinkel der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel auf die Beleuchtungsebene verändert wird, insbesondere um beispielsweise eine Gitterkonstante zu verändern.

Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zusätzlich zu dem Beleuchtungsmuster ein weiteres Beleuchtungsmuster erzeugt, das dem Beleuchtungsmuster kohärent oder inkohärent überlagert wird.

Beispielsweise kann ein weiteres Beleuchtungsmuster dadurch erzeugt werden, dass aus dem Beleuchtungslichtbündel wenigstens zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel abgespalten werden, die in der Beleuchtungsebene miteinander interferieren. Alternativ ist es auch möglich, dass mittels einer weiteren Lichtquelle wenigstens zwei weitere Teilbeleuchtungslichtbündel erzeugt werden, die in der Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene das weitere Beleuchtungsmuster entsteht.

Auch auf diese Weise kann beispielsweise eine überaufgelöste Abbildung erzeugt werden. Durch die Überlagerung mehrerer Beleuchtungsmuster entsteht in der Beleuchtungsebene insgesamt ein hochfrequentes Beleuchtungsmuster. Wird dann die relative Phase der jeweils zu einem Beleuchtungsmuster gehörenden Teilbeleuchtungslichtbündel geändert, wird dadurch auch die Phase des hochfrequenten Gitters geändert, so dass die jeweils resultierenden Bilddaten als Rohdaten zur Erzeugung bzw. Berechnung einer überaufgelösten und/oder kontrastgesteigerten Abbildung des in der Beleuchtungsebene beleuchteten Probenbereichs verwendet werden können. Hierbei kann insbesondere vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Probe in der Beleuchtungsebene mit mehreren gekreuzten Beleuchtungsgittern, die sich kohärent überlagern beleuchtet wird.

Außer einer kohärenten Überlagerung von Beleuchtungsmustern, insbesondere einer Überlagerung gekreuzter Beleuchtungsgitter, besteht, wie bereits erwähnt, auch die Möglichkeit einer inkohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit wenigstens einem weiteren Beleuchtungsmuster. (Der Hauptunterschied der beiden Überlagerungsarten besteht darin, dass in einem Fall isolierte Maxima erzeugt werden, z. B. zur Anregung, im anderen Fall werden isolierte Minima/Nullstellen erzeugt. Die inkohärente Überlagerung lässt sich als einfache Summe der beiden Gitter verstehen: Die Gitter überlagern sich, ohne dass es durch Interferenz zu irgendwelchen Abweichungen kommt.) Das resultierende Beleuchtungsmuster besitzt dann einerseits einen ringförmigen Charakter. Insbesondere liegen echte Nullstellen dann nur noch im Zentrum bzw. an den Schnittpunkten der (linienförmigen) Nullstellen der beiden gekreuzten Gitter. Bei einer inkohärenten Überlagerung eines Beleuchtungsmusters mit einem einzigen weiteren, um 90 Grad in der Beleuchtungsebene gedrehten, weiteren Beleuchtungsmuster liegen die echten Nullstellen nur noch im Zentrum der Beleuchtungsebene innerhalb eines Quadrates, das aus vier benachbarten Punkten (Intensitätsmaxima) gebildet ist. Darüber hinaus besitzt ein durch inkohärente Überlagerung erzeugtes Gesamtbeleuchtungsmuster andererseits eine kleinere Periode. Insbesondere lässt sich das durch inkohärente Überlagerung erzeugte Beleuchtungsmuster auch für parallelisierte STED- bzw. RESOLFT-Experimente ausnutzen, wenn zeitlich parallel bzw. abwechselnd Anregungslicht einer anderen, passenden Wellenlänge eingestrahlt wird (bei schaltbaren Fluorophoren abwechselnd, bei STED/RESOLFT-artigen Techniken gleichzeitig).

Insbesondere reizvoll ist auch die Überlagerung von zwei Gittern mit unterschiedlichen Wellenlängen möglich. Mit Licht einer ersten Wellenlänge wird ein Punktgitter durch kohärente Überlagerung erzeugt, dessen Maxima an den Nullstellen eines Gitters liegen, welches mit Licht einer zweiten Wellenlänge erzeugt wurde und durch inkohärente Überlagerung erzeugt wird. Dabei ist die erste Wellenlänge zur Anregung der Fluorophore geeignet, die zweite Wellenlänge zur stimulierten Abregung mittels STED-Prozess bzw. zur Schaltung der Fluorophore mittels RESOLFT wie im weiteren erklärt wird.

Gegenüber Weitfeld-Realisierungen für RESOLFT-Experimente (Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions) bietet die vorliegende Erfindung den ganz besonderen Vorteil in einer höheren Raumfrequenz des resultierenden Beleuchtungsmusters und der hierdurch erzielbaren höheren Auflösung. Darüber hinaus ist bei RESOLFT-Experimenten und bei STED-Experimenten (Stimulated Emission Depletion) wegen der höheren Gitterfrequenz eine höhere Auflösung bei geringeren Beleuchtungslichtleistungen erzielbar. Darüber hinaus bietet die vorliegende Erfindung auch durch effizientere Nutzung des Lichts, da nur in einem schmalen Bereich außerhalb der Beleuchtungsebene beleuchtet wird.

