Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbilden eines innerhalb eines dreidimensionalen Probenbereichs befindlichen Objektes, insbesondere eines Biochips, und eine Optikvorrichtung, die dazu ausgebildet ist, das Verfahren auszuführen. Das Verfahren betrifft insbesondere das Abbilden von Fluorophoren, die auf einem Biochip gebunden sind.

Labordiagnostische Untersuchungen stellen eine unverzichtbare Grundlage für die moderne Medizin dar. Mittlerweile steht eine Vielzahl von routinemäßig durchführbaren Tests zur Verfügung, mit Hilfe derer in Abwesenheit des Patienten aus Probenmaterial menschlichen oder tierischen Ursprungs entscheidende Informationen zum vorliegenden Krankheitsbild, zur Prognose oder zum Erfolg einer Behandlung erhalten werden können. Die Verantwortung dem Patienten gegenüber gebietet es, an die Zuverlässigkeit und Aussagekraft der Ergebnisse solcher Untersuchungen höchste Anforderungen zu stellen. Aus diesem Grund muss auf arbeitsintensive und technisch aufwändige analytische Verfahren zurückgegriffen werden können, wenn diese gegenüber einfacher durchführbaren Verfahren zuverlässigere Ergebnisse liefern.

Zu solchen überlegenen Verfahren gehört die Immunfluoreszenz. Typischerweise wird dabei eine am menschlichen oder tierischen Körper gewonnene flüssige Probe mit nachzuweisenden Antikörpern auf einen Biochip, der mit einem antigenhaltigen biologischen Reagenz beschichtet ist, aufgetragen und mit fluoreszenzmarkiertem Antikörper versetzt. Enthält die Probe Antikörper, so entsteht auf dem biologischen Reagenz ein fluoreszierender Komplex aus Antigen, Antikörper aus der Probe und markiertem Antikörper. Es kann dann nicht etwa lediglich über eine Quantifizierung des Fluoreszenzsignals wie bei anderen Verfahren, sondern anhand eines unter dem Mikroskop erkennbaren charakteristischen Musters auf dem Biochip eine zuverlässige Diagnose gestellt werden.

BESTÄTJGÜWGSKOPIE Zum Nachteil der Patienten limitiert der erhebliche Aufwand bei der mikroskopischen Untersuchung individueller Proben die Nutzung der Immunfluoreszenz und anderer mikroskopiegestützter Diagnoseverfahren. Nicht nur muss die Probe in mehreren Schritten mit Reagenzien inkubiert werden und manuell für die mikroskopische Untersuchung hergerichtet werden, auch die mikroskopische Untersuchung selbst, bei der in einem ersten Schritt auf das biologische Reagenz fokussiert werden muss, ist arbeitsintensiv und muss von geschultem Fachpersonal durchgeführt werden.

Im Stand der Technik sind verschiedene Ansätze beschrieben worden, um den hohen Ressourcenbedarf für die Immunfluoreszenz zu verringern.

Einerseits besteht die Möglichkeit, durch ausgeklügelte Inkubationsvorrichtungen die benötigte Menge an teuren Reagenzien zu minimieren. So beschreibt die US20100124750 eine Vorrichtung zur Durchführung von Analysen mit Rinnen, wobei ein Objektträger und ein Reagenzträger im verbundenen Zustand mittels eines Bewegungsmittels derart bewegt werden, dass sich in den Rinnen befindliche Flüssigkeit abwechselnd in die beiden Längsrichtungen der Rinnen bewegt. Die DE 10 2013 017802 beschreibt eine Vorrichtung zum Kontaktieren eines immobilisierten Reaktionspartners mit wenigstens einer Flüssigkeit, wobei die Flüssigkeit einem nach unten gewandten immobilisierten Reaktionspartner über eine eng anliegende Erhebung zugeführt wird, so dass das für das Kontaktieren der Flüssigkeit mit dem Reaktionspartner benötigte Volumen minimiert ist.

Andererseits wurden im Stand der Technik auch Ansätze beschrieben, um den Fokussierungsschritt zu automatisieren. Die WO 2012/025220 beschreibt eine dazu geeignete Vorrichtung mit einem Kreuztisch zur automatisierten Untersuchung einer biologischen Probe, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Biochip, auf dessen Oberfläche sich die Probe befindet, eine optisch gut erkennbare Kennzeichnung (zum Beispiel eine Zielscheibe, die kontrastreiche Ringe aufweist) aufweist. Zur automatischen Fokussierung wird zunächst die Kennzeichnung und deren Position bestimmt. In der Folge wird, während der Kreuztisch innerhalb eines anhand der zuvor bestimmten Position verfahren wird, eine Serie von Bildern mit unterschiedlichen Fokussierungen angefertigt. Diese Serie von Bildern wird an eine Auswerteeinheit übertragen, die basierend auf einem Vergleich der Qualität der Bilder eine Fokusebene bestimmt. Dieser Ansatz weist eine Reihe von Nachteilen auf. Zunächst muss die Probe bereits vor der eigentlichen Analyse mehrfach belichtet werden. Dabei kann es nicht nur zu einer Bleichung des Fluorophors in der Fluoreszenzmarkierung kommen, sondern auch zu einer Beeinträchtigung der Probe, worunter die Bildqualität leiden kann, mit der Folge, dass die Diagnose erschwert oder gar unmöglich gemacht wird. Weiterhin muss der Biochip ausschließlich für die Fokussierung mit einer Kennzeichnung versehen werden. Dies erhöht den Aufwand bei der Herstellung und nimmt auf dem Chip Platz in Anspruch, der nicht für Probenmaterial genutzt werden kann. Außerdem erfordert das Aufnehmen und Auswerten der Serie von Bildern eine relativ lange Zeitdauer und großen Speicherbedarf, was ein Hochdurchsatzverfahren erschweren kann. Die DE 10 2010 033 249 A1 offenbart eine mikroskopische Einrichtung zur Abbildung einer Probensubstanz, wobei Kurzkohärenz-Interferometrie zur Bestimmung der Z- Position der Probensubstanz verwendet wird, um die Probensubstanz in die Fokusebene zu bewegen. Dabei wird nach Zuordnung der durch die Probensubstanz verursachten Interferenz zu der Tiefenposition eine diesbezügliche Informationen über eine Ansteuereinheit an Stellantriebe weitergegeben, um entweder durch Bewegung des Objektivs oder des Objektträgers eine Verschiebung der Fokusebene im Z-Richtung so weit zu veranlassen, dass sich diese in der Tiefenposition befindet, in welcher sich die aufzunehmende Probensubstanz erstreckt. Es ist jedoch beobachtet worden, dass ein derartiges Verfahren nicht unter allen Bedingungen zu zufriedenstellenden Ergebnissen hinsichtlich einer korrekten Fokussierung führt.

Die Druckschrift DE 10 2006 027 836 A1 offenbart eine Autofokuseinrichtung für die Mikroskopie, wobei ein Lichtmodulator ein zweidimensionales intensitätsmoduliertes Modulationsobjekt erzeugt, dass im Autofokussierungs-Strahlengang in einer zur Fokusebene des Objektivs konjugierten Ebene liegt und in die Fokusebene des Objektivs abgebildet wird. Dabei erhöht der Lichtmodulator die Komplexität der Vorrichtung.

Die US 2009/0279052 A1 beschreibt ein Operations-Mikroskopiesystem, welches ein OCT-Messgerät aufweist, um eine automatische Fokussierung auf Zellstrukturen zu ermöglichen. Basierend auf einem detektierten OCT-Signal wird ein Hauptobjektiv automatisch eingestellt. Diese Druckschrift offenbart keine Details, in welcher Weise ein OCT-Signal zur Fokussierung verwendet wird, insbesondere wenn sich über der Probe noch eine stark reflektierende Schicht befindet. Es besteht somit Bedarf an einem Verfahren und an einer Vorrichtung zum Abbilden eines Objektes innerhalb eines Probenbereiches, das hinsichtlich einer Fokussierung gegenüber dem Stand der Technik bezüglich Genauigkeit, Schnelligkeit und erforderlichen Ressourcen verbessert ist.

Der Bedarf wird durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche erfüllt. Die abhängigen Ansprüche spezifizieren bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum optischen Abbilden eines innerhalb eines dreidimensionalen Probenbereichs befindlichen Objektes bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte: a) Ermitteln, zumindest an einem lateralen Punkt (bzw. zweidimensionalen Bereich), eines Tiefenprofils des Probenbereichs mittels optischer Kurzkohärenz-Interferometrie; b) Erkennen eines Peaks in dem Tiefenprofil, der von einer Reflexion an einem Objektpunkt herrührt; c) Bestimmen einer optische-Weglänge-Position des Peaks, welche die optische Weglänge des Objektpunktes von einem Referenzpunkt repräsentiert; d) Berechnen, basierend auf der optische-Weglänge-Position und zumindest einer vorbekannten optischen Eigenschaft des Probenbereichs, einer geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes, welche eine geometrische Weglänge des Objektpunktes von dem Referenzpunkt repräsentiert; und e) Fokussieren eines Mikroskops auf den Objektpunkt basierend auf der geometrische-Weglänge-Position zum Abbilden des Objektes.

Das Verfahren kann insbesondere mittels einer Optikvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.

Der dreidimensionale Probenbereichs kann mehrere Teilbereiche umfassen, die jeweils (Gruppen- und Phasen-) Brechungsindizes aufweisen, welche verschieden von einem entsprechenden Brechungsindex für Luft in einem Wellenlängenbereich (insbesondere Fluoreszenzlicht) sind, der für die mikroskopische Abbildung verwendet wird. Der dreidimensionale Probenbereich kann insbesondere durch mindestens einen Teilbereich, der einen Brechungsindex aufweist, welcher von dem der Luft abweicht, von einem Raumbereich, der lediglich Luft aufweist, abgegrenzt sein. Der dreidimensionale Probenbereich kann insbesondere bei Zimmertemperatur feste und/oder flüssige Teilbereiche umfassen. Einer dieser Teilbereiche kann das abzubildende Objekt umfassen. Der laterale Punkt kann eine Ausdehnung in zwei Dimensionen haben, welche einer Querschnittsausdehnung eines Messstrahls entspricht, welcher für die Kurzkohärenz- Interferometrie verwendet wird. Die Ausdehnung des lateralen Punkts kann zum Beispiel 5 μιη bis 10 m in jeder der zwei Dimensionen betragen.

Das Tiefenprofil basiert auf einem Interferenz-Signal, welches durch Interferenz von Referenzlicht mit Licht entsteht, welches von dem Probenbereich an dem lateralen Punkt auf verschiedenen Tiefen reflektiert ist. Dazu wird der Probenbereich mit Licht beleuchtet, welches eine kurze Kohärenzlänge hat. Eine konstruktive Interferenz des Referenzlichts mit von dem Probenbereich herrührendem Licht kann nur dann auftreten, wenn die optische Weglänge, welche das Referenzlicht zurückgelegt hat, bis auf die Kohärenzlänge genau mit der optischen Weglänge übereinstimmt, welche das Licht, welches von dem Probenbereich herrührt, zurückgelegt hat. Aufgrund verschiedener Teilbereiche innerhalb des Probenbereichs, die unterschiedliche (Phasen-) Brechungsindizes aufweisen, kommt es an Zwischenschichten zwischen verschiedenen Teilbereichen zu Reflexionen, die in dem Interferenzsignal detektiert werden können.

