US5595893A | 1997-01-21 |
ROSSIGNOL N ET AL: "COMPARISON OF TWO MEMBRANE - PHOTOBIOREACTORS, WITH FREE OR IMMOBILIZED CELLS, FOR THE PRODUCTION OF PIGMENTS BY A MARINE DIATOM", BIOPROCESS ENGINEERING, SPRINGER VERLAG, DE, vol. 23, no. 5, 1 March 2000 (2000-03-01), pages 495 - 501, XP001126228, ISSN: 0178-515X, DOI: 10.1007/S004499900186
RAJBIR SINGH ET AL: "Biofilms: implications in bioremediation", TRENDS IN MICROBIOLOGY, ELSEVIER SCIENCE LTD., KIDLINGTON, GB, vol. 14, no. 9, 1 September 2006 (2006-09-01), pages 389 - 397, XP002726833, ISSN: 0966-842X, [retrieved on 20060718], DOI: 10.1016/J.TIM.2006.07.001
BEI WANG ET AL: "Closed photobioreactors for production of microalgal biomasses", BIOTECHNOLOGY ADVANCES, vol. 30, no. 4, 27 January 2012 (2012-01-27), pages 904 - 912, XP028511666, ISSN: 0734-9750, [retrieved on 20120127], DOI: 10.1016/J.BIOTECHADV.2012.01.019
Patentansprüche 1. Verfahren zum Kultivieren eines Mikroorganismus (10) in einer in vitro Kultur, umfassend die Schritte: - Bereitstellen des Mikroorganismus (10) und eines Kulturmediums (12) in einem Reaktionsbehälter (26) eines Bioreaktors (24), wobei der Mikroorganismus (10) die Eigenschaft aufweist, in einem lebenden Zustand an eine Oberfläche zu adhärieren und nach Absterben bei Vorliegen einer vorbestimmten Ablösebedingung sich von der Oberfläche wieder zu lösen, - Inkontaktbringen des Mikroorganismus (10) mit einer von einer Innenwand des Reaktionsbehälters (26) beabstandenden Oberfläche einer Rückhalteeinrichtung (14) des Bioreaktors (24) und damit Fixieren des Mikroorganismus (10) an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung (14) (A) , und - Bereitstellen eines Substrats (16) als Ausgangsstoff für den Stoffwechsel des Mikroorganismus (10) (B) . 2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt des Ablösens des Mikroorganismus (10) von der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung (14) während oder nach dem Absterben des Mikroorganismus (10) durch Einstellen der Ablösebedingung (C) . 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend den Schritt des Inkontaktbringens eines weiteren Mikroorganismus (10) mit der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung (14) (D) durch Einstellen einer Bedingung, die das Vermehren eines an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung (14) vorhandenen Mikroorganismus (10) auslöst und/oder durch Einbringen des weiteren Mikroorganismus (10) in den Reaktionsbehälter (26). 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Ein- (E) oder Abpumpen (F) des in dem Reaktionsbehälter (26) vorhandenen Kulturmediums (12) über eine Zulauf- (28) und/oder eine Ablaufeinrichtung (30) des Bioreaktors (24) erfolgt . 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein photosynthetischer Mikroorganismus (10) in dem Reaktionsbehälter (26) des Bioreaktors (24) bereitgestellt wird . 6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Inkontaktbringen des Mikroorganismus (10) an einer Oberfläche einer Rückhalteeinrichtung (14), die einen Lichtleiter umfasst, erfolgt . 7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Rückhalteeinrichtung (14) mit Licht beaufschlagt wird. 8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Beaufschlagen mit Licht durch eine als transparente Faser und/oder Netz ausgebildete Rückhalteeinrichtung (14) erfolgt. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, umfassend den Schritt des Auskoppeins des Lichts aus der Rückhalteeinrichtung (14) in den Mikroorganismus (10). 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei der photosynthetische Mikroorganismus (10), die Rückhalteeinrichtung (14) und das Kulturmedium (12) unterschiedliche Brechungsindizes aufweisen. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Mikroorganismus (10) bereitgestellt wird, der einen Biokraftstoff (18) herstellt. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein gentechnisch veränderter Mikroorganismus (10) bereitgestellt wird, der mindestens eine rekombinante DNA für ein Protein zur Adhäsion an einer Oberfläche kodiert und/oder mindestens eine rekombinante DNA für einen Biokraftstoff (18) kodiert . 13. Verfahren zum Herstellen eines Biokraftstoffs (18), umfassend die Schritte eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12. |
Verfahren zum Kultivieren eines Mikroorganismus in einer in vitro Kultur und Verfahren zum Herstellen eines
Sekundärmetabolits
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Kultivieren eines Mikroorganismus in einer in vitro Kultur und ein Verfahren zum Herstellen eines Sekundärmetabolits, z.B. eines
Biokraftstoffes, z.B. eines Biokraftstoffs, einer
Feinchemikalie eines Pharmacons oder eines
Nahrungsmittelzusatzes, mithilfe eines Mikroorganismus.
