3-Halogen-l , 2-propandiole und deren Mono- und Diester, ins ^¬ besondere 3-Monochlor-l , 2-propandiol (3-MCPD) und dessen Ester mit Carbonsäuren sind Verbindungen, welche in Lebensmitteln als unerwünschte Kontaminationen auftreten. Besonders betroffen sind davon Fette und Öle. Speziell 3-MCPD ist eine toxische Verbindung, die beispielsweise für die Niere schädlich ist, da es dort zu Veränderungen bis hin zur Tumorbildung führen kann.

Die Entfernung dieser Substanzen, vorrangig des 3-MCPD, aus Lebensmitteln ist somit zwingend notwendig, was aktuell Ge ^¬ genstand analytischer und toxikologischer Untersuchungen ist .

Nach derzeitigem Stand entstehen diese Verbindungen bei der Herstellung und Prozessierung von Pflanzenölen, beispielsweise durch Hitzebehandlung von Ölsaaten und in der Raffination (Raffinieren oder Raffinierung) , dort insbesondere bei der Desodorierung .

Neben dem Auftreten in Fetten und Ölen finden sich die schädlichen Substanzen auch in weiteren Lebensmitteln wie Brot, geräucherten Fleischwaren und in Säuglingsnahrung wie Säuglingsmilchpulver. Aufgrund der Toxizität der 3-Halogen- 1 , 2-propandiole und deren Derivaten, insbesondere von 3- MCPD und seinen Derivaten ist eine Entfernung dieser Stoffe vor allem aus lebensmittelrechtlicher Sicht wünschenswert. Bei der Bewertung der Toxizität der 3-MCPD-Ester geht man zur Zeit aufgrund von fehlenden Daten von einer vollständigen Hydrolyse der Ester aus. Die Ester müssen also in Bezug auf ihre Toxizität wie das freie 3-MCPD behandelt werden. Somit sind auch die Ester des 3-MCPD Verbindungen, welche es aus Lebensmitteln zu entfernen gilt.

Verfahrenstechnische Ansätze zur Reduzierung des Gehalts an 3-MCPD finden sich in den Schriften von Zelinkova, S. et al., Food Addit. Contam. 2006, Vol. 23, 1290-1298; Hamlet G. et al., Food Addit. Contam. 2002, Vol. 19, 619-631; See ^¬ felder W., Food Addit. Contam. Part A Chem. Anal. Control Expo Risk Assess. 2008, Vol. 25, 391-400.

Nachteilig bei den dort beschriebenen Ansätzen ist allerdings, dass es auch zu einer Erhöhung der 3-MCPD-Konzentra- tion kommen kann. Ebenso ist es von Nachteil, dass diese Verfahren sehr energieintensiv sind. Es kann zu unerwünschten Veränderungen in der Qualität der behandelten Fette/Öle kommen. Beispielsweise können Isomerisierungen, Abbau bzw. chemische Veränderungen der enthaltenen Fettsäuren, sowie Änderungen im Spektrum der Antioxidantien auftreten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Eliminierung von 3-Halogen-l , 2-propandiolen und deren Derivaten bereitzustellen, welches die oben genannten Nachteile überwindet.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen gemäß Anspruch 1 gelöst. In anderen Worten ist die Lösung der Aufgabe ein Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2- propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten der allge ^¬ meinen Formel I,

Formel I worin der Rest R Wasserstoff oder den Rest einer

veresterten Fettsäure bedeutet, der Rest R' ebenfalls

Wasserstoff oder den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, wobei die Reste R und R' gleich oder verschieden sind und X ein Halogenatom, vorzugsweise ein Chloratom, ist,

zu 1 , 2 , 3-Propantriol oder Monoacylglyceriden,

welches gekennzeichnet ist durch enzymatische Umsetzung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diester ^¬ derivaten der allgemeinen Formel I mit einer Dehalogenase und anschließende enzymatische Umsetzung mit einer

mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, wobei die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v) erfolgen.