Optische Kurzkohärenz-Interferometrie wird in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung als optisches interferometrisches Verfahren verstanden, um Strukturinformationen innerhalb eines Volumenbereichs eines Objekts zu bestimmen. Zuweilen wird Kurzkohärenz-Interferometrie innerhalb dieser Anmeldung auch als optische Kohärenztomografie (OCT) oder Weißlichtinterferometrie bezeichnet, obwohl die Kurzkohärenz-Interferometrie, welche innerhalb des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz kommt, nicht notwendigerweise eine Tomographie durchführen muss. Die Kurzkohärenz-Interferometrie erfordert gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Aufnahme eines Tiefenprofils zumindest an einem lateralen Punkt. Der Kürze halber wird jedoch die Kurzkohärenz-Interferometrie auch als OCT bezeichnet.

Dazu wird ein in dem Objekt- bzw. Probenbereich angeordnetes Objekt mit einem ersten Teil des von der Lichtquelle erzeugten OCT-Messlichts beleuchtet. Der erste Teil des Messlichts wechselwirkt mit Materie innerhalb eines Volumenbereichs des Objekts, wobei ein Teil des ersten Teils des OCT-Messlichts von dem Objekt zurückkehrt. Der von dem Objekt zurückgekehrte Teil des OCT-Messlichts wird mit einem zweiten Teil des OCT- Messlichts interferometrisch überlagert und von einem Detektor registriert. Verschiedene Implementierungen von OCT, die alle von dem Verfahren angewendet werden können, unterscheiden sich in der Art und Weise, wie das Objekt entlang einer Tiefenrichtung des Objekts abgetastet wird und auch in der Art und Weise, wie das überlagerte Licht registriert wird. Abhängig von dem in dem untersuchten Objekt umfassten Material, einer Wellenlänge des OCT-Messlichts und anderen physikalischen Eigenschaften nimmt eine Intensität von OCT-Messlicht, das in das Objekt eindringt, exponentiell ab, was durch eine bestimmte Eindringtiefe charakterisiert werden kann. Insbesondere kann ein Grad einer Reflektivität innerhalb des Probenbereichs von einem Brechungsindex und/oder einem Gradienten des Brechungsindexes des Materials innerhalb dieses Probenbereichs abhängen. Insbesondere kann das OCT-Messlicht eine kleine Kohärenzlänge aufweisen, die etwa im Bereich einiger Mikrometer liegt. Die Kohärenzlänge des OCT-Messlichts repräsentiert eine mittlere Länge eines Wellenzuges, in dem verschiedene Abschnitte des Wellenzuges in einer definierten Phasenbeziehung stehen. Der erste Teil des OCT-Messlichts, der von dem Objekt zurückkehrt, ist nur dann mit dem zweiten Teil des OCT-Messlichts interferenzfähig, wenn eine Differenz der von den beiden Teilen des OCT-Messlichts durchlaufenen optischen Weglängen kleiner als die Kohärenzlänge des OCT-Messlichts ist. Aufgrund dieses Prinzips kann das OCT-System Strukturinformationen über den Probenbereich bei einer definierten Tiefe erhalten.

Ausführungsformen der Erfindung umfassen verschiedene Varianten einer Kurzkohärenz- Interferometrie-Apparatur, die in der Optikvorrichtung neben dem Mikroskopiesystem bereitgestellt ist. Diese Varianten eines OCT-Systems unterscheiden sich dahingehend, auf welche Weise verschiedene Tiefen innerhalb des Objekts abgetastet werden und auf welche Weise das überlagerte Licht detektiert wird.

Bei Time-Domain-OCT (TD-OCT) wird das Abtasten des Probenbereichs in verschiedenen Tiefen durch Verändern der optischen Weglänge durchgeführt, welche von dem zweiten Teil des OCT-Messlichts (auch Referenzlicht genannt) durchlaufen wird.

Hierzu kann beispielsweise eine reflektierende Fläche, wie etwa ein Spiegel, verschoben werden, während gleichzeitig eine Intensität des überlagerten Lichts detektiert wird.

Nachteilig bei diesem Verfahren ist jedoch, dass eine mechanische Verlagerung der reflektierenden Fläche durchgeführt werden muss, was mit Ungenauigkeiten eines

Betrages der Verschiebung der reflektierenden Fläche als auch mit Ungenauigkeiten hinsichtlich der korrekten Orientierung der reflektierenden Fläche behaftet sein kann.

Auch erfordert das Verfahren des Reflektors zum Aufnehmen eines Tiefenprofils eine relativ lange Zeitdauer. Frequency-Domain-OCT (FD-OCT) ist eine weitere Variante eines OCT-Systems, das in der Optikvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bereitgestellt sein kann. Hierbei wird ebenso der zweite Teil des OCT-Messlichts (Referenzlicht) an einer reflektierenden Fläche reflektiert, diese reflektierende Fläche muss jedoch nicht verschoben werden, um verschiedene Tiefen innerhalb des Objekts zur Strukturbestimmung abzutasten. Stattdessen werden Strukturinformationen über den Probenbereich in verschiedenen Tiefen erhalten, indem Intensitäten des überlagerten Lichts in Abhängigkeit einer Wellenlänge des überlagerten Lichts detektiert werden. Gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können verschiedene Ausgestaltungen von Frequency-Domain-OCT in dem Verfahren und der Optikvorrichtung verwendet werden. Insbesondere können die Ausgestaltungen von Frequency-Domain- OCT Spektral-Domain-OCT (SD-OCT), bisweilen auch Fourier-Domain-OCT genannt, und Swept-Source-OCT (SS-OCT) verwendet werden. Bei Spektral-Domain-OCT wird das überlagerte Licht aus Referenzlicht und dem von dem Objekt zurückkehrenden OCT-Messlicht unter Verwendung eines Spektrometers spektral zerlegt, um mehrere Spektralteile des überlagerten Lichts räumlich zu separieren. Intensitäten dieser räumlich separierten mehreren Spektralteile des überlagerten Lichts werden beispielsweise durch einen ortsauflösenden Detektor, wie etwa eine CCD- Kamera/Zeilendetektor, detektiert. Hierbei kann der ortsauflösende Detektor mehrere Detektorsegmente umfassen, wobei jedes dieser Detektorsegmente einen Spektralteil des überlagerten Lichts empfängt. Der ortsauflösende Detektor stellt dann elektrische Signale bereit, welche den Intensitäten der mehreren Spektralteile entsprechen, welche ein Spektrum des überlagerten Lichts repräsentieren. Durch Analyse des Spektrums, wie etwa durch Fourier-Transformation, kann eine Verteilung von Reflektivitäten innerhalb des Objekts entlang der Tiefenrichtung, d. h. einer axialen Richtung, erhalten werden, um somit ein Tiefenprofil zu bestimmen.

Für Time-Domain-OCT als auch für Spektral-Domain-OCT kann beispielsweise als Lichtquelle zum Erzeugen des OCT-Messlichts eine Superlumineszenzdiode verwendet werden. Die Lichtquelle zum Erzeugen von OCT-Messlicht kann OCT-Messlicht mit einer Spitzenwellenlänge zwischen 800 nm und 1300 nm und mit einer spektralen Breite zwischen 5 nm und 100 nm, insbesondere zwischen 15 nm und 30 nm erzeugen. Eine Kohärenzlänge des OCT-Messlichts ist umgekehrt proportional zu der spektralen Breite des OCT-Messlichts. Im Falle von Spektral-Domain-OCT beeinflusst die spektrale Breite des OCT-Messlichts, mit welchem das Objekt beleuchtet wird, eine erreichbare axiale Auflösung, d. h. eine Auflösung entlang der Tiefenrichtung.

In Spektral-Domain-OCT kann beispielsweise als Spektrometer zum räumlichen Separieren der mehreren Spektralteile des überlagerten Lichts ein Beugungsgitter oder eine Mehrzahl von Beugungsgittern mit weiteren optischen Komponenten verwendet werden.

Andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwenden eine andere Ausgestaltung von Frequency-Domain-OCT, nämlich Swept-Source-OCT (SS-OCT). Hierbei wird das Objekt mit OCT-Messlicht beleuchtet, welches eine sehr viel kleinere Spektralbreite aufweist, und somit eine sehr viel größere Kohärenzlänge als in Time- Domain-OCT oder Spektral-Domain-OCT. Hierbei wird während einer Messung die Zentralwellenlänge des beleuchtenden OCT-Messlichts über einen Bereich von Wellenlängen von etwa 10 nm bis hin zu 200 nm oder mehr verändert. Während des Veränderns (sweeping) der Zentralwellenlänge des OCT-Messlichts wird das von dem Probenbereich zurückkehrende OCT-Messlicht, welches mit Referenzlicht überlagert ist, von einem Detektor, wie etwa einer Fotodiode, detektiert. Somit kann ein Spektrum des überlagerten Lichts durch zeitliches Ändern der Zentralwellenlänge des OCT-Messlichts und Detektieren des überlagerten Lichts erhalten werden. Wie in dem Fall von Spektral- Domain-OCT kann Strukturinformation über das Objekt durch Analyse des aufgenommenen Spektrums des überlagerten Lichts, wie etwa durch Fourier- Transformation, erhalten werden. Im Gegensatz zu Spektral-Domain-OCT ist hierbei jedoch kein Spektrometer notwendig und auch kein ortsauflösender Detektor.

Das Ermitteln des Tiefenprofils l ann ein Detektieren von Interferenzlicht, insbesondere mittels eines Zeilendetektors, und ein Auswerten des detektierten Interferenzlichts, insbesondere ein Durchführen einer Fouriertransformation umfassen. Das Tiefenprofil kann die Stärke bzw. Intensität der Reflektivität an verschiedenen optische-Weglänge- Positionen innerhalb des Probenbereichs repräsentieren. An einer bestimmten optische- Weglänge-Position hat das von dem Probenbereich herrührende OCT-Licht eine bestimmte optische-Weglänge zurückgelegt, welche jedoch nicht der geometrischen Weglänge entspricht, da zur Umrechnung noch der Brechungsindex bzw. die Brechungsindizes (insbesondere Gruppen-Brechungsindizes) der Materialien bzw. Teilbereiche innerhalb des Probenbereichs berücksichtigt werden müssen, die von dem OCT-Licht durchlaufen sind. Ein Peak im Tiefenprofil kann durch eine (lokal) hohe Reflektivität in einer bestimmten Tiefe verglichen mit anderen Positionen in dem Tiefenprofil charakterisiert sein. Der Peak kann durch Auswerten einer Charakteristik, insbesondere eines Verlaufs des Tiefenprofils erkannt werden, insbesondere indem ein oder mehrere lokale Maxima in dem Tiefenprofil bestimmt werden und mit vorbekannten Teilbereichen bzw. Zwischenschichten von Teilbereichen innerhalb des Probenbereichs assoziiert werden. Die Reflexion an dem Objektpunkt kann insbesondere einer Reflexion an einem abzubildenden Biochip an einem Punkt entsprechen.

