SUBSTRAT CARBONÉ

La présente invention concerne un procédé de culture de levures oléagineuses, plus particulièrement du genre Yarrowia, sur substrat carboné, en vue de produire des lipides en évitant la production de coproduits exocellulaires, en particulier d'acide citrique, et ce même en excès de substrat carboné.

Ce procédé trouve en particulier une application tout à fait avantageuse pour la production de lipides à usage de carburants alternatifs, en substitution des carburants issus du raffinage du pétrole, par conversion par de telles levures de substrats d'origine agricole non alimentaires et/ou de sous-produits industriels. Ce domaine d'application n'est cependant nullement restrictif de l'invention, et les lipides produits conformément à l'invention peuvent également trouver application dans tout autre domaine, par exemple dans le domaine de la chimie, de l'alimentaire, etc.

Les levures oléagineuses, plus particulièrement du genre Yarrowia, sont connues pour être capables, en conditions de limitation nutritionnelle, de consommer des sources carbonées, telle que du glucose et du glycérol, pour produire de la biomasse, accumuler des substances de réserve carbonées du type polysaccharides et lipides, et produire des coproduits exocellulaires, dont majoritairement l'acide citrique. Il a été montré par des études expérimentales et de modélisation des flux métaboliques de ces levures qu'elles présentent la capacité, en présence d'un apport contrôlé de substrat carboné, d'accumuler une quantité importante de lipides intracellulaires totalement néosynthétisés, par opposition à assemblés, en théorie jusqu'à environ 35 % de leur masse sèche. A ce titre, elles ont fait plus particulièrement l'objet d'études visant à tirer profit de ces propriétés à des fins de production de lipides à partir de substrats carbonés, en particulier contenant du glucose et/ou du glycérol, pour des usages divers, et notamment en tant que combustibles.

Il a ainsi notamment été décrit par l'art antérieur que lorsque des levures du genre Yarrowia se développent en condition de limitation d'azote, avec comme seule source de carbone le glucose, elles accumulent une quantité importante de lipides. Cependant, en présence d'un excès de substrat carboné, il a été constaté que cette production de lipides s'accompagne d'une production accrue de coproduits exocellulaires, principalement, comme il a été exposé ci-avant, d'acide citrique, ces coproduits pouvant s'avérer préjudiciables, et notamment diminuer le rendement de conversion du substrat carboné en lipides. La production d'acide citrique a été expliquée comme associée à un flux de carbone largement supérieur au flux d'azote. Pour maximiser la synthèse de lipides en présence d'un excès de substrat carboné, tout en limitant la production d'acide citrique, il a été proposé par l'art antérieur, plus particulièrement illustré par le document FR- A-2 940 315, une stratégie de conduite de culture de levures du genre Yarrowia lipolytica basée sur un contrôle des apports d'azote et de carbone dans le milieu de culture. Plus particulièrement, il a été proposé de maintenir un rapport entre la vitesse de consommation de carbone et la vitesse de consommation d'azote, par la levure, à une valeur constante, plus précisément comprise entre 13 et 15, lorsque les levures sont en phase d'accumulation des lipides. Il a ainsi été montré que dans ces conditions maîtrisées de limitation en azote, avec comme seule source de carbone le glucose, Yarrowia lipolytica était apte à accumuler une quantité importante de lipides par gramme de biomasse, avec un bon rendement de production de lipides par rapport au glucose consommé, et une vitesse spécifique de production de lipides élevée. La présente invention vise à proposer un procédé alternatif de conduite de cultures de levures, plus particulièrement du genre Yarrowia, dont la mise en œuvre soit simplifiée par rapport aux procédés proposés par l'art antérieur, en particulier au procédé décrit dans le document FR-A-2 940 315, et qui permette de maximiser l'accumulation intracellulaire de lipides par les levures, en évitant voire en excluant la production de coproduits exocellulaires et plus particulièrement d'acide citrique. A l'origine de la présente invention, il a été découvert par les présents inventeurs que, de manière tout à fait inattendue, une gestion adéquate de l'apport en phosphore dans le milieu de culture de levures oléagineuses, et notamment du genre Yarrowia, dans une phase particulière de culture, dite phase de production, pendant laquelle la vitesse spécifique de croissance des levures est maintenue entre 0,03 et 0,06 h ^"1 , permettait de contrôler le flux de carbone et sa répartition entre biomasse, polysaccharides, lipides et coproduits exocellulaires, dont l'acide citrique, et ainsi de maîtriser les performances macro cinétiques d'accumulation intracellulaire de lipides de ces levures, tant en termes de vitesses de consommation du substrat carboné et de production de lipides, que de rendements de conversion du substrat carboné en lipides. Une telle gestion permet plus particulièrement de maximiser cette accumulation intracellulaire de lipides aux vitesses maximales de production, tout en limitant, voire en supprimant, la production d'acide citrique, et ceci même en présence d'un excès de substrat carboné.