Beide Umsetzungen finden in demselben hydrophoben Lipidsystem statt, ohne dass eine Aufreinigung oder eine Veränderung des hydrophoben Lipidsystems erforderlich ist. Dies heißt auch, dass das Verhältnis Lipid/Wasser unver ^¬ ändert bleibt. Es handelt sich quasi um eine Eintopfreak- tion . Vorzugsweise weist das hydrophobe Lipidsystem einen Wasser ^¬ anteil zwischen 0.1 und 10% (v/v), besonders bevorzugt zwischen 0.1 und 5% (v/v) auf.

Im Gegensatz zu einigen anderen Enzymen wie Lipasen, welche in Ölen meist sehr aktiv und stabil sind, entfalten Dehalo- genasen und mikrobielle Epoxid-Hydrolasen ihre Wirkung so gut wie ausschließlich nur in wässrigen Systemen.

Überraschenderweise konnte aber gezeigt werden, dass bei der enzymatischen Umwandlung von 3-Halogen-l , 2 , -propan- diolen und ihren Derivaten, insbesondere bei der Umwandlung von 3-Monochlor-l , 2-propandiol und seinen Derivaten, sowohl die Dehalogenase als auch die mikrobielle Epoxid-Hydrolase ihre Wirkung auch in einem Lipidsystem entfaltet, d.h.

beide Enzyme auch in Gegenwart von Pflanzenölen in einer sehr hydrophoben Umgebung aktiv sind. Wasser muss dabei nur in sehr geringen Mengen zugegen sein.

Das Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen-l , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten, ist also insbe ^¬ sondere dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzungen in einem hydrophoben Lipidsystem mit einem Wasseranteil zwischen 0.1 und 40% (v/v), mehr bevorzugt zwischen 0.1 und 10% (v/v), höchst bevorzugt zwischen 0.1 und 5% (v/v) erfolgen. Unter einem hydrophoben Lipidsystem ist ein

Lipidsystem zu verstehen, welches einen log p-Wert von mindestens 2, vorzugsweise von mindestens 4 aufweist.

Das Lipidsystem umfasst Fettsäuren, Triacylglyceride (Fette und Öle) sowie die entsprechenden Mono- und Diacyl- glyceride, Wachse, Phospholipide, Sphingolipide, Lipo- polysaccharide und Isoprenoide (Steroide, Carotinoide etc.), insbesondere solche Lipide, wie sie in Pflanzenölen vorkommen. Vorzugsweise umfasst das Lipidsystem Triacyl-, Mono- und Diacylglyceride . Umfasst sind dabei einzelne Substanzen sowie Mischungen aus mehreren Substanzen.

Unter „3-Halogen-l , 2-propandiolen und ihren Derivaten" bzw. „3-MCPD und seinen Derivaten" sind im nachfolgenden 3- Halogen-1 , 2-propandiole und ihre Mono- und Diesterderivate, aber auch die enantiomeren l-Halogen-2 , 3-propandiole und ihre Mono- und Diesterderivate bzw. 3-MCPD und seine Mono- und Diesterderivate sowie das enantiomere 1-MCPD und seine Mono- und Diesterderivate zu verstehen.

Im Gegensatz zu 3-Halogen-l , 2-propandiolen und ihren Derivaten bzw. 3-MCPD und seinen Derivaten ist 1 , 2 , 3-Propan- triol (Glycerin) , welches das Endprodukt des erfindungsge ^¬ mäßen Verfahrens darstellt, eine nicht toxische, in Lebens ^¬ mittel zugelassene Substanz. Das Verfahren ermöglicht also die Überführung toxischer 3-Halogen-l , 2-propandiole und ih ^¬ ren Derivaten, insbesondere die Überführung von 3-MCPD und seinen Derivaten mittels enzymatischer Hydrolyse in die lebensmitteltechnisch unbedenkliche Verbindung Glycerin bzw. deren Derivate.

Hinsichtlich der Mono- und Diesterderivate der 1-Halogen- 2 , 3-propandiole war es besonders überraschend, dass diese mit diesem Verfahren umgesetzt werden können. Hierbei wurde festgestellt, dass die Umsetzung an der Grenzfläche zwi ^¬ schen Öl und Wasser stattfindet/stattfinden muss. Eine derartige Grenzflächenaktivität wurde bisher nur für Lipasen beschrieben. Bei diesen beruht die Grenzflächenaktivität strukturell auf einem „Deckel", der sich in Gegenwart einer Grenzfläche öffnet und so die hohe Aktivität der Lipase be- wirkt. Ein solches strukturelles Merkmal existiert weder bei Dehalogenasen noch bei mikrobiellen Epoxid-Hydrolasen, weshalb deren Grenzflächenaktivität überraschend war. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reste R oder R' den Rest einer veresterten Fettsäure bedeutet, d.h. dass Mono- und Diesterderivate bevorzugte Edukte für das vorliegende Verfahren sind.