Das Ernten heterotropher und photosynthetischer
Mikroorganismen aus Großkulturen von z.B. Mikroalgen oder Cyanobakterien stellt einen aufwendigen und zeitintensiven Prozess mit einem hohen Energieaufwand dar. Alternative
Verfahren umfassen photosynthetische Mikroorganismen, die ein gewünschtes Zielprodukt des Stoffwechsels sekretieren, sodass die Mikroorganismen nicht mehr geerntet werden müssen
(EP 2 231 864 AI) . Ein solches Verfahren besteht aus einer Wachstumsphase, in der sich die Mikroorganismen bis hin zu einer optimalen Dichte in einem Kulturmedium reproduzieren, und einer anschließenden Produktionsphase, in denen das gewünschte Produkt synthetisiert, von dem Mikroorganismus stetig in das Kulturmedium sekretiert und anschließend in einem Extraktionsschritt von dem Kulturmedium abgetrennt wird. Während der Wachstumsphase wird die Energie des
photosynthetischen Apparats fast komplett in den
Reproduktionsmechanismus des Mikroorganismus geleitet und es findet keine Produktsynthese statt, während die Energie für den Betrieb eines Bioreaktors weiterhin aufgebracht werden muß . Während der Produktionsphase findet der Zelltod des
Mikroorganismus statt, wodurch die Anzahl der produzierenden Mikroorganismen reduziert wird und nach einigen Wochen ein kompletter Ersatz des Kulturmediums notwendig ist (Robertson, D.E. et al . , „A new dawn for industrial photosynthesis" , Photosynthesis Research 2011 Mar; 107 (3) : 269-277) .
Die Notwendigkeit der kompletten Erneuerung des Kulturmediums birgt die Nachteile, dass bei der Beseitigung einer
beachtlichen Menge an Biomasse der ausgetauschten Kultur weiterhin eine hohe Anzahl produktiver Mikroorganismen verworfen werden muss und eine neue Kultur zunächst in einer nicht-produktiven Reproduktionsphase der Mikroorganismen ist. Die Kultivierung neuer Kulturen benötigt weiterhin eine signifikante Menge an Nährstoffen, was die Kosten erhöht und die Energiebilanz des Prozesses verschlechtert. Bei der
Verwendung photosynthetischer Mikroorganismen setzen sich diese zudem auf der Innenwand eines Photobioreaktors ab, sodass in das Innere der Kultur zu wenig Licht vordringt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Rentabilität eines Kultivierungsverfahrens von Mikroorganismen zu erhöhen. Die Aufgabe wird von dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß dem Patentanspruch 1 gelöst. Weiterhin wird die Aufgabe von dem erfindungsgemäßen Verfahren gemäß Patentanspruch 13 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind durch die Unteransprüche gegeben.
Die Erfindung basiert auf der Idee, immobilisierte
(adhärente) Mikroorganismen in einem Bioreaktor mit einer Rückhalteeinrichtung, die eine von der Innenwand eines
Reaktorbehälters des Bioreaktors beabstandete Oberfläche aufweist, zu kultivieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Kultivieren eines
Mikroorganismus in einer in vitro Kultur umfasst dabei zunächst den Schritt des Bereitstellens eines Mikroorganismus und eines Kulturmediums in dem Reaktionsbehälter. Der
Mikroorganismus weist die Eigenschaft auf, in einem lebenden Zustand an eine Oberfläche zu adhärieren (also zu haften) und nach Absterben bei Vorliegen einer vorbestimmten Ablösebedingung sich von der Oberfläche wieder zu lösen. Es erfolgt ein Inkontaktbringen des Mikroorganismus mit der von der Innenwand des Reaktionsbehälters beabstandenden
Oberfläche der Rückhalteeinrichtung und damit ein Fixieren, also Adhärieren, des Mikroorganismus an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung. Es erfolgt weiterhin ein Bereitstellen eines Substrats als Ausgangsstoff für den Stoffwechsel des Mikroorganismus . Der Mikroorganismus kann ein heterotropher oder phototropher Mikroorganismus sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Mikroorganismus ein phototropher, also
photosynthetischer Mikroorganismus, wie z.B. ein
Cyanobakterium, beispielsweise der Gattung Spirulina.
