L'état de la technique est constitue de documents qui ne traitent que d'une seule des trois différentes techniques présentées ci-dessus.

En ce qui concerne la sonication, la demanderesse a d(C1-C6)pos(C1-C6) une demande de brevet FR99/04289 qui décrit un procédé d'activation de la sonotrode qui comporte les caractéristiques suivantes : -durée de la sonication 10 à 15 minutes, - rapport cyclique compris entre 40 et 60 % et pr(C1-C6)f(C1-C6)rentiellement 50 %, et -puissance 10 a 30 W.

Cette sonication est efficace pour la lyse des micro-organismes qu'il s'agisse de levures ou de bactéries. Pourtant une optimisation des résultats est possible comme le prouve la présente invention. Cette constatation est également vraie pour d'autres documents de l'état de la technique tels que EP-A-0.337.690 qui ne décrit qu'une bactérie, c'est-à-dire Listeria innocua.

Le vortex mecanique a deja ete decrit dans une precedente demande de brevet de la demanderesse. n s'agit de la demande WO-A-99/15621 qui a trait à un procédé pour lyser un échantillon biologique, comprenant au moins un micro-organisme soit de type bactérie, soit de type levure. Les procédés de Iyse different par le diamètre des billes qui est compris entre 90 et 150 µm, pr(C1-C6)f(C1-C6)rentiellement de 100 µm, pour les bact(C1-C6)ries, et qui est de 500 µm pour les levures. A noter que dans cette demande de brevet, des m(C1-C6)langes de billes de zirconium de 100, um et de 500, um de diametre ont ete utilises, avec un ratio de 50 % pour chaque type de billes (voir figures 1 et 2 protocole G), afin de lyser des bactéries Staphylococcus epidermidis.

Les résultats obtenus avec ces ratios de billes de différents diamètre, sans être mauvais, sont inférieurs à :

-ceux obtenus avec des billes de verre de 90 à 150 um de diamètre (protocole C), -ceux obtenus avec des billes de verre de 100 um de diamètre (protocole D), ou -ceux obtenus avec des billes de zirconium de 100 am de diamètre (protocole E).

La demanderesse a déjà décrit et revendiqué un dispositif et un procédé de Iyse de micro-organismes impliquant un vortex magnétique. Ainsi dans la demande de brevet <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> WO-A-00/05338, le dispositif de Iyse comprend au moins deux types de moyen de broyage de dimensions différentes : -au moins un moyen magnétique de grande dimension, qui est asservi au mouvement d'un champ magnétique, et -au moins un moyen de petite dimension, qui est mis en mouvement par le moyen de broyage de grande dimension. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P>Le moyen de broyage de grande dimension est constitui par au moins une bille de grand diamètre, et, le moyen de broyage de petite dimension est constitué d'au moins une bille de petit diamètre. Le rapport existant entre les dimensions du moyen de broyage de petite dimension et les dimensions du moyen de broyage de grande dimension esí compris eníre 1/10 et 1/100, préférentiellement entre 1/30 et 1/60 et, plus précisément, ce rapport est de 1/40.

Toutefois, la demanderesse a continué ces travaux dans ce domaine technique et a mis en évidence des protocoles de lyse de n'importe quels micro-organismes, que ceux-ci soient des procaryotes (bactéries) ou des eucaryotes (levures) ou un mélange d'eucaryotes et de procaryotes. Ces protocoles, dits universels, permettent une efficacité aussi importante que les lyses associées uniquement aux bactéries ou uniquement aux levures, telles que développées dans l'état de la technique ci-dessus. De manière surprenante et dans certains cas, il s'avère que ces protocoles universels sont souvent plus efficaces que les lyses de l'état de la technique.

A cet effet, la présente invention concerne un procédé de lyse cellulaire de procaryotes ou d'eucaryotes ou de lyse cellulaire simultanée de procaryotes et d'eucaryotes qui consiste à adapter au moins trois des paramètres suivants : -un pourcentage en masse de billes actives de petit diamètre par rapport à des billes actives de grand diamètre inférieur ou égal à 50 %, et/ou

-une masse totale de billes lysantes, comprenant un mélange ou pas de billes de petit diamètre et/ou de billes de grand diamètre, compris entre 50 et 100 % par rapport à la masse totale de l'échantillon biologique traité, et/ou -une durée de la lyse comprise entre 10 et 20 mn, et/ou -un nombre de billes de verre non lysantes mais d'entraînement des billes lysantes inférieur à sept (7), et/ou -un nombre de billes de fer non lysantes mais d'entraînement des billes lysantes compris entre cinq (5) et quinze (15), en fonction de la technique utilisée : -la sonication, -le vortex mécanique, ou -le vortex magnétique.

