La presente invención se refiere a un método de identificación de células, basado en el uso de nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células y en Ia utilización de un método electrocatalítico para Ia detección de estas nanopartículas, así como su aplicación en el diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La detección de células, en particular células tumorales, ha sido un campo de gran interés en los últimos años. Este interés es debido al hecho de que Ia presencia de estas células en sangre periférica es indicativa de una enfermedad, así como de una baja efectividad en tratamientos terapéuticos.

Los métodos actuales utilizados para el diagnóstico, como por ejemplo citometría de flujo e histoquímica son poco precisos, caros, con tiempos de análisis largos y requieren de instrumentación muy avanzada. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos basados en Ia detección de células utilizando anticuerpos específicos.

Por otro lado, el uso de biosensores para Ia identificación de células se ha desarrollado para el seguimiento de los cambios morfológicos y fotoquímicos de células adheridas a estos sensores, usando un sistema de detección de impedancia eléctrica y el estudio de Ia respuesta celular a sustancias químicas, como por ejemplo Ia monitorización de Ia acidificación del medio en cultivos de células vivas.

En alguno de los métodos mencionados anteriormente, se requiere Ia inmovilización de las células en una superficie, como Ia superficie de un transductor electroquímico. Esta inmovilización se realiza mediante técnicas de adsorción, sandwich, de atrapado o uniones covalentes entre otras. Estas técnicas presentan el inconveniente que dificultan Ia fijación de las células en Ia superficie del transductor y su posterior análisis. Asimismo, Ia limitación básica de las técnicas de adsorción y atrapado pasivo es Ia inestabilidad de las células durante el uso continuado de éstas. Se ha demostrado que un aumento en Ia porosidad de Ia superficie favorece esta inmovilización celular. Las nanopartículas pueden utilizarse para inducir este aumento de Ia porosidad, formando interfases o matrices biomiméticas no tóxicas entre Ia célula y Ia superficie del transductor electroquímico. La débil interacción entre las nanopartículas y Ia superficie de las células aporta un ambiente similar a un sistema nativo y permite una mayor libertad de orientación de las biomoléculas. Estas matrices poliméricas están formadas por las nanopartículas y productos con una buena biocompatibilidad y alta capacidad gel ¡ficante como puede ser el chitosan. En estos casos concretos que existe un recubrimiento de Ia superficie del transductor, Ia detección de Ia presencia de las células se realiza mediante Ia correlación mostrada entre el incremento de Ia resistencia de transferencia de electrones y Ia concentración de las células en Ia superficie del transductor.

En el caso de las nanopartículas de oro (AuNPs), éstas presentan propiedades electroactivas que hacen que Ia detección electroquímica esté especialmente indicada, aprovechando así las ventajas intrínsecas de las técnicas electroquímicas (tales como polarografía diferencial de Pulso, voltamperometría de pulso diferencial, voltamperometría de onda cuadrada y potenciometría) como son su rapidez, sencillez y bajo coste. Habitualmente, esta detección se lleva a cabo indirectamente, disolviéndolas en una mezcla de ácido bromhídrico/bromo y detectando posteriormente Ia solución de Au3+ resultante. Últimamente se han desarrollado métodos de detección directa, basados en una oxidación electroquímica de las AuNPs a Au 3+ (cf. Pumera et al., "Direct voltammetric determination of gold nanoparticles using graphite- epoxy composite electrode", Electrochimica Acta 2005, vol. 50, pp 3702-3707) sobre Ia superficie del transductor electroquímico y posterior detección in-situ. Asimismo, existen otros métodos indirectos basados en el efecto catalítico que ejercen las AuNPs sobre Ia reducción de ciertos iones. En Ia mayoría de estos casos, Ia sensibilidad de Ia detección se aumenta por deposición química o electroquímica de plata en Ia superficie de Ia nanopartícula.

Aunque estos métodos catalíticos presentan una mayor sensibilidad que los métodos directos, todavía existen ciertos inconvenientes, como por ejemplo, tiempos de análisis prolongados debido a Ia complejidad de los procesos implicados en Ia detección, o el estricto control de las condiciones de reacción, como es el caso de las condiciones de deposición de Ia plata sobre Ia superficie de Ia AuNPs.

Así, de Io que se conoce en el estado de Ia técnica se desprende que todavía existe Ia necesidad de proporcionar métodos que aporten una mayor sensibilidad, exactitud y rapidez, y que al mismo tiempo, requieran instrumentación más sencilla y manejable, para mejorar Ia identificación de células y establecer más rápidamente el diagnóstico y/o el pronóstico de una enfermedad.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los investigadores han encontrado un método de identificación y cuantificación de células, basado en el uso de nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células a identificar y en Ia utilización de un método electrocatalítico que mide Ia corriente catódica generada en Ia evolución de hidrógeno por reducción de los iones de hidrógeno del medio, siendo Ia reducción catalizada por las nanopartículas de oro.