Bei einer ganz besonders voreilhaften Ausführung sind die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel als Besselstrahlen ausgebildet. In ganz besonders vorteilhafter Weise kann vorgesehen sein, dass die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel und/oder die weiteren interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel als Sectioned-Bessel-Strahlen ausgebildet sind. Insbesondere kann vorerst vorgesehen sein, dass die interferierenden Besselstrahlen, beispielsweise unter Verwendung einer oder mehrerer hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung, in der Beleuchtungsebene synchron zueinander hin und her bewegt werden.

Der Hintergrund einer Beleuchtung unter Verwendung von Besselstrahlen oder Sectioned-Bessel-Strahlen ist folgender:

Wenn man das durch eine Ringblende tretende Licht fokussiert, entstehen entlang der optischen Achse im Bereich des Fokus aufgrund konstruktiver Interferenz Intensitätsmaxima. Eine Störung in einem kleinen Teilbereich des ringförmigen Beleuchtungslichtbündels wirkt sich im Bereich des Fokus auf der optischen Achse nahezu gar nicht aus, weil dort das gesamte Beleuchtungslicht interferiert. Ein Ausblenden in einem kleinen Teilbereich außerhalb der optischen Achse hat folglich auf die konstruktive Interferenz nahezu keinen Einfluss. In den Bereichen des Fokus mit einem Axialabstand zur optischen Achse wird eine Störung im Bereich des einfallenden Lichtes dadurch „geheilt", dass das übrige Licht hinter der Störung einen Schattenwurf durch die Störung vermeidet.

Ein mit einer ringförmigen Beleuchtung erzeugter Besselstrahl ist in Bezug auf die optische Achse rotationssymmetrisch. Darüber hinaus weist ein solcher Besselstrahl in einem Querschnitt senkrecht zur optischen Achse Intensitätismaxima in Form konzentrischer Ringe auf, wobei sich auf der optischen Achse das größte Intensitätsmaximum befindet. Blendet man nun von dem im Querschnitt ringförmigen Beleuchtungslicht, insbesondere symmetrisch, Segmente aus, so spricht man von einem „sectioned Bessel beam" (Sectioned-Bessel-Strahl). Beispielsweise könnte man eine Ringblende verwenden, bei der zusätzlich zwei einander spiegelsymmetrisch gegenüberliegende Umfangsbereiche abgedeckt sind. Das Licht tritt dann nur noch durch die zwei dazwischen liegenden Umfangsbereiche der Ringblende. Der Fokus eines solchen „sectioned Bessel beam" ist im Querschnitt senkrecht zur optischen Achse nicht rotationssymmetrisch. Vielmehr sind bei einem solchen„sectioned Bessel beam" Teile der ursprünglich ringförmigen Intensitätsmaxima ausgeblendet, so dass nebeneinanderliegende, zur optischen Achse konkav ausgerichtete gebogene Intensitätsmaxima in der Form von Ringsegmenten bzw.„sections" verbleiben.

Durch ein laterales Versetzen, beispielsweise unter Verwendung einer hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbaren Strahlablenkeinrichtung, um einen Bruchteil der Periode des Gitters eines Sectioned-Bessel-Strahles (beispielsweise um ein Drittel der Gitterperiode), können nacheinander mehrere Abbildungen (zweite drei Abbildungen) erzeugt und jeweils Bilddaten gewonnen werden, aus denen sich eine Gesamtabbildung mit höherem Kontrast errechnen lässt. Alternativ zur Überlagerung von zwei oder mehr senkrecht zueinander ausgerichteten Beleuchtungsmustern ist eine ähnliche Struktur erzeugbar, indem zwei gegeneinander laufende Sectioned- Bessel-Strahlen zur Interferenzen gebracht werden. Insoweit ist eine solche Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Erzielung einer Auflösungssteigerung und/oder zur Erzielung einer Kontraststeigerung besonders vorteilhaft. Der Hauptvorteil der Sectioned-Bessel-Strahlen besteht darin, dass durch die Überlagerung von lediglich zwei Strahlen aus entgegengesetzten Richtungen ein Gitter erzeugt werden kann. Man benötigt also nur zwei Spiegelkappen bzw. Objektive. Die Möglichkeit, das Gitter auch noch seitlich mittels einen Scan-Spiegels zu versetzen ist nur notwendig, wenn die Breite des Bildfeldes größer ist als die des Sectioned-Bessel-Strahls.