Die in den Estern enthaltenen Fettsäuren sind ausgewählt aus der Gruppe der gesättigten oder einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Bevorzugt sind unverzweigte Mono- carbonsäuren mit mindestens vier Kohlenstoffatomen . Einsetzbar sind grundsätzlich alle Fettsäuren, in deren finalen Produkten 3-Halogen-l , 2-propandiole bzw. deren Mono- oder Diester, insbesondere 3-MCPD und dessen Ester, zu finden sind. Die Ölsäure ist ein prominenter Vertreter, der beispielsweise in hohen Mengen im Palmöl und Olivenöl zu finden ist. Weitere Vertreter sind die Linolsäure,

Linolensäure, gamma-Linolensäure, konjugierte Linolensäure Eicosapentaensäure, Docosahexaensäure, Stearinsäure und Palmitinsäure. Vorzugsweise werden die Fettsäuren insgesamt ausgewählt aus der Gruppe von Ölsäure, Linolsäure, Stearin ^¬ säure, Palmitinsäure, Buttersäure, Capronsäure, Laurinsäu- re, Myristinsäure und Margarinsäure. Als Pflanzenöle sind insbesondere Öle aus der Gruppe von Palmöl, Palmkernöl, Olivenöl, Rapsöl, Sonnenblumenöl, Soj abohnenöl , Erdnußöl, Baumwollsaatenöl und Kokosnußöl relevant.

Die Nomenklatur der hydrolytischen Dehalogenasen ist ein Thema, welches in der Literatur uneinheitlich behandelt wird. In der BRENDA-Datenbank findet man beispielsweise ausschließlich Haloalkan-Dehalogenasen (E.C. 3.8.1.5). Halohydrin- (oder synonym Haloalkohol- ) Dehalogenasen werden dort nicht genannt. In Publikationen wird meist von Halohydrin- (bzw. Haloalkohol- ) Dehalogenasen gesprochen, wenn das Enzym einen vicinalen Haloalkohol zu einem Epoxid umsetzt. Von Haloalkan-Dehalogenasen ist die Rede, wenn das Enzym das Substrat, welches für gewöhnlich ein Haloalkan ist, direkt zum Alkohol umsetzt.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „Dehalogenasen", dass sowohl Halohydrin-Dehalogenasen als auch Haloalkan-Dehalogenasen umfasst sind. Der Begriff „Halohydrin- (bzw. Haloalkohol-) Dehalogenase" wird verwen ^¬ det, wenn das Enzym einen vicinalen Haloalkohol zu einem Epoxid umsetzt (HHD) . Der Begriff „Haloalkan-Dehalogenase" bezeichnet, dass das Enzym das Substrat direkt zum Alkohol umsetzt (HAD) .

Vorzugsweise ist die Dehalogenase ausgewählt aus der Gruppe von HheA aus Arthrobacter sp . AD2, HheA aus Corynebacterium sp . N-1074, HheB aus Mycobacterium sp . GP1, HheC aus

Agrobacterium radiobacter AD1 und Dehalogenase B aus

Agrobacterium tumefaciens HK7. Besonders bevorzugt ist die Halohydrin-Dehalogenase (HHD) HheA aus Arthrobacter sp . AD2.

Die Dehalogenase überführt die 3-Halogen-l , 2-propandiole in das entsprechende Glycidolderivat (Epoxid) . Anschließend wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein zweites Enzym (Epoxid-Hydrolase) zugesetzt, welches hydrolytisch das Glycidolderivat in ein Glycerinderivat überführt. In Schema 1 sind die jeweiligen Reaktionen für 3-Halogen-l , 2-propandiole und für deren Monoester dargestellt. mikrobielle

Formel I

R= Fettsäurerest

R'= H

Schema 1

Beide Reaktionen (Umsetzung mit Dehalogenase und mit mikro- bieller Epoxid-Hydrolase) laufen ab, ohne dass das Reakti ^¬ onsgemisch nach dem ersten Schritt aufgereinigt werden muss .