Este método es ventajoso porque permite Ia identificación y cuantificación de células mediante un método rápido y sensible, así como llevar a cabo el diagnóstico y/o de pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente susceptible de presentar Ia enfermedad y sus correspondientes kits de identificación, de diagnóstico y/o de pronóstico de manera rápida y precisa.

Así, un aspecto de Ia presente invención es proporcionar un método de identificación de células que comprende: (a) Poner en contacto un transductor electroquímico y las células a identificar en un medio de cultivo apropiado a una temperatura determinada y durante el tiempo necesario, para inmovilizar y hacer crecer las células en Ia superficie del transductor electroquímico; (b) Poner en contacto una suspensión de nanopartículas de oro con un anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de las proteínas de superficie de las células a identificar; (c) Poner en contacto las células inmovilizadas en Ia superficie del transductor electroquímico con las nanopartículas de oro 8 resultantes de Ia etapa (b), a una temperatura apropiada; (d) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado en un medio ácido, con Io cual se produce Ia reducción catalizada por las nanopartículas de oro 8, de los iones hidrógeno del medio a hidrógeno; (e) Medir Ia corriente catódica generada en Ia reducción de los iones hidrógeno; (f) Restar el valor neto de Ia corriente generada por el transductor electroquímico sin células inmovilizadas, del valor obtenido en el apartado (e) y correlacionar Ia diferencia de intensidad de corriente observada con Ia presencia o ausencia de nanopartículas de oro 8 unidas a las proteínas de superficie de las células a identificar.

Este método de identificación de células está basado en las propiedades catalíticas de las nanopartículas de oro para Ia generación de hidrógeno a partir de los iones hidrógeno. Las nanopartículas de oro en un medio ácido a un potencial adecuado, reducen catalíticamente los iones hidrógeno, generando hidrógeno y una corriente catalítica asociada. Esta corriente se mide cronoamperométricamente. La cronoamperometría consiste en someter a un potencial fijo al electrodo de trabajo y registrar Ia corriente generada a Io largo del tiempo. Para ello, se puede utilizar cualquier potenciostato- galvanostato que integre un sistema de medida y registro de corrientes. Posteriormente se correlaciona Ia diferencia de intensidad de corriente generada con Ia presencia o ausencia de las células de interés.

Un sistema potenciostato-galvanostato permite realizar pruebas electroquímicas, suministrando una diferencia de potencial controlada y registrando Ia corriente que circula a través de una celda electroquímica (modo Potenciostato) o suministrando una corriente controlada registrando Ia diferencia de potencial en las terminales de Ia celda (modo Galvanostato).

El método catalítico de generación de hidrógeno catalizado por partículas metálicas ha sido descrito anteriormente para Ia cuantificación de iones metálicos tales como complejos de platino (II) y oro (I). Así, por ejemplo, los complejos de oro se han utilizado en Ia detección de secuencias específicas de ADN (cf. M. Díaz-González et al., "DNA hybridization biosensors using polylysine modified SPCEs", Biosensors and bioelectronics 2008, vol. 23, pp. 1340-1346). Por otro lado, también se han utilizado nanopartículas de oro formando parte de inmunocomplejos de partículas magnéticas con anticuerpos específicos conjugados y se han cuantificado mediante detección electroquímica directa, aplicando Ia técnica de voltamperometría diferencial de pulso (cf. A. Ambrosi et al., "double-codified gold nanolabels for enhanced immunoanalysis", Analvtical Chemistrv 2007, vol. 79, pp. 5232-5240). Sin embargo, aunque el método catalítico de generación de hidrógeno para Ia identificación de complejos de oro es conocido, nunca se ha sugerido para Ia identificación y cuantificación de AuNPs ni su aplicación en Ia identificación de células.

Otra ventaja del método de identificación de células de Ia invención es que permite reducir el tiempo de análisis considerablemente, incluso hasta llegar a valores de 30 segundos. De este modo, se pueden llevar a cabo los métodos de diagnóstico y/o de pronóstico de Ia invención de manera más rápida y eficiente. Se ha observado que Ia corriente neta (diferencia entre Ia señal y el blanco) de catálisis es mucho más estable a tiempos cortos al utilizar las nanopartículas de oro conjugadas a anticuerpos específicos de Ia invención con respecto a los complejos de oro descritos en el estado de Ia técnica para el propósito de generar corriente.

Otra ventaja del método de identificación de células de Ia invención es que permite discriminar células que expresen determinadas proteínas de superficie, como las células HMy2 6, en presencia de diferentes porcentajes de células que expresen otras proteínas de superficie diferentes, como las células PC-3 7. La presencia de las células PC-3 7 no afecta a Ia señal analítica proveniente del reconocimiento de las células HMy2 6. Esta ventaja podría utilizarse para Ia discriminación de células tumorales en biopsias donde al menos 4000 células expresaran una proteína específica de superficie (cf. FIG. 7 apartado B).