Selon une variante préférentielle de réalisation, les billes lysantes sont en verre.

Selon une autre variante préférentielle de réalisation, les billes lysantes de petit diamètre sont d'un diamètre compris entre 90 et 150 llm et préférentiellement d'environ 100, um, et les billes lysantes de grand diamètre sont d'un diamètre compris entre 400 et 600 llm et préférentiellement d'environ 500 um.

Si l'on utilise la technique de sonication, le procédé consiste à effectuer une lyse selon les paramètres suivants : -une durée de la lyse de 9 à 20 mn, préférentiellement de 12 à 18 mn et encore plus préférentiellement de 15 mn, -un pourcentage de billes de 100 um de diamètre compris entre 10 à 50 % préférentiellement entre 20 et 30 % et encore plus préférentiellement de 20 %, et -une masse totale de billes lysantes comprise entre 50 à 100 % de la masse totale de l'échantillon biologique traité, préférentiellement compris entre 75 et 90 % et préférentiellement entre 80 et 85 %.

Si l'on utilise la technique de vortex mécanique, le procédé consiste à effectuer une lyse selon les paramètres suivants : -une durée de la lyse de 11 à 20 mn, préférentiellement de 15 à 20 mn et encore plus préférentiellement de 20 mn, -un pourcentage de billes de 100 llm de diamètre inférieur à 50 %, préférentiellement inférieure à 30 %, et encore plus préférentiellement de 20 %,

-une masse totale de billes lysantes supérieure à 60 %, préférentiellement supérieure à 80 %, et encore plus préférentiellement de 100 % de la masse totale de l'échantillon biologique traité, et -un nombre de billes de verre inférieur à sept (7) préférentiellement égal à un (1).

Si l'on utilise la technique de vortex magnétique, le procédé consiste à effectuer une lyse selon les paramètres suivants : -une durée de la lyse de 12 à 20 mn, préférentiellement de 15 à 20 mn et encore plus préférentiellement de 20 mn, -une masse totale de billes lysantes de 100 um supérieure à 80 % et préférentiellement de 100 % de la masse totale de l'échantillon biologique traité, et -un nombre de billes de fer compris entre cinq (5) à quinze (15) billes, préférentiellement de dix (10) billes de fer.

Les figures ci-jointes sont données à titre d'exemple explicatif et n'ont aucun caractère limitatif. Elles permettront de mieux comprendre l'invention.

La figure 1 représente un exemple de courbes d'isoréponses dans le cadre d'une approche MRE.

La figure 2 représente des courbes d'isoréponses dans le cadre de la lyse par sonication de levures.

La figure 3 représente des courbes d'isoréponses dans le cadre de la lyse par sonication de bactéries.

La figure 4 représente des courbes d'isoréponses dans le cadre de la lyse par vortex mécanique de levures.

Enfin, la figure 5 représente des courbes d'isoréponses dans le cadre de la lyse par vortex mécanique de bactéries.

I. Matériel et méthodes : Comme exposé dans l'état de la technique ci-dessus, trois protocoles sont connus.

Il s'agit de la sonication, du vortex mécanique et du vortex magnétique. Chacun d'eux a été défini pour les bactéries et pour les levures de façon indépendante. Les paramètres ainsi définis sont présentés dans le tableau 1, ils sont en rapport avec des paramètres jugés corrects de l'état de la technique. A noter que le volume des échantillons biologiques traités, que ce soit avec les protocoles de référence ou avec les protocoles selon la présente invention, est de 600 jus. Protocole Sonic ation Vortex mécanique Vortex magnétique Facteur bactéries levures bactéries levures bactéries levures Diamètre(pm) 100 500 100 500 100 500 et quantité (g) et et et et et et de billes 0,4 0,3 0,6 0,5 0,6 0,5 actives Nombre billes de verre (3 mm//6// de diamètre) Nombre billes defer (2mm//10 10 de diamètre) Durée de lyse 15 mn 2 mn 12 mn 10 mn 12 mn

Tableau 1 : Protocoles de lyse selon l'état de la technique appelés protocoles de référence Les billes actives dites « lysantes » sont constituées des billes qui permettent la lyse des micro-organismes. Il s'agit des billes de petits diamètres (100 ou 500 llm). I1 convient de noter que les billes de verre de 100 um de diamètre ont été obtenues chez Masteau et Lamarié, Paris, France, sous la référence Via 1, et que les billes de verre de 500 am de diamètre proviennent de la société Sigma, Saint Louis, Missouri, Etats-Unis d'Amérique, sous la référence 8772.

