Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure (Nukleinsäu- revervielfältigungsreaktion,- NSV) in einem flüssigkeitsleitenden System sowie eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung. Unter einem flüssigkeitsleitenden System wird eine Anordnung flüssigkeitsleitend bzw. fluidisch miteinander verbundener Flüssigkeitsleitungen und Flüssigkeits- kammern verstanden.

Ein solches Verfahren und eine solche Vorrichtung sind aus dem Stand der Technik bekannt. Dabei wird eine Flüssigkeit, welche eine zu vervielfältigende Nukleinsäure und sämtliche zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) erforderlichen Reagenzien enthält, durch einen Schlauch geleitet. Der Schlauch wird in verschiedenen Abschnitten unterschied- lieh temperiert, so dass die darin fließende Flüssigkeit die für die PCR erforderlichen Temperaturen durchläuft. Nachteilig bei diesem Verfahren ist es, dass das Temperaturprofil, welches die Flüssigkeit durchläuft, durch den Verlauf des Schlauchs durch vorgegebene Temperaturzonen festgelegt ist . Es ist mit einer solchen Vorrichtung nicht oder nur sehr schwer möglich, das für die Durchführung der PCR erforderliche Temperaturprofil zu verändern und dadurch beispielsweise an die zu vervielfältigende Nukleinsäure anzupassen. Weiterhin besteht bei einer solchen Anordnung das Problem, dass sich bei Temperaturen in der Nähe des Siedepunkts der Flüssigkeit in der Flüssigkeit Gasblasen bilden, die zu einem Auseinanderziehen der Probe im Schlauch führen. Dadurch ist das Temperaturprofil, welches die Flüssigkeit durchläuft, für verschiedene Teile der Flüssigkeit uneinheitlich. Das führt

zu uneinheitlichen, schlecht reproduzierbaren und oft auch unzureichenden Vervielfältigungsreaktionen.

Aus EP 1 123 980 A2 ist ein Verfahren zur Durchführung einer Nukleinsäureanalytik bekannt. Dabei ist eine Kapillare über einen Dreiwegehahn mit zwei Spritzen verbunden. über die Spritzen kann Flüssigkeit durch die Kapillare gesaugt und zur Durchmischung zwischen den Spritzen hin und hergepumpt werden. In der Kapillare erfolgt sowohl eine Bindung von Nu- kleinsäuren als auch eine anschließende Amplifikation der Nukleinsäuren in einer PCR. Zur Durchführung der PCR wird die Kapillare von den Spritzen abgenommen und mit Stopfen verschlossen. Dadurch ist das Verfahren nicht automatisierbar. Ohne einen Verschluss der Kapillare würde es bei der Durch- führung der PCR jedoch zu einem Flüssigkeitsverlust kommen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitstellen, welche es ermöglichen, eine NSV innerhalb eines fluidischen Systems unter Vermeidung der oben genannten Nachteile durchzuführen. Insbesondere soll es möglich sein, beliebige, für die NSV günstige, Temperaturbedingungen zu wählen. Darüber hinaus soll vermieden werden, dass Flüssigkeit, beispielsweise in Form von Dampf, aus der Vorrichtung entweicht. Dadurch würde sich die in der Flüssig- keit vorhandene definierte Konzentration oder Menge der Reagenzien oder der zu vervielfältigenden Nukleinsäure ändern.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 35 gelöst. Zweckmäßigen Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 34 und 36 bis 57.

Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zur Vervielfältigung einer Nukleinsäure (Nukleinsäure- vervielfältigungsreaktion,- NSV) in einem flüssigkeitsleiten-

den System vorgesehen, wobei die Nukleinsäure in einer ersten Flüssigkeit enthalten ist. Dabei ist ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß vorgesehen, welches an einem ersten Ende eine öffnung aufweist, die flüssigkeitsleitend über eine erste Flüssigkeitsleitung an das flüssigkeitsleitende System angeschlossen ist. über die erste Flüssigkeitsleitung kann das Reaktionsgefäß mit der ersten Flüssigkeit gefüllt und entleert werden. Zwischen einem Außenraum und dem Innenraum des Reaktionsgefäßes weist das Reaktionsgefäß einen im Reaktions- gefäß verschiebbaren ersten Kolben auf.

Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Einleiten der ersten Flüssigkeit und von für die Durch- führung der NSV erforderlichen Reagenzien, soweit die Reagenzien nicht im Reaktionsgefäß (12) vorgelegt sind, durch die erste Flüssigkeitsleitung (16) in das Reaktionsgefäß (12) , so dass sämtliche für die Durchführung der NSV erforderlichen Reagenzien im Reaktionsgefäß (12) vorhanden sind,

b) Inkubation der ersten Flüssigkeit in dem Reaktionsgefäß unter Bedingungen, welche für die NSV erforderlich sind und

c) Nachweis der bei der NSV entstandenen vervielfältigten Nukleinsäure.