Insbesondere freies 3-MCPD wird so schnell und einfach in Glycerin überführt. Monoesterderivate können mittels Zusatz einer Lipase optional gespalten werden, d.h., dass wenn einer der Reste R oder Rest R' ein Rest einer veresterten Fettsäure ist, in einer bevorzugten Ausführungsform

zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt. Die Zugabe der Lipase erfolgt zeitgleich mit oder vor dem

Zusatz der Dehalogenase.

Insgesamt werden 3-Halogen-l , 2-propandiolderivate mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens in die korrespondierenden Glyceride (Glycerin bzw. Monoacylglyceride) überführt, wel ^¬ che natürliche Bestandteile von Pflanzenölen sind. Die mikrobielle Epoxid-Hydrolase ist vorzugsweise ausge ^¬ wählt aus der Gruppe von Epoxid-Hydrolase aus Aspergillus niger und Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium

radiobacter AD1. Stärker bevorzugt ist die Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, besonders bevorzugt die Mutante F108A der EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1.

Die Zugabe der mikrobiellen Epoxid-Hydrolase kann prinzipiell gleichzeitig mit der Zugabe der Dehalogenase erfolgen, wobei dies oft nicht zum gewünschten Abbau des Glycidols führt .

Im wässrigen System konnte zunächst gezeigt werden, dass 3- MCPD in Anwesenheit einer Dehalogenase (hier eine

Halohydrin-Dehalogenase) und einer mikrobiellen Epoxid- Hydrolase (mEH) über die Zwischenstufe Glycidol zu Glycerin umgesetzt wird. 3-MCPD und Glycidol konnten

gaschromatographisch nachgewiesen werden. Über einen inneren Standard, Dimethylsulfoxid (DMSO) , wurde die Reaktion quantifiziert. Die Abb. 1 zeigt den Verlauf der Reaktion. Die HAD HheA aus Arthrobacter sp . AD2 setzt in einer hydrolytischen Reaktion 3-MCPD zu Glycidol um. Glycidol wiederum ist ein Substrat der mEH EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1, welche dieses zu Glycerin abbaut. Die Mutante F108A der EchA besitzt eine verbesserte Aktivität gegenüber

Glycidol und wurde bei den hier beschriebenen Experimenten verwendet. Beide Enzyme wurden zu Beginn der Reaktion zuge ^¬ geben .

Trotz Zugabe von mEH war keine Verminderung der Konzentration an Glycidol zu verzeichnen (vgl. Abb. 1) . Auch nach 24 h war kaum eine Veränderung zu erkennen. Nach 450 min be- trug die Konzentration von 3-MCPD 2,5 mM und die von

Glycidol 7,8 mM. Die Messdaten, welche mittels Gaschroma ^¬ tographie ermittelt wurden, sind in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1

Aus diesem Grund wurde der Abbau von 3-MCPD zu Glycerin in zwei Schritte aufgeteilt.

Vorzugsweise erfolgt die Beigabe der mEH daher dann, wenn nach Zusatz der Dehalogenase keine signifikanten Änderungen in den Konzentrationen von Glydidol und 3-Halogen-l , 2- prodandiol, bzw. dessen Derivaten mehr beobachtet werden kann. Die Konzentrationsmessung erfolgt mit Standardmessme ^¬ thoden. Zunächst wird mittels Dehalogenase Glycidol er ^¬ zeugt, dass anschließend durch die mEH in Glycerin über ^¬ führt wird. Der Reaktionsverlauf ist in Abb. 2 abgebildet. Beide Reaktionen laufen sequentiell ab, ohne dass jedoch das Reaktionsgemisch nach dem ersten Schritt aufgereinigt wird . Die Messdaten, welche mittels Gaschromatographie ermittelt wurden, sind in Tabelle 2 dargestellt.