Par contre, les autres billes de verre (3 mm de diamètre) et de fer (2 mm de diamètre), utilisées pour les vortex mécanique et magnétique, ont pour objectif de mettre en mouvement les billes actives lors d'une agitation. Elles sont appelées billes passives ou actives indirectement, via les billes lysantes ci-dessus définies. Les billes de verre de 3 mm de diamètre ont été achetées chez Prolabo (Fontenay-sous-Bois, France) sous la référence 00680032, et c'est Bennk Elektronic (Norderstadt, Allemagne) qui a fourni les billes de fer de 2 mm de diamètre, sous la référence 050-330.

A noter qu'il est possible d'utiliser des billes de fer recouvertes d'une matière biologiquement inerte, telle que plastique ou verre, afin d'isoler le fer et d'éviter son relargage qui est souvent incompatible avec les opérations d'amplification ultérieures d'acides nucléiques libérés par la lyse.

Les résultats obtenus avec les procédés selon l'invention seront par la suite comparés avec les résultats obtenus par l'intermédiaire des procédés de référence ci- dessus décrits.

L'intérêt d'un protocole universel de lyse est de permettre la détection, après lyse, de micro-organismes responsables d'infections de fluides biologiques stériles (liquide céphalo-rachidien, urine et sang), sans savoir à priori s'il s'agit de micro-organismes procaryotes (bactéries) ou eucaryotes (levures).

A) Méthologie de la Recherche Expérimentale : Une approche par la Méthologie de-la Recherche Expérimentale (MRE) a été utilisée pour la sonication et le vortex mécanique. Une approche expérimentale a été utilisée pour le vortex magnétique.

L'étude MRE comprend deux étapes. Dans un premier temps et pour différents facteurs, une zone optimale propre aux levures et une zone optimale propre aux bactéries ont été définies. Cette zone optimale est définie comme celle donnant une efficacité de lyse équivalente ou supérieure à celle obtenue avec le protocole de référence.

Dans un deuxième temps et si possible, une zone dite de compromis, correspondant à l'intersection de la zone optimale bactérie avec la zone optimale levures, est définie.

La MRE est une approche mathématique qui consiste à modéliser un phénomène biologique, en l'occurrence la lyse, par une équation mathématique (souvent une équation mathématique polynomiale du second degré) du type : R=aX+bY+cX2+dY2+eXY+f, où R est la réponse expérimentale traduisant l'effficacité de la lyse, X et Y sont des facteurs influençant la lyse comme la durée de la lyse et la taille des billes, et a, b, c, d, e et f sont des coefficients.

Cette équation peut-être représentée sous forme de courbes dites d'isoréponses permettant de visualiser comment varie la réponse en fonction des valeurs prises par les différents facteurs. La figure 1 donne un. exemple de courbes d'isoréponses.

Selon cette figure 1, deux facteurs sont étudiés. Il s'agit du poids total (X1) de billes lysantes de 100 et 500 u. m de diamètre et le pourcentage en masse de billes de 100 pm de diamètre par rapport au total de billes lysantes de 100 et 500 llm de diamètre (X2) ;

la réponse étudiée correspond à un nombre d'unités de fluorescence RLU, c'est-à-dire Relative Light Unit. Les courbes représentées relient les points du domaine expérimental donnant une réponse identique. On voit sur ce graphe que la réponse maximale obtenue dans le domaine expérimental est de 900 000 unités de fluorescence, et pour obtenir cette réponse, il faut que Xl soit compris entre 0,2 et 0,4 et X2 soit proche de 20.

L'obtention du modèle mathématique nécessite la réalisation de plusieurs expériences définies par des matrices dites « matrices composites », bien décrites dans les documents suivants : Box and Wilson (1951) « On the experimental atteignement of optimal conditions » Journal of the Royal Statistical Society, B, 13, p. 1-45.

Feneuille, Mathieu, Phan-Tan-Lun (1978) « Méthodologie de la Recherche Expérimentale. Introduction, outils mathématiques, études des surfaces de réponse, matrices de mélanges ; méthodes du simplex ; Université d'Aix-Marseille 3- Publication du LMRE.

B) Réponse étudiée : L'efficacité de la lyse est quantifiée en mesurant la quantité d'ARN 16S et 23S (pour les bactéries) et d'ARN ribosomal (pour les levures) libérée par hybridation avec une sonde chemiluminescente. Il s'agit d'une mesure HPA (Hybridization Protection Assay). Il s'agit d'une technique de la société Gen-Probe bien décrite dans l'article de Norman C. Nelson, Mark A. Reynolds et Lyle J. Arnold Jr : « Detection of Acridinium Esters by Chemiluminescence » Nonisotropic probing, Blotting and Sequencing (1995) 391-428. Des informations sur cette technique peuvent également être trouvées dans le brevet US-A-6,004,745.