Los términos HMY y HMy-2 (6) se han utilizado indistintamente y se refieren a Ia misma célula. De igual modo, los términos PC3 y PC-3 (7) también se han utilizado indistintamente y se refieren a Ia misma célula.

Una realización preferida es un método de identificación y cuantificación de células que comprende: (a) llevar a cabo el método de identificación de células de Ia presente invención, y (b) cuantificar Ia cantidad de células mediante Ia siguiente ecuación:

Número de células= 1000 [(corriente generada (μA) - 0.497)70.0641] El valor de la señal registrada aumenta proporcionalmente al aumentar el número de células inmovilizadas en Ia superficie del SPCE con anticuerpos específicos conjugados con las nanopartículas de oro 8. En una realización preferida, las células inmovilizadas son células tumorales y células inflamatorias.

La correlación entre el número de células y el valor de Ia señal registrada presenta una relación lineal en el rango de entre 10000 a 200000 células, con un coeficiente de correlación de 0.9955 y un límite de detección de 4000 células (cf. FIG.7 apartado A).

Por otro lado, este método permite Ia inmovilización y crecimiento de células en Ia superficie del transductor electroquímico, Io que también aumenta Ia sensibilidad y favorece Ia disminución del tiempo de análisis. La detección en el mismo medio donde se inmovilizan y/o se proliferan las células a identificar, facilita Ia disminución de etapas y como consecuencia Ia simplificación del método.

Como se ha mencionado anteriormente, el método de Ia invención utiliza un transductor electroquímico. Un transductor es un dispositivo capaz de transformar o convertir un determinado tipo de energía, en otra diferente de salida. Concretamente un transductor electroquímico es el dispositivo que mide propiedades químicas de las sustancias tales como pH y potenciales de oxidación por medios electroquímicos. En una realización preferida, el transductor electroquímico utilizado para Ia identificación de células es un electrodo de carbono serigrafiado ("screen-printed carbón electrode", SPCE) (cf. FIG.1 y FIG. 8 A).

En una realización particular, Ia inmovilización de las células en Ia superficie del transductor electroquímico se lleva a cabo a una temperatura adecuada, preferentemente a 37 ⁰ C.

En otra realización particular, Ia etapa (a) del método de identificación de células de Ia presente invención se lleva a cabo en una atmósfera que comprende un contenido de dióxido de carbono del 5%.

Generalmente, Ia incubación de Ia nanopartícula de oro con el anticuerpo específico o combinación de anticuerpos de las proteínas de superficie que corresponde a Ia etapa (b) del método de identificación de Ia invención, se realiza a 25 ⁰ C, preferentemente durante aproximadamente 20 minutos.

En una realización particular, un modo de aumentar Ia sensibilidad del método consiste en Ia amplificación de Ia señal analítica registrada llevando a cabo un inmunoensayo indirecto, utilizando anticuerpos secundarios. Estos anticuerpos secundarios se conjugan a las nanopartículas de oro y posteriormente se ponen en contacto con una solución de células a identificar conjugadas con anticuerpos primarios específicos frente a las proteínas de membrana. La amplificación en Ia señal analítica se debe al hecho de que a cada anticuerpo primario que se enlace a las proteínas de superficie celulares, se Ie enlazarán un gran número de anticuerpos secundarios marcados con nanopartícula.

Otra manera de aumentar Ia sensibilidad y selectividad del método es mediante el bloqueo o saturación de Ia superficie de Ia nanopartícula que se encuentra libre de anticuerpo. Para alcanzar esta saturación, se pueden utilizar diferentes técnicas, como por ejemplo aumentar Ia concentración de los mismos anticuerpos específicos o fragmentos de éstos en Ia etapa (b) o adicionar proteínas capaces de unirse inespecíficamente a Ia superficie libre de las nanopartículas.

En una realización preferida, las nanopartículas de oro 8 resultantes de Ia etapa (b), se ponen en contacto con una sustancia capaz de saturar Ia superficie de Ia nanopartícula libre de anticuerpo, como por ejemplo albúmina de suero bovino (BSA) o caseína. En una realización particular, se utiliza BSA a una temperatura de 25 ⁰ C durante 20 minutos.

En otra realización particular, Ia incubación de las células inmovilizadas en Ia superficie del transductor electroquímico con el anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos conjugados con Ia nanopartícula de oro 8 y con el BSA se realiza a 37 ⁰ C durante 30 minutos.

Generalmente, el pH del medio ácido de Ia etapa (d) del método de identificación de células es igual o inferior a 5. Preferentemente, el pH es igual o inferior a 3. En una realización preferida, el medio ácido se alcanza por adición de un ácido seleccionado entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido acético. En una realización más preferida, el ácido es ácido clorhídrico. En otra realización preferida, Ia muestra a identificar se somete a un potencial reductor comprendido entre -0.6 v y -1.4 v. Preferentemente, se aplica un potencial de pretratamiento de +1.35 v durante 1 minuto después de Ia etapa (c). En una realización particular, el potencial de reducción aplicado es de -1 v y el tiempo de aplicación 30 segundos.