Tabelle 2

Die 3-MCPD-Konzentration nahm zunächst annähernd linear ab. Nach ca. 2,5 h ließ sich jedoch kaum noch eine Abnahme der 3-MCPD-Konzentration messen und die Reaktion stagnierte bei etwa 25 % der Ausgangskonzentration, sodass nach 3 h die mEH zugesetzt wurde. Eine halbe Stunde nach Zugabe des En ^¬ zyms ließ sich das Glycidol nicht mehr nachweisen. Nach 24 h zeigte sich keine Veränderung in den Konzentrationen. 3- MCPD wurde zu 2,5 mM bestimmt, Glycidol war nicht nachzu ^¬ weisen (Daten in Abb .2 nicht aufgeführt) . Kontrollen zur Stabilität von 3-MCPD und Glycidol lieferten keine Anzei ^¬ chen für deren Autohydrolyse innerhalb von 24 h: Bei

Glycidol wurde eine Abweichung von weniger als 1% gemessen, bei 3-MCPD θΠ 6"6 · Da die Standardabweichung jedoch in beiden Fällen höher bestimmt wurde (Glycidol 3,5% bzw. 3-MCPD 7,4 %) , kann man davon ausgehen, dass die Substanzen unter den Reaktionsbedingungen stabil sind. Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 3- Halogen-1 , 2-propandiolderivate über das entsprechende

Glycidolderivat in die korrespondierenden Glyceride über ^¬ führt, welche natürliche Bestandteile von Pflanzenölen sind. Ergänzend für die Umsetzung der Diester bei Verwendung einer Halohydrin-Dehalogenase ist allerdings der Zu ^¬ satz einer Lipase erforderlich, welche die Ester in die entsprechende (n) Fettsäure (n) und die 3-Halogen-l , 2- propandiol-Verbindung spaltet. Der Reaktionsverlauf für Diesterderivate ist in Schema 2 dargestellt. Eine bevorzug ^¬ te Ausführungsform des Verfahrens zur Umwandlung von 3- Halogen-1 , 2-propandiol und seinen Mono- und

Diesterderivaten ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass wenn beide Reste R und Rest R' Reste veresterter Fett ^¬ säuren sind, wobei diese gleich oder verschieden sind, zusätzlich eine Umsetzung mit einer Lipase erfolgt

(Esterspaltung) . Die Zugabe der Lipase erfolgt zeitgleich mit oder vor dem Zusatz der Dehalogenase .

Zu bemerken ist dabei, dass bei Verwendung einer Haloalkan- Dehalogenase (HAD) als Dehalogenase Diester auch direkt in das Glycerid überführt werden können. Eine bevorzugte Aus ^¬ führungsform des Verfahren zur Umwandlung von 3-Halogen- 1 , 2-propandiol und seinen Mono- und Diesterderivaten ist entsprechend dadurch gekennzeichnet, dass wenn der Rest R und der Rest R' beide Reste einer veresterten Fettsäure sind, welche gleich oder verschieden sind, die Umwandlung durch enzymatische Umsetzung mit einer HAD, ohne Zusatz einer mikrobiellen Epoxid-Hydrolase, erfolgt. Der Zusatz ei ^¬ ner Lipase ist dann nur optional. mikrobielle

s ureres

R'= Fettsäurerest Haloalkan- OR'

Dehalogenase

RO.

Schema 2

Die Wahl der Lipase hängt von der Zusammensetzung des Produktes ab und muss dementsprechend angepasst werden, wobei die generelle Auswahl alle Lipasen umfasst, die Glyceride umsetzen. Vorzugsweise wird die Lipase ausgewählt aus der Gruppe von CAL-B (Lipase B aus Candida antarctica) ;

CAL-A (Lipase A aus Candida antarctica) ;

RML (Lipase aus Rhizomucor miehei) ;

TLL (Lipase B aus Thermomyces lanuginosus) ;

Amano PS (Lipase aus Burkholderia cepacia) ;

Amano G (Lipase aus Penicillium camembertii, Lipase G Amano 50) ;

Lipase aus Geotrichum candidum;

Amano R (Lipase aus Penicillium roquefortii) ;

Newlase F (Lipase aus Rhizopus niveus) ;

Amano AYS (Lipase aus Candida rugosa, ehemals C. cylindra- cea) ;

Amano AS (Lipase aus Aspergillus niger) ;

Amano F-AP15 (Lipase aus Rhizopus oryzae) ;

Amano AK (Lipase aus Pseudomonas fluorescens) und

Lipase aus Pseudomonas aeruginosa. Bevorzugt ist die Verwendung einer Lipase aus der Gruppe von CAL-A (Lipase A aus Candida antarctica) und Lipase G Amano 50 (Lipase aus Penicillium camembertii) .