On a utilisé deux sondes l'une développée par Gen Probe et commercialisée sous le nom Mycoplasma Tissue Culture NI (MTC-NI), voir leur prospectus : 104574 Revendication. A. Comme il est précisé en page 3 dans le chapitre « Performance Characteristics », cette sonde peut détecter une large variété de micro-organismes à Gram négatif et à Gram positif, sans toutefois croiser avec des cibles eucaryotes.

Une seconde sonde pour les levures a été utilisée. Il est ainsi possible d'utiliser une sonde telle que celles décrites par :

-J. F. Hinder, S. Kozen, D. A. Bruckner dans leur article : « Application of an rRNA Probe Matrix for Rapid Identification of Bacteria and Fungi in Routine Blood Cultures » N° 1557, et -D. D. Fuller, T. E. Davis dans l'article : « Comparison of rRNA Probe Matrix to Conventional Methods for Rapid Identification of Clinically Significant Bacteria and Fungi Recovered from Blood Cultures Specimens » N°1558, de la session 154. D, page 221, Laboratory Tests for Diagnosing Infections ; Methods for susceptibility testing.

-Abstracts book, ICAAC-Sept. 26-29,1999-San Francisco-USA-Deux posters présentent l'utilisation d'une sonde universelle permettant la détection de l'ensemble des espèces de champignons (moisissures et levures) C) Facteurs étudiés : Les facteurs que l'on peut étudier sont : -le poids total de billes actives (en g), -le pourcentage en masse de billes lysantes de 100 um, -la durée de la lyse (en mn), -le nombre de billes de verre de 3 mm additionnelles, et -le nombre de billes de fer de 2 mm additionnelles.

D) Souches de levure et bactérie utilisées : La souche de levure retenue pour l'étude est Candida krusei ayant comme numéro de collection bioMérieux : API n° 9604191. La souche de bactérie est Mycobacterium fortuitum déposée auprès de 1'ATCC sous le numéro : 49403.

La lyse est réalisée sur 600 ul d'une suspension à 0,5 Mac Farland (densitomètre bioMérieux).

II. Résultats préliminaires selon les procédés de références : A) Résultats montrant que les billes de 100 um sont plus efficaces que les billes de 500 um pour lyser les bactéries : Le tableau 2 ci-dessous représente les résultats obtenus où toutes les unités sont en HPA comme dans les tableaux suivants numérotés 3 à 10. Billes actives de diamètre 100 µm Billes actives de diamètre 500 µm Valeurs brutes Moyenne Valeurs brutes Moyenne 125 382 75 607 Sonication 105 474 125 180 95 799 84 428 120 807 93 081 149 057 73 225 105 263 39 624 Vortex 96 142 100 513 41 879 43 946 mécanique 97 875 50 584 102 771 43 697 83 400 27 744 Vortex 83 798 78 213 28 285 28 012 magnétique 69 290 28 475 76 362 27 542

Tableau 2 : Etude comparative entre les billes de 100 um et les billes de 500 um pour les trois techniques de lyse des bactéries On remarque aisément que pour les trois techniques, les billes de 100 pm sont plus efficaces que les billes de 500 pm.

B) Résultats comparant la performance des billes de 500 µm et de 100 plu pour lyser les levures : Le tableau 3 ci-dessous est représentatif des résultats obtenus. Billes actives de diamètre 100 ; j. m Billes actives de diamètre 500 1lm Valeurs brutes Moyenne Valeurs brutes Moyenne 614 668 1 487 786 3919421448239 Sonication 567756 452564 1281 148 1366451 258 648 1 294 420 429 805 1 320 663 1 392 101 2 464 220 1 511 603 2 598 929 Vortex 1 493 588 1 317 454 2 234 830 2 565 353 m(C1-C6)canique 1 128 468 2 695 394 10615142833394 1 688 929 1 026 887 1 853 702 1 192 650 Vortex 1 361 236 1 543 208 970 409 1 131 101 magn(C1-C6)tique 1 362 156 1 097 997 14500161367563

Tableau 3 : Etude comparative entre les billes de 100 um et les billes de 500 um pour les trois techniques de lyse des levures Pour la sonication et le vortex mécanique, les billes de 500 um sont plus efficaces que les billes de 100 um pour lyser les levures. Par contre, pour le vortex magnétique, les billes de 100 um sont plus efficaces.