Das Bestimmen der optische-Weglänge-Position des Peaks kann ein Bestimmen einer Position eines lokalen Maximums in dem Tiefenprofil umfassen. Insbesondere kann das Tiefenprofil durch eine Mehrzahl von Messwerten gebildet sein, die jeweils einen Reflektivitätswert und eine optische-Weglänge-Position aufweisen. Dabei können verschiedene Messwerte durch ein bestimmtes Abtastintervall voneinander getrennt sein. Zwischenwerte können interpoliert werden. Zur Bestimmung der optische-Weglänge- Position des Peaks kann eine Anpassung einer Funktion an die Mehrzahl von Messwerten durchgeführt werden. Das Berechnen der geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes kann auf ein Vorwissen hinsichtlich des Aufbaus und/oder der vorbekannten optischen Eigenschaft des Probenbereichs aufbauen. Die zumindest eine vorbekannte optische Eigenschaft kann insbesondere ein oder mehrere Brechungsindizes (insbesondere Phasen- Brechungsindizes und/oder Gruppen-Brechungsindizes) von einem oder mehreren Teilbereichen innerhalb des Probenbereichs bis zum Objektpunkt umfassen. Das Tiefenprofil kann jedoch Information über Reflektivität enthalten, welche sogar jenseits des Objektpunktes liegt. Ein diesseits des Objektpunktes liegender Bereich des Probenbereichs wird dabei als ein Bereich verstanden, welcher von dem OCT-Licht von einer OCT-Lichtquelle aus innerhalb des Probenbereichs bis zum Objektpunkt durchlaufen wird. Ein jenseits des Objektpunktes liegender Bereich des Probenbereichs wird dabei als ein Bereich verstanden, der von dem OCT-Licht nach Erreichen des Objektpunktes innerhalb des Probenbereichs durchlaufen wird. Der jenseits des Objektpunktes liegende Bereich des Probenbereichs kann in dem Tiefenprofil berücksichtigt werden, um den Peak zu erkennen, d.h. um zu erkennen, dass eine erhöhte Reflektivität an einer bestimmten Position in dem Tiefenprofil von einer Reflexion von dem Objektpunkt herrührt. Dieser jenseits des Objektpunktes liegende Bereich wird jedoch zur Berechnung der optische-Weglänge-Position des Objektpunktes nicht benötigt. In einigen Ausführungsformern kann der Unterseite des Objektträgers zur Berechnung der Brechungsindizes oder als Referenz benutzt werden. Das Fokussieren des Mikroskops kann ein Verfahren eines Hauptobjektivs des Mikroskops entlang einer optischen Achse (parallel zur Tiefenrichtung) des Hauptobjektivs umfassen, wobei die optische Achse des Hauptobjektivs vorzugsweise parallel bzw. kollinear mit einem Strahlengang des OCT-Lichts ist, das für die Kurzkohärenz- Interferometrie verwendet wird.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Objekt eine biologische Probe, bevorzugt Zellstruktur und/oder Gewebe und/oder Gewebeschnitt mit fluoreszenzmarkiertem Antikörper, auf einem, insbesondere planaren, Biochip, wobei die biologische Probe bevorzugt mindestens eines aus der folgenden Gruppe umfasst: Dünnschnitt biologischen Gewebes, bevorzugt paraffiniert und/oder formalinfixiert oder als Gefrierschnitt, Zellausstrich, Bakterienausstrich, Viren, Protozoen und Parasiten, in Lösung aufgetragene, angetrocknete oder angekoppelte Antigentropfen, sonstige an eine Oberfläche gekoppelte Antigene und beliebige Nukleotidsequenzen. Das Objekt kann insbesondere lichtempfindlich sein, weswegen eine übermäßige Bestrahlung des Objekts mit Licht, insbesondere Fluoreszenzanregungslicht, vermieden werden sollte. Die Bestimmung der Geometrische-Weglänge-Position des Peaks mittels optischer Kurzkohärenz-Interferometrie kann eine Bestrahlung mit OCT-Licht umfassen, welches kein Fluoreszenzanregungslicht aufweisen muss und bezüglich dessen das Objekt nicht lichtempfindlich sein muss. Daher kann eine Schädigung des Objektes während der Bestimmung der geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes (insbesondere eines Punktes auf dem Biochip) gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermindert sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Erkennen des Peaks ein Registrieren eines Musters in dem Tiefenprofil und Zuordnen, bevorzugt anhand relativer Optische-Weglänge-Positionen, von Musterdetails zu vorbekannten Strukturen in dem Probenbereich auf. In dem Tiefenprofil kann bzw. können ein Abstand bzw. Abstände zwischen Maxima bestimmt werden. Diese Abstände können verwendet werden, um zu erkennen, von welcher vorbekannten Grenzfläche bzw. Zwischenschichten eine Reflexion herrührt, welche zu einem (lokalen) Maximum in dem Tiefenprofil führt. Die Anordnung verschiedener Maxima in dem Tiefenprofil kann als ein Muster angesehen werden. Je mehr Maxima (außer dem Maximum, welches dem Peak zugeordnet ist) in dem Tiefenprofil beobachtet werden können, umso zuverlässiger kann der Peak als dasjenige lokale Maximum erkannt werden, das von einer Reflektion von dem Objektpunkt herrührt.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Bildebenenversatz aus einer Tiefenausdehnung und einem Brechungsindex des Probenbereichs bis zum Objektpunkt berechnet, und das Fokussieren erfolgt basierend auf, insbesondere einer Differenz zwischen, der geometrische-Weglänge-Position und dem Bildebenenversatz.

Der diesseits des Objektpunktes liegende Bereich des Probenbereichs kann einen Brechungsindex (insbesondere Phasenbrechungsindex) aufweisen, welcher größer ist als der Brechungsindex von Luft. Daher kann von dem Objektpunkt ausgehendes Licht, das zum Abbilden des Objekts verwendet wird, beim Übergang von dem Probenbereich in Luft vom Lot weggebrochen werden, bevor es ins Objektiv eintritt. Daher muss zur Fokussierung ein Objekt, das in einem Probenbereich befindlich ist, welcher diesseits von den Objektpunkt einen Brechungsindex größer als der von Luft aufweist, weiter von dem Objektiv entlang der optischen Achse des Objektivs wegbewegt werden, als ein Objekt, das diesseits des Objektpunktes keinen Bereich des Probenbereichs aufweist, der einen Brechungsindex hat, welcher größer ist als der von Luft.

Zur korrekten Fokussierung auf das Objekt muss daher der Brechungsindex bzw. die Brechungsindizes (insbesondere Phasen-Brechungsindizes) der Materialien bzw. Teilbereiche des Probenbereichs diesseits des Objektes zusammen mit ihren jeweiligen Tiefenausdehnungen bekannt sein und berücksichtigt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Probenbereich bis zum Objektpunkt Teilbereiche und der Bildebenenversatz wird gemäß berechnet, wobei die d _i geometrische Tiefenausdehnungen der jeweiligen Teilbereiche / bis zum Objektpunkt sind und die n _j die Phasen-Brechungsindizes, bevorzugt bei einer Zentralwellenlänge des zum Abbilden mittels des Mikroskops verwendeten Lichts, der jeweiligen Teilbereiche bis zum Objektpunkt sind.

Die geometrischen Tiefenausdehnungen können vorher zumindest näherungsweise bekannt sein. Ebenso können die Phasen-Brechungsindizes und der Öffnungswinkel des Objektivs bekannt sein. Der Bildebenenversatz kann ohne eine Verwendung von Ergebnissen der Kurzkohärenz-Interferometrie berechnet werden, indem zumindest näherungsweise bekannte Tiefenausdehnungen verwendet werden. Alternativ können die geometrischen Tiefenausdehnungen basierend auf mittels der Kurzkohärenz- Interferometrie bestimmten Differenzen von Optische-Weglänge-Positionen berechnet werden, wobei die Phasen-Brechungsindizes als bekannt vorausgesetzt werden.

Die obige Formel (*) zur Berechnung des Bildebenenversatzes kann angewendet werden für Objektive mit kleinem Öffnungswinkel des Objektivs (kleiner numerischer Apertur (NA)). Bei Objektiven mit hoher NA tritt zusätzlich zu dem Fokusversatz eine Verlängerung des Fokus in axialer Richtung (Tiefenrichtung, d.h. z-Richtung) auf (sphärische Aberration), da der Bildebenenversatz gemäß

vom Einfallswinkel ^a der Strahlen abhängig ist. Dieser Effekt kann zu einer Verminderung der Abbildungsqualität führen. Ein Objektiv mit hoher NA kann deshalb z.B. über einen sogenannten Deckglas-Korrektur-Ring (insbesondere motorisierten Korrekturring) verfügen. Damit kann die Stärke der Deckglaskorrektur (Stärke der sphärischen Aberration) an verschiedene Deckglasdicken und zusätzlich durchlaufene refraktive Medien (wie Glas und/oder Glycerin) angepasst werden. Nach dem Ausmessen der (optischen und/oder geometrischen) Schichtdicken durch die Kurzkohärenz- Interferometrie kann die optimale Einstellung für solch einen Korrekturring berechnet werden. Der Korrekturring kann insbesondere in Abhängigkeit der optischen Weglänge von der Oberseite des Deckglases bis zum Objektpunkt eingestellt werden. Der Fokusabstand des Objektivs kann von der Einstellung des Korrekturrings abhängen. Dies kann bei der Fokussierung berücksichtigt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat eine für die optische Kurzkohärenz-Interferometrie verwendete Kurzkohärenz-Interferometrie- Apparatur eine axiale Auflösung von 1 pm bis 15 pm, bevorzugt 3 pm bis 10 pm, weiter bevorzugt 8 μητι bis 10 μιη, wobei die Geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes mit höherer Genauigkeit, bevorzugt 0,03 μιη bis 1 μιη, weiter bevorzugt 0,1 μητι bis 0,5 μm, als die axiale Auflösung des Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur bestimmt wird.

Damit sind keine übermäßigen Anforderungen an eine axiale Auflösung der Kurzkohärenz-Interferomet e-Apparatur gestellt, so dass konventionell erhältliche Apparaturen verwendet werden können. Nichtsdestotrotz kann aufgrund der Verwendung von Vorwissen über Aufbau und Brechungsindex bzw. Brechungsindizes des Probenbereichs eine absolute geometrische Position des Objektpunktes (entlang einer Tiefenrichtung, die parallel zu der optischen Achse des Mikroskops ist) mit wesentlich höherer Genauigkeit bestimmt werden als das Auflösungsvermögen der Kurzkohärenz- Interferometrie-Apparatur. Insbesondere kann der Probenbereich Grenzschichten bzw. Zwischenschichten zwischen Teilbereichen mit verschiedenen Brechungsindizes aufweisen, welche zur Erreichung dieser Genauigkeit einer absoluten Positionsbestimmung einen größeren gegenseitigen Abstand haben als das Auflösungsvermögen der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Abbilden ein Anregen von Fluoreszenz eines in dem Objekt umfassten Fluorophors und Erfassen des emittierten Fluoreszenzlichtes vom dem Objekt auf.