Definitionsgemäß umfasst der Begriff „photosynthetischer
Mikroorganismus" hier auch eine Mikroalge, also eine ein- bis wenigzellige Alge mit weniger als 50 Zellen, insbesondere mit weniger als 20 Zellen. Um in einem lebenden Zustand an einer Oberfläche zu
adhärieren, kann der Mikroorganismus beispielsweise eine extrazelluläre polymere Substanz (EPS) zur Bildung eines Biofilms oder ein Adhäsin bilden, welches einen festen
Kontakt zwischen dem Mikroorganismus und einer organischen oder nicht-organischen Oberfläche herstellen kann. Ein solcher Mikroorganismus kann ein natürlich vorkommender oder ein gentechnisch veränderter oder ein durch Züchtung
erhaltener Mikroorganismus sein. Die Rückhalteeinrichtung kann beispielsweise eine
vorbestimmte Oberflächenstruktur aufweisen, an der der
Mikroorganismus gut haftet. Die Oberfläche der
Rückhalteeinrichtung kann den Mikroorganismus beispielsweise auch mechanisch festhalten, indem sie rau, geschlitzt oder löchrig ist oder eine haarige oder samtige Struktur aufweist. Ein chemisches Festhalten kann durch eine Oberfläche erreicht werden, die mit einer Zellmembran oder Zellwand in
Wechselwirkung treten kann. Die Oberfläche der Rückhalteeinrichtung kann auch mit einer haftenden Schicht z.B. aus einem Gel, das z.B. Fibronectin enthält, bedeckt sein oder Rezeptoren aufweisen, an die korrespondierende Proteine oder andere Zellbestandteile des Mikroorganismus binden. Die Rückhalteeinrichtung ermöglicht eine Vergrößerung der Oberfläche, an der der Mikroorganismus haften kann.
Die vorbestimmte Ablösebedingung, durch die der
Mikroorganismus sich von der Oberfläche wieder löst, kann von der Art der Eigenschaft, in einem lebenden Zustand an eine Oberfläche zu adhärieren, abhängen. Bildet der
Mikroorganismus in dem lebenden Zustand z.B. ein Adhäsin, ist die Ablösebedingung z.B. ein vollständiger Abbau des Adhäsins durch ein Einstellen der Synthese des Adhäsins oder die
Sekretion einer Protease, die z.B. das Adhäsin abbaut.
Alternativ kann der Mikroorganismus nach dem Zelltod, z.B. nach einem Abbau des Adhäsins, durch einen mechanischen
Einfluss, z.B. ein Vibrieren der Rückhalteeinrichtung als Ablösebedingung, von der Rückhalteeinrichtung ablösen.
Die Verwendung eines solchen Mikroorganismus ermöglicht ein kontinuierliches Kultivieren des Mikroorganismus. Hierfür ist es von Vorteil, wenn das Verfahren das Kultivieren mehrerer der oben beschriebenen Mikroorganismen umfasst. Dadurch, das sich der abgestorbene Mikrorganismus von der Oberfläche ablöst und dann in dem Kulturmedium in Suspension vorliegt, während z.B. ein weiterer lebender Mikroorganismus weiterhin an der Rückhalteeinrichtung haftet, kann der abgestorbene Mikroorganismus entfernt oder ein Produkt aus dem
Kulturmedium abgetrennt werden, ohne dass ein kompletter
Kulturwechsel notwendig ist. Damit verbleibt die Kultur zudem in einer kontinuierlichen Produktionsphase.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens umfasst dieses den Schritt des Ablösens des Mikroorganismus von der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung während oder nach dem Absterben des Mikroorganismus durch Einstellen der
Ablösebedingung. Die Ablösebedingung kann z.B. durch den Prozess des Zelltods an sich, ein Vibrieren der
Rückhalteeinrichtung oder einen durch ein Strömen des
Kulturmediums durch den Reaktionsbehälter erreicht werden. Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens umfasst den Schritt des Inkontaktbringens eines weiteren Mikroorganismus mit der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung. Dies kann durch Einstellen einer Bedingung, die das Vermehren eines an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung vorhandenen
Mikroorganismus auslöst, erreicht werden. Eine solche
Bedingung ist beispielsweise das Vorliegen eines Botenstoffes wie z.B. Mitogen oder ein Hormon (z.B. Diprolin) , das eine Teilung des bereits an der Rückhalteeinrichtung haftenden Mikroorganismus, z.B. über Quorum-Sensing, bewirkt. Diese Bedingung kann z.B. über ein Zugeben des Botenstoffes in den Reaktionsbehälter oder durch Bereitstellen des Botenstoffes durch den bereits an der Rückhalteeinrichtung haftenden
Mikroorganismus eingestellt werden. Die Bedingung wird bevorzugt nach dem Absterben eines Mikroorganismus
eingestellt.
Alternativ oder zusätzlich kann das Inkontaktbringen eines weiteren Mikroorganismus mit der Oberfläche der
Rückhalteeinrichtung durch Einbringen des weiteren
Mikroorganismus in den Reaktionsbehälter erreicht werden.
Dies ermöglicht eine möglichst konstante Anzahl an
Mikroorganismen in der Kultur und schont den bereits
vorhandenen Mikroorganismus, da die Kultur nicht komplett gewechselt werden muss.