En otra realización particular, Ia corriente catódica generada en Ia etapa (d) se mide cronoamperométricamente.

El método comprende en una etapa posterior comparar esta corriente generada por células que presentan las proteínas de superficie conjugadas con Ia nanopartícula, como por ejemplo, las células HMy2 (HLA-DR+) 6 como se ilustra en el ejemplo 7, con Ia corriente generada por Ia adición de una solución de ácido clorhídrico 1 M a un blanco sin células inmovilizadas o a un blanco de células inmovilizadas que no expresen Ia proteína de superficie conjugada con Ia nanopartícula de oro tal como células PC-3 7. Éstas últimas son células de Ia línea tumoral de cáncer de próstata que no expresan Ia proteína de superficie DR. Así, en este caso concreto, se puede correlacionar de manera rápida Ia diferencia de intensidad observada con Ia presencia o ausencia de nanopartículas de oro 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA unidas con Ia proteína de superficie de las células a identificar HMy2 (HLA- DR+) 6 (cf. FIG.2).

En otra realización preferida, las células se seleccionan entre células tumorales y células inflamatorias que expresen proteínas específicas en Ia superficie de Ia célula. Preferentemente células tumorales. Y en otra realización particular, las células tumorales son de Ia línea tumoral HMy2 6 que expresa en superficie moléculas de HLA-DR.

Otro aspecto de Ia presente invención es el uso del método de identificación de células para diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente susceptible de presentar Ia enfermedad, donde el anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de Ia etapa (b) reconocen marcadores específicos de Ia enfermedad a identificar. Una realización preferida es el uso del método de identificación y cuantificación de células para diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente susceptible de presentar Ia enfermedad, donde el anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de Ia etapa (b) reconocen marcadores específicos de Ia enfermedad a identificar.

Los marcadores específicos son sustancias producidas por las células a identificar o inducidas por el huésped ante Ia presencia de una enfermedad que permiten establecer el diagnóstico o pronóstico de una enfermedad, realizar su seguimiento o comprobar Ia eficacia de un tratamiento. En este caso concreto, los marcadores utilizados deben expresarse en Ia superficie de Ia célula.

En una realización preferida, las células a identificar se seleccionan entre células tumorales y células inflamatorias que expresen los marcadores específicos de Ia enfermedad en Ia superficie de Ia célula. Preferentemente, son células tumorales.

Otro aspecto de Ia presente invención es un kit de identificación de células, diagnóstico y/o de pronóstico de una enfermedad en muestras aisladas de un paciente, donde los medios necesarios para Ia identificación de células comprenden las nanopartículas de oro conjugadas con el anticuerpo o combinación de anticuerpos 8.

En una realización preferida, el kit además comprende un transductor electroquímico. En una realización particular, el transductor electroquímico es un SPCE.

Tal y como se ha comentado durante Ia presente invención, las nanopartículas de oro están conjugadas con un anticuerpo o combinación de anticuerpos específicos de Ia proteína de superficie de Ia célula a identificar.

Por el término "anticuerpo" se entiende un anticuerpo entero, incluyendo sin límite un anticuerpo quimérico, humanizado, recombinante, transgénico, injertado y de única cadena, y similares, o cualquier proteína de fusión, conjugada, fragmento, o derivados de éstos que contengan uno o más dominios que se unan selectivamente a proteínas específicas de superficie. El término anticuerpo incluye también una molécula de inmunoglobulina entera, un anticuerpo monoclonal, o un fragmento inmunológicamente efectivo de alguno de éstos.

Por un fragmento de anticuerpo se entiende un Fv, un disulfuro unido a fragmentos de Fv, scFv, Fab, F(ab'), o F(ab')2, que son bien conocidos en el estado de Ia técnica. Un fragmento de un anticuerpo representa cualquier parte del mismo con un tamaño adecuado y una conformación para unirse a las proteínas de superficie.

Por el término "Fv" se entiende un fragmento variable de un anticuerpo. Por el término "scFv" se entiende un fragmento variable de cadena sencilla que corresponde a Ia mitad de un Fab donde únicamente está presente Ia parte que aporta Ia especificidad. El scFv se obtiene por Ia unión de Ia parte variable de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo.

Por el término "Fab" se entiende un fragmento de un anticuerpo y de unión a un antígeno. Por el término "F(ab')" se entiende el fragmento de anticuerpo obtenido por Ia digestión de un anticuerpo entero con el enzima pepsina y por el término "F(ab')2" se entiende el fragmento de anticuerpo obtenido por Ia digestión de un anticuerpo entero con el enzima papaϊna.