Im Sinne der Erfindung ist das Reaktionsgefäß auch dann flüssigkeitsleitend an das flüssigkeitsleitende System angeschlossen, wenn der Fluss der Flüssigkeit zwischen dem Reak- tionsgefäß und dem restlichen flüssigkeitsleitenden System durch ein Ventil oder eine andere Einrichtung reversibel unterbrochen ist. Beim Schritt lit. a kann die erste Flüssigkeit die für die Durchführung der NSV neben der zu vervielfältigenden Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien teilweise

oder vollständig enthalten. Die erste Flüssigkeit kann auch nur die Nukleinsäure enthalten. Im Sinne der Erfindung ist die erste Flüssigkeit jede Flüssigkeit, welche die erste Flüssigkeit enthält. Als erste Flüssigkeit wird demnach auch eine Mischung aus erster Flüssigkeit und sonstigen Flüssigkeiten oder eine Losung von Reagenzien in der ersten Flüssigkeit verstanden. Das Einleiten der ersten Flüssigkeit in das Reaktionsgefäß gemäß Schritt lit. a) kann auch erfolgen, nachdem die erste Flüssigkeit zwischen dem Reaktionsgefäß, und einem weiteren Gefäß zur besseren Durchmischung oder Auflösung von Reagenzien in der Flüssigkeit hin und her bewegt worden ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch den ersten Kolben ein Reaktionsgefäß bereitgestellt, welches durch den beweglichen ersten Kolben ein variables Volumen aufweist. Ein dadurch erreichter Vorteil besteht darin, dass ein Entweichen der ersten Flüssigkeit in Form von Dampf oder beispielsweise indem die erste Flüssigkeit durch die Entstehung einer Dampf- blase aus dem Reaktionsgefäß herausgedrückt wird, verhindert wird. Das Vorsehen eines zylinderförmigen Reaktionsgefäßes ermöglicht eine weit gehende thermische Entkopplung des Reaktionsgefäßes von dem restlichen flüssigkeitsleitenden System, so dass nur die in dem Reaktionsgefäß vorhandene erste Flüs- sigkeit entsprechend der für die NSV erforderlichen Temperaturen temperiert werden kann. Durch die thermische Entkopplung des Reaktionsgefäßes ist es außerdem möglich, Temperaturwechsel in dem Reaktionsgefäß schneller zu vollziehen. Eine NSV, welche vielfache Temperaturwechsel erfordert, wie z. B. eine PCR, kann dadurch schneller durchgeführt werden. Darüber hinaus ist es durch ein zylinderförmiges Reaktionsgefäß möglich, im Verhältnis zum Volumen des Reaktionsgefäßes eine große Oberfläche bereitzustellen. Auch dadurch wird ein schneller Temperaturwechsel in dem Reaktionsgefäß begünstigt

und eine vielfache Temperaturwechsel erfordernde NSV kann schneller durchgeführt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Durchführung eine NSV in einem fluidischen System unter genau definierten Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Konzentration der eingesetzten Reagenzien und Menge der eingesetzten Nukleinsäure. Das Verhindern eines Flüssigkeitsverlusts durch den Kolben ermöglicht es außerdem, bei infektiösen Proben eine Kontami- nation der Umgebung zu vermeiden. Weiterhin kann durch den ersten Kolben auch eine Kontamination der ersten Flüssigkeit durch Verunreinigungen aus der Umgebung vermieden werden. Insbesondere bei der Durchführung einer eine exponentielle Nukleinsäurevervielfältigung bewirkenden NSVs ist das wich- tig, da hier auch kleinste Verunreinigungen, beispielsweise durch in das Reaktionsgefäß fallende Hautschuppen, das Ergebnis verfälschen können.

Darüber hinaus ermöglicht der erste Kolben einen Druckaus - gleich zwischen dem Innenraum des Reaktionsgefäßes und dem

Außenraum, so dass sich in dem System kein oder nur ein durch die Stellung des Kolbens vorgegebener überdruck aufbaut. Dadurch kann eine Druckbelastung des flüssigkeitsleitenden Systems und insbesondere darin enthaltener Ventile begrenzt oder sogar verhindert werden. Durch die Begrenzung der Druckbelastung kann weiterhin verhindert werden, dass Flüssigkeit durch den Druck über das flüssigkeitsleitende System in Bereiche des flüssigkeitsleitenden Systems gedrückt wird, in denen die Flüssigkeit unerwünscht ist. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht insgesamt eine automatisierte, kontaminationsfreie und unter genau definierten Bedingungen erfolgende NSV.