Ein Ein- oder Abpumpen des in dem Reaktionsbehälter
vorhandenen Kulturmediums kann über eine Zulauf- und/oder eine Ablaufeinrichtung des Bioreaktors erfolgen. Während der Produktionsphase kann so Kulturmedium aus dem
Reaktionsbehälter abgezogen werden und z.B. mit Nährstoffen versetzt werden. Aus dem Kulturmedium kann zudem während der Produktionsphase z.B. das StoffWechselprodukt , das von dem Mikroorganismus hergestellt und in das Kulturmedium
sekretiert wird, extrahiert werden. Ein fortwährendes
Kultivieren des Mikroorganismus vermeidet unproduktive
Wachstumsperioden .
Es hat sich weiterhin als vorteilhaft erwiesen, einen
photosynthetischen Mikroorganismus mit einer Oberfläche einer Rückhalteeinrichtung, die einen Lichtleiter umfasst, in
Kontakt zu bringen. Ein Lichtleiter ist eine Einrichtung, wie z.B. eine Glasfaser, eine optische Faser oder ein
Lichtwellenleiter, die Lichtwellen über eine vorbestimmte Strecke führt. Dadurch wird das Licht in das Innere des Reaktionsbehälters und damit direkt zu dem photosynthetischen Mikroorganismus geleitet. Außerdem wird die Oberfläche, an der Licht für den photosynthetischen Mikroorganismus
verfügbar ist, vergrößert.
Diese Rückhalteeinrichtung wird in einer weiteren
Ausführungsform mit Licht beaufschlagt. Damit wird das
Versorgen des Mikroorganismus im gesamten Innenraum des
Reaktionsbehälters des Bioreaktors durch eine ausreichende Versorgung mit Licht gewährleistet. Ein solches Verfahren ist zudem von der Lichtdurchlässigkeit des Kulturmediums
unabhängig. Das Beaufschlagen der Rückhalteeinrichtung mit Licht kann das Einkoppeln von Licht in die
Rückhalteeinrichtung, z.B. mit einer Leuchte, die mit der Rückhalteeinrichtung verbunden ist, und/oder das Bestrahlen der Rückhalteeinrichtung mit z.B. Sonnenlicht umfassen, sodass das Sonnenlicht in den Lichtleiter einkoppelt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist dabei die einen Lichtleiter umfassende
Rückhalteeinrichtung als transparente Faser und/oder Netz ausgebildet. Dadurch vergrößert sich die Oberfläche, auf der der Mikroorganismus und/oder mehrere Mikroorganismen haften können . Das Licht kann aus der einen Lichtleiter umfassenden
Rückhalteeinrichtung in den photosynthetischen
Mikroorganismus ausgekoppelt werden. Dies ermöglicht ein direktes Beaufschlagen des Mikroorganismus mit Licht.
Der photosynthetische Mikroorganismus, die
Rückhalteeinrichtung und das Kulturmedium können
unterschiedliche Brechungsindizes aufweisen. Bei einer
Differenz der Refraktionsindizes von Kulturmedium und
Mikroorganismus kann durch den Effekt einer partiellen
Reflexion oder durch das Auftreten eines Tunneleffekts in evaneszenten Wellen (gestörte Totalreflexion) an der
Lichtleiteraußenseite das Licht aus dem Lichtleiter in den Mikroorganismus ausgekoppelt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird ein Mikroorganismus bereitgestellt, der einen
Biokraftstoff synthetisiert und vorzugsweise den
Biokraftstoff in das Kulturmedium ausscheidet, also
sekretiert. Ein Biokraftstoff bezeichnet hierbei einen
Kraftstoff oder ein Molekül, aus dem ein flüssiger oder gasförmiger Kraftstoff hergestellt werden kann. Mithilfe dieses Mikroorganismus kann ein Biokraftstoff, z.B. ein
Alkohol wie z.B. Ethanol, Wasserstoff, ein Alkan, ein Lipid, ein Öl oder ein Triglycerid, ein Triacylglycerol , ein
Fettsäureester oder ein Wachs hergestellt werden.
Der Mikroorganismus kann in einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform ein gentechnisch veränderter Mikroorganismus sein, der mindestens eine rekombinante DNA für ein Protein zur Adhäsion, z.B. ein Adhäsin, an einer Oberfläche kodiert und/oder mindestens eine rekombinante DNA für einen
Biokraftstoff kodiert. Durch die gentechnische Veränderung des Mikroorganismus lässt sich ein Biokraftstoff in noch größerem Maßstab herstellen. Die oben beschriebenen Ausführungsformen des
erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich ebenfalls als ein Verfahren zum Herstellen eines Biokraftstoffs. Die Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten
Zeichnungen noch einmal durch konkrete Ausführungsbeispiele näher erläutert. Dazu zeigt:
FIG 1 eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens,
FIG 2 eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens, und FIG 3 den schematischen Aufbau einer beispielhaften
Vorrichtung zum Kultivieren eines Mikroorganismus 10 und eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens . Die FIG 1 veranschaulicht eine Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens zum Kultivieren eines
Mikroorganismus in einer in vitro Kultur und/oder des
Verfahrens zum Herstellen eines Biokraftstoffs, indem ein Lebenszyklus eines Mikroorganismus 10 gezeigt wird.