También se considera parte de Ia invención el método de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro que comprende: (a) Poner en contacto una mezcla de nanopartículas de oro en un medio ácido, con Ia superficie de un transductor electroquímico; (b) Aplicar un potencial reductor durante un tiempo apropiado, con Io cual se produce Ia reducción catalizada por las nanopartículas de oro, de los iones hidrógeno del medio a hidrógeno; (c) Medir Ia corriente catódica generada en Ia reducción de los iones hidrógeno; (d) Restar el valor neto de Ia corriente generada por el transductor electroquímico en un medio ácido, del valor obtenido en el apartado (c) y correlacionar Ia diferencia de intensidad de corriente observada con Ia presencia o ausencia de nanopartículas de oro presentes en el medio y/o con Ia concentración de nanopartículas de oro presentes en el medio.

Una ventaja de este procedimiento de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro es que el efecto catalítico del oro en las nanopartículas se observa a potenciales menos negativos y se presenta de una manera más constante y reproducible, que cuando se utilizan complejos de oro. Ello conlleva un menor tiempo de análisis para conseguir una estabilización de Ia señal y por otro lado, evita el daño del electrodo. Además, debido al efecto catalítico de las nanopartículas, Ia corriente anódica generada es de mayor medida en función de Ia concentración de nanopartículas de oro (cf. FIG.6). La intensidad de Ia corriente registrada mediante cronoamperometría durante el estadio de electroreducción de los iones hidrógeno a un potencial fijo, es decir -1.0 v, se puede correlacionar con Ia presencia (cf. FIG 6A, derecha, curvas b'-g') o ausencia (cf. FIG 6A, derecha, curva a') de nanopartículas de oro en Ia superficie del SPCE. El incremento de Ia corriente catalítica registrada es proporcional al incremento de las concentraciones de nanopartículas de oro. En el caso de nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos, se observa una respuesta catalítica similar, (cf. FIG 6B, derecha).

En una realización preferida, Ia corriente catódica generada en Ia etapa (c) del método de identificación de nanopartículas de oro se mide a 200 segundos. El valor absoluto de Ia corriente generada a 200 segundos se selecciona como señal analítica para Ia cuantificación de las nanopartículas de oro 8.

En otra realización preferida, el número de nanopartículas de oro presentes en el medio se cuantifica mediante Ia siguiente ecuación: Número de nanopartículas = ant Ln [(corriente generada (μA) - 7.4554)/4.7399]x1.51 -10 ⁷ .

En una realización particular Ia cantidad de muestra a cuantificar que se deposita en Ia superficie del transductor electroquímico es de 25μl.

En una realización preferida el transductor electroquímico utilizado en Ia etapa (a) del método de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro es un electrodo de carbono serigrafiado.

En una realización preferida, el potencial de reducción aplicado está comprendido entre -0.6 v y -1.4 v y en una realización particular, este potencial es de -1 v y el tiempo de aplicación 30 segundos. Generalmente, el pH del medio ácido de Ia etapa (d) del método de identificación de células es igual o inferior a 5. Preferentemente, el pH es igual o inferior a 3. En una realización preferida, el medio ácido se alcanza por adición de un ácido seleccionado entre ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y ácido acético. En una realización más preferida, el ácido es ácido clorhídrico.

En otra realización preferida, el método de identificación y cuantificación de nanopartículas de oro además comprende aplicar un potencial de pretratamiento después de llevar a cabo Ia etapa (a). En una realización particular, este potencial es +1.35 v y se aplica durante 1 minuto.

En otra realización preferida, Ia corriente catódica generada en Ia etapa (c) se mide cronoamperométricamente.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa un SPCE, utilizado como transductor electroquímico que comprende tres electrodos: 1 el electrodo de referencia de plata, 2 el electrodo de trabajo de carbono de 4 mm de diámetro para un volumen de muestra máximo de 50 μl y 3 el electrodo auxiliar. También se representa Ia capa aislante 4 y los contactos eléctricos 5.

La Figura 2 representa en el apartado A un ejemplo del método de identificación de células HMY 6 utilizando células PC3 7 como blanco y las nanopartículas 8 conjugadas con el anticuerpo monoclonal anti-humano de ratón (anti-DR mAb) y BSA . En el apartado B se representa los cronoamperogramas obtenidos por aplicación de un potencial de -1.40 v durante 5 minutos por adición de 50 μl de una solución de HCI 1 M, donde 9 representa un blanco del SPCE con ácido clorhídrico. Las unidades del cronoamperograma se representan a continuación: t es tiempo, s son segundos, i es intensidad de corriente y μA son microampehos.

La Figura 3 representa un ejemplo de un voltamperograma cíclico registrado desde +1.35 v hasta -1.40 v a una velocidad de barrido de 50 mv/s, después de adicionar 50 μl de una solución de HCI 1 M directamente en Ia superficie del SPCE (curva blanco IQ) o sobre Ia muestra de nanopartícula 8 conjugada con anti-DR mAb (curva H) y BSA. Las unidades del voltamperograma se representan a continuación: E es potencial, v son voltios, i es intensidad de corriente y μA son microamperios.

La Figura 4 representa imágenes de microscopio de líneas celulares de tumor humano B HMY 6 y de líneas celulares de tumor humano de próstata PC3 7 creciendo en cámara (parte superior) o en placa de petri (parte inferior).