Bei dem fluidischen System handelt es sich bevorzugt um ein mikrofluidisches System. Unter einem mikrofluidischen System wird ein flüssigkeitsleitendes System verstanden, bei welchem die Flüssigkeitsleitungen in einem überwiegenden Teil der Länge der Flüssigkeitsleitungen einen Durchmesser oder eine Diagonale aufweisen, der/die kürzer als 2 mm, insbesondere kürzer als 1 mm, bevorzugt kürzer als 0,5 mm, ist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Ver- fahrens befindet sich der erste Kolben vor dem Einleiten der ersten Flüssigkeit am ersten Ende des zylinderförmigen Reaktionsgefäßes. Dadurch wird das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes minimiert, so dass sich nach dem Einleiten der ersten Flüssigkeit kein oder fast kein Gas, wie z. B. Luft, im Reaktionsgefäß befindet. Ein Gas im Reaktionsgefäß ist komprimierbar und erschwert es dadurch, ein genau definiertes Volumen durch Drücken des ersten Kolbens aus dem Reaktionsgefäß herauszuleiten.

Vorzugsweise wird der erste Kolben durch das Einleiten der ersten Flüssigkeit verschoben. Bevorzugt handelt es sich bei der NSV um eine Polymerasekettenreaktion (PCR) oder eine sonstige Reaktion, bei welcher die Temperatur der ersten Flüssigkeit verändert wird. Wenn die erste Flüssigkeit durch eine Temperaturänderung ihr Volumen ändert oder Gas bildet, sei es durch Ausgasen darin gelöster Luft oder durch Dampfentste- hung, kann der erste Kolben durch die erste Flüssigkeit bewegt werden, so dass dadurch das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes verändert wird.

Besonders bevorzugt ist es, wenn der erste Kolben während des gesamten Verfahrens nur durch die erste Flüssigkeit und/oder durch aus der ersten Flüssigkeit gebildetem Gas und/oder durch Drücken des ersten Kolbens von außerhalb des Reaktions-

gefäßes verschoben wird. Dadurch kann eine besonders einfach aufgebaute Betätigungsvorrichtung zur automatisierten Durchführung des Verfahrens verwendet werden, weil keine konstruktiven Maßnahmen getroffen werden müssen, um den ersten Kolben durch Zug zu bewegen.

Vorteilhaft ist es, wenn der erste Kolben bei den Schritten lit. a) und/oder lit. b) bis zu einem vorgegebenen Anschlag bewegt wird. Der vorgegebene Anschlag ermöglicht es, ein de- finiertes Volumen in das Reaktionsgefäß zu füllen. Bei gegebener Konzentration der zu vervielfältigenden Nukleinsäure in der ersten Flüssigkeit kann dadurch eine genau definierte Menge zu vervielfältigender Nukleinsäure in das Reaktionsgefäß gefüllt werden. Durch den Anschlag kann gewährleistet werden, dass in das Reaktionsgefäß ein definiertes Volumen gelangt, ohne dass die Flüssigkeitsmenge, welche durch die öffnung des Reaktionsgefäßes gedrückt wird, auf Seiten des restlichen flüssigkeitsleitenden Systems reguliert werden muss .

Vorteilhaft ist es, wenn der Anschlag zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) in zur öffnung hin entgegengesetzten Richtung verschoben oder entfernt wird. Der Anschlag kann dazu z. B. durch einen verschiebbaren oder entfernbaren Stab gebildet sein. Dadurch kann beim Befüllen des Reaktionsgefäßes ein jeweils gewünschtes Flüssigkeitsvolumen durch den Anschlag eingestellt werden. Nach dem Befüllen kann der Anschlag zur Durchführung der Reaktion entfernt oder zurückgezogen werden, um dadurch einen Druckausgleich zu ermöglichen.

Vorteilhaft ist es auch, wenn durch den ersten Kolben gegenüber der sich beim Erwärmen ausdehnenden ersten Flüssigkeit eine solche Gegenkraft ausgeübt wird, dass dadurch ein Druck aufgebaut wird, welcher eine Bildung von Gasblasen im Ver-