Ein im Verfahren bereitgestellter Mikroorganismus 10 kann z.B. eine Cyanobakterie der Gattung Gloeocapsa, Gloeobacter, Anabaena, Nostoc, Nodularia, oder Spirulina sein. Es kann sich jedoch auch um eine andere einzellige Alge oder eine Mikroalge, oder auch um einen heterotrophen Mikroorganismus 10, wie z.B. einen Mikroorganismus 10 der Gattung
Saccharomyces oder Acetinobacter handeln. Der Mikroorganismus 10 kann beispielsweise in seiner natürlich vorkommenden Form verwendet werden und einen der oben genannten Biokraftstoffe herstellen.
Alternativ kann ein gentechnisch veränderter Mikroorganismus 10 verwendet werden, der beispielsweise eine rekombinante DNA für ein Gen, das an der Synthese eines Biokraftstoffes beteiligt ist, wie z.B. ein Alkan, ein Triacylglycerol , ein Fettsäureester oder ein Wachs, kodiert. Ein bevorzugtes Biokraftstoffmolekül kann dabei z.B. durch die Überexpression der Acyl-CoA-Synthetase, Fettsäure-ACP Thioesterase,
bifunktionale Wachs-Ester-Synthase (DGAT) , sowie von Enzymen des Kennedy-Pathways , wie z.B. der Glycerol-3-phosphat
Acyltransferase (GPAT) , Acylglycerophosphat Acyltransferase (AGPAT) , Phosphatidsäure-Phosphohydrolase (PAP) oder
Diacylglycerol Acyltransferase (DGAT) hergestellt werden.
Weitere Enzyme, die geeignet für eine Überexpression in dem Mikroorganismus 10 sind, sind in der Publikation von Chen et al., 2012 (Chen, J.E. & Smith, A.G., „A look at
diacerylglycerol acyltransferases /DGATs) in algae", Journal of Biotechnology 162: 28-39) beschrieben. Einen Überblick über verwendbare Mikroorganismen, die Biokraftstoffe
synthetisieren und Verfahren zu deren Herstellung stellen zudem Hameed et al . (Hameed, MSA, Ebrahim, OH,
"Biotechnological Potential Uses of Immobilized Algae" Int. J. Agri. Biol. 2007; 9(l):183-92) bereit. Konstrukte zur genetischen Modifikation von Cyanobakterien zur Herstellung von Ethanol sind in dem Patent US 6,699,696 (Woods et al . ) und in der WO 2007/084477 (Fu et al . ) beschrieben. Der Mikroorganismus 10 kann alternativ ein durch klassische Züchtung entstandener Mikroorganismus 10 sein.
Im Verfahrensschritt A wird der Mikroorganismus 10, der hier von einem Kulturmedium 12 umgeben ist und zunächst in einer Suspension vorliegt, in einem Reaktionsbehälter eines
Bioreaktors, z.B. einer Bioanlage zur Herstellung des
Biokraftstoffs in großem Maßstab oder einem Bioreaktor in einem Labor, bereitgestellt und mit einer Oberfläche einer Rückhalteeinrichtung 14 in Kontakt gebracht. Dies kann z.B. über Rühren der Suspension erfolgen. Der Mikroorganismus 10 weist die Eigenschaft auf, in dem lebenden Zustand an einer Oberfläche der Rückhalteeinrichtung 14 zu haften, z.B.
dadurch, dass er ein Adhäsin herstellt, das die Zellwand oder die Zellmembran des Mikroorganismus 10 mit der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung 14 verbindet. Dazu kann der
Mikroorganismus 10 beispielsweise eine rekombinante DNA, die z.B. für ein Adhäsin kodiert. Der Mikroorganismus 10 muss jedoch nicht gentechnisch verändert sein.
Die Rückhalteeinrichtung 14 ist dabei von einer Innenwand des Reaktionsbehälters zumindest teilweise beabstandet und befindet sich zumindest teilweise im Innern des
Reaktionsbehälters, sodass der Mikroorganismus 10 von der Innenwand des Reaktionsbehälters beabstandet haftet.
Im Verfahrensschritt B wird dem Mikroorganismus 10 ein oder mehrere Substrate 16, hier z.B. Kohlenstoffdioxid und Wasser, bereitgestellt. Das Substrat ist ein Ausgangsstoff für den Stoffwechsel des Mikroorganismus 10. Der Mikroorganismus 10 stellt über seinen Stoffwechsel ein Produkt 18, z.B. Ethanol her. Der Mikroorganismus 10 kann weiterhin die Eigenschaft aufweisen, das Produkt 18 zu sekretieren, also in das
Kulturmedium 12 auszuscheiden.