Pour la sonication et le vortex mécanique, un protocole universel nécessite un mélange de billes de 100 et 500 um. Par contre, pour le vortex magnétique, il n'est pas nécessaire de mélanger les deux tailles puisque les billes de 100 um sont plus efficaces que les billes de 500 llm pour les bactéries et les levures, ce qui est surprenant.

III. Résultats de la lyse par sonication selon la présente invention : Deux facteurs sont utilisés, il s'agit du pourcentage en masse de billes de 100 llm de diamètre et de la masse totale de billes lysantes.

A) Sonication et levures : Le protocole de référence (masse totale de billes lysantes = 0,3 grammes (g) et pourcentage en masse de billes de 100 um de diamètre= 0 %) donne sur trois essais les résultats suivants 2 264 515,1 821 135 et 1 505 887, soit une moyenne de 1 863 846.

Le tableau 4 ci-dessous représente les résultats obtenus. Pourcentage e billes de 20% 50% 80% 00 Am Masse Valeurs Valeurs Valeurs totale billes brutes Moyenne brutes Moyenne brutes Moyenne lysantes (g) 1292794 1220036 595207 1 161 495 1 362 230 1 054 355 0,1 1476144 1322991 1054256 1 182919 1233330 955668 1205671 809459 1019397 1 478 850 1 468 613 876 052 1 454 421 1 289 100 912 332 1 104 398 1 266 980 692 731 0,3 1 208 753 1 407 117 1 316 456 1 331 139 745 533 912 904 1399980 1452021 1301020 1868031 1704912 852939 213745 1656852 1267203 604487 0,5 1266184 1650238 1 155399 1252013 429326 415853 1861236 1732513 1 762 006

Tableau 4 : Etude comparative entre la technique de référence et des techniques pouvant répondre aux critères de la présente invention pour la sonication des levures La réponse maximale est obtenue pour un pourcentage de billes de 100 um de diamètre de 20% et une masse totale de billes lysantes de 0,5 g.

La figure 2 met en évidence les courbes d'isoréponses. Ces courbes d'isoréponses montrent que pour obtenir une réponse élevée (800 000 unités de fluorescence), il est nécessaire d'avoir une masse totale de billes lysantes comprise entre 0,3 et 0,5 g et un pourcentage de billes de 100 um de diamètre proche de 20 %.

B) Sonication et bactéries : Le protocole dit de référence utilise une masse totale de billes lysantes 0,4 g et un pourcentage en masse de billes de 100 pm de diamètre de 100 %. Ce protocole donne les valeurs suivantes : 264 915,305 907 et 195 160, soit une moyenne de 255 327. Le tableau 5 met en évidence l'ensemble des résultats obtenus. Pourcentage e billes de 20% 50% 80% \t00 Fm Masse Valeurs Valeurs Valeurs totale billes brutes Moyenne brutes Moyenne brutes Moyenne lysantes (g) 293 068 229 455 324 640 199 178 235 334 323 472 0,1 213691 255085 348094 288104 254815 285390 248 425 307 997 220 425 321 064 319 640 303 600 316672 312002 256234 322 443 279 713 126 639 0,3 325 418 306 462 284 487 298 236 303 203 228 692 313 086 311784 252 692 303 192 272371 268035 183 800 294 345 162 858 138 313 0,5 350 986 299 829 272 402 237 229 271 054 197 722 261 954 192 428 319 487 290 421

Tableau 5 : Etude comparative entre la technique de référence et des techniques pouvant répondre aux critères de la présente invention pour la sonication des bactéries La réponse maximale est obtenue avec un pourcentage de billes de 100 um de diamètre de 20% et une masse totale de billes lysantes comprise entre 0,3 ou 0,5 g.

La figure 3 met en évidence les courbes d'isoréponses. Ces courbes d'isoréponses montrent que pour obtenir une réponse élevée, il faut une masse totale de billes lysantes supérieur à 0,2 g et un pourcentage de billes de 100 um de diamètre compris entre 20 et 50%.

C) Choix d'un protocole universel de lyse par sonication : Le protocole universel est donc défini par les paramètres suivants : -pourcentage de billes de 100 um de diamètre = 20 %, et -masse totale de billes lysantes = 0,5 g.

Dans ces conditions, la réponse moyenne obtenue pour les bactéries de 299 829 est supérieure à 255 327, moyenne obtenue avec le protocole de référence propre aux bactéries utilisant 100 % de billes de 100 um, ce qui est assez surprenant, et ce d'autant plus que la réponse moyenne obtenue pour les levures est de 1 650 238, c'est-à-dire assez proche de la valeur 1 863 846, qui correspond à la moyenne obtenue avec le protocole de référence propre aux levures utilisant 100 % de billes de 500 um.