La Figura 5 representa fotografías del sistema de incubación utilizando placa de 8 pocilios en cámara (A, B y C) o placa de Petri (D).

La Figura 6 representa en el apartado A izquierda ejemplos de voltamperogramas cíclicos registrados desde +1.35 v hasta -1.40 v a una velocidad de barrido de 50 mv/s, después de Ia adición de una solución de HCI 1 M sobre Ia superficie del SPCE (curva blanco a) o sobre concentraciones crecientes de nanopartículas 8 en Ia superficie del SPCE (concentración de nanopartículas de 0.96pM en curva b; 4.8 pM en curva c; 24 pM en curva d; 12OpM en curva e; 60OpM en curva f y 3nM en curva g).

En el apartado B izquierdo se representan ejemplos de voltamperogramas cíclicos registrados en las condiciones mencionadas en el apartado A, después de Ia adición de una solución de HCI 1 M sobre Ia superficie del

SPCE (curva blanco a) o sobre una solución de nanopartículas 8 conjugadas con anticuerpos específicos anti-DR mAb (curva b).

En los apartados A y B de Ia derecha se representan los cronoamperogramas registrados aplicando un potencial de -1.0Ov durante 5 minutos sobre Ia superficie del SPCE (apartado A derecha curva a'), concentraciones crecientes de una solución de nanopartícula (apartado A derecha curvas b'-g') y en una solución de nanopartícula conjugada con anticuerpos específicos anti-DR mAb (apartado B derecha curva b').

Las unidades se representan a continuación: E es potencial, v son voltios, i es intensidad de corriente, μA son microamperios, t es tiempo, s son segundos, pM son picomoles y nM son nanomoles.

La Figura 7 apartado A representa el efecto sobre las señales electrocatalíticas del número de células que expresan Ia proteína de superficie HLA DR, después de Ia incubación con nanopartículas conjugadas con anticuerpos específicos anti-DR mAb (αDR). El apartado B representa señales electrocatalíticas obtenidas con células HMy2 6 después de Ia incubación con nanopartículas de oro conjugadas con anticuerpos específicos anti-DR mAb (αDR) en presencia de células PC-3 7 a diferentes porcentajes, donde el porcentaje de 100% corresponde a 200000 células. Las unidades se representan a continuación: c es corriente, μA son microamperios, BL es el blanco y en son número de células.

La Figura 8 representa en el apartado A Ia hoja con 45 SPCEs obtenida tras Ia fabricación con Ia máquina de serigrafiado (izquierdo) y detalle de uno de los SPCEs (derecha). En el apartado B se muestra el montaje experimental para Ia realización de las medidas electroquímicas con el sistema de cámara: ocho SPCEs se montan en el sistema de cámara y se conectan al potenciostato secuencialmente. En el apartado C se muestra un detalle del sistema de ocho cámaras en donde se introducen los ocho SPCEs para el posterior cultivo celular.

La Figura 9 representa imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) del transductor electroquímico (SPCE) (izquierda) y detalles de las células HMy2 6 (apartado A) y PC-3 7 (apartado B) que han crecido sobre su superficie. Las imágenes que aparecen en las esquinas superiores derechas corresponden a células que han crecido en Ia superficie plástica de los SPCEs. Se comprueba que las células han crecido sobre el carbono y que su morfología no se ve afectada sobre este material. Las unidades se representan a a continuación: mm es milímetros y μm es micrómetros.

La Figura 10 apartado A representa el estudio comparativo de Ia respuesta electroquímica obtenida para las líneas celulares HMy2 6 y PC-3 7 frente a los diferentes anticuerpos probados. Los anticuerpos αlgM y αDR son los que se han conjugado con nanopartícula de oro. Las tres primeras columnas corresponden al blanco y a ensayos directos y las dos últimas columnas corresponden a los ensayos indirectos. El apartado B representa Ia respuesta obtenida por citometría de flujo para las dos líneas celulares frente a los anticuerpos utilizados. Se corrobora Ia especificad que se había obtenido con el método electrocatalítico. Las unidades se representan a continuación: c es corriente, μA son microamperios, BL es el blanco, Ab son los anticuerpos ensayados y fi / % es porcentaje de intensidad de fluorescencia.