Das Anregen von Fluoreszenz kann dabei durch das Beleuchten des Objekts mit Fluoreszenzanregungslicht erreicht werden. Als Fluorophore eignen sich fluoreszierende Moleküle oder Molekülgruppen, die über ein ausreichend enges Extinktions- und Emissionsspektrum verfügen, intensiv leuchten und stabil sind. Dem Fachmann sind zahlreiche geeignete Fluorophore mit ihren jeweiligen Extinktions- bzw. Emissionsspektra bekannt, beispielsweise die Fluorophore aus der Gruppe umfassend Hydroxycoumarin (325 bzw. 386 nm), Cascade Blue (410 bzw. 423 nm), DAPI (345 bzw. 455 nm), Texas Red (589 bzw. 615 nm), Fluorescein (495 bzw. 519 nm), X-Rhodamin (570 bzw. 576 nm), Alexa Fluor-Serie, beispielsweise Alexa Fluor 532 (530 bzw. 555nm), Cy-Farbstoffe, z. B. Cy2 (489 bzw. 506 nm), Cy3 (550 bzw. 570 nm) oder Cy5 (650 bzw. 670 nm), DyLight- Farbstoffe, z.B. DyLight549 (562 bzw. 576 nm), Ethidiumbromid (493 bzw. 620 nm), Hoechst 33342 (343 bzw. 483 nm), Fluo-3 (506 bzw. 526 nm) und die fluoreszierenden Proteine GFP (396 bzw. 508), Y66H (360 bzw. 442 nm), Y66F (360 bzw. 508 nm), RFP (563 bzw. 582 nm), EBFP (380 bzw. 440 nm), ECFP (434 bzw. 477 nm), EGFP (488 bzw. 507 nm), sowie fluoreszierende Derivate und Homologe davon, welche sämtlich in verschiedenen Ausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt der Fluorophor aus den Klassen Cyanin-Farbstoffe, Fluoresceine, Rhodamine, am bevorzugtesten handelt es sich um Fluorescein-Isothiocyanat (FITC). Fluorophore können je nach Anwendung underivatisiert eingesetzt werden, z. B. DNA-bindende Fluorophore wie Ethidiumbromid. Besonders bevorzugt ist der Fluorophor jedoch als Markierung Teil eines Reagenz, das mit Molekülen, Zell- oder Gewebebestandteilen oder -strukturen der zu untersuchenden Proben spezifisch interagiert, bevorzugt einem Reagenz aus der Gruppe umfassend Antikörper, Fusionskonstrukte oder Fragmente davon, beispielsweise primäre oder sekundäre Antikörper, Nukleinsäuren, Anticaline, Aptamere und dergleichen. Geeignete Fluorophore und damit markierte Reagenzien sind im Handel erhältlich, beispielsweise von der Firma EUROIMMUN AG, Lübeck.

Wellenlängenbereiche des zur Anregung verwendeten Lichtes können einen Bereich um eine Wellenlänge des Extinktionsmaximum des verwendeten Fluorophors +/- 20 nm, bevorzugt +/- 10 nm, noch bevorzugter +/- 5 nm, umfassen.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der Probenbereich in einem bis zum Objekt durchstrahlten Bereich ein Eindeckglas und eine Flüssigkeit, bevorzugt eine pH-gepufferte Glycerinlösung. Ein derartig gestalteter Probenbereich erlaubt insbesondere ein Abbilden eines Biochips nach einer genauen Fokussierung. Dabei kann das Eindeckglas zwei detektierbare Grenzflächen bereitstellen und eine dritte Grenzfläche jenseits der Flüssigkeit kann eine Oberfläche des zu untersuchenden Biochips darstellen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Tiefenprofil neben dem Peak in einem bis zum Objekt durchstrahlten Bereich einen weiteren Peak, der von einer Oberseite des Eindeckglas herrührt, und noch einen weiteren Peak, der von einer Unterseite des Eindeckglases herrührt, auf, wobei der weitere Peak und der noch weitere Peak zum Erkennen des Peaks und/oder der geometrische-Weglänge Position des Objekts herangezogen werden. Der weitere Peak und der noch weitere Peak können ein Erkennen des Peaks erleichtern und können somit die Zuverlässigkeit des Verfahrens verbessern. In anderen Ausführungsformen kann die Genauigkeit der Bestimmung der geometrischen Position des Objektpunktes verbessert werden. Vorteilhafterweise kann dazu ein konventionell verwendeter Probenbereich zur Untersuchung eines Biochips verwendet werden, ohne den konventionell verwendeten Probenbereich ändern zu müssen, insbesondere ohne auf dem Probenbereich optisch erkennbare Markierungen oder Zielscheiben anbringen zu müssen. Damit können Kosten eingespart werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert das Berechnen der geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes ferner auf einer Optische- Weglänge-Position des weiteren Peaks, einer Optische-Weglänge-Position des noch weiteren Peaks, einem Brechungsindex des Eindeckglases, einer Differenz zwischen der Optische-Weglänge-Position des noch weiteren Peaks und der Optische-Weglänge- Position des Peaks und einem Brechungsindex der Flüssigkeit.

Aus der Differenz der Optische-Weglänge-Position des weiteren Peaks (insbesondere Oberseite des Eindeckglases) und der Optische-Weglänge-Position des noch weiteren Peaks (insbesondere Unterseite des Eindeckglases) kann die Dicke des Eindeckglases berechnet werden. Aus der Differenz der Optische-Weglänge-Position des noch weiteren Peaks und der Optische-Weglänge-Position des Peaks kann die Dicke der Glycerinlösung berechnet werden. Werden dann die Gruppen-Brechungsindizes des Eindeckglases und der Glycerinlösung verwendet, so kann die Geometrische-Weglänge-Position des Peaks und somit unter Berücksichtigung des Bildebenenversatzes die Fokusposition des Objektpunktes bestimmt werden. Somit ist zur Fokuspositionsbestimmung des Objektpunktes lediglich die Auswertung eines Tiefenprofils und Kenntnis der Brechungsindizes des Eindeckglases und der Glycerinlösung erforderlich.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Bestimmen der Optische-Weglänge-Position des Peaks und/oder des weiteren Peaks und/oder des noch weiteren Peaks bevorzugt durch Anpassung einer geeigneten Fitfunktion an ein durch Zeropadding des Interferogramms erzeugtes, überabgetastetes Tiefenprofil und/oder unter Berücksichtigung eines Maximalsignals und beidseitiger Nachbarsignale des jeweiligen Peaks in dem Tiefenprofil, bevorzugt mittels eines Frequency-Estimation- Verfahrens. Andere mathematische Verfahren sind auch möglich. Zeropadding "Auffüllen mit Nullen..." ist ein Verfahren zur virtuellen Vergrößerung der spektralen Auflösung bei der diskreten Fourier Transformation. Das Anhängen von Nullen bewirkt die Interpolation von zusätzlichen Frequenzwerten in der Fourier-Transformierten. Wenn zum Beispiel das Spektrometer bzw. der Detektor 200 Pixelwerte liefert, werden 824 Nullen angehängt. Danach wird eine FFT über 1024 Stützstellen durchgeführt.

Ein Frequency-Estimation-Verfahren ermöglicht eine Erhöhung der Genauigkeit der Bestimmung der Peak-Position im FFT-Spektrum und ist mit der mathematischen Schwerpunktbestimmung vergleichbar. Eine "klassische" Schwerpunktbestimmung führt zu Artefakten, bedingt durch die Faltung zwischen Fensterfunktion und Signal. In dem Frequency-Estimation-Verfahren ist die Peaklagenbestimmung weniger dem Artefakt durch die Faltung zwischen Fensterfunktion und Signal unterworfen, wenn man eine Schwerpunktbestimmung über mehrere Pixel in der Nachbarschaft des maximalen Wertes durchführt. Damit kann insbesondere eine optische-Weglänge-Position des Peaks mit höherer Genauigkeit als die axiale Auflösung der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur bestimmt werden.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die geometrische- Weglänge-Position Z(Obj) des Objektpunktes berechnet gemäß:

Z(Obj) = Z(wP)/n(Luft) + [Z(nwP) - Z(wP)]/n(Glas) + [Z(P) - Z(nwP)]/n(Glycerin), wobei

Z(wP) die Optische-Weglänge-Position des weiteren Peaks ist,

Z(nwP) die Optische-Weglänge-Position des noch weiteren Peaks ist,

Z(P) die Optische-Weglänge-Position des Peaks ist,

n(Luft) der (Gruppen-)Brechungsindex von Luft bei der Zentralwellenlänge des zur Kurzkohärenz-Interferometrie verwendeten Lichts ist,

n(Glas) der (Gruppen-)Brechungsindex des Eindeckglases bei der Zentralwellenlänge des zur Kurzkohärenz-Interferometrie verwendeten Lichts ist, n(Glycerin) der (Gruppen-)Brechungsindex der Glycerinlösung bei der Zentralwellenlänge des zur Kurzkohärenz-Interferometrie verwendeten Lichts ist.

Damit kann die Geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes auf einfache Art berechnet werden, und dann korrekt fokussiert werden, wenn weiterhin der oben definierte Bildebenenversatz berücksichtigt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das Verfahren weiter den Schritt auf: f) laterales Verfahren des Objektes entlang einer ersten Linie und bevorzugt ferner entlang einer zweiten Linie, währenddessen jeweilige geometrische- Weglänge-Positionen einer Mehrzahl, insbesondere zwischen 10 und 30 Objektpunkten jeweils in der ersten und zweiten Linie, von Objektpunkten bestimmt werden.

Ein laterales Verfahren kann mit einer herkömmlichen Probenhalterung mit Verschiebemöglichkeit durchgeführt werden. Das laterale Verfahren kann schrittweise erfolgen, wobei bei jedem Stillstand nach einem Schritt eine geometrische-Weglänge- Position des Peaks bestimmt werden kann. Die (Tiefen-) Position kann jeweils (insbesondere zusammen mit zugehöriger lateraler Positionsinformation) gespeichert werden. Die zweite Linie kann lateral versetzt zu der ersten Linie verlaufen. Dadurch können Positionsinformationen über das Objekt an verschiedenen lateralen Punkten erhalten werden, was eine (spätere) Fokussierung auf das Objekt zur Abbildung des Objekts verbessern kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird anhand von Positionen der Objektpunkte der ersten Linie eine erste Geradengleichung bestimmt wird, anhand von Positionen der Objektpunkte der zweiten Linie eine zweite Geradengleichung bestimmt, wobei aus der ersten und der zweiten Geradengleichung eine Normale des Objektes berechnet wird und die Normale und eine geometrische-Weglänge-Position des Objektes an einem lateralen Punkt zum Fokussieren des Mikroskops an einem anderen lateralen Punkt herangezogen werden.