Eine Expressionssteuerung kann über dem Fachmann geläufige Methoden wie z.B. Promoterdesign oder Codon-Anpassung
erfolgen. Die BiokraftstoffProduktion, insbesondere eine Lipidproduktion, kann von dem Mikroorganismus 10 kann
weiterhin gesteuert und/oder gesteigert werden. Durch z.B. einen Mangel an Nährstoffen, die für den Aufbau der Biomasse benötigt werden (insbesondere Nitrate und Phosphate) , wird die Reproduktion blockiert und die durch z.B. Photosynthese gewonnene Energie wird in Form von Lipiden in dem
Mikroorganismus 10 gespeichert. Die Konzentration dieser Stoffe in dem Kulturmedium bzw. Wachstumsmedium kann daher genutzt werden, um die z.B. Lipidproduktion zu steuern. Diese Steuerung und/oder Steigerung kann sowohl bei einem natürlich vorkommenden Mikroorganismus 10, als auch bei einem
gentechnisch veränderten Mikroorganismus 10 angewendet werden. Ist der Mikroorganismus 10 ein photosynthetischer Mikroorganismus 10, so stellt eine Lichtquelle 20, z.B. Sonnenlicht oder eine künstliche Lichtquelle, die innerhalb oder außerhalb des Reaktionsbehälters angeordnet ist, Licht (in der FIG 1 als Lichtwelle 22 dargestellt) bereit. Bei Erfüllen der Ablösebedingung während oder nach einem Absterben des Mikroorganismus 10, wenn z.B. an der
Rückhalteeinrichtung 14 z.B. eine Vibration ausgelöst wird, löst sich der Mikroorganismus 10 ab (C) . Die
Bewegungsrichtung P deutet dabei an, dass der abgestorbene Mikroorganismus 10' nach dem Ablösen in dem Kulturmedium 12 in Suspension geht. Der Fachmann kann diese Ablösebedingung in Abhängigkeit von der Art und/oder dem Mittel der Adhäsion einstellen. Umfasst der Mikroorganismus 10 eine genetische Sequenz zum Exprimieren einer Protease, ist die Bedingung beispielsweise erfüllt, wenn während oder nach einem
Absterben des Mikroorganismus 10 diese Protease exprimiert wird und das Adhäsionsprotein spaltet, sodass sich der
Mikroorganismus 10 ablöst. Der Mikroorganismus und/oder die Gesamtheit aller lebenden
Mikroorganismen 10 kann vermehrt werden, indem z.B. ein oder mehrere weitere lebende Mikroorganismen 10 der Kultur zugegeben werden (D) . Dieser oder diese haften dann an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung 14 und stellen in der Produktionsphase das Produkt 18 her (in der FIG 1 unter D nicht gezeigt) . Vor und/oder nach dem Absterben lösen der Mikroorganismus 10 oder die Mikroorganismen 10 ab.
Die FIG 2 zeigt ein kontinuierliches Verfahren zum
Kultivieren eines Mikroorganismus 10 und/oder ein
kontinuierliches Verfahren zum Herstellen eines
Biokraftstoffes, wobei das Vermehren des Mikroorganismus 10 durch ein Einstellen einer Bedingung, die das Vermehren (D) eines an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung 14
vorhandenen Mikroorganismus 10 auslöst, erfolgt.
Im linken Bild der FIG 2 ist eine Rückhalteeinrichtung 14 dargestellt, an deren Oberfläche z.B. zwei Mikroorganismen der Gattung Acetinobacter haften. Das Bereitstellen der
Mikroorganismen 10 und das Inkontaktbringen der
Mikroorganismen 10 mit der Rückhalteeinrichtung 14 kann dabei, wie bereits zur FIG 1 beschrieben, erfolgen. Den beiden Mikroorganismen 10 steht z.B. zumindest ein Substrat 16 zur Verfügung. Beide Mikroorganismen 10 stellen dabei z.B. Ethanol als Produkt 18 her (B) . Im Beispiel der FIG 2 ist ebenfalls ein abgestorbener Mikroorganismus 10 λ gezeigt, der sich bei Erfüllen einer bereits oben beschriebenen
Ablösebedingung von der Rückhalteeinrichtung 14 in Richtung P ablöst (C) . Zwischen den beiden Mikroorganismen 10 bleibt eine Lücke auf der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung 14.