gleich zu einem druckfreien System vermindert . Der sich dabei aufbauende Druck ist geringer als der Druck, der sich bei einem mit einem unbeweglichen Verschluss verschlossenen Gefäß aufbauen würde. Beispielsweise kann das erreicht werden, in- dem der beim Einfüllen der Flüssigkeit den Anschlag bildende Stab nach dem Einfüllen der Flüssigkeit soweit zurückgezogen wird, dass der Kolben sich in einem Bereich bewegen kann, welcher der temperaturbedingten Volumenänderung der Flüssigkeit entspricht. Die Gegenkraft kann durch ein auf den ersten Kolben wirkendes durch eine Ausdehnung der ersten Flüssigkeit gegen die Schwerkraft zu bewegendes Gewicht oder durch einen Reibwiderstand des ersten Kolbens gegenüber dem Reaktionsgefäß erzeugt werden. Das Gewicht kann z. B. auf den Kolben wirken, indem der Kolben selbst dieses Gewicht aufweist. Durch den Reibwiderstand bewegt sich der Kolben erst, wenn ein bestimmter Mindestdruck erreicht ist und er kommt zum Stillstand, bevor völlige Druckfreiheit in dem Reaktionsgefäß erreicht ist.

Vorzugsweise wird das Reaktionsgefäß bei der Durchführung des Verfahrens so angeordnet, dass dabei in der ersten Flüssigkeit sich bildende Blasen zum ersten Kolben aufsteigen können. Das kann insbesondere dadurch erreicht werden, dass die Längsachse des Reaktionsgefäßes im Wesentlichen lotrecht an- geordnet wird. Dadurch kann es vermieden werden, dass die Blasen beim späteren Entleeren des Reaktionsgefäßes in das flüssigkeitsleitende System gelangen. Das kann insbesondere dadurch erfolgen, dass der erste Kolben zum Herausdrücken der ersten Flüssigkeit in Richtung des ersten Endes aber nicht bis zum ersten Ende gedrückt wird. Es kann ein definiertes

Volumen im Zylinder verbleiben, in welchem die Blasen enthalten sind.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen. Verfahrens ist bei dem zylinderförmigen Reaktionsgefäß das Verhältnis von Höhe zum Innendurchmesser größer als 2, bevorzugt größer als 4, insbesondere größer als 6. Das zylinder- förmige Reaktionsgefäß kann insbesondere auch leicht konisch zum ersten Ende hin zulaufen. Bei einem aus einem elastischen Material bestehenden ersten Kolben wird dadurch erreicht, dass der erste Kolben durch das Einleiten der ersten Flüssigkeit leicht verschoben werden kann und für das Einleiten da- durch ein geringerer Druck erforderlich ist.

Weiterhin ist es vorteilhaft, wenn die Wandstärke des zylinderförmigen Reaktionsgefäßes geringer als 1 mm, bevorzugt geringer als 0,5 mm, insbesondere geringer als 0,3 mm, ist. Da- durch ist eine gute Wärmeübertragung auf den Innenraum des Reaktionsgefäßes möglich. Der Wärmeübertrag ist umso besser, je dünner die Wandstärke ist. Ganz besonders bevorzugt ist die Wandstärke so gering, wie sie durch ein Spritzgussverfahren eben noch hergestellt werden kann.

Bevorzugt ist es, wenn das flüssigkeitsleitende System oder die öffnung oder die erste Flüssigkeitsleitung zwischen den Schritten lit. a) und lit. b) flüssigkeitsdicht verschlossen wird. Es versteht sich, dass die öffnung oder die erste Flüs- sigkeitsleitung nach Schritt lit. b) wieder geöffnet wird, wenn die erste Flüssigkeit danach wieder aus dem Reaktionsgefäß geleitet werden soll. Durch das Verschließen des Flüssigkeitsleitenden Systems kann nach dem Einleiten der ersten Flüssigkeit jede Kontamination der Umgebung vermieden werden. Das ist insbesondere bei infektiösen Proben wichtig. Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn die Nukleinsäure, insbesondere in Form einer biologischen Probe, vor Schritt lit. a) in das flüssigkeitsleitende System eingeleitet wird und das flüssigkeitsleitende System danach und vor Durchführung des Schritts

lit. a) flüssigkeitsdicht verschlossen wird. Sowohl die NSV als auch der Nachweis kann innerhalb des flüssigkeitsdicht verschlossenen flüssigkeitsleitenden Systems erfolgen. Danach kann das flüssigkeitsleitende System inklusive darin enthal- tener Flüssigkeiten vollständig entsorgt werden. Dadurch ist das erfindungsgemäße Verfahren sehr sicher. Durch das Verschließen der öffnung oder der ersten Flüssigkeitsleitung kann erreicht werden, dass ein in dem Reaktionsgefäß sich aufbauender Druck nicht auf das restliche flüssigkeitsleiten- de System wirken kann.