Eine Bestimmung einer jeweiligen Geradengleichung an die erste Linie bzw. die zweite Linie kann eine Anpassung einer jeweiligen Geraden an die Mehrzahl der gemessenen Punkte derart umfassen, dass ein Fehlerterm minimal wird. Dadurch können Messungenauigkeiten der bestimmten Positionen der gemessenen Punkte teilweise kompensiert werden. Die Geradengleichungen können anhand der geometrische- Weglänge-Positionen oder/und der optische-Weglänge-Positionen ermittelt werden. Die Normale kann allgemein unter Verwendung von mindestens drei Positionen bzw. dreidimensionalen Positionen berechnet werden, nicht notwendigerweise somit unter Zuhilfenahme einer ersten Geradengleichung und einer zweiten Geradengleichung und somit auch nicht unter notwendigerweise Zuhilfenahme eines Vermessene entlang einer ersten Linie und einer zweiten Linie. Wenn eine Vielzahl von Biochips abzubilden sind, so können zunächst sämtliche Biochips zur Bestimmung von zumindest jeweils drei geometrische-Weglänge-Positionen von drei Punkten mittels Kurzkohärenz-Interferometrie vermessen werden. In einem nachfolgenden Durchgang können die Biochips nacheinander abgebildet werden, wobei es vorkommen kann, dass eine laterale Position, die für einen Biochip angefahren ist, nicht genau einer lateralen Position entspricht, die zuvor mittels Kurzkohärenz- Interferometrie hinsichtlich ihrer Tiefenposition, d.h. Fokusposition, vermessen wurde. In diesem Fall kann zur Bestimmung der Tiefenposition, d.h. Fokusposition, der angefahrenen lateralen Position, die geometrische-Weglänge-Position desjenigen zuvor vermessenen Punktes herangezogen werden, welcher der momentanen lateralen Position am nächsten ist, und unter weiterer Heranziehung der bestimmten Normalen (bzw. ihrer Neigung gegenüber der Tiefenrichtung), welche eine Tiefenabweichung von der Tiefenposition des zuvor vermessenen Punktes linear mit dem Abstand von diesem verknüpft.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung hat der Referenzpunkt einen vorbekannten Abstand entlang eines Mikroskopstrahlenganges von einer Position, bevorzugt eine objektseitig nächste optische Fläche, eines Objektivs des Mikroskops, wobei bevorzugt das Objektiv ein 20fach bis 40fach vergrößerndes Objektiv ist und das Mikroskop bevorzugt eine Tiefenschärfe von zwischen 0,5 pm und 1 ,8 pm hat.

Der Referenzpunkt kann ein bezüglich der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur fester Punkt sein. Die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur kann fest oder beweglich, insbesondere verschwenkbar, relativ zu dem Mikroskop sein. Mithilfe des Abstands des Referenzpunkt von der Position des Objektivs kann aus der geometrische-Weglänge- Position des Peaks auf eine Verfahrlänge des Objektivs geschlossen werden, um das Objekt in die Fokusebene des Objektivs zu bringen. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Kurzkohärenz- Interferometrie-Apparatur eine Beleuchtungsquelle (auch als OCT-Lichtquelle bezeichnet) zum Beleuchten des Objektes mit Beleuchtungslicht (auch als OCT-Licht bezeichnet), bevorzugt im Nahinfrarotbereich, und einen Detektor zum Detektieren von Interferenzlicht, welches durch Interferenz von dem Objekt reflektiertem Beleuchtungslicht mit Referenzlicht erhalten ist, auf, wobei die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur bevorzugt ein Gitter zum spektralen Zerlegen des Interferenzlichts aufweist und bevorzugt ausgebildet ist, Tiefenprofile bei einer Messrate von zwischen 1 kHz und 2 kHz aufzunehmen.

Der Detektor kann insbesondere ein Zeilendetektor sein, welcher das Interferenzlicht spektral aufgelöst detektieren kann. Die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur kann insbesondere eine Spektral-Domain-Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur sein oder umfassen. Die Messrate kann ausreichend hoch sein, um eine Mehrzahl von Biochips, welche auf einem Verfahrtisch angeordnet sind, nacheinander zur Fokuspositionsbestimmung zu vermessen und darauffolgend mittels des Mikroskops abzubilden, unter Verwendung abgerufener Fokuspositionen der jeweiligen Biochips,

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Messverfahren zum Vermessen einer Mehrzahl von Biochips, die auf einem Träger lateral nebeneinander angeordnet sind, bereitgestellt, umfassend die Schritte: a) schrittweises laterales, bevorzugt mäanderförmiges, Verfahren des Trägers relativ zu einem Mikroskop und einer Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur; b) bei einem Schritt oder kontinuierlich, Durchführen eines Verfahrens gemäß einem der vorangehenden Ansprüche; und c) Aufnehmen eines Bildes eines jeweils fokussierten Biochips mittels des Mikroskops.

Das mäanderförmige Verfahren erlaubt ein Vermessen eines zweidimensionalen Feldes von Objekten in relativ kurzer Zeit. Ferner erlaubt diese Art eines Verfahrens ein Vermessen entlang einer ersten Linie und entlang einer zweiten Linie. Während des mäanderförmigen Verfahrens des Trägers relativ zu der Kurzkohärenz-Interferometrie- Apparatur kann diese in einen Mikroskop-Strahlengang eingeschwenkt sein (bzw. der Mikroskop-Strahlengang kann ausgeschwenkt sein), so dass eine mikroskopische Abbildung nicht erfolgt. Bestimmte Positionen können jeweils für jedes Objekt der Mehrzahl von Objekten bzw. Biochips in einem Speicher der Optikvorrichtung gespeichert werden. In einem darauf folgenden Durchgang eines Verfahrens des Trägers relativ zu dem Mikroskop können jeweils die der lateralen Position entsprechenden geometrische- Weglänge-Positionen bzw. daraus sich ergebende Fokuspositionen abgerufen werden und das Mikroskop kann basierend auf einer Fokusposition des jeweils im Sichtfeld des Mikroskops befindlichen Biochips fokussiert werden.

Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird während des lateralen Verfahrens des Trägers relativ zu der Kurzkohärenz-Interferomethe-Apparatur jeweils für einen Biochip mindestens eine geometrische-Weglänge-Position bestimmt und mit lateraler Positionsinformation assoziiert gespeichert und das Verfahren weist ferner auf: nach Bestimmen der geometrische-Weglänge-Positionen der Mehrzahl von Biochips, lateralen Verfahrens des Trägers relativ zu dem Mikroskop, Abrufen der gespeicherten geometrische-Weglänge-Position, die mit der momentanen lateralen Position des Mikroskops relativ zu dem Träger assoziiert ist, Fokussieren auf den Biochip zum Abbilden durch das Mikroskop basierend auf der abgerufenen geometrische-Weglänge- Position. Damit kann insbesondere eine Mehrzahl von Biochips rasch und zuverlässig vermessen werden. Es ist zu beachten, dass Merkmale, welche individuell oder in irgendeiner Kombination im Zusammenhang mit einem Verfahren zum Abbilden eines innerhalb des dreidimensionalen Probenbereichs befindlichen Objekts beschrieben, eingesetzt oder bereitgestellt sind, ebenso individuell oder in irgendeiner Kombination für eine Optikvorrichtung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung gelten bzw. angewendet werden können.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Optikvorrichtung zum Abbilden eines innerhalb eines dreidimensionalen Probenbereichs befindlichen Objektes bereitgestellt. Dabei weist die Optikvorrichtung eine Kurzkohärenz- Interferometrie-Apparatur, welche ausgebildet ist, zumindest an einem lateralen Punkt ein Tiefenprofil des Probenbereichs mittels optischer Kurzkohärenz-Interferometrie zu ermitteln, und einen Prozessor auf. Der Prozessor ist ausgebildet, einen Peak in dem Tiefenprofil, der von einer Reflexion an einem Objektpunkt herrührt, zu erkennen, eine Optische-Weglänge-Position des Peaks, welche die optische Weglänge des Objektpunktes von einem Referenzpunkt repräsentiert, zu bestimmen, und basierend auf der Optische-Weglänge-Position und zumindest einer vorbekannten optischen Eigenschaft des Probenbereichs, eine Geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes, welche eine geometrische Weglänge des Objektpunktes von dem Referenzpunkt repräsentiert, zu berechnen. Die Optikvorrichtung umfasst ferner einen Aktuator, welcher ausgebildet ist, ein Mikroskop auf den Objektpunkt basierend auf der Geometrische-Weglänge-Position zum Abbilden des Objektes zu fokussieren.

Die Optikvorrichtung ist insbesondere ausgebildet, ein Verfahren zum Abbilden eines Objektes gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auszuführen. Die Optikvorrichtung kann insbesondere das Mikroskop umfassen. Ferner kann die Optikvorrichtung eine Vorrichtung umfassen, um einen Strahlengang der Kurzkohärenz- Interferometrie-Apparatur zum Beleuchten des Objekts mit OCT-Licht auf ein Sichtfeld des Mikroskops bzw. in einen Strahlengang des Mikroskops zu richten bzw. einzuschwenken und selektiv auszuschwenken.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Optikvorrichtung ferner eine Steuerung auf, welche mit dem Prozessor und dem Aktuator gekoppelt ist, um den Aktuator in Antwort auf ein Ausgabesignal des Prozessors zum Fokussieren zu treiben, um bevorzugt ein Objektiv entlang einer Tiefenrichtung zu verfahren.

Damit kann in automatischer Weise eine Fokussierung einer Vielzahl von Objekten erreicht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Optikvorrichtung ferner eine lateral verfahrbare Probenhalterung auf, welche bevorzugt von der Steuerung zum lateralen Verfahren gesteuert wird.

Somit kann eine Vielzahl von Objekten, welche lateral nebeneinander angeordnet sind, abgebildet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die Optikvorrichtung ferner einen Speicher zum Speichern von geometrische-Weglänge- Positionen einer Mehrzahl von Objektpunkten auf.

Zunächst können mittels der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur Fokuspositionen einer Vielzahl von Objekten, insbesondere Biochips, bestimmt und in dem Speicher gespeichert werden. In einem weiteren Durchgang können die Biochips nacheinander mittels des Mikroskops abgebildet werden, wozu die jeweiligen Fokuspositionen aus dem Speicher abgerufen werden und zur Fokussierung des Objektivs des Mikroskops herangezogen werden.