Sollen das Beleuchtungsmuster und das wenigstens eine weitere Beleuchtungsmuster kohärent interferieren, muss zwingend darauf geachtet werden, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel, die zur Interferenz gebracht werden, dieselbe Polarisation aufweisen. Bei der Verwendung von Umlenkspiegeln als Umlenkelementen ist hierbei zu beachten, dass durch die Reflektion die Linearpolarisationsrichtung des Teilbeleuchtungslichtbündels geändert wird, wenn das auf den Spiegel einfallende Teilbeleuchfungslichfbündel eine parallel zur Einfallsebene ausgerichtete Linearpolarisation aufweist. Im Gegensatz hierzu wird die Linearpolarisationsrichtung nicht verändert, wenn das jeweils einfallende Teilbeleuchtungslichtbündel eine Linearpolarisationsrichtung aufweist, die senkrecht zur Einfallsebene ausgerichtet ist.

Sollen das Beleuchtungsmuster und das wenigstens eine weitere Beleuchtungsmuster inkohärent überlagert werden, so kann dies beispielsweise dadurch erreicht werden, dass diese am Ort der Überlagerung in der Beleuchtungsebene unterschiedliche Polarisationen aufweisen. Beispielsweise überlagern sich zwei senkrecht zueinander ausgerichtete Beleuchtungsmuster inkohärent, die durch vier Teilbeleuchtungslichtbündel (jeweils zwei) erzeugt werden, wobei die Teilbeleuchtungslichtbündel in der Eintrittspupille des Beleuchtungsobjektivs gleich polarisiert sind und die nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs jeweils von einem von vier im Quadrat zueinander ausgerichteten Umlenkspiegel, insbesondere um 90 Grad, in die Beleuchtungsebene umgelenkt werden, da sie, wegen der geschilderten Effekte hinsichtlich der Linearpolarisation bei der Reflexion, nach dem Umlenken in der Beleuchtungsebene senkrecht zueinander stehende Linearpolarisationsrichtungen aufweisen.

Wenn eine inkohärente Überlagerung der Beleuchtungsmuster gewünscht ist, ist es auch möglich, zeitlich gepulst zu beleuchten, wobei die Pulslänge und die Repetitionsrate und der zeitliche Versatz der Lichtpulse des Beleuchtungsmusters relativ zu den Lichtpulsen des weiteren Beleuchtungsmusters so gewählt sind, dass das Beleuchtungsmuster und das weitere Beleuchtungsmuster abwechselnd zu unterschiedlichen Zeiten in der Beleuchtungsebene entstehen.

Alternativ ist es zu Erzeugung einer inkohärenten Überlagerung auch möglich, das Licht für das Beleuchtungsmuster und für das weitere Beleuchtungsmuster jeweils mit unterschiedlichen Lichtquellen zu erzeugen, weil das Licht unabhängiger Lichtquellen per se keine Kohärenz aufweist.

Eine weitere Möglichkeit zur Erzeugung einer inkohärenten Überlagerung besteht darin, den Lichtweg der Teilbeleuchtungslichtbündel und den Lichtweg der weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel derart auszugestalten, dass sich die Lichtweglängen um mehr als die Kohärenzlänge voneinander unterscheiden. Beispielsweise könnte das Beleuchtungslicht für das Beleuchtungsmuster unmittelbar ins Probenvolumen eingekoppelt werden, während das Licht für das weitere Beleuchtungsmuster durch eine lange Glasfaser, die länger ist als die Kohärenzlänge, geleitet wird, oder umgekehrt.

Alternativ ist es auch möglich, das Licht zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters und das Licht zur Erzeugung des weiteren Beleuchtungsmusters jeweils in eine polarisationserhaltende Glasfaser einzukoppeln, wobei diese gegeneinander verdreht beziehungsweise nicht gegeneinander verdreht werden. Das Licht der Lichtquelle wird dabei in vier Fasern eingekoppelt, die wiederum das Licht in die Pupille des Beleuchtungsobjektivs einkoppeln. Die Fasern werden dabei jeweils paarweise gegenüberliegend angeordnet und dabei so gedreht, dass das emittierte Licht in der gleichen Richtung polarisiert ist. Mit dieser Anordnung ist es in einfacher Weise möglich zwischen kohärenter Überlagerung der gekreuzten Gitter und inkohärenter Überlagerung zu wechseln indem die einzelnen Fasern des einen Paares gegenüberliegender Fasern jeweils um 90 Grad um ihre eigene Achse gedreht werden (und zwar nur an einem Ende gegenüber dem anderen der Faser).

Als weitere Alternative ist es zur Erzeugung einer inkohärenten Überlagerung auch möglich, einen Modulator, beispielsweise einen AOM (Acusto Optical Mudulator) oder ein AOD (Acusto Optical Deflector) zu verwenden um damit die Frequenz des Beleuchtungslichts der Teilbeleuchtungslichtbündel so zu manipulieren, dass sie nicht mehr mit dem unmanipulierten Licht der weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel interferieren. Der Modulator sollte dabei in der Lage sein, beispielsweise durch Photon-Photon-Wechselwirkung die Frequenz des Lichts zu schieben.