Nachfolgend wird exemplarisch die Umsetzung von 3-MCPD in einem hydrophoben Lipidsystem beschrieben (2-Phasensystem aus wässriger Phase und Ölphase) .

Da 3-MCPD, genauer gesagt dessen Fettsäureester, bei der Produktion von u.a. Ölen entstehen, wurde davon ausgegangen, dass auch im Prozess zur Entfernung von 3-MCPD aus dem Reaktionsgemisch nicht unerhebliche Mengen an Triglyceriden und partiellen Glyceriden im Reaktionsgemisch enthalten sind. Es wurde weiterhin davon ausgegangen, dass der Fettsäureester bereits vollständig hydrolysiert vorliegt. Reak ^¬ tionsmischungen mit verschiedenen Verhältnissen von wässriger Phase und Ölphase wurden erstellt und diese auf Abbau des 3-MCPD untersucht. 3-MCPD selbst ist sehr polar und so ^¬ mit hauptsächlich in der wässrigen Phase zu finden.

Es wurden Reaktionen mit folgenden Anteilen (Volumenprozent) der wässrigen Phase erstellt: 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 95% (v/v) . Nach 20 h wurde zunächst der Ansatz mit 50% (v/v) gemessen. Die Konzentration lag bei 26 % (2,6 mM) der Ausgangskonzentration des 3-MCPD. Bei einem Wasseranteil von 20 % (v/v) setzte die HheA ebenfalls 3- MCPD um, und zwar bis auf einen Rest von 14 % (1,4 mM) . Bei einem Wasseranteil von 5 % (v/v) ließ sich gar kein 3-MCPD mehr nachweisen. Die Glycidolkonzentration wurde zu 6,3 mM (50 % (v/v)), 7,2 mM (20 % (v/v)) bzw. 7,7 mM (5 % (v/v) bestimmt. Folglich ist die Dehalogenase in einem Öl/Wasser ^¬ gemisch aktiv. Um zu überprüfen, ob auch die EH unter diesen Bedingungen aktiv war, wurde EchA zu den drei gemessenen Ansätzen hinzugegeben. Nach mehr als einer Stunde ließ sich nur bei 50 % (v/v) Wasseranteil noch eine geringe Menge (0,7 mM) an Glycidol messen. Bei einem Wasseranteil von 20 und 5 % (v/v) konnte kein Glycidol mehr nachgewiesen werden. Folglich ist auch die Epoxidhydrolase in einem Öl/Wassergemisch aktiv .

Ergänzend wurde ebenfalls ein 3-MCPD-l-Monoölsäureester in einem hydrophoben Lipidsystem untersucht (2-Phasensystem aus wässriger Phase und Ölphase) .

3-MCPD liegt als Kontamination von Ölen in erster Linie nicht frei, sondern als Fettsäuremonoester vor. Aus diesem Grund wurde der (in der Ölphase befindliche) 3-MCPD-l- Monoölsäureester im 2-Phasensystem zunächst durch eine Li- pase selektiv gespalten und anschließend 3-MCPD (in der wässrigen Phase) zu Glycerin umgesetzt.

Dafür wurden wie bei der Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem verschiedene Volumenverhältnisse von wässriger Phase und Ölphase erstellt und in diesem Fall der 3-MCPD-Ester und eine Lipase (Candida Antarctica Lipase A (CAL-A ) bzw. Lipase G Amano 50) zugegeben. Die Konzentration des 3-MCPD- Esters in der Ölphase betrug jeweils 50 mM. Nach 20 h wurde die wässrige Phase auf 3-MCPD untersucht.