Le procédé associé à ce protocole de lyse universelle consiste donc à effectuer une sonication selon les paramètres suivants : -un pourcentage de billes de 100 um de diamètre compris entre 10 à 50 % préférentiellement entre 20 et 30 % et encore plus préférentiellement de 20 %, et -une masse totale de billes lysantes comprise entre 50 à 100 % de la masse totale de l'échantillon biologique traité, préférentiellement compris entre 75 et 90 % et préférentiellement entre 80 et 85 %.

Le pourcentage de masse totale de billes lysantes par rapport à la masse totale de l'échantillon biologique traité est calculé dans ce chapitre, comme dans les suivants, en utilisant 0,5 g de billes lysantes pour un échantillon de 600 ul, c'est-à-dire sensiblement 0,6 g. Le pourcentage est donc de : (0,5 : 0,6) x 100 = 83, 33 %.

IV. Résultats de la lyse par vortex mécanique selon la présente invention : Quatre paramètres sont utilisés, il s'agit du pourcentage de billes de 100 um de diamètre, de la masse totale de billes lysantes de 100 et de 500 um du nombre de billes de verre de 3 mm additionnelles et de la durée de la lyse (en minutes).

A) Vortex mécanique et levures : Le protocole de référence utilise une masse totale de billes lysantes de 0,3 g, un pourcentage de billes de 100 pm de diamètre de 0%, 6 billes de verre et 10 billes de fer, ainsi qu'un temps de lyse de 12 mn. Les valeurs HPA obtenues sont de 1 944 115,2 213 485 et 2 158 958 soit une moyenne de 2 105 519. Le tableau 6 met en évidence les résultats obtenus. Pourcentage de billes de 20 % 50 % 80 % 100 µm de diamètre Masse Nombre Durée Valeurs Valeurs Valeurs de billes de billes de la Moyenne Moyenne Moyenne ,,, brutes brutes brutes 173 382 53 771 @@@ @@@ @@@ @@@ NT = non @@ @@@ 1 2 mn 198 469 187 805 55 591 53 609 191565 teste 51464 383 782 566 150 13 2 mn 875 488 635 628 NT 631271 559011 647 615 479 612 1499619 569050 0, 1 1 20 mn 696 373 819 615 NT 590 737 613 066 262 854 679 410 1 009 588 852 141 13 20 mn 1472753 1 194601 NT 1 041 371 1 037 128 1 101 463 1 217 872 731 593 7 11 mn 543 160 664309 NT 718 173 1 772 021 1 342 768 7 11 mn 1 817 222 1 822 683 NT 1740035 1491564 1 878 805 1 391 889 896 736 1 11 mn NT 1 329 122 1 066 980 NT 975 083 1429173 0, 35 g 13 11 mn NT 1 439 611 1 485 707 NT 1 588337 323 207 7 2 mn NT 271399 327602 NT 388 199 2 655 347 7 20 mn NT 2620069 2532245 NT 2 321 318 1 519280 7 11 mn NT 1 503 048 1 466 095 NT 1375956 509 952 60 273 1 2 mn 278 641 379 277 NT 105730 80981 349 239 76 940 1 070 276 234 974 13 2 mn 794 021 863 409 NT 467 140 320 819 725 931 260 342 2 856 141 1 767 239 0,6 g 1 20 mn 3 176 777 2 952 656 NT 1 412 744 1 620 779 2 825 049 1 682 354 1826409 2000094 NT 1500483 896418 13 20 mn 2 156 630 816 002 2 017 243 372 770 2257042 7 11 mn NT 1 868 266 2 076 765 NT 2 104 986

Tableau 6 : Etude comparative entre la technique de référence et des techniques pouvant répondre aux critères de la présente invention pour la lyse par vortex mécanique des levures La figure 4 met en évidence les courbes d'isoréponses ainsi obtenues. L'analyse des courbes montre que le facteur le plus influent sur la réponse est la durée. Pour maximiser la lyse, il faut une durée de la lyse de 20 mn, un pourcentage de billes de 100 am de diamètre inférieur à 50 %, une masse totale de billes lysantes supérieure à 0,35 g et un nombre de billes de verre inférieur à sept (7).

Un exemple de courbes d'isoréponses est donné pour un poids total de 0,5 g et un pourcentage de billes de 100 um de diamètre de 20%.

On démontre que pour augmenter la réponse, il faut une durée de lyse supérieure à 11 mn, un pourcentage de billes de 100 um de diamètre inférieure à 50 %, une masse totale de billes lysantes supérieure à 0, 35 g et un nombre de billes de verre inférieur à 7.