EJEMPLOS

Consideraciones generales

Trihidrato de Tetracloroaurato (III) de hidrógeno (HAuCI ₄ -3H ₂ O, 99.9%) y citrato trisódico se compraron a Sigma-Aldrich. Todos los reactivos tampones y otros productos químicos inorgánicos fueron suministrados por Sigma, Aldrich o Fluka, salvo que se indique Io contrario. Todos los productos químicos se utilizaron tal y como se recibieron y todas las soluciones acuosas se prepararon con agua doblemente destilada. El tampón de solución fosfato (PBS) consiste en 0.01 M fosfato salino tamponado, 0.137 M NaCI y 0.003 M KCI (pH 7.4). El ácido clorhídrico (HCI) es calidad de análisis. Sus soluciones se prepararon con agua ultra-pura. Las líneas de células tumorales utilizadas en este estudio fueron HMy2 6 (HLA-DR+) y PC-3 7 (HLA-DR-). Todas las células se cultivaron en el medio RPMI 1640 (Gibco, Life technologies, Grand Island, Escocia) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS) (PAA, Linz, Austria), penicilina (100 U/ mi) y glutamina (2 mM) (Gibco) a 37 ⁰ C en una atmósfera humidificada con un contenido de CO ₂ del 5%. Las mediciones de Ia expresión de HLA-DR se llevaron a cabo utilizando un anticuerpo monoclonal HLA-DR antihumano de ratón (mAb) (Immunotech, Marsella, Francia) y BH1 , un anticuerpo IgM mAb humano que reconoce moléculas de HLA clase Il humano en Ia superficie de monocitos humanos, linfocitos B, líneas de células tumorales B (HMy2, Raji y Dausi) y células tumorales de pacientes que sufren de neoplasias hematológicas. Como control de reconocimiento positivo de las células testadas, se utiliza mAb humanos 32.4. En el caso de BH1 y 32.4 mAbs, anticuerpos policlonales IgM antihumanos de conejo conjugados con isotiocianato de fluoresceina (FITC) (DakoCytomation, España) se usan como anticuerpos secundarios, permitiendo contrastar el método electroquímico con medidas por citometría de flujo.

Las células se visualizaron con microscopios invertidos y directos (Olympus 1X50 y BX51 respectivamente, Olympus Optical. Tokyo, Japón) y las fotografías se tomaron con una cámara Olympus DP71.

El transductor electroquímico utilizado para el crecimiento in-situ de las células se construyó por los investigadores y era un SPCE. El sustrato utilizado es una hoja de poliéster transparente (Austostat HT5 de Ia empresa McDermid Autotype) y el tamaño total del sensor era 29 mm x 6.7 mm (cf. FIG.1 ).

La corriente generada se registró mediante cronoamperometría, utilizando un potenciostato-galvanostato Ivium Compactstat (Ivium Technologies, Holanda).

Ejemplo 1 : Voltamperogramas cíclicos en HCI 1 M.

Se añadieron 50 μl de HCI 1 M en Ia superficie del SPCE y se registró un voltamperograma cíclico desde +1.35 v hasta -1.40 v, a una velocidad de barrido de 50 mv/s, obteniendo una curva del blanco (curva 10, FIG. 3 y curva a, FIG. 6A). Por otro lado, se mezclaron 25 μl de una solución de HCI 2 M con 25 μl de una solución de las AuNPs a concentraciones crecientes. Las mezclas resultantes se depositaron en las superficies de otros SPCEs. De nuevo se registraron voltamperogramas cíclicos desde +1.35 v hasta -1.40 v, a una velocidad de barrido de 50 mv/s, obteniendo las curvas IJ., FIG. 3 y curvas b-g, FIG. 6A, en donde se observa un desplazamiento de potencial respecto a Ia curva del blanco que corresponde al efecto catalítico de las nanopartículas y que aumenta con Ia concentración de éstas.

Los mismos experimentos se realizaron para AuNPs 8 conjugadas con anti- DR mAb y BSA, observándose de nuevo un desplazamiento de potenciales entre el blanco de HCI 1 M (curva IQ, FIG. 3 y curva a, FIG. 6B) y Ia disolución de AuNPs 8_conjugadas con anticuerpo (curva V\_, FIG. 3 y curva b, FIG. 6B). Ejemplo 2: incubación de células en frasco.

Las líneas celulares HMy2 6 y PC-3 7 se cultivaron en un medio de cultivo a 37 ⁰ C en una atmósfera humidificada con un contenido de CO2 del 5% durante 48 h en un frasco de cultivo de tejidos (Falcon, Belcton Dickinson and Company Franklin Lakes, NJ, USA).

Ejemplo 3: Incubación de células en Ia superficie del SPCE en cámara.

El electrodo de trabajo 2 se introdujo dentro de una Lab-Tek™ con placas de 8 pocilios (Nunc, Thermo Fisher scientific), después de eliminar Ia junta, se fijó con el medio de cultivo mounting. A continuación, se añadieron en cada pocilio 200.000 células en 700 μl del medio de cultivo y se incubaron a 37 ⁰ C en una atmósfera humidificada con un contenido de CO2 del 5% durante 48 h. (cf. FIG. 4 (parte superior) y 5 (A, B y C) y FIG. 8 (B ₁ C). En Ia figura 9 se observan las dos líneas celulares crecidas sobre Ia superficie del SPCE.

Ejemplo 4: Incubación de células en Ia superficie del SPCE en placa de Petri.

Se introdujeron los SPCE en las placas de petri Corning®, DxH35 mm x 10 mm, sin tratar (SIGMA-ALDRICH). A continuación se añadieron 200.000 células en 3 mi de medio de cultivo y se incubaron a 37 ⁰ C en una atmósfera humidificada con un contenido de CO2 del 5% durante 48 h (cf. FIG. 4 (parte inferior) y 5 D).