Im mittleren Bild der FIG 2 ist das Inkontaktbringen (D) eines weiteren Mikroorganismus mit der Oberfläche der
Rückhalteeinrichtung zu sehen. Das Vermehren des
Mikroorganismus 10 erfolgt z.B. durch Zugeben eines Mitogens in das Kulturmedium 12, das die Zellteilung des
Mikroorganismus 10 induziert. Andere derartige Botenstoffe oder Hormone sind dem Fachmann bekannt. Die genannte
Bedingung kann alternativ auch eine bestimmte Zelldichte sein, sodass der Mikroorganismus 10 durch Quorum-Sensing mit der Zellteilung beginnt. Der weitere Mikroorganismus 10 kann dabei in der Produktionsphase verbleiben. Die Tochterzelle 10 des Mikroorganismus 10 wird so z.B. bereits bei der
Zellteilung in Kontakt mit der Oberfläche der
Rückhalteeinrichtung 14 gebracht und haftet so zu Beginn ihrer Produktionsphase (rechtes Bild der FIG 2) bereits an der Rückhalteeinrichtung 14.
In dem Ausführungsbeispiel der FIG 3 ist ein schematischer Aufbau einer beispielhaften Vorrichtung zum Durchführen einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens gezeigt. Der Bioreaktor 24 umfasst einen Reaktionsbehälter 26. Der Reaktionsbehälter kann dabei zumindest teilweise aus einem transparenten Material bestehen. Dies ist insbesondere bei der Verwendung eines photosynthetischen Mikroorganismus 10 von Vorteil.
Der in der FIG 3 gezeigte Bioreaktor 24 umfasst weiterhin eine Zulaufeinrichtung 28 und eine Ablaufeinrichtung 30, die im vorliegenden Beispiel als Schläuche ausgebildet sind, und durch die z.B. mittels einer Pumpe 30 Kulturmedium 12 in den Reaktionsbehälter 26 hinein- (E) bzw. hinausgepumpt (F) werden kann. Dies vereinfacht den Wechsel eines Kulturmediums 12 und/oder der Extraktion der StoffWechselprodukte 18. In dem Reaktionsbehälter 26 befindet sich weiterhin eine
Rückhalteeinrichtung 14. Die Rückhalteeinrichtung 14 kann eine Faser, z.B. eine Glasfaser oder Glaswolle, insbesondere eine transparente Faser, umfassen.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist der Mikroorganismus 10 ein photosynthetischer Mikroorganismus 10, z.B. der Gattung Spirulina. Im vorliegenden Beispiel ist die Rückhalteeinrichtung 14 als lichtleitendes Netz ausgestaltet. Ein vergrößerter Ausschnitt des Netzes der
Rückhalteeinrichtung 14 ist in dem Ausschnitt 34 gezeigt. Zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens wird der mindestens eine photosynthetische Mikroorganismus 10 (in der FIG 3 sind der Übersichtlichkeit wegen nur einige der
Mikroorganismen 10 mit dem Bezugszeichen gekennzeichnet) in dem Reaktionsbehälter 26 bereitgestellt. Der Mikroorganismus 10 haftet an der Oberfläche der Rückhalteeinrichtung 14 nach einem der bereits oben genannten Mechanismen. Während des gesamten Verfahrens ist durch den adhärenten Mikroorganismus 10 z.B. das Wechseln des Kulturmediums 12 über die Zulaufeinrichtung 28 und/oder die Ablaufeinrichtung 30 ermöglicht. Im Beispiel der FIG 3 umfasst die Rückhalteeinrichtung 14 einen faserförmigen Lichtleiter, also eine optische Faser oder einen Lichtwellenleiter, der z.B. als Netz ausgestaltet ist. Im Ausschnitt 34 der Rückhalteeinrichtung 14 ist zu sehen, dass dadurch die Oberfläche, an der die
Mikroorganismen 10 haften, erheblich vergrößert wird. Das umgebende Kulturmedium 12 strömt dabei durch das Netz 14, sodass die Mikroorganismen 10 in ständigem Kontakt mit dem Kulturmedium 12 sind. Der Lichtleiter kann z.B. teilweise oder ganz aus einer Glasfaser und/oder auf einer Kunststoff basierenden Faser, wie z.B. eine polymere optische Faser, HCS-Faser (hard cladded silica optical fiber) oder PCS-Faser (plastic-cladded silica optical fiber) bestehen. Gängige Kunststoffe sind z.B. PMMA, Polycarbonat oder Ulexit.
Die Rückhalteeinrichtung 14 und/oder der Lichtleiter kann mit einer Außenwandung des Reaktionsbehälters 26 verbunden sein (in der FIG 3 nicht gezeigt) . Das Licht einer Lichtquelle außerhalb des Reaktionsbehälters 12, z.B. Sonnenlicht oder eine Leuchte, wird durch die Rückhalteeinrichtung 14 und/oder den Lichtleiter in das Innere des Reaktionsbehälters 26 geleitet. Eine Lichtquelle wie z.B. eine Leuchte oder LED kann jedoch auch im Innern des Reaktionsbehälters 26
angebracht sein. Eine künstliche Lichtquelle (in der FIG 3 nicht gezeigt) kann auch mit der Rückhalteeinrichtung 14 verbunden sein, sodass das Licht direkt in die
Rückhalteeinrichtung 14 und/oder den Lichtleiter eingekoppelt wird. Eine künstliche Lichtquelle bietet den Vorteil, dass die Lichtqualität, z.B. die photosynthetisch aktive Strahlung (PAR) mit einer Wellenlänge von 400-700 nm, eingestellt werden kann.