Bevorzugt wird das Reaktionsgefäß beim Schritt lit. b) zur Einstellung der Bedingungen, welche für die NSV erforderlich sind, insbesondere durch Anblasen mit einem Luftstrom, er- wärmt oder gekühlt. Durch die zylindrische Form des Reaktionsgefäßes kann das Reaktionsgefäß so isoliert und exponiert stehen, dass im Wesentlichen nur das Reaktionsgefäß erwärmt oder gekühlt wird. Durch das Anblasen mit einem erwärmten oder gekühlten Luftstrom ist ein besonders schneller Tempera- turwechsel innerhalb des Reaktionsgefäßes und dadurch ein schnelles Durchführen der NSV möglich. Bevorzugt durchläuft das Reaktionsgefäß beim Schritt lit. b) ein zyklisches Temperaturprofil. Das bedeutet, dass mehrfach dieselben Temperaturstufen innerhalb einer vorgegebenen zeitlichen Abfolge durchlaufen werden. Besonders bevorzugt ist es, wenn der

Luftstrom durch eine Luftführung, insbesondere ein Luftleitschild, zumindest teilweise, um das Reaktionsgefäß herumgeführt wird. Dadurch ist ein besonders intensiverer und dadurch auch schnellerer Wärmeaustausch zwischen dem Luftstrom und dem Reaktionsgefäß möglich.

Besonders bevorzugt ist es, wenn der Nachweis gemäß Schritt lit. c) außerhalb des Reaktionsgefäßes erfolgt und die erste Flüssigkeit zwischen den Schritten lit. b) und lit. c) durch

die öffnung und die erste Flüssigkeitsleitung hindurch, insbesondere durch Vorschub des ersten Kolbens, aus dem Reaktionsgefäß geleitet wird. In dem flüssigkeitsleitenden System kann der Nachweis beispielsweise mittels einer Elektrode mit daran immobilisierten Fängermolekülen, mit welchen die vervielfältigten Nukleinsäuren hybridisieren, durch eine elektrochemische Reaktion erfolgen. Vorzugsweise wird die erste Flüssigkeit über das flüssigkeitsleitende System in eine flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System in Verbindung stehende Detektionskammer geleitet. Bevorzugt erfolgt beim Schritt lit. c) eine Hybridisierung der vervielfältigten Nukleinsäuren mit, insbesondere immobilisierten, weiteren Nukleinsäuren. Die weiteren Nukleinsäuren können auf einem, insbesondere in der Detektionskammer angeordneten, Chip immobilisiert sein. Der Nachweis gemäß Schritt lit. c) kann auf dem Chip mittels eines optischen oder eines elektrischen Nachweisverfahrens erfolgen. Beim optischen Nachweisverfahren kann das Vorhandensein von Nukleinsäuren, welche an auf dem Chip immobilisierte weitere Nukleinsäuren gebunden haben, beispielsweise dadurch nachgewiesen werden, dass die Fluoreszenz von in die vervielfältigten Nukleinsäuren eingebauten Fluorophoren gemessen wird. Der elektrochemische Nachweis kann beispielsweise durch auf dem Chip angeordnete Gra- fitelektroden erfolgen, an welche die weiteren Nukleinsäuren als Sonden immobilisiert sind. Nach dem Binden der spezifischen vervielfältigen Nukleinsäuren kann dann ein elektrochemischer Nachweis gebundener Nukleinsäuren durchgeführt werden.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens sind das Reaktionsgefäß und das flüssigkeitsleitende System oder das Reaktionsgefäß, zumindest ein Teil der Detektionskammer und das flüssigkeitsleitende System, bevorzugt einstückig, aus demselben Material, insbesondere aus einem spritzgegossenen

Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat , hergestellt. Durch die einstückige Herstellung kann das Todvolumen zwischen der De- tektionskammer und dem restlichen flüssigkeitsleitenden System und dem Reaktionsgefäß und dem restlichen flüssigkeits- leitenden System minimiert werden. Dadurch kann das Verfahren insgesamt mit weniger Flüssigkeit, weniger Nukleinsäuren und weniger Reagenzien für die NSV durchgeführt werden. Das Verfahren ist dadurch empfindlicher und kostengünstiger durchzuführen. Weiterhin ist die einstückige Herstellung durch ein Spritzgussverfahren besonders kostengünstig. Der Einstückig- keit steht es nicht entgegen, wenn das flüssigkeitsleitende System eine zumindest teilweise offene Leitungen enthaltende Leitungsplatte und ein damit verbundenes, die offenen Leitungen verschließendes, Verschlussmittel umfasst. Das Ver- Schlussmittel kann z. B. eine Kunststoffplatte sein, die mit der Leitungsplatte durch Laserschweißen entlang der offenen Leitungen in der Leitungsplatte fest verbunden ist . Ein derartiges flüssigkeitsleitendes System ist einfach und kostengünstig herzustellen und weist eine hohe Dichtigkeit und Druckstabilität der Leitungen auf.