Ejemplo 5: Síntesis de las nanopartículas de oro y su conjugación con anticuerpos específicos.

Las nanopartículas se prepararon por reducción del tetracloroaurato (III) de hidrógeno con citrato trisódico, según método descrito por Turkevich (cf J. Turkevich et al., Faradav Discussion of the Chemical Society, 1951 , vol. 11 , pp. 55-75). A una solución de 200 mi de HAuCI ₄ 0.01 % en ebullición con agitación vigorosa, se adicionaron rápidamente 5 mi de una solución de citrato trisódico. Cuando Ia mezcla de reacción se volvió de color rojo intenso, indicando Ia formación de las nanopartículas de oro, Ia solución se enfrió manteniendo Ia agitación. Se mezclaron 2 mi de Ia suspensión de nanopartículas de oro con 100 μl (de 100 μg/ mi) de anti-DR mAb y se incubaron a 25 ⁰ C durante 20 minutos. A continuación se realizó una etapa de bloqueo con 150 μl (de 1 mg/ mi) de albúmina de suero bovino (BSA) manteniendo Ia temperatura a 25 ⁰ C durante 20 minutos. Finalmente, Ia mezcla resultante se centrifugó a 14.000 rpm durante 20 minutos y las nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA se reconstituyeron con PBS.

Para los ensayos indirectos, se conjugaron de un modo similar las nanopartículas con anticuerpos anti-lgM (αlgM) y con BSA.

Ejemplo 6: A. Incubación de células con las nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb v BSA.

Una vez las células habían crecido en Ia superficie del SPCE, se lavaron con PBS. A continuación se adicionaron 50 μl de una solución de nanopartículas 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA sobre el electrodo de trabajo 2 y se mantuvieron durante 30 minutos a 37 ⁰ C.

B. Incubación de células con las nanopartículas 8 conjugadas con αlgM y BSA.

Una vez las células se habían incubado con los anticuerpos primarios (BH1 o 32.4 mAbs) durante 30 minutos, se lavaron con PBS. A continuación se incubó con una solución de nanopartículas 8 conjugadas con αlgM y BSA durante 30 minutos.

Ejemplo 7: Señal analítica basada en Ia generación de hidrógeno catalizada por Ia nanopartícula 8 conjugadas con anti-DR mAb y BSA y, registro de Ia corriente generada.

Las células se lavaron con PBS y a continuación se adicionaron 50 μl de una solución de HCI 1 M sobre Ia superficie de los 3 electrodos I ₁ 2 y 3. Después, el SPCE se conectó al potenciostato (cf. FIG. 8 B ₁ C) y el electrodo de trabajo 2 se sometió a un primer potencial de +1.35 v durante 1 minuto y luego se aplicó un segundo potencial de -1 v durante 300 segundos, registrándose Ia corriente catódica generada. Esta corriente generada se registra por cronoamperometría. Para ello, se puede utilizar cualquier potenciostato-galvanostato que integre un sistema de medida y registro de corrientes. En este caso, se utiliza un Ivium Compactstat.

Aunque en este ejemplo el potencial de reducción se aplica durante 300 segundos, el tiempo de aplicación podría reducirse hasta 30 segundos, ya que a partir de 30 segundos Ia corriente catódica generada por Ia reducción de los iones hidrógeno se encuentra estabilizada en el tiempo, tal y como se observa en Ia figura 2B.

Ejemplo 8. Señal analítica basada en Ia generación de hidrógeno catalizada por Ia nanopartícula conjugadas con anti-lgM y BSA y, registro de Ia corriente generada (ensayo indirecto).

Se realizó una primera incubación de las células con anticuerpos primarios (BH1 ó 32.4) de un modo similar al detallado en el ejemplo 7. Posteriormente se lavó con PBS y se realizó una segunda incubación en idénticas condiciones con nanopartículas conjugadas con anti-lgM y BSA. El registro de Ia señal analítica se llevó a cabo siguiendo el mismo procedimiento detallado en el ejemplo 7. Las respuestas electrocatalíticas se muestran en Ia Figura 10 A.

REFERENCIAS MENCIONADAS EN LA SOLICITUD

1. Pumera et al., "Direct voltammetric determination of gold nanoparticles using graphite-epoxy composite electrode", Electrochimica Acta, 2005, vol. 50, p. 3702-3707. 2. M. Díaz-González et al., "DNA hybridization biosensors using polylysine modified SPCEs", Biosensors and bioelectronics, 2008, vol. 23, p. 1340-1346.

3. A. Ambrosi et al., "double-codified gold nanolabels for enhanced immunoanalysis", Analvtical Chemistrv, 2007, vol. 79, p. 5232-5240.

4. J. Turkevich et al., Faradav Discussion of the Chemical Society, 1951 , vol. 11 , p. 55-75.