B) Vortex mécanique et bactéries : Le protocole de référence utilise une masse totale de billes lysantes de 0,6 g, un pourcentage de billes de 100 pm de diamètre de 100%, 6 billes de verre et 10 billes de fer, et ce pendant un temps de lyse de 2 mn ; les valeurs HPA trouvées sont de 107 406, 124 609 et 138 405, soit une moyenne de 123 473.

Le tableau 7 met en évidence les résultats obtenus. Pourcentage de billes de 20% 50% 80% 100 µm de diamètre Masse Nombre Durée Valeurs Valeurs Valeurs de billes de billes de la Moyenne Moyenne Moyenne brutes brutes brutes lysantes verre lyse 52 553 63 184 1 2 mn 74 120 65 783 NT 58 656 60 008 70 675 58 185 14521 41 586 13 2mn 119746 58087 NT 54 066 45 346 39 993 40 387 342 532 143 231 0, 1 g 1 20 mn 192353 319286 NT 141 178 141 883 422 974 141 240 180 946 62 916 13 20 mn 152 548 166 747 NT 33 591 62 131 89 886 95 433 7 11 mn NT NT 89 768 88 830 NT 81 290 96363 164967 7 11 mn 82 168 105 687 NT 133 405 148 344 138 530 146 659 182 124 1 11 mn NT 134 177 NT 97015 137772 79 136 0, 35 g 13 11 mn NT 58 570 NT 71 041 69 582 68 180 7 2 mll NT 55 805 55 450 NT 42 366 326925 7 20 mn NT 229 725 233 194 NT 142933 103348 7 11 mn NT 90 163 96 760 NT 96770 54466 108236 1 2 mn 49 842 52 154 NT 82 578 106 943 130 014 80 796 102 979 13 2 mn 63 431 72 113 NT 162 136 123 315 104 830 275 653 255 286 0, 6 g 1 20 mn 153 372 226 063 NT 265 434 248 053 249 164 223 440 189947 176619 13 20 mn 107 754 136 594 NT 183 820 182 044 112 081 185 692 131 318 7 11 mn NT 121488 135438 NT 153 508 Tableau 7 : Etude comparative entre la technique de référence et des

techniques pouvant répondre aux critères de la présente invention pour la lyse par vortex mécanique des bactéries La figure 5 met en évidence les courbes d'isoréponses ainsi obtenues. L'analyse des courbes montre que le facteur le plus actif sur la lyse est la durée. Pour augmenter la réponse, il faut une durée maximale de lyse de 20 mn et un faible nombre de billes de verre. De plus, la réponse est un peu meilleure avec un pourcentage de billes de 100 um de diamètre faible, proche de 20 %, et une masse totale de billes lysantes proche de 0,6 g, ces 2 facteurs ayant une moindre influence.

Un exemple de courbes est donné pour une masse totale de billes lysantes fixée à 0,6 g et un pourcentage de billes de 100 llm de diamètre fixé à 20 %. C'est le cas sur la figure 5.

Les courbes montrent que la durée de lyse a un effet important sur la réponse, la réponse maximum est obtenue pour une durée de 20 mn. Le nombre de billes de verre a moins d'effet sur la lyse, une seule bille de verre étant suffisante.

C) Choix d'un protocole universel de lyse par vortex mécanique : Le protocole universel est donc défini par les paramètres suivants -durée de la lyse de 20 mn, -pourcentage de billes de 100 um de diamètre = 20 %, -masse totale de billes lysantes = 0, 5 g, et -nombre de billes de verre égal à une (1), avec un diamètre de sensiblement 3 mm.

Dans ces conditions, on obtient les résultats surprenants suivant : -la moyenne obtenue pour les bactéries est de 226 063 alors qu'elle est de 123 473 pour le protocole de référence utilisant 100 % de billes de 100 um, -la moyenne obtenue pour les levures est de 2 952 656 alors qu'elle est de 2 105 519 pour le protocole de référence utilisant 100 % de billes de 500 um.

Le procédé associé à ce protocole de lyse universelle consiste donc à effectuer un vortex mécanique selon les paramètres suivants : -une durée de la lyse de 11 à 20 mn, préférentiellement de 15 à 20 mn et encore plus préférentiellement de 20 mn, -un pourcentage de billes de 100 llm de diamètre inférieur à 50 %, préférentiellement inférieure à 30 %, et encore plus préférentiellement de 20 %,

-une masse totale de billes lysantes supérieure à 60 %, préférentiellement supérieure à 80 %, et encore plus préférentiellement de 100 % de la masse totale de l'échantillon biologique traité, et -un nombre de billes de verre inférieur à sept (7) préférentiellement égal à une (1).