Alternativ kann das Reaktionsgefäß auch in Form einer Patrone bereitgestellt werden, welche vor Durchführung des Schritts lit. a) durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnahme- einheit flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht mit dem flüssigkeitsleitenden System verbunden wird. Die Aufnahmeeinheit kann beispielsweise durch einen Anschlussstutzen zum Einstecken eines Anschlussabschnitts der Patrone bereitgestellt werden. Durch die Ausbildung des Reaktionsgefäßes als Patrone kann in dem Reaktionsgefäß beispielsweise die Nukleinsäure oder ein für die NSV erforderliches Reagenz vorgelegt werden.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens wird mindestens ein zylinderförmiges Gefäß bereitgestellt, welches eine zweite oder weitere Flüssigkeit enthält und an das flüssigkeitsleitende System flüssigkeitsleitend angeschlossen ist, wobei das Gefäß zwischen einem Außenraum und einem Innenraum des Gefäßes einen im Gefäß verschiebbaren zweiten oder weiteren Kolben aufweist, wobei die zweite oder weitere Flüssigkeit durch Betätigen des zweiten oder weiteren Kolbens über das flüssigkeitsleitende System in das Reaktionsgefäß gedrückt wird. Bevorzugt ist es, wenn drei zylinderförmige

Gefäße bereitgestellt werden, welche jeweils eine Flüssigkeit und einen Kolben aufweisen, wobei je eine der Flüssigkeiten ein für die Durchführung einer PCR erforderliches Reagenz, insbesondere Polymerase, Primer und Puffer, enthält.

Besonders bevorzugt ist es, wenn das zylinderförmige Gefäß in Form einer Patrone bereitgestellt wird, welche vor Durchführung des Schritts lit. a) durch Aufstecken auf eine dafür vorgesehene Aufnahmeeinheit mit dem flüssigkeitsleitenden Sy- stem flüssigkeitsleitend und nach außen flüssigkeitsdicht verbunden wird. Dadurch können beispielsweise einheitliche Patronen mit Polymerase und Puffer bereitgestellt werden und für die jeweils nachzuweisende Nukleinsäure individuelle Patronen mit einem jeweils dazu erforderlichen Primerpaar. Be- vorzugt ist es, wenn das zylinderförmige Gefäß oder, im Falle der Bereitstellung mehrerer zylinderförmiger Gefäße, die zylinderförmigen Gefäße sämtliche für die Durchführung der NSV neben der Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien, insbesondere Polymerase, Primer und Puffer, enthält bzw. enthalten.

Bei einer Ausgestaltung des Verfahrens umfasst das flüssigkeitsleitende System eine Mehrzahl von in einer Ebene in einem plattenartigen Leitungselement angeordneten zweiten Flüssigkeitsleitungen und die Aufnahmeeinheit/Aufnahmeeinheiten

zum Aufstecken der Patrone/Patronen. Die Durchführung des Verfahrens mit einem derartigen flüssigkeitsleitenden System ist besonders günstig, weil die Spezifität des Verfahrens für bestimmte Nukleinsäuren durch das Aufstecken entsprechender Patronen beliebig gewählt werden kann. In den zweiten Flüssigkeitsleitungen können, insbesondere durch eine Membran bereitgestellte, Ventile vorgesehen sein. Die Membran ist so angeordnet und ausgebildet, dass durch Ausüben von Druck ein Durchgang durch die zweiten Flüssigkeitsleitungen abgesperrt werden kann. Der Druck kann beispielsweise durch einen von einer automatisierten Betätigungsvorrichtung betätigten auf die Membran drückenden Stößel ausgeübt werden.

Weiterhin kann das flüssigkeitsleitende System eine jeweils flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System in Verbindung stehende Probenaufbereitungskammer und Abfallkammer sowie einen flüssigkeitsleitend mit dem flüssigkeitsleitenden System in Verbindung stehenden Anschlussstutzen, insbesondere mit einem Profil zur Herstellung eines Bajonette- Verschlusses, aufweisen. An den Anschlussstutzen kann beispielsweise ein eine biologische Probe enthaltendes Rδhrchen, wie beispielsweise eine so genannte Monovette™, angeschlossen werden. Vorzugsweise sind die Probenaufbereitungskammern, die Abfallkammer, der Anschlussstutzen und das flüssigkeits- leitende System einstückig aus demselben Material, insbesondere aus spritzgegossenem Kunststoff, bevorzugt Polycarbonat, hergestellt. Der Einstückigkeit steht es nicht entgegen, wenn das Leitungselement eine zumindest teilweise offene Leitungen enthaltende Leitungsplatte und ein damit verbundenes, die of- fenen Leitungen verschließendes, Verschlussmittel umfasst .