Ist hingegen eine kohärente Überlagerung gewünscht, kann die Linearpolarisationsrichtung der beiden Teilbeleuchtungslichtbündel eines der Beleuchtungsmuster, beispielsweise mittels einer Lambda/2-Platte, gedreht werden. Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung wird hierzu eine Phasenplatte mit vier Quadranten verwendet, wobei zwei diagonal gegenüberliegende Quadranten die Linearpolarisationsrichtung nicht beeinflussen, während die beiden anderen diagonal gegenüberliegenden Quadranten jeweils als Lambda/2 Phasenplatten ausgeführt sind. Beispielsweise können die das Beleuchtungsmuster erzeugenden Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils durch einen von zwei diagonal gegenüberliegenden Quadranten verlaufen, während die das weitere Beleuchtungsmuster erzeugenden weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel jeweils durch einen der beiden anderen diagonal gegenüberliegenden Quadranten verlaufen.

Die Phasenplatte kann vorteilhaft in einer zur Fokusebene des Beleuchtungsobjektivs konjugierten Ebene angeordnet sein. Alternativ zu einer Phasenplatte ist es auch möglich, die Polarisation mittels aktiven optischen Bauteilen, wie beispielsweise einem SLM (spatial light modulator), insbesondere einem ferroelektrischen SLM, oder beispielsweise mittels eines LcoS-Bauteils („Liquid crystal on Silicon"-Bauteils) zu beeinflussen. Die Verwendung derartiger Bauteile hat den ganz besonderen Vorteil, dass die Polarisation ortsabhängig und individuell gesteuert verändert werden kann. Auf diese Weise kann vorteilhaft einfach, schnell und zuverlässig eine Veränderung des Beleuchtungsmusters und/oder des wenigstens einem weiteren Beleuchtungsmusters erreicht werden und/oder schnell von einer kohärenten Überlagerung der Beleuchtungsmuster zu einer inkohärenten Überlagerung der Beleuchtungsmuster umgeschaltet werden.

Wie oben bereits erläutert, kann die Bildaufnahme mehrerer Abbildungen jeweils bei strukturierter Beleuchtung mit dem Beleuchtungsmuster und/oder dem weiteren Beleuchtungsmuster durch sukzessives Verschieben des jeweiligen Beleuchtungsmusters in der Beleuchtungsebene erfolgen. Hierzu kann die relative Phase der das Beleuchtungsmuster erzeugenden Teilbeleuchtungslichtbündel oder der das weitere Beleuchtungsmuster erzeugenden weiteren

Teilbeleuchtungslichtbündel verändert werden. Dies ist beispielsweise durch Verändern der Länge des Lichtwegs einer Untermenge der jeweils interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel beziehungsweise weiteren Teilbeleuchtungslichtbündel möglich. Eine Veränderung der Länge des Lichtwegs kann beispielsweise mittels eines aktiven Spiegels, der beispielsweise mit einem Piezoelement verschoben werden kann, erreicht werden. Alternativ oder zusätzlich ist auch die Verwendung eines akustooptischen Elements möglich. Als weitere Alternative ist es zur Veränderung des Lichtwegs auch möglich, wahlweise unterschiedliche optische Elemente mit unterschiedlicher Dicke und/oder unterschiedlicher optischer Dichte in den Strahlengang einzubringen. Es ist auch möglich, räumliche Lichtmodulatoren (SLM) oder Digital Mirror Devices (DMD) oder Deformable Mirrors (DM) zur Veränderung des Lichtweges zu verwenden. Das Aufspaltungsmittel kann beispielsweisen einen einfachen Strahlteiler oder einen Polarisationsstrahlteiler aufweisen. Bei einer besonderen Ausführung weist das Aufspaltungsmittel ein Phasengitter auf. Eine solche Ausführung ist besonders vorteilhaft, weil ein weitgehend symmetrischer Strahlengang für die unterschiedlichen Teilbeleuchtungslichtbündel erreicht werden kann.

Das Umlenkmittel kann beispielsweise einen oder mehrere Spiegel (Umlenkspiegel) als Umlenkelemente aufweisen. Insbesondere können die Spiegel eben ausgebildet sein. Es ist jedoch auch möglich, dass ein oder mehrere Spiegel gekrümmt ausgebildet sind. Es ist, alternativ oder zusätzlich, auch möglich, dass das Umlenkmittel wenigstens ein Prisma aufweist.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorteilhaft ein Umlenkmittel aufweisen, das das Beleuchtungslichtbündel, nachdem es das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen hat, derart umlenkt, dass das Beleuchtungs-lichtbündel in der Beleuchtungsebene verläuft. Insbesondere kann das Umlenkmittel derart angeordnet sein, dass das umgelenkte Beleuchtungslichtbündel einen von Null Grad verschiedenen Winkel zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs und/oder des Detektionsobjektivs aufweist. Insbesondere kann die Beleuchtungsebene senkrecht zur optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs ausgerichtet sein.