Die Vorgehensweise bei der Messung entsprach der bei der Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem. Zunächst wurde der Ansatz mit einem Volumenverhältnis wässrige Phase zu

Ölphase von 1:1 gemessen. Bei erfolgreicher Umsetzung wurde bei 20 % (v/v) wässrige Phase und schließlich bei 5 % (v/v) gemessen. Mit CAL-A konnte sowohl bei 50, 20 als auch bei 5 % (v/v) wässrige Phase 3-MCPD in der wässrigen Phase nachgewiesen werden. Allerdings konnte auch bei der Kontrolle zur Autohydrolyse des 3-MCPD-Esters 3-MCPD in der wässrigen Phase gemessen werden. Die Kontrolle wurde bei einem Volumenverhältnis von wässriger Phase zu Ölphase von 1:1 durchgeführt. Die Peakflächen von Kontrolle und ent ^¬ sprechender Biokatalyse (50 % (v/v) wässrige Phase) waren vergleichbar, sodass das davon ausgegangen werden kann, dass nach 20 h die Autohydrolyse so weit fortgeschritten ist wie die Umsetzung mit CAL-A , wenn nicht sogar vollständig ist. Der Einsatz einer Lipase ist also, zumindest bei längerer Reaktionszeit, nicht erforderlich.

Die enzymatische Umwandlung des hierdurch gebildeten 3 MCPDs erfolgte anschließend durch Kombination von

Dehalogenase und mikrobiell r Epoxidhydrolase wie oben schrieben .

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1 Die Abbildung zeigt den Abbau von 3-MCPD mit der

HHD HheA aus Arthrobacter sp . AD2 und mikrobieller Epoxid-Hydrolase EchA aus Agrobacterium radiobacter AD1. Beide Enzyme wurden zu Beginn der Reaktion zugegeben.

Abb. 2 Abgebildet ist der Abbau von 3-MCPD mit HheA und

EchA. Die Reaktion wurde zunächst nur mit HheA gestartet. EchA wurde nach 3 Stunden zugegeben. Beispiele

Chemikalien und Enzyme

Glycidol und 3-MCPD wurden als Racemat von Sigma Aldrich gekauft. HEPES wurde ebenfalls von Sigma Aldrich gekauft. Die HHD HheA aus Arthrobacter sp . AD2 ist bei Codexis erhältlich. Das Enzym liegt in einer 50%igen Glycerinlösung vor. Der Proteingehalt wurde mit dem Bradford Assay zu 10 mg/ml bestimmt. Die Epoxidhydrolase EchA F108A aus

Agrobacterium radiobacter AD1 ist ebenfalls bei Codexis erhältlich. Das Enzym liegt als Lyophilisat vor und hat einen Proteingehalt von 790 yg/mg. Vor ihrem Einsatz in Biokatalysen wurden die Enzyme EchA F108A und HheA dreimal in Zentrifugenröhrchen (Amicon Ultra, Millipore, Ausschlussli ^¬ mit: 10 kDa) gewaschen, um Glycerin und eventuell störende Ionen zu entfernen. Als Waschpuffer wurde HEPES-Puffer (50 mM, pH 8, 4°C) verwendet. Für die Umsetzung in 2- Phasensystemen wurde ein im Handel erhältliches Speiseöl verwendet .

Umsetzung von 3-Monochlorpropandiol (3-MCPD) zu Glycerin Alle Reaktionen wurden im wässrigen Puffersystem in einem Volumen von 200 μΐ in GC-Glasröhrchen durchgeführt. Als Puffer diente HEPES (50 mM, pH 8) . Die Ausgangskonzentrati ^¬ on des Substrates 3-MCPD lag stets bei 10 mM. Für die Um ^¬ setzung mit HheA wurden in dem Falle, dass EchA und HheA beide von Beginn an zugesetzt wurden, 10 μΐ der Enzymlösung eingesetzt. In dem Falle, dass die EchA erst nach der Um ^¬ setzung des 3-MCPD zugesetzt wurde, 25 μΐ der Enzymlösung. Vom Lyophilisat der EchA wurden 5 mg eingesetzt. Die Reak- tionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermomixer

inkubiert .

Für die Probennahme wurden 10 μΐ Reaktionslösung mit einer Tischzentrifuge kurz zentrifugiert , um eventuell ausgefal ^¬ lenes Protein abzutrennen. Das Zentrifugat wurde mit Hilfe einer Hamiltonpipette in den Gaschromatographen (GC) eingespritzt (0,4 μΐ) . Als GC diente ein Hewlett Packard 5890 Series II (Säule: Nitroterephthalsäure derivatisiertes PEG 30 m x 0,25 mm; Temperaturprogramm: 5 min 180°C, 10°C/min bis 220°C) .