Vorzugsweise werden beim erfindungsgemäßen Verfahren der erste und der zweite Kolben oder, im Falle des Bereitsteilens mehrerer zylinderförmiger Gefäße, der erste, der zweite und

der/die weitere/n Kolben von derselben Seite des plattenartigen Leitungselements her durch Vorschub betätigt. Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des Verfahrens werden die erste, zweite, eine ggf. vorhandene weitere Flüssigkeit und/oder; ei- ne Mischung daraus vor Schritt lit. b) zwischen dem zylinderförmigen Gefäß und einem ggf. vorhandenen weiteren Gefäß oder dem Reaktionsgefäß und dem zylinderförmigen Gefäß hin- und herbewegt . Dadurch kann eine besonders gute Durchmischung sämtlicher für die NSV erforderlicher Reagenzien und der nachzuweisenden Nukleinsäuren erreicht werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, bestehend aus einem zylinderförmigen Reaktionsgefäß, welches über eine an einem ersten Ende des Reaktionsgefäßes vorgesehene öffnung und eine in die öffnung mündende erste Flüssigkeitsleitung flüssigkeitsleitend an ein flüssigkeitsleitendes System angeschlossen ist, so dass das Reaktionsgefäß über das flüssigkeitsleitende System mit einer ersten, zweiten oder weiteren Flüssig- keit gefüllt und entleert werden kann. Das Reaktionsgefäß weist zwischen einem Außenraum und einem Innenraum des Reaktionsgefäßes einen im Reaktionsgefäß verschiebbaren ersten Kolben auf, wobei der erste Kolben derart ausgebildet ist, dass er durch die erste, zweite oder weitere Flüssigkeit be- wegt werden kann, wenn sie in das Reaktionsgefäß durch die öffnung eingeleitet wird oder bei einer Temperaturänderung ihr Volumen ändert oder Gas bildet, so dass dadurch das Volumen des Innenraums des Reaktionsgefäßes verändert wird. Es ist mindestens ein Gefäß vorgesehen, welches die zweite oder weitere Flüssigkeit enthält und an das flüssigkeitsleitende System flüssigkeitsleitend angeschlossen ist. Das Gefäß oder, im Falle des Vorhandenseins mehrerer Gefäße, die Gefäße enthält/enthalten für die Durchführung der NSV neben der Nukleinsäure erforderliche Reagenzien. Dabei können sämtliche

für die Durchführung der NSV neben der zu vervielfältigenden Nukleinsäure erforderlichen Reagenzien enthalten sein. Im Falle, dass bereits ein Teil der für die NSV erforderlichen Reagenzien im Reaktionsgefäß vorgelegt oder in der ersten Flüssigkeit enthalten ist, kann auch nur der restliche Teil der für die NSV erforderlichen Reagenzien enthalten sein.

Bevorzugt weist das Reaktionsgefäß eine starre, insbesondere aus Polycarbonat bestehende, Gefäßwand auf. Eine starre Ge- fäßwand verbessert die Dichtheit zwischen Kolben und Gefäßwand. Polycarbonat ermöglicht eine gute Wärmeübertragung von außen in das Reaktionsgefäß und ist darüber hinaus mit der Durchführung einer PCR kompatibel. Darüber hinaus gewährleistet die starre Gefäßwand eine präzise änderung des VoIu- mens des Innenraums des Reaktionsgefäßes und eine präzise

Flüssigkeitsbewegung durch eine definierte Bewegung des ersten Kolbens.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vor- richtung sind den Ansprüchen zu entnehmen.

Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternde Merkmale nicht nur in den jeweils angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombina- tionen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.

Nachfolgend wird eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 Eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens,

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung am Beginn des Befüllens des Reaktionsgefäßes mit einer Flüssigkeit,

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung nach dem Befüllen mit der Flüssigkeit,

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung beim Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens und

Fig. 5 eine Explosionszeichnung eines die erfindungsgemäße Vorrichtung enthaltenen flüssigkeitsleitenden Systems .

Die erfindungsgemäße Vorrichtung 10 besteht aus dem Reaktionsgefäß 12 und einem flüssigkeitsleitenden System 14, an welches das Reaktionsgefäß 12 über mindestens eine erste

Flüssigkeitsleitung 16 angeschlossen ist. Die Vorrichtung 10 weist einen beweglichen Verschluss in Form eines ersten Kolbens 18 auf. Weiterhin weist die Vorrichtung 10 einen durch einen entfernbaren Stab 20 gebildeten Anschlag 21 für den er- sten Kolben 18 auf. Das flüssigkeitsleitende System 14 weist eine verschließbare oder selbstschließende, hier als Ventil 22 ausgebildete, Eingangsöffnung auf. Statt des Ventils 22 könnte hier auch ein Septum oder ein Gummistopfen vorgesehen sein, welches/welcher mittels einer Kanüle durchstochen wer- den kann. Weiterhin weist die Vorrichtung 10 ein weiteres Ventil 24 auf.