V. Résultats de la lyse par vortex magnétique selon la présente invention : Une étude MRE n'a pas été nécessaire dans le cas présent du fait des paramètres étudiés et de leur influence plus limitée.

Les essais décrits précédemment, pour le vortex magnétique, montrent que les billes de 100 pm étaient plus efficaces que les billes de 500 um pour lyser les bactéries et les levures.

L'objectif est de définir, avec des billes de 100 nm de diamètre, les conditions optimales pour un protocole de lyse universelle avec un vortex magnétique.

Les conditions testées sont : -la quantité totale de billes de 100 um de diamètre, -le nombre de billes de fer, et -la durée de lyse.

A) Vortex magnétique et levures : Le protocole de référence utilise une masse totale de billes lysantes de 0,5 g, un pourcentage de billes de 100 Am de diamètre de 0 %, c'est-à-dire 100 % de billes de 500 m, 10 billes de fer et une durée de lyse de 12 mn. La moyenne obtenue est de 852 648.

Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 8 ci-après. Masse totale de 0, 5 g 0, 6 g billes lysantes Nombre de 5 10 5 10 billes de fer Durée de la lyse 12 mn 20 mn 12 mn 20 mn 12 mn 20 mn 12 mn 20 mn Moyenne 905S71 994733 1321t76 I5H558 799621 926658 1326085 1541946 Tableau 8 : Etude comparative entre la technique de référence et des techniques pouvant répondre aux critères de la présente invention pour la lyse par vortex magnétique des bactéries

L'efficacité supérieure des billes de 100 llm par rapport aux billes de 500 u, m est confirmée ; en effet la troisième condition, dont la valeur moyenne est de 1 321 176, donne une valeur supérieure à la condition de référence. Néanmoins, il n'y a pas de différence sensible entre 0,5 et 0,6 g.

Le nombre de billes de fer et la durée de lyse ont de l'influence, il vaut mieux 10 billes de fer et 20 mn de lyse.

B) Vortex magnétique et bactéries : Le protocole de référence utilise une masse totale de billes lysantes de 0,6 g, un pourcentage de billes de 100 um de diamètre de 100 %, 10 billes de fer et une durée de lyse de 10 mn. La moyenne obtenue est de 72 942.

Les résultats obtenus sont reproduits dans le tableau 9 ci-dessous. Masse totale de 0, 5 g 0, 6 g billeslysantes Nombre de 5 10 5 10 billes de fer Duree de la lyse 12 mn 20 mn 12 mn 20 mn 12 mn 20 mn 12 mn 20 mn Moyenne 50613 69614 70589 84779 58461 71676 79985 103190 Tableau 9 : Etude comparative entre la technique de référence et des techniques pouvant répondre aux critères de la présente invention pour la lyse par vortex magnétique des bactéries La masse totale de billes lysantes a peu d'influence, mais les valeurs HPA sont un peu supérieures avec 0,6 que 0,5 g de billes de 100 uni. Le nombre de billes de fer et le temps de lyse ont de l'influence, ainsi il est préférable d'utiliser 10 billes de fer et 20 mn de lyse.

C) Choix d'un protocole universel : Les conditions optimales communes aux bactéries et aux levures correspondent aux conditions suivantes : -0, 6 g de billes de 100 um de diamètre, -10 billes de fer, et -une durée de lyse de 20 mn.

Ces conditions dites universelles sont étonnement plus efficaces que les conditions dites de références, comme cela est bien récapitulé dans le tableau 10 ci- dessous.

Levure Bactérie Protocole de 852648 72942 référence Protocole 1541946 103190 universel Tableau 10 : Etude comparative entre les techniques de référence et les techniques répondant aux critères de la présente invention pour la lyse par vortex magnétique des levures et des bactéries Le procédé associé à ce protocole de lyse universelle consiste donc à effectuer un vortex magnétique selon les paramètres suivants : -une durée de la lyse de 12 à 20 mn, préférentiellement de 15 à 20 mn et encore plus préférentiellement de 20 mn, -une masse totale de billes lysantes supérieure à 80 % et préférentiellement de 100 % de la masse totale de l'échantillon biologique traité, et -un nombre de billes de fer compris entre cinq (5) à quinze (15) billes, préférentiellement de dix (10) billes de fer.

VI. Conclusion : Il est démontré que pour les trois techniques, sonication, vortex mécanique et vortex magnétique, il est possible de définir des protocoles universels, c'est-à-dire, capable de lyser des cellules procaryotes et/ou eucaryotes avec une efficacité identique et souvent supérieure à celle obtenue avec les protocoles dits de référence