Insbesondere kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass das, insbesondere zu einem Lichtblatt geformte, Beleuchtungslichtbündel zunächst in vertikaler Richtung durch das Beleuchtungsobjektiv verläuft und anschließend in horizontale Richtung mit der Umlenkeinrichtung umgelenkt wird, um die Probe in der Probenebene entlang des Beleuchtungsstreifens zu beleuchten. Vorzugsweise verläuft das von dem Beleuchtungsstreifen ausgehende Detektionslicht, insbesondere Fluoreszenzlicht, in vertikaler Richtung durch ein Detektionsobjektiv. Ein solcher Aufbau ermöglicht die Verwendung von aufrechten oder inversen Standard-Mikroskopstativen zur Herstellung der erfindungsgemäßen optischen Vorrichtung. Bei einer ganz besonders vorteilhaften Ausführung ist vorgesehen, dass das Beleuchfungsobjekfiv und die Umlenkeinrichfung, die beispielsweise einen oder mehrere Umlenkspiegel aufweisen kann, relativ zueinander beweglich angeordnet sind, um das Beleuchtungslichtbündel relativ zur Probe bewegen zu können. Alternativ oder zusätzlich kann auch vorgesehen sein, dass die Umlenkeinrichtung, insbesondere beweglich, an dem Detektionsobjektiv oder dem Beleuchtungsobjektiv befestigt und/oder angeordnet ist.

Bevorzugt wird das Beleuchtungsmuster und/oder das weitere Beleuchtungsmuster zur Fluoreszenzanregung der Probe in der Probenebene verwendet. Alternativ oder zusätzlich wird die Probenebene gleichzeitig homogen mit Abregungslicht beaufschlagt.

Ganz besonders bevorzugt wird das Beleuchtungsmuster zum Schalten von Fluoreszenzfarbstoffen verwendet.

Grundsätzlich kann die Gitter-Beleuchtung in besonders günstiger Weise auch für RESOLFT-ähnliche Effekte verwendet werden (z.B. STED ,stimulated emission depletion' oder für GSD ,Ground State Depletion'). Der Unterschied zur strukturierten Beleuchtung zur Fluoreszenzanregung liegt darin, dass eine strukturierte oder nicht strukturierte Beleuchtung zur Fluoreszenzanregung mehr oder weniger Zeitgleich (z.B. versetzt bei GatedSTED) mit einer weiteren strukturierten Beleuchtung (auf einer anderen Wellenlänge) in der Probe überlagert wird. Beispielsweise könnte ein „gewöhnliches" z.B. blaues Lichtblatt in die Probe eingestrahlt und mit einem z.B. roten „Gitter" überlagert werden, wobei das rote Gitter dazu führt, dass dort die Fluorophore entweder stimuliert abgeregt werden oder in einem Dunkelzustand gehalten werden oder durch Konformationsänderung in einen nicht von dem blauen Lichtblatt anregbaren Zustand überführt werden, wobei durch die ,rote' Beleuchtung immer effektiv die Emission von Fluoreszenz in Richtung Detektor unterdrückt wird.

Gemäß einer Variante kann dazu auch das Anregungslicht eine Gifterform haben. Die Maxima der Anregung müssten dann in den Minima der Abregung liegen. Problematisch hierbei ist, dass die Lichtstrahlen unterschiedliche Wellenlängen aufweisen und daher sich nicht die gleiche Gitterperiode einstellt, wenn die Gitter auf die gleiche Weise erzeugt werden. Als Lösung bietet es sich daher an, die Periode des Gitters mit der kürzeren Periode zu strecken, um es an die Periode des längeren Gitters anzupassen. Dies ist möglich, indem die beiden gegenläufigen Lichtstrahlen, die das Gitter erzeugen sollen, innerhalb der beleuchteten Ebene gegeneinander verkippt werden (also nicht unter einem Winkel von 180° gegenläufig sind, sondern z.B. unter einem Winkel von 160° gegenläufig sind).

Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass die hier beschriebenen Konzepte bezüglich der Schaltbarkeit der Fluoreszenzfarbstoffe und/oder die Konzepte um die RESOLFT, STED, GatedSTED und/oder GSD einerseits im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung und andererseits auch losgelöst von der konkreten Merkmalskombination der vorliegenden Erfindung gemäß den ursprünglich formulierten unabhängigen Ansprüchen realisiert werden können. Insbesondere ist es im letztgenannten Fall nicht erforderlich, dass der Teilbeleuchtungslichtbündel durch ein, für beide Teilbeleuchtungslichtbündel gemeinsames, Beleuchtungsobjektiv gelenkt wird und/oder dass wenigstens eines der Teilbeleuchtungslichtbündel, nachdem diese das Beleuchtungsobjektiv durchlaufen haben, mit wenigstens einem Umlenkmittel derart umgelenkt werden, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel in einer Beleuchtungsebene miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene ein Beleuchtungsmuster entsteht.