In Fig. 2 ist der Beginn des Befüllens des Reaktionsgefäßes 12 mit der ersten Flüssigkeit 26 schematisch dargestellt. Die

erste Flüssigkeit 26 befindet sich zunächst in der Injektionsspritze 28. Die erste Flüssigkeit 26 wird mittels einer Kanüle durch das geöffnete Ventil 22 in das flüssigkeitsleitende System 14 injiziert. Da das weitere Ventil 24 geschlos- sen ist, wird die erste Flüssigkeit 26 über die erste Flüssigkeitsleitung 16 in das Reaktionsgefäß 12 gedrückt. Dabei wird der erste Kolben 18 angehoben. In das Reaktionsgefäß 12 gelangt ein genau definiertes Volumen, welches durch den durch den Stab 20 gebildeten Anschlag 21 für den ersten KoI- ben 18 vorgegeben ist. Nach dem Füllen des Reaktionsgefäßes 12 wird die Injektionsspritze 28 entfernt und das Ventil 22 in Schließstellung gebracht. Dieser Zustand ist in Fig. 3 dargestellt .

Fig. 4 zeigt die Vorrichtung 10 schematisch bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Stab 20 ist entfernt worden, damit sich der erste Kolben 18 frei bewegen kann. Die erste Flüssigkeit 26 wird, wie bei der Durchführung einer PCR üblich, erwärmt und wieder abgekühlt. Dabei ändert sich das Volumen der ersten Flüssigkeit 26. Diese Volumenänderung bewirkt eine Bewegung des ersten Kolbens 18. Dadurch wird die Volumenänderung der ersten Flüssigkeit 26 durch eine entsprechende Volumenänderung des Innenraums des Reaktionsgefäßes 12 ausgeglichen. Es ist auch möglich, den Stab 20 nur etwas zurückzuziehen, so dass durch eine Bewegung des ersten

Kolbens 18 die Volumenänderung der ersten Flüssigkeit 26 zwar ausgeglichen wird, die Bildung von Gasblasen durch einen weiterhin bestehenden durch den Stab 20 gebildeten Anschlag 21 für den ersten Kolben 18 jedoch vermieden oder zumindest ab- geschwächt wird.

Fig. 5 zeigt ein fluidisches System, welches einen Träger 30 umfasst. Auf der in der Zeichnung nicht dargestellten Unterseite des Trägers 30 verlaufen Flüssigkeitsleitungen ein-

schließlich der ersten Flüssigkeitsleitung 16, welche eine nach unten zumindest teilweise offene Seite aufweisen und durch die Verschlussplatte 32 verschlossen werden. Auf dem Träger 30 ist das Reaktionsgefäß 12 vorgesehen. Zum Anschlie- ßen von Patronen 34 mit Reagenzien enthaltenden weiteren

Flüssigkeiten oder Probenbehälter 36 ist ein Anschlusselement 38 vorgesehen. Das Anschlusselement 38 wird mit dem Träger 30 verbunden und der Chip 40, welcher zum Nachweis von im Reaktionsgefäß 12 amplifizierter Nukleinsäuren dient, wird mit den Rasthaken 42 verrastet. Das flüssigkeitsleitende System

14 weist eine Probenaufbereitungskammer 44, eine Abfallkammer 46, verschiedene Anschlussstutzen zum Aufstecken von Patronen 34 und Probenbehälter 36 sowie eine Reaktionskammer 12 auf. Das in Fig. 5 dargestellte flüssigkeitsleitende System 14 kann nach einem Aufstecken der Patronen 34 eine Einheit bilden, in der komplexe Vorgänge, wie z. B. ein AufSchluss von Zellen, eine Reinigung von Biomolekülen, eine Nukleinsäuream- plifikation und ein Nachweis von Biomolekülen mittels des Chips 40 erfolgen kann.

Bezugszeichenliste

10 Vorrichtung

12 Reaktionsgefäß 14 flüssigkeitsleitendes System

16 erste Flüssigkeitsleitung

18 erster Kolben

20 Stab

21 Anschlag 22 Ventil

24 weiteres Ventil

26 erste Flüssigkeit

28 Injektionsspritze

30 Träger 32 Verschlussplatte

34 Patrone

36 Probenbehälter

38 Anschlusselement

40 Chip 42 Rasthaken

44 Probenaufbereitungskammer

46 Abfallkammer