Die Optikvorrichtung kann ferner ein Objektiv zum Abbilden des Objektes aufweisen, wobei das Objektiv insbesondere (z.B. bei numerischer Apertur größer als 0,7oder größer als 0,8) eine Deckglas-Korrektur-Vorrichtung aufweist, die ausgebildet ist, Bildfehler, insbesondere sphärische Aberration, bei der Abbildung von Objektpunkten aufgrund der Kenntnis von Lage, Dicke und Brechungsindex der Teilbereiche zu korrigieren, wobei der Bildebenenversatz insbesondere durch

berechnet wird, wobei die geometrische Tiefenausdehnungen der jeweiligen

Teilbereiche i bis zum Objektpunkt (120) sind und die ⁿ ' die Phasen-Brechungsindizes, bevorzugt bei einer Zentralwellenlänge des zum Abbilden mittels des Mikroskops verwendeten Lichts, der jeweiligen Teilbereiche bis zum Objektpunkt sind und wobei α der Winkel des Strahlengangs zur optischen Achse des Mikroskop-Objektivs ist. Insbesondere kann die sphärische Aberration des Objektivs durch Änderung der Einstellung der Deckglas-Korrektur-Vorrichtung in einem gewissen Bereich einstellbar sein.

Das Objektiv kann z.B. über einen sogenannten Deckglas-Korrektur-Ring (insbesondere motorisierten Korrekturring) verfügen. Damit kann die Stärke der Deckglaskorrektur an verschiedene Deckglasdicken und zusätzlich durchlaufene refraktive Medien (wie Glas und/oder das Glycerin) angepasst werden. Bei der Verwendung eines solchen Objektivs muss nach dem Auffinden der Fokusebene zusätzlich die optimale Einstellung des Korrekturrings durch "Ausprobieren" ermittelt werden. Nach dem Ausmessen der Schichtdicken durch die Kurzkohärenz-Interferometrie kann die optimale Einstellung für solch einen Korrekturring berechnet werden kann. Der Fokusabstand des Objektivs kann von der Einstellung des Korrekturrings abhängen. Falls die Deckglaskorrektur den Fokusabstand des Objektivs verändert, kann das bei der Fokussierung berücksichtigt werden.

Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, auf die die Erfindung nicht begrenzt ist, werden nun mit Bezug auf die angehängten Zeichnungen beschrieben.

Fig. 1 zeigt schematisch eine Optikvorrichtung zum Abbilden eines innerhalb eines dreidimensionalen Probenbereichs befindlichen Objekts gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung; Fig. 2 zeigt schematisch eine Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur, welche beispielsweise in der Optikvorrichtung von Figur 1 eingesetzt werden kann;

Fig. 3 illustriert einen Probenträger für eine Mehrzahl von Biochips, welche in mehreren Kammern angeordnet sind und gemäß einem Verfahren zum Abbilden eines innerhalb eines dreidimensionalen Probenbereichs befindlichen Objektes untersucht werden;

Fig. 4 zeigt in einer Seitenansicht einen Probenbereich, welcher mit einem Mikroskop der Optikvorrichtung von Fig. 1 abgebildet wird;

Fig. 5 zeigt in einer Seitenansicht einen weiteren Probenbereich mit einer größeren Dicke zur Illustration eines Bildebenenversatzes, welcher gemäß Ausführungsformen zur Fokussierung und Abbildung berücksichtigt wird; Fig. 6 illustriert schematisch Grenzflächen innerhalb eines Probenbereiches, welche gemäß Ausführungsformen der Erfindung erkannt werden, um eine Fokusposition eines Biochips zu bestimmen;

Fig. 7 illustriert eine gemäß Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bestimmbare Fokusebene;

Fig. 8 illustriert ein Offsetspektrum und Fig. 9 illustriert ein Apodisationsspektrum, die bei einer Auswertung eines Interferenz Signals berücksichtigt werden; Fig. 10 zeigt ein von einem Detektor der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur aufgenommenes Spektrum;

Fig. 11 illustriert ein mittels der in Figuren 8 und 9 diskreten Spektren korrigiertes aufgezeichnetes Spektrum von Figur 10;

Fig. 12 zeigt ein gefenstertes Spektrum gemäß Ausführungsformen der Erfindung;

Fig. 13 illustriert ein Tiefenprofil bzw. einen A-Scan, welches zur Bestimmung einer geometrische-Weglänge-Position eines Objektpunktes, insbesondere eines Biochips, herangezogen wird; Fig. 14 illustriert einen Phasenbrechungsindex und einen Gruppenbrechungsindex von Glas, aus welchem ein Eindeckglas des Probenbereichs gefertigt ist;

Fig. 15 illustriert einen Phasenbrechungsindex und einen Gruppenbrechungsindex einer Glycerinlösung, welche zwischen einem Eindeckglas und dem Biochip befindlich ist.

Die Figuren zeigen schematische Darstellungen. Dabei sind in Struktur und/oder Funktion ähnliche oder gleiche Elemente mit Bezugsziffern gekennzeichnet, die sich nicht in den letzten beiden Stellen unterscheiden. Eine Beschreibung eines in einer Figur vorkommenden aber nicht explizit beschriebenen Elementes kann in solchen Fällen der Beschreibung dieses Elements in einer anderen Figur entnommen werden.

Fig. 1 illustriert schematisch eine Optikvorrichtung 100 zum Abbilden eines innerhalb eines dreidimensionalen Probenbereichs 101 befindlichen Objekts 103 gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Die Optikvorrichtung 100 umfasst eine Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 105, einen Prozessor 107 und einen Aktuator 109. Optional umfasst die Optikvorrichtung 100 ein Mikroskop 1 1 1 , das ein Objektiv 1 13, eine Abbildungsoptik 115 und einen Bilddetektor 117 umfasst. Die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 105 ist ausgebildet, zumindest an einem lateralen Punkt 1 19 ein Tiefenprofil des Probenbereichs 101 mittels optischer Kurzkohärenz-Interferometrie zu ermitteln. In Fig. 1 ist dieser laterale Punkt als ein lateraler Bereich 1 19 dargestellt, der eine gewisse laterale Ausdehnung, etwa einiger Mikrometer je nach lateraler Auflösung der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 105, aufweist. Die laterale Ausdehnung des Bereichs 119 ist in einer x-Richtung bzw. einer y- Richtung, welche mit Bezugsziffer 121 gezeigt sind, welche senkrecht auf einer z- Richtung stehen, welche mit Bezugsnummer 123 bezeichnet ist. Die z-Richtung 123 entspricht einer Tiefenrichtung, entlang derer ein Tiefenprofil durch Kurzkohärenz- Interferometrie bestimmt wird.

Dazu weist die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 105 eine Lichtquelle 125 zum Aussenden von OCT-ücht mit kurzer Kohärenzlänge, etwa einige Mikrometer, auf, das entlang eines Lichtleiters 127 zu einem optischen Koppler 129 geführt wird. Der optische Koppler 129 teilt das OCT-ücht in zwei Teile auf, von welchen ein erster Teil entlang des Lichtleiters 127 zu einem Reflektor 131 geführt wird, welcher in seiner Position zum Einstellen einer optischen Referenzlänge verstellbar sein kann. Ein zweiter Teil des OCT- Lichts wird durch den Lichtleiter 127 und nach Austritt aus dem Lichtleiter durch eine Beleuchtungsoptik 133 auf eine geeignete Querschnittsausdehnung geformt, um den Probenbereich 101 entlang der Tiefenrichtung bzw. z-Richtung 123 zu durchstrahlen. Dazu wird das OCT-Licht z.B. mittels eines Reflektors 135 auf den Probenbereich 101 an dem lateralen Punkt bzw. Bereich 119 gerichtet. Der Reflektor 135 ist optional, das OCT- Licht kann auch ohne diesen auf das Objekt gerichtet werden. Ein zentraler Bereich auf dem Reflektor 135 definiert einen Referenzpunkt 136, auf den sich eine geometrische- Weglänge-Position in einem Tiefenprofil bezieht. Der Referenzpunkt 136 kann an anderen Stellen angeordnet sein.

Der Probenbereich 101 umfasst ein Eindeckglas 137, welches eine Vorderseite 139 (das heißt diesseits des Objekts 103 gelegen) und eine Rückseite 141 (diesseits des Objekts 103 gelegen aber jenseits der Vorderseite 139 des Eindeckglases 137 gelegen) hat. Jenseits des Eindeckglases 137 weist der Probenbereich 101 eine Glycerinlösung 143 auf, welche den gesamten Raum zwischen dem Eindeckglas 137 und dem Objekt 103, d.h. eine obere Oberfläche des Biochip 145, ausfüllt. Der Biochip 145 ist mit Klebstoff 147 an einem Kammerboden 149 befestigt. Innerhalb der nur unvollständig illustrierten Kammer mit Kammerboden 149 können mehrere (nicht dargestellte) Biochip 145 enthalten sein.

In einem Tiefenprofil, welches mittels der Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 105 nach einer Auswertung mittels des Prozessors 107 bestimmt ist, können optische- Weglänge-Positionen der Grenzschichten 139,141 und 103 ermittelt werden, die in einem Speicher 151 gespeichert werden können. Insbesondere ist der Prozessor 107 ausgebildet, einen Peak, wie etwa Peak 1353 in Figur 13 zu erkennen und eine entsprechende optische-Weglänge-Position des Peaks zu bestimmen, welcher von einer Reflexion des OCT-Lichts von der Oberfläche 103 des Biochip 145 herrührt. Basierend auf der optische-Weglänge-Position und zumindest einer vorbekannten optischen Eigenschaft des Probenbereichs 101 , wie etwa Brechungsindizes des Eindeckglases 137 und der Glycerinlösung 143 und der jeweiligen Dicken dieser Elemente, berechnet der Prozessor 107 eine geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes 120 auf der Oberfläche 103 des Biochip 145. Der Prozessor 107 kann Steuersignale bzw. Ergebnisse seiner Berechnungen an eine Steuerung bzw. Treiber 155 ausgeben, welche den Aktuator 109 treiben kann, das Objektiv 1 13 entlang der Tiefenrichtung 123 bzw. z- Richtung zu verfahren, so dass der Objektpunkt 120 in der Fokusebene des Objektivs 1 13 angeordnet ist. Das von dem lateralen Bereich 1 19 in verschiedenen Tiefen reflektierte OCT-Licht wird an dem Spiegel 135 reflektiert und tritt wieder in den Lichtleiter 127 ein, welcher das reflektierte OCT-Licht zu den optischen Koppler 129 führt, wo das reflektierte OCT-Licht mit Referenzlicht, welches von dem Referenz-Spiegel 131 reflektiert wurde, zur Interferenz gebracht wird. Das Interferenzlicht wird durch einen Detektor 130 detektiert, welcher in einer Ausführungsform ein optisches Gitter umfasst, um das Interferenzlicht nach Wellenlängen aufzuspalten, bevor es beispielsweise durch einen Zeilendetektor detektiert wird. Elektrische oder optische Signale, welche Intensitäten entsprechen, welche von dem Detektor 130 detektiert wurden, werden dem Prozessor 107 zugeführt, welcher aus diesen Signalen ein Tiefenprofil bestimmt.