Eine Vorrichtung, die geeignet ist, das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen, kann vorteilhaft auf der Basis eines Rastermikroskops, insbesondere eines konfokalen Rastermikroskops, aufgebaut sein. Hierbei bietet sich insbesondere die Verwendung eines inversen Mikroskopstatives an. Von besonderem Vorteil ist insoweit die Verwendung eines (möglicher-weise in einem Labor ohnehin vorhandenen) Rastermikroskops zur Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand beispielhaft und schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:

Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel eines Details einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, Fig. 2 schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM- Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 3 schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 4 schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters mit drei weiteren Beleuchtungsmustern bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 5 die Lichtverteilung bei der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung,

Fig. 6 die Lichtverteilung bei der kohärenten Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters,

Fig. 7 die Lichtverteilung bei der inkohärenten Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters,

Fig. 8 das Interferenzmuster zweier einender entgegenlaufender Sectioned-Bessel- Strahlen, Fig. 9 schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bei einer als TIRF- Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung, und

Fig. 10 eine Detailansicht der in Fig. 9 dargestellten Vorrichtung. Fig. 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel eines Details einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Vorrichtung beinhaltet ein Aufspaltungsmittel 1 , das ein Beleuchtungslichtbündel 2 räumlich in zwei Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 aufspaltet. Die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 durchlaufen eine Linse 5, die die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 fokussiert und eine Tubuslinse 6, die die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 kollimiert und in entgegengesetzter Richtung gegen die optische Achse verkippt in die Eintrittspupille eines Beleuchtungsobjektivs 7 koppelt.

Nach dem Durchlaufen des Beleuchtungsobjektivs 7 treffen die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 jeweils auf einen von zwei einander gegenüberliegend an einem Detektionsobjektiv 8 angeordneten Umlenkspiegeln 9, 10 eines Umlenkmittels, das die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 derart umlenkt, dass die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 in einer Beleuchtungsebene 1 1 , die gleichzeitig die Fokalebene des Detektionsobjektivs 8 ist, miteinander interferieren, so dass in der Beleuchtungsebene 1 1 ein Beleuchtungsmuster entsteht.

Fig. 2 zeigt schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters 12 in einem Probenvolumen 34 bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Beleuchtungsmuster 12 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 9, 10, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs 7 umgelenkt werden, so dass sie in der Beleuchtungsebene sich mit entgegengesetzten Ausbreitungsrichtungen ausbreiten. Die vertikalen Linien zwischen den Umlenkspiegeln zeigen beispielhaft die Positionen der Maxima/Minima einer sich ausbildenden stehenden Welle für zwei gegenläufige Strahlbündel mit ebener Phasenfront wie sie für in SPIM-Mikroskopen übliche Beleuchtungsstrahlen, auch Lichtblätter genannt, in guter Näherung aufweisen.

Fig. 3 zeigt schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters 12 und eines weiteren Beleuchtungsmusters 13 bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Beleuchtungsmuster 12 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 9, 10, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Das weitere Beleuchtungsmuster 13 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier weiterer Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden weiteren Umlenkelementen, nämlich weiteren Umlenkspiegeln 14, 15, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Durch die Überlagerung und Interferenz des Beleuchtungsmusters 12 mit dem weiteren Beleuchtungsmusters 13 entsteht im Zentrum ein Punktgitter 1 6. Fig. 4 zeigt schematisch die Erzeugung der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters 12 mit drei weiteren Beleuchtungsmustern 13, 1 7, 18 bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Es sei an dieser Stelle betont, dass es sich bei Fig. 4 nicht zwingend um eine Darstellung eines realen Umlenkmittels handelt, sondern vielmehr ebenfalls die Möglichkeit einer zeitlichen Integration zeigt, die bspw. durch Einsatz eines drehbaren Umlenkmittels umgesetzt werden kann: Die in der Figur gezeigten Umlenkspiegel können fest verbaut sein, aber sie müssen nicht alle im Aufbau vorhanden sein. Insbesondere kann auch ein bewegliches Paar von Umlenkspiegeln 9, 10 derart verdrehbar vorgesehen sein, dass es nacheinander die Positionen der Umlenkspiegel 9,10 und dann 21 , 22 und dann 14, 15 und dann 19, 20 einnehmen kann oder eine beliebige Zahl von beliebigen anderen Positionen. Idealerweise wird ein streifenförmiges Beleuchtungsmuster 12 dabei zwei Mal um jeweils um Winkel von 60 Grad verdreht um eine in der Ebene 1 1 isotrope Auflösungserhöhung zu erreichen. Dies geschieht während der Belichtung eines einzigen Bildes der Kamera.

Wenn mehrere Spiegel fest verbaut sind und deren Gitter sich überlagern führt das zu komplexen Beleuchtungsmustern. Diese würden dann strukturierte Beleuchtung höherer Ordnungen ermöglichen. Wenn das Beleuchtungsmuster kein regelmäßiger Sinus ist, dann muss man das Gitter mehr als zwei Mal verschieben und mehr als drei Bilder aufnehmen, erhält aber auch eine höhere Steigerung der Auflösung.