Zur Quantifizierung der Chromatogramme wurde ein innerer Standard (DMSO) genutzt, welcher bei allen Reaktionen in einer Endkonzentration von 10 mM zugesetzt wurde. Zur Bestimmung der Responsefaktorverhältnisse wurden Glycidol, DMSO und 3-MCPD jeweils in einer Konzentration von 10 mM in der beschriebenen Pufferlösung gelöst und diese Lösung gemessen. Das Flächenverhältnis von 3-MCPD zu DMSO fucPD be ^¬ trug 0,417, das von Glycidol zu DMSO fciy _c i _do i 0, 583.

Zur Kontrolle der Stabilität von 3-MCPD und Glycidol wurde eine Lösung zur Bestimmung der Responsefaktorverhältnisse nach 24 h erneut wie beschrieben gemessen.

Umsetzung von 3-MCPD im 2-Phasensystem

Die Reaktionen wurden in GC-Glasröhrchen durchgeführt und das Reaktionsvolumen betrug in allen Fällen 1 ml. Insgesamt wurden elf Ansätze mit unterschiedlichen Volumenverhältnis ^¬ sen von wässriger Phase und Ölphase erstellt:

Volumenverhältnis wässrige Phase : Ölphase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5. Als Puffer für die wässrige Phase diente wiederum HEPES (50 mM, pH 8) . Die Konzentration von 3-MCPD lag in allen Fällen bei 10 mM, wobei für die Berechnung nur das Volumen der wässrigen Phase berücksichtigt wurde, da davon ausgegangen werden kann, dass 3-MCPD ausschließlich in der wässrigen Phase vorliegt. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in ei ^¬ nem Thermomixer inkubiert. Die Probennahme erfolgte aus der wässrigen Phase wie bereits beschrieben.

Umsetzung des 3-MCPD-l-Monoölsäureesters im 2-Phasensystem Die Reaktionen wurden in GC-Glasröhrchen durchgeführt und das Reaktionsvolumen betrug in allen Fällen 1 ml. Insgesamt wurden elf Ansätze mit unterschiedlichen Volumenverhältnis ^¬ sen von wässriger Phase und Ölphase erstellt:

Volumenverhältnis wässrige Phase : Ölphase 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5.

Als Puffer für die wässrige Phase diente wiederum HEPES (50 mM, pH 8) . Die Konzentration des 3-MCPD-Ölsäureesters lag in allen Ansätzen bei 50 mM. In diesem Fall bezieht sich diese Konzentration auf das Volumen der Ölphase, da der 3- MCPD-Ester in der wässrigen Phase praktisch nicht löslich ist. Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C in einem Thermo ^¬ mixer inkubiert. Die Probennahme erfolgte aus der wässrigen Phase wie bereits beschrieben.

Für die Kontrolle zur Autohydrolyse des 3-MCPD- Ölsäureesters wurde in einem Ansatz mit einem Volumenverhältnis von wässriger Phase zu Ölphase von 1:1 der 3-MCPD- Ester in einer Konzentration von 50 mM (bezogen auf das Vo- lumen der Ölphase) zugegeben und wie die übrigen Ansätze inkubiert .

Synthese des 3-MCPD-l-Monoölsäureesters

3-MCPD (1,1 g) und Ölsäure (3,02 g) werden in 30 ml MTBE gelöst, ca 5 g aktiviertes Molekularsieb (zur Wasserentfer ^¬ nung) hinzugegeben und die Reaktion durch Zugabe von 300 mg Lipase B aus Candida antarctica (CAL-B, Novozymes, Däne ^¬ mark) gestartet. Das Reaktionsgemisch wird bei 37°C über Nacht unter Vakuum und Stickstoffatmosphäre gerührt und nach Dünnschicht-Kontrolle des Umsatzes durch Filtration über eine Nutsche gestoppt. Der Niederschlag wird mit MTBE gewaschen, das Filtrat am Rotationsverdampfer eingeengt und das saubere Produkt in einer quantitativen Ausbeute (4,1 g) erhalten. Die Identität wurde durch NMR-Spektroskopie und GC-MS bestätigt.