Die in Fig. 1 illustrierte Optikvorrichtung 100 weist ferner eine lateral verfahrbare Probenhalterung 157 auf, welche relativ zu einer Basis 159 entlang einer oder mehrerer lateraler Richtungen 121 (zum Beispiel x-Richtung und/oder y-Richtung) bewegt werden kann. Insbesondere kann die Steuerung 107 entsprechende Steuersignale der Basis 159 zuführen, um die Probenhalterung 157, auf welcher der Probenbereich 101 innerhalb einer Kammer angeordnet ist, lateral zu bewegen. Insbesondere können geometrische- Weglänge-Positionen einer Mehrzahl von Oberflächen 103 von Biochips 144 in dem Speicher 151 speichert werden und zur Fokussierung des Objektivs 1 13 aus dem Speicher 151 unter Bezugnahme auf die jeweilige lateralen Position des momentan untersuchten Biochip abgerufen werden.

Die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur innerhalb der Optikvorrichtung kann folgende Spezifikationen erfüllen:

• Eine laterale Verfahrgeschwindigkeit des Objektträgers unter dem Mikroskop- Objektiv von bis zu 60 mm/s wird unterstützt. Die Messfrequenz ist mindestens 1 kHz.

• Die laterale Auflösung kann auf Grund der typischen Proben- und Bildfelddimensionen mindestens 100 μιη betragen.

^• Die axiale Auflösung liegt unter 15 μιη (insbesondere kann sie größer als die Rayleigh-Länge des bei der Fluoreszenzaufnahme verwendeten Objektivs sein). Die Genauigkeit der Positionsbestimmung der Grenzfläche, auf die fokussiert werden soll, kann genauer sein als die Rayleighlänge des Objektivs des Mikroskops.

• Die Messtiefe beträgt bis zu bzw. etwa 2 mm.

Der Probenbereich 101 hat bis zum Objektpunkt 120 eine Tiefenausdehnung TA. Der Öffnungswinkel des Objektivs ist α Die geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes 120 ist mit gWI bezeichnet, der Bildebenenversatz mit δζ und die Differenz zwischen geometrische-Weglänge-Position des Objektpunktes 120 und Bildebenenversatz ist mit Δζ bezeichnet und in Fig. 1 eingetragen. Der Abstand zwischen Objektiv 1 13 und dem Referenzpunkt 136 ist mit A bezeichnet.

Fig. 2 illustriert schematisch eine Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 205, welche zum Beispiel in der Optikvorrichtung 100 der Figur 1 eingesetzt werden kann. Die Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur 205 umfasst eine OCT-Lichtquelle 225, welche OCT-Licht 226 aussendet und auf einen Strahlteiler 229 richtet. Der Strahlteiler 229 teilt das OCT-Licht 226 in zwei Teile auf, wobei ein erster Teil 228 auf einen Referenz Spiegel 231 gerichtet wird und wobei ein zweiter Teil 230 auf den Objektbereich 201 gerichtet wird. Von dem Objektbereich 101 aus verschiedenen Tiefen z (Bezugsziffer 223) reflektiertes OCT-Licht 230 interferiert mit an dem Referenz Spiegel 231 reflektiertem ersten Teil 228 des OCT-Lichts 226 und wird an dem optischen Gitter 232 spektral zerlegt. Das spektral zerlegte Interferenzlicht wird mit der Zeilenkamera 230 detektiert. Daraus kann ein wellenlängenabhängiges Intensitätsspektrum 232 erhalten werden.

Die Probe wird mit einer breitbandigen Lichtquelle konfokal abgerastert, während die

Laufzeit des detektierten Lichts innerhalb der Probe ermittelt wird, um die Streu- und

Reflexionseigenschaften der Probe tiefenaufgelöst zu gewinnen. Die Laufzeitmessung geschieht interferometrisch durch Überlagerung des aus der Probe zurückkehrenden

Lichtes mit einem Referenzstrahl, der eine bekannte Weglänge zurückgelegt hat.

Ein schnelles Spektrometer zeichnet die Interferenzerscheinung wellenlängenaufgelöst auf.

Aus diesem spektralen Interferogramm wird in der Fourier-Domain-OCT mittels Fourier- Transformation die Tiefeninformation gewonnen. Z.B. können folgende Spezifikationen für die Apparatur 105 bzw. 205 gelten: • Messfrequenz 1 , 2 kHz

• Laterale Auflösung 15 μητι · Axiale Auflösung 7 m

• Messtiefe 1 ,6 mm

Fig. 3 zeigt einen Probenträger 350 mit einer Mehrzahl von Kammern 352, in denen jeweils eine Mehrzahl von Biochips 345 enthalten sind, wobei die Biochip gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mittels eines Mikroskops abgebildet werden. Dazu wird der Probenträger 350 zur Bestimmung von Tiefenpositionen der einzelnen Biochips 345 mithilfe von Kurzkohärenz-Interferometrie zunächst mäanderförmig bewegt, wie in der Spur 354 angedeutet ist. Dabei werden bevorzugt zwei Linien 356 und 358 pro Biochip 345 abgefahren und die Tiefenpositionen bzw. geometrische-Weglänge- Positionen an einer Mehrzahl von Punkten 360 auf jedem Biochip werden bestimmt und abgespeichert, beispielsweise in dem Speicher 151 , welcher in Figur 1 illustriert ist. Die Kammern 352 können einen Probenbereich 101 wie in Figur 1 illustriert mit jeweils mehreren Biochip 145 umfassen oder Probenbereiche wie sie beispielsweise in Figuren 4 und 5 illustriert sind.

Der Objektträger 350 kann im Spritzguss-Verfahren aus PMMA hergestellt sein. Sie können je nach Größe entweder 10 oder 50 Kammern aufweisen, in denen sich jeweils bis zu neun Biochips 345 befinden können. Die Biochips können in die Kammern 352 des Objektträgers 350 eingeklebt werden und mit einem Deckglas aus Schott-D263T eingedeckt sein. Der Zwischenraum kann mit Glycerin 143 gefüllt (siehe Fig. 1) sein. Die optischen Eigenschaften und geometrischen Abmessungen der Probenbestandteile sind bekannt: · eingeklebtes Deckglas (Biochip) (Ziffer 145 in Fig. 1)

- Brechungsindex n(Biochip) = 1 , 5230

- Dicke d = 145 ± 15 μιτι

- Laterale Abmessungen 1 * 1 mm ² bis 2 2 mm ² · Locker aufliegendes Deckglas (Ziffer 137 in Fig. 1)

- Brechungsindex n(Glas) = 1 , 5230 - Dicke d = 170 ± 30 μιη

^• Zwischenraum gefüllt mit Glycerin (Ziffer 143 in Fig. 1)

- Brechungsindex n(Glycerin) = 1 , 4722

- Dicke d = 20 ± 20 μιη

Die für die Fluoreszenzaufnahmen verwendeten Objektive 113 erzeugen Foki mit einer Rayleigh-Länge im Mikrometerbereich, so dass auf Grund der herstellungsbedingten Schwankungen der Probenabmessungen nicht ohne weiteres gewährleistet ist, dass sich die Probenoberfläche im Fokus des Objektivs befindet.

Figs. 4 und 5 illustrieren einen Fokusebenenversatz bzw. Bildebenenversatz in refraktiven Medien. Die Biochip-Oberflächen 403 bzw. 503, auf die bei den Fluoreszenz- Aufnahmen fokussiert werden soll, befinden sich nicht an Luft, sondern unter dem Deckglas 437 bzw. 537 und einer Schicht aus Glycerin 443 bzw. 543. Beim Eintritt in diese refraktiven Medien verringert sich der Öffnungswinkel αθ (auch als α bezeichnet) des Strahlengangs auf α'. Dadurch verschiebt sich der Fokus je nach Schichtdicke und Brechungsindex der durchlaufenen Medien von seiner ursprünglichen Position hin zu größeren Arbeitsabständen:

Wird der Biochip 445 bzw. 545 bzw. seine Oberfläche 403 bzw. 503 exakt im Arbeitsabstand unter dem Mikroskop-Objektiv positioniert, dann wird trotzdem keine scharfe Abbildung ermöglicht, weil das Deckglas 437 bzw. 547 und die Glycerinschicht den Fokus innerhalb der Probe versetzen. Es genügt deshalb nicht, nur die Position des Biochips bzw. seiner Oberfläche 403 bzw. 503 genau zu kennen. Für eine Positionierung des Biochips im verschobenen Fokus müssen zusätzlich die genauen Grenzflächen der darüber liegenden refraktiven Medien bekannt sein.

In Figs. 4 und 5 ist der Abstand zwischen Biochipoberfläche 403 bzw. 503 und Mikroskopobjektiv 413 bzw. 513 in beiden Fällen identisch, trotzdem erscheint der Biochip in Fig. 5 zu hoch. Die Probe müsste abgesenkt werden, um den Biochip 503 in den Fokus des Objektivs 513 zu bewegen. Mittels Optischer Kohärenztomografie hingegen werden nicht die tatsächlichen geometrischen Strukturen, sondern Lichtlaufzeiten innerhalb der Probe, also optische Weglängen gemessen. Durch die Erhöhung der Glycerin- Schichtdicke verlängert sich die Lichtlaufzeit zur Biochip-Oberfläche 403 bzw. 503, so dass diese in Fig. 5 weiter vom Objektiv 513 entfernt zu sein scheint. Würde man lediglich die Position der Biochip-Oberfläche 503 im OCT-Bild anpassen, dann müsste man in diesem Beispiel die Probe also anheben und damit den Biochip noch weiter vom Fokus entfernen als er es ohnehin schon ist. Die unterschiedlichen Einflüsse der refraktiven Medien auf den Fokusebenenversatz und die Laufzeitmessung mittels OCT werden gemäß Ausführungsformen der Erfindung berücksichtigt.

Dazu werden zunächst die drei relevanten Grenzflächen Luft-Glas 639, Glas-Glycerin 641 und Glycerin-Biochip 603 präzise vermessen, wie in Fig. 6 illustriert ist. Anschließend wird die Fokusebene 703 bezüglich ihrer Tiefenposition und ihrer Orientierung mittels einer Normalen N (die senkrecht auf der Ebene 703 steht) berechnet, wie in Fig. 7 illustriert ist, in der der Biochip positioniert werden muss, um eine scharfe Abbildung zu erhalten.

Figs. 8-13 illustrieren Prozessierungsschritte einer Verarbeitung von Interferenz-Signalen, welche durch einen Detektor einer Kurzkohärenz-Interferometrie-Apparatur, etwa Detektor 130, welcher in Figur 1 illustriert ist, oder Detektor 230, welcher in Figur 2 illustriert ist, aufgenommen sind.

Das in Fig. 8 illustrierte Offsetfehler-Spektrum 861 (dargestellt in einem Koordinatensystem mit einer Abszisse 863, welche mit der Wellenlänge verknüpft ist, und mit einer Ordinate 865, welchem mit einer Intensität verknüpft ist) wird üblicherweise beim Einschalten des Gerätes aufgenommen, bevor die OCT-Lichtquelle, wie etwa eine SLD, eingeschaltet wird, und wird später für einen Schwarzabgleich der aufgezeichneten Spektren benutzt.