Das Beleuchtungsmuster 12 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 9, 10, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Das weitere Beleuchtungsmuster 13 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier weiterer Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden (weiteren) Umlenkelementen, nämlich weiteren Umlenkspiegeln 14, 15, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden

Das weitere Beleuchtungsmuster 17 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden Umlenkelementen, nämlich Umlenkspiegeln 19, 20 (oder Umlenkspiegeln 9, 1 0 die an die Position von 19, 20 gedreht wurden), nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden. Das weitere Beleuchtungsmuster 18 entsteht in der Beleuchtungsebene 1 1 durch Interferenz zweier weiterer Teilbeleuchtungslichtbündel, die von einander gegenüberliegenden weiteren Umlenkelementen, nämlich weiteren Umlenkspiegeln 21 , 22, nach Durchlaufen eines Beleuchtungsobjektivs umgelenkt werden.

Durch die Überlagerung des Beleuchtungsmusters 12 und mit den weiteren Beleuchtungsmustern 1 3, 1 7, 18 entsteht im Zentrum ein Punktgitter 23. Es kann auch eine Untergruppe z.B. von 12 und 1 3 oder 1 7 und 18 zur Überlagerung gebracht werden.

Fig. 5 zeigt die Lichtverteilung bei der Überlagerung eines Beleuchtungsmusters und eines weiteren Beleuchtungsmusters bei einer als SPIM-Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Konkret zeigt Fig. 5 in der oberen Zeile ein in der Beleuchtung eben erzeugtes Beleuchtungsmuster in drei verschiedenen Ansichten. In der linken Darstellung ist eine Ansicht der Beleuchtungsebene 1 1 mit Blickrichtung entlang der optischen Achse des der Detektionsobjektivs (Z-Richtung) zu sehen. Die beiden anderen Darstellungen zeigen das Beleuchtungsmuster mit einer Blickrichtung entlang der X-Richtung (Ausbreitungsrichtung der Strahlen des ersten Beleuchtungsmusters) und mit einer Blickrichtung entlang der zu X und Z senkrecht verlaufenden Y-Richtung (Ausbreitungsrichtung der Strahlen des zweiten Beleuchtungsmusters).

Fig. 5 zeigt in der mittleren Zeile ein in der Beleuchtung eben erzeugtes weiteres Beleuchtungsmuster in den drei verschiedenen Ansichten wie in der oberen Zeile. In der linken Darstellung ist eine Ansicht mit Blickrichtung entlang der optischen Achse des der Detektionsobjektivs (Z-Richtung) zu sehen. Die beiden anderen Darstellungen zeigen das Beleuchtungsmuster mit einer Blickrichtung entlang der X-Richtung und mit einer Blickrichtung entlang der Y-Richtung. Das weitere Beleuchtungsmuster ist in der Beleuchtung eben nur relativ zu dem in der oberen Zeile gezeigten Beleuchtungsmuster um 90 Grad gedreht. Fig. 5 zeigt in der unteren Zeile das Resultat der kohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit dem weiteren Beleuchtungsmuster in den drei verschiedenen Ansichten wie in der oberen Zeile. In der linken Darstellung ist eine Ansicht mit Blickrichtung entlang der optischen Achse des der Direktionsobjektivs (Z- Richtung) zu sehen. Die beiden anderen Darstellungen zeigen das Beleuchtungsmuster mit einer Blickrichtung entlang der X-Richtung und mit einer Blickrichtung entlang der Y-Richtung.

Fig. 6 zeigt vergrößert die Lichtverteilung der kohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters mit dem weiteren Beleuchtungsmuster, wie es bereits in der unteren Zeile der Figur 5 dargestellt ist.

Fig. 7 zeigt die Lichtverteilung, die bei der inkohärenten Überlagerung des Beleuchtungsmusters und des weiteren Beleuchtungsmusters entsteht. Fig. 8 zeigt das Interferenzmuster zweier einander entgegenlaufender Sectioned- Bessel-Strahlen. Beispielsweise durch Verändern der Phase und der lateralen Position der sich überlagernden Sectioned-Bessel-Strahlen kann das Interferenzmuster sukzessive geändert werden, um mehrere Abbildungen zu generieren, aus deren Bilddaten sich im Ergebnis ein Bild mit höherem Kontrast und höherer Auflösung errechnen lässt.

Fig. 9 zeigt schematisch die Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bei einer als TIRF- Mikroskop ausgeführten erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Vorrichtung weist ein Beleuchtungsobjektiv 7 und ein Detektionsobjektiv 8 auf, zwischen denen eine zu untersuchende Probe 24 in einer Untersuchungsposition angeordnet ist. Die Probe 24 steht mit einem optisch transparenten Medium 25 in Kontakt, das einen höheren Brechungsindex aufweist als die Probe 24. Die Probe kann dabei auch auf einem Deckglas präpariert sein, welches mit dem optisch transparenten Medium 25 in Kontakt steht, wobei im Zwischenraum ein Immersionsmedium zur Minimierung von Sprüngen im Brechungsindex eingefügt werden kann.