Im vorliegenden Beispiel ist der Reaktionsbehälter 26
transparent, sodass er, wenn er z.B. im Freien aufgebaut ist, von Sonnenlicht durchstrahlt werden kann.
Die oben angeführten Ausführungsbeispiele zeigen das Prinzip der Erfindung, bei dem ein immobilisierter (adhärenter)
Mikroorganismus 10, insbesondere ein photosynthetischer
Mikroorganismus 10, in einem entsprechenden Bioreaktor angezogen wird. Der Mikroorganismus 10 kann dazu in der Lage sein, ein gewünschtes Produkt 18 in das Kulturmedium 12 auszuscheiden bzw. zu sekretieren. Eine weitere Eigenschaft des beschriebenen Mikroorganismus 10 ist das Ablösen des Zellkörpers von einem Träger bzw. einer Oberfläche nach (oder während) dem Zelltod.
Der Mikroorganismus 10 ist z.B. gentechnisch verändert oder gezüchtet und umfasst z.B. die folgenden Eigenschaften:
1) der Mikroorganismus 10 wächst adhärent auf einer
Oberfläche (nicht in Suspension) ,
2) der Mikroorganismus 10 produziert einen Biokraftstoff (oder Vorstufen eines Biokraftstoffs) und sekretiert den Biokraftstoff (oder die Vorstufe des
Biokraftstoffs) in das Kulturmedium 12,
3) der Mikroorganismus 10 kann in einem Wachstums-Modus vorliegen, der die Reproduktion erlaubt, oder in einem Produktionsmodus, in dem ein gewünschtes Produkt 18 hergestellt wird,
4) der Mikroorganismus 10 wächst bis zu einer
vorbestimmten Größe oder zu einem vorbestimmten
Stadium, bevor zwischen dem Wachstumsmodus und dem Produktionsmodus gewechselt wird; die Reproduktion kann durch Teilung einer Elternzelle 10 in dem Reaktor oder durch Inokulation von „Stammzellen" 10, die an freie Stellen des Reaktors, insbesondere der
Rückhalteeinrichtung 14, in Suspension erfolgen, und/oder
5) die Zellen 10 lösen sich beim Zelltod von der
Oberfläche ab und werden mit der Strömung des
Kulturmediums 12 von der Kultur entfernt.
Diese Eigenschaften ergeben, insbesondere in Kombination, die folgenden Vorteile:
- einen einfachen Austausch des Kulturmediums 12, das das gewünschte Produkt 18 enthält, ohne das die Mikroorganismen 10 abgetrennt werden müssen; - Verringerung des Volumens und der Masse des
durchzupumpenden Volumens, wodurch Energie gespart wird;
- verbesserte Zugänglichkeit zu dem gewünschten Produkt 18 durch die erleichterte Extraktion aus dem Wachstumsmedium inklusive Abtrennungsmethoden, wie z.B. Destillation oder Lösemittelextraktion, die die Mikroorganismen 10 abtöten würden ;
- ein leichter und schneller Wechsel der Zusammensetzung des Kulturmediums 12 und/oder Entfernen ungewünschter Substanzen, wie z.B. toxische Nebenprodukte oder Signalmoleküle; dies kann vorteilhaft sein, um Zellaktivitäten auszulösen, die Nährstoff-Verarmung zu berechnen oder einem Quorum-Sensing der Mikroorganismen 10 vorzubeugen;
- das selektive Entfernen bereits abgestorbener
Mikroorganismen 10' aus der Kultur ist ermöglicht. Zellen 10, die beim Zelltod in das Medium 12 abgegeben werden, können anschließend gefiltert werden, sodass die Kultur vorwiegend lebende Zellen 10 umfasst;
- ein fortwährendes Kultivieren der Mikroorganismen 10 ist ermöglicht und verringert die Notwendigkeit, das komplette
Kulturmedium 12 zu wechseln, was zeit- und kostenintensiv wäre ;
- unproduktive Wachstumsperioden werden bei einem
fortwährenden Kultivieren ausgeschlossen, wobei die
betriebsbedingten Kosten reduziert werden;
- die Erfordernisse an die Nährlösung können reduziert werden, da nur tote Zellen 10' ersetzt werden;
- das Volumen an Biomasse toter Mikroorganismen 10', das entsorgt werden muss, wird verringert.
Next Patent: MULTI-LAYERED POLYMER FILM