Das in Fig. 9 dargestellte Apodisationsspektrum 867 wird aufgezeichnet, um die spektrale Intensitätsverteilung der OCT-Lichtquelle (zum Beispiel SLD) zu bestimmen. Während der Aufnahme darf kein Licht aus dem Probenarm auf das Spektrometer fallen. Zum Beispiel kann ein mechanischer Verschluss den Probenarm blockieren oder der Mikroskoptisch kann derart verfahren werden, dass sich während der Aufnahme des Apodisationsspektrums kein Objekt im Fokusbereich der OCT-Abbildungsoptik befindet. Da sich das Spektrum mit der Zeit ändern kann, kann es in regelmäßigen Abständen neu aufgenommen werden. Es bietet sich an, dies beispielsweise direkt vor dem Vermessen jedes Objektträgers durchzuführen. Die beiden Referenzspektren 861 und 867, welche in Figuren 8 bzw. 9 dargestellt sind, können aus jeweils 25 aufeinanderfolgenden Spektren gemittelt werden. Anschließend können die Objektträger vermessen werden, indem an unterschiedlichen lateralen Positionen (x, y) der Proben jeweils ein Spektrum 1069 aufgezeichnet wird, wie in Fig. 10 illustriert ist.

Die weitere Prozessierung der Spektren kann folgende Schritte umfassen:

1. Apodisation und Off set- Korrektur: Jedes aufgezeichnete Spektrum wird mit

den beiden zuvor aufgezeichneten Referenzspektren verrechnet. Dabei wird zu- nächst das unkorrigierte Apodisationspektrum abgezogen, anschließend wird durch das Offset-korrigierte Apodisationsspektrum geteilt:

Ein derartig korrigiertes Spektrum ist in Fig. 11 als Kurve 1171 illustriert.

2. Wellenzahl-Interpolation: Die spektralen Interferogramme werden vom Spektrometer annähernd äquidistant in λ abgetastet. Aus den korrigierten Spektren müssen jetzt äquidistant in der Wellenzahl k = 2ττ/λ abgetastete Spektren interpoliert werden. Interpoliert man das Spektrum an diesen nicht-ganzzahligen Indizes, erhält man das linear in k abgetastete Spektrum. Für die bestmögliche Bildqualität kann eine Spline- Interpolation verwendet werden.

3. Fensterung: Um Nebenbänder zu unterdrücken, werden die Spektren mit einer

Hann-Fensterfunktion multipliziert, wobei das Ergebnis in Fig. 12 als Kurve 1273 gezeigt ist. Die Werte des Hann-Fensters können als Vektor hinterlegt werden.

4. Fouriertransformation: Auf die korrigierten, gefensterten Spektren wird eine

Fast-Fourier-Transformation angewandt. Man erhält (z.B. 1024) komplexe Zahlen.

5. Negative Frequenzen verwerfen: Die negativen Frequenzen enthalten keine zusätzliche Information und können verworfen werden.

6. Beträge bilden: Von den Fourierkoeffizienten bei den (z.B. 512) positiven Frequenzen werden die Beträge gebildet. Logarithmisch dargestellt bilden sie einen klassischen

OCT-A-Scan, wie in Fig. 13 als Tiefenprofil 1375 dargestellt ist. Das in Fig. 13 Illustrierte Tiefenprofil 1375 zeigt vier lokale Maxima, einen Peak 1353 mit optische-Weglänge-Position 1354, welcher von der Oberfläche 103 des Biochips 145 herrührt, einen weiteren Peak 1377 mit optische-Weglänge-Position 1378, welcher von der Oberseite 139 des Eindeckglases 137 herrührt, einen noch weiteren Peak 1379 mit optische-Weglänge-Position 1380, welcher von der Unterseite 141 des Eindeckglases 37 herrührt, und einen zusätzlichen weiteren Peak 1381 , welcher von einer Unterseite 104 des Biochip 145 herrührt. Die Berechnung der Fokusebene aus den prozessierten OCT-Daten kann folgendermaßen erfolgen:

1. Oberflächen identifizieren: Die in den OCT-Daten erkennbaren Oberflächen

werden den jeweiligen Grenzflächen zugeordnet. Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird zunächst der weiter Peak 1377 der Luft-Deckglas- Grenzfläche identifiziert, was leicht durchführbar ist, da dieser weitere Peak den höchsten und meist auch ersten Peak des A-Scans bzw. Tiefenprofils 1375 darstellt. Ist der weitere Peak 1377 der Deckglas-Oberseite 139 gefunden, dann kann die Lage des Peaks 1353 und des noch weiteren Peaks 1379 schon ungefähr anhand der Probenspezifikationen abgeschätzt werden, so dass diese relativ einfach zu identifizieren sind.

2. Frequency Estimation: Nach der Identifikation der relevanten Peaks wird

die exakte Position bestimmt. Dafür kann ein Parabelfit durch das Maximum und die beiden Nachbarwerte eines Peaks verwendet werden. Damit kann die Genauigkeit bei der Positionsbestimmung von 7 pm auf etwa 120 nm erhöht werden. Für eine noch genauere Bestimmung der drei Peak-Positionen (1377, 1379, 1353) kann ein Frequency- Estimation-Verfahren durchgeführt werden. Dabei werden ebenfalls das Maximum der Beträge Azmax und die beiden direkten Nachbarwerte berücksichtigt:

-jwrai— -*nuct i j -z —— 7 ~ ~Ä '

Gemäß anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Peak-Positionen durch andere Verfahren bestimmt werden. Das oben durch die Gleichung definierte Verfahren erfordert keinen höheren numerischen Aufwand und kann die Genauigkeit der Reflexbestimmung von 120 nm auf etwa 25 nm verbessern. Alternativ könnten die verarbeiteten Spektren vor der Fouriertransformation mit Nullen aufgefüllt werden, um einen überabgetasteten A-Scan zu erhalten. In diesem können die Peakpositionen durch Parabelanpassungen mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern bestimmt werden.

3. Biquadratischer Fit: An die lokal detektierten Grenzflächen-Positionen können

Geraden angepasst werden. Würde bei der Datenaufnahme nicht die Probe bewegt, sondern stattdessen der Umlenkspiegel 135 (wenn dieser z.B. als Scan-Spiegel fungiert) (siehe Figur 1), dann müssen aufgrund der Bildfeldkrümmung keine Geraden sondern Parabeln angepasst werden. Wegen der erhöhten Robustheit gegen Ausreißer kann ein iteratives biquadratisches Fitverfahren angewendet werden. Der numerische Aufwand könnte eventuell vermindert werden, wenn zunächst eventuell vorhandene Ausreißer aus den Datenpunkten entfernt werden und dann ein einfacher linearer Least-Square-Fit angewendet wird.

4. Ebenen bestimmen: Mathematisch betrachtet ist das Problem

nach dem Bestimmen von zwei Geraden bereits überbestimmt, weil die beiden

Geraden dieselbe Steigung haben müssen, um in einer Ebene liegen zu können.

Dies könnte beim Fitten der Geraden bereits berücksichtigt werden. Für die Bestimmung der Ebene 703 (siehe zum Beispiel Figur 7) werden drei Punkte benötigt, beispielsweise der erste Wert P1 = (x1 , y1 , z1 ) der ersten Fitgeraden, der letzte Wert P2 = (x2 , y2 , z2) der ersten Fitgeraden und der Mittelpunkt P3 = (x3 , y3 , z3 ) der zweiten Fitgeraden.

Einer der drei Punkte, z. B. P1 , kann direkt als Aufpunkt A der Ebene E dienen. Den Normalenvektor N berechnet man am einfachsten als Kreuzprodukt der Verbindungsvektoren zwischen A und P2 sowie A und P3, wie dem Fachmann bekannt ist. Jeder Punkt P der Ebene 703 erfüllt nun eine sich aus dem Normalen-Vektor N und dem Abstand vom Nullpunkt ergebende Ebenengleichung, wie dem Fachmann bekannt ist.

5. Fokusebene berechnen: An jeder Stelle des Biochips kann aus den drei Grenzflächenpositionen

Z(wP), die optische-Weglänge-Position des weiteren Peaks, Z(nwP), die optische-Weglänge-Position des noch weiteren Peaks,

Z(P), die optische-Weglänge-Position des Peaks ist, die Fokuslage der Biochip-Oberfläche 103 berechnet werden gemäß:

Z(Obj) = Z(wP)/n(Luft) + [Z(nwP) - Z(wP)]/n(Glas) + [Z(P) - Z(nwP)]/n(Glycerin), wobei n(Luft) der (Gruppen-)Brechungsindex von Luft bei der Zentralwellenlänge des zur Kurzkohärenz-Interferometrie verwendeten Lichts ist,

n(Glas) der (Gruppen-)Brechungsindex des Eindeckglases bei der Zentralwellenlänge des zur Kurzkohärenz-Interferometrie verwendeten Lichts ist, n(Glycerin) der (Gruppen-)Brechungsindex der Glycerinlösung bei der Zentralwellenlänge des zur Kurzkohärenz-Interferometrie verwendeten Lichts ist. b) Berechnung des Bildebenenversatzes:

Der Bildebenenversatz δζ, den eine planparallele Platte der Dicke d mit Brechzahl n verursacht, ist abhängig vom Öffnungswinkel α des Strahlengangs. Dadurch stimmt bei unkorrigierten Objektiven der Fokus für die zentralen Strahlen nicht mit dem der Randstrahlen überein, wenn sich eine planparallele Platte (beispielweise ein Deckglas) im Strahlengang befindet:

Ein Objektiv 113 kann zum Beispiel für eine Deckglasdicke von 170 μιη korrigiert sein. Wird dabei der Fokus der Randstrahlen auf die Zentralstrahlen korrigiert, dann kann der Bildebenenversatz gemäß

berechnet werden. c) Berechnung der notwendigen Höhenkorrektur: Die geometrische Lage der Fokusebene ergibt sich aus dem Arbeitsabstand des Objektivs zuzüglich des Bildebenenversatzes, der durch das Deckglas und die Glycerinschicht verursacht wird, wenn sich der Biochip im Fokus befindet. Die geometrische Position der Biochipoberfläche wurde in Punkt a) berechnet. Wird die Probe um die Differenz der beiden Werte angehoben, dann befindet sich die Biochip-Oberfläche im verschobenen Fokus des Objektivs. Die Gruppen- und Phasenbrechungsindices für das Eindeckglas 137 (Schott D263T Eco) bzw. Glycerin Lösung 143 sind in Figs. 14 bzw. 15 in Abhängigkeit von der Wellenlänge dargestellt. Die Werte für die Phasenbrechungsindices 1483 bzw. 1485 sind jeweils kleiner als die Werte der Gruppen-Brechungsindizes 487 und 1489.