Zwei Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 gelangen über eine hinsichtlich des Ablenkwinkels einstellbare Strahlablenkeinrichtung 26, eine Scanlinse 27 und eine Tubuslinse 28 zu dem Beleuchtungsobjektiv 7, durchlaufen dieses und werden anschließend von einem Umlenkmittel 29, das zwei Umlenkelemente 30, 31 aufweist und an dem Detektionsobjektiv 8 befestigt ist, umgelenkt. Das Umlenkmittel 29 weist ein erstes Umlenkelement 30 und ein zweites Umlenkelement 31 auf, wobei das optisch transparente Medium 25 (neben seiner Funktion, eine ebene Grenzfläche zur Probe 24 bereit zu stellen) auch ein weiteres Umlenkelement bildet. Die Umlenkelemente 30, 31 und die Eintrittsfenster des optisch transparenten Mediums 25 lenken die Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 jeweils nacheinander mit Ablenkwinkeln unterschiedlichen Vorzeichens und unterschiedlicher Beträge um.

An der Grenzfläche 32 zwischen dem optisch transparenten Medium 25 und der Probe 24 werden die interferierenden Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 zur evaneszenten Beleuchtung der Probe 24 totalreflektiert. Das evaneszente Feld 33 ragt in die Probe 24 und führt dort zu einer optischen Anregung von Fluoreszenzfarbstoffen.

Das von der Probe 24 ausgehende Fluoreszenzlicht gelangt durch das Detektionsobjektiv 8 hindurch und wird auf die aktive Fläche eines (nicht dargestellten ortsauflösenden Detektors fokussiert, der beispielsweise als Flächendetektor ausgebildet ist.

Die Strahlablenkeinrichtung 26 weist einen kardanisch aufgehängten Spiegel auf, der es ermöglicht, dass die Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 in zwei zueinander senkrechten Ebenen mit jeweils beliebigem Ablenkwinkel ablenken zu können. Auf diese Weise können die räumliche Lage und die Ausbreitungsrichtung der aus dem Beleuchtungsobjektiv 7 austretenden Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 weitgehend frei eingestellt werden. Auf diese Weise ist es beispielsweise möglich, die Teilbeleuchtungslichtbundel 3, 4 statt auf die Umlenkelemente 30, 31 auf ein anderes Paar von Umlenkmitteln zu lenken, beispielsweise um die Ausrichtung des Beleuchtungsmusters zu ändern.

Alternativ zu einem kardanisch aufgehängten Spiegel 26 könnte die Strahlablenkeinrichtung beispielsweise auch mindestens zwei optisch in Reihe geschaltete Ablenkelemente, insbesondere Ablenkspiegel, aufweisen, die die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 in zueinander senkrechten Ablenkebenen ablenken können. Die Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 werden aus einem Beleuchtungslichtbündel 2 mithilfe eines Aufspaltungsmittels 1 , das beispielsweise als Gitter ausgebildet sein kann, erzeugt.

Alternativ oder zusätzlich ist es bspw. auch vorstellbar, dass das Aufspaltungsmittel 1 um eine Achse drehbar oder kardanisch gelagert ist und sich die Drehbarkeit der Strahlablenkeinrichtung 26 ggf. auf nur eine Achse beschränkt, solange die freie Ausrichtbarkeit der Teilbeleuchtungslichtbündel gewährleistet bleibt.

Fig. 10 zeigt eine Detailansicht des Probenbereichs der in Fig. 9 dargestellten Vorrichtung und insbesondere die Lichtwege der interferierenden Teilbeleuchtungslichtbündel 3, 4 im Bereich der Probe 24.

Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken. Insbesondere sind sämtliche, in dieser Beschreibung enthaltenen Merkmale und/oder deren Funktionen, Wirkungen und Eigenschaften für sich gesehen und/oder in Kombination miteinander als hierin offenbart anzusehen, die ein auf dem vorliegenden Gebiet tätiger Fachmann ggf. unter Hinzuziehung seines Fachwissens einzeln oder in Kombination zur Lösung der objektiven Aufgabe oder damit zusammenhängenden Problemstellungen vorsehen würde.

Bezuqszeichenliste:

1 Aufspal†ungsmi††el

2 Beleuchtungslichtbündel

3 Teilbeleuchtungslichtbündel 4 Teilbeleuchtungslichtbündel

5 Linsen

6 Tubuslinse

7 Beleuchtungsobjektiv

8 Detektionsobjektiv

9 Umlenkspiegel

10 Umlenkspiegel

1 1 Beleuchtungsebene

12 Beleuchtungsmuster

13 weiteres Beleuchtungsmuster 14 weiterer Umlenkspiegel

15 weiterer Umlenkspiegel

1 6 Punktgitter

1 7 weiteres Beleuchtungsmuster

18 weiteres Beleuchtungsmuster 19 weiterer Umlenkspiegel

20 weiterer Umlenkspiegel

21 weiterer Umlenkspiegel

22 weiterer Umlenkspiegel

23 Punktgitter

24 Probe

25 optisch transparentes Medium

26 Strahlablenkeinrichtung

27 Scanlinse

28 Tubuslinse

29 Umlenkmittel

30 Umlenkelement

31 Umlenkelement

32 Grenzfläche

33 evaneszentes Feld

34 Probenvolumen