Il est ainsi proposé selon la présente invention un procédé de culture de levures oléagineuses, notamment du genre Yarrowia, et plus particulièrement Yarrowia lipolytica, sur substrat carboné, comportant une phase dite de production dans laquelle on ajuste l'apport de phosphore dans le milieu réactionnel de sorte à maintenir la teneur en phosphore intracellulaire à une valeur comprise entre 4 et 27 mg / g de biomasse catalytique, permettant de réguler métaboliquement le flux de carbone pour produire des lipides en évitant la production de coproduits exocellulaires, en particulier d'acide citrique, ceci dans des conditions dans lesquelles l'apport d'azote dans le milieu de culture est ajusté pour limiter la vitesse spécifique de croissance μ des levures à une valeur comprise entre 0,03 et 0,06 h ^"1 .

Une telle phase de production est avantageusement simple à mettre en œuvre. Elle permet un contrôle de l'apport de la source carbonée tel que si le flux d'apport devient supérieur à la demande métabolique pour la production de biomasse et de lipides, il n'y a pas de production préjudiciable de coproduit exocellulaire, en particulier d'acide citrique, ce qui évite les pertes de rendement de conversion du substrat carboné en lipides. Ce procédé n'exige ainsi pas l'élaboration d'un mode de contrôle et commande complexe nécessitant la consommation immédiate des coproduits exocellulaires éventuellement produits par les levures, contrairement aux procédés proposés par l'art antérieur.

La phase de production peut être précédée d'une phase dite de croissance, dans laquelle on amène la culture à la concentration en biomasse adéquate, en fonction de la composition du milieu de culture, du volume du réacteur et de la quantité de lipides que l'on souhaite produire. L'homme du métier saura aisément définir les paramètres d'une éventuelle telle phase de croissance préalable. De même, une phase d'appauvrissement en phosphore, visant à faire diminuer la concentration en phosphore intracellulaire dans les levures à une valeur conforme à l'invention, peut être intercalée entre la phase de croissance et la phase de production proprement dite. Ces phases préalables, qui peuvent être réalisées de manière classique en elle-même pour un homme du métier, permettent d'amener la culture dans des conditions initiales requises pour la mise en œuvre de la phase de production conforme à la présente invention.

Le milieu de culture comprend, de façon classique en elle-même, une source carbonée, une source de phosphore, une source d'azote et une solution saline. Lorsque la culture des levures est réalisée avec un sous- produit industriel en tant que milieu de culture, il entre dans le ressort de l'homme du métier de complémenter ce milieu avec les additifs nécessaires à la bonne mise en œuvre du procédé selon l'invention, en fonction de sa composition initiale.

Dans toute la présente description, on entend par biomasse catalytique les cellules des levures constituées de lipides et polysaccharides structuraux. La biomasse totale, désignée également pour plus de commodité par le terme « biomasse », est entendue ici comme désignant l'ensemble des cellules en prenant en compte les lipides et polysaccharides accumulés intracellulaires. En phase de croissance des levures, la biomasse catalytique correspond à la biomasse totale.

La formule en Cmol d'un composé correspond à la formule brute de ce composé ramenée à une unité de carbone. Ainsi, par exemple, le glucose, dont la formule brute est C ₆ H ₂ 0 ₆ , présente, exprimée en Cmol, la formule CH ₂ 0. De façon classique en elle-même, dans toute la présente description, l'unité Cmol est utilisée pour représenter le nombre de moles ramené à une unité de carbone.

Les termes « acide citrique » et citrate sont utilisés indifféremment l'un de l'autre dans toute la présente description Une fourchette de 0,03 à 0,06 h ^" 1 pour la vitesse spécifique de croissance μ des levures, telle que préconisée par l'invention, s'avère notamment optimale en termes de quantité de lipides produits et de vitesse spécifique de production de lipides, vitesse qui est en particulier favorisée au détriment de celle de production de polysaccharides. Suivant des modes de mise en œuvre préférés, l'invention répond en outre aux caractéristiques suivantes, mises en œuvre séparément ou en chacune de leurs combinaisons techniquement opérantes.

Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, dans la phase de production on ajuste l'apport de phosphore dans le milieu de culture des levures de sorte à maintenir la teneur en phosphore intracellulaire à une valeur comprise entre 4 et 18 mg / g de biomasse catalytique, préférentiellement encore entre 7 et 15 mg / g de biomasse catalytique.

Selon une caractéristique avantageuse de l'invention, le milieu de culture desdites levures comporte des substrats osidiques et/ou des polyols comme seule(s) source(s) carbonée(s), de préférence des sucres simples tels que le glucose et/ou du glycérol.

Préférentiellement, le mode de mise en œuvre est discontinu alimenté, directement transposable à un mode continu multiétagé.

Dans des modes de mise en œuvre avantageux de l'invention, le procédé comporte, postérieurement à la phase de production, une étape de diminution de l'apport en source carbonée dans le milieu de culture lorsqu'on observe que la concentration en carbone extracellulaire dans le milieu n'est pas nulle ou que les levures produisent des polysaccharides. Il est ainsi toujours assuré une production maximale de lipides par les levures, le métabolisme de ces dernières étant alors entièrement orienté vers cette production, au détriment notamment de la production de polysaccharides.

La mesure de la concentration en carbone extracellulaire dans le milieu de culture, et l'évaluation d'une production de polysaccharides par les levures, peuvent être réalisées par toute méthode connue de l'homme du métier. Par exemple, on peut évaluer si des polysaccharides sont ou non produits par les levures par un suivi du potentiel redox de la biomasse, ce potentiel diminuant en présence de polysaccharides.

Dans des modes de mise en œuvre préférés de l'invention, le procédé comporte une étape ultime de diminution de l'apport en azote, de l'apport en source carbonée et le cas échéant de l'apport en solution saline dans le milieu de culture, puis d'arrêt de la culture à l'observation de l'apparition d'acide citrique dans le milieu de culture. Cette étape, dite de mobilisation des polysaccharides, peut être mise en œuvre à la fin de la phase de production, lorsqu'on estime que l'objectif de production de lipides, suivant les critères de rendement prédéfinis, a été atteint. Elle peut par exemple être mise en œuvre lorsque le rapport entre le carbone accumulé par les levures et la concentration en biomasse a atteint son maximum. Ce maximum peut être déterminé expérimentalement par l'homme du métier, pour chaque couple « souche de levure - substrat carboné » donné. A titre d'exemple, pour le couple « Yarrowia lipolytica - glucose », ce maximum est égal à 50 % environ. Cette dernière étape permet avantageusement de mobiliser les polysaccharides éventuellement accumulés par les levures vers la production de lipides, et ainsi d'augmenter encore la quantité totale de lipides produits. Lorsqu'on observe une libération de coproduits extracellulaires, en particulier d'acide citrique, dans le milieu de culture, la culture est stoppée, et les lipides peuvent être récupérés.

Un autre aspect de l'invention est un procédé plus général de production de lipides utilisables pour la fabrication d'un carburant, selon lequel on met en œuvre un procédé de culture de levures oléagineuses, en particulier du genre Yarrowia, tel que décrit ci-avant, sur un substrat carboné d'origine agricole non alimentaire et/ou un sous-produit industriel, et on récupère les lipides produits par lesdites levures.

De manière tout à fait avantageuse, le procédé de culture de levures selon l'invention peut être mis en œuvre, pour la production de lipides, à partir de substrats industriels provenant de matières premières renouvelables dont la teneur en phosphore est faible. En fonction de la composition exacte de chaque milieu industriel donné, l'homme du métier saura le complémenter de manière adéquate pour mettre en œuvre la culture dans les conditions définies par la présente invention. Les caractéristiques et avantages du procédé selon l'invention apparaîtront plus clairement à la lumière des exemples de mise en œuvre ci- après, fournis à simple titre illustratif et nullement limitatifs de l'invention, avec l'appui des figures 1 et 2, dans lesquelles : la figure 1 est une courbe illustrant l'évolution de la vitesse spécifique de production de lipides en fonction de la teneur intracellulaire

en phosphore [P], pour une culture de levures du genre Yarrowia lipolytica sur glucose ; la figure 2 représente une courbe illustrant l'évolution des vitesses spécifiques de production de lipides de polysaccharides et du carbone de réserve en fonction de la vitesse spécifique de

croissance des levures μ, pour une culture de levures du genre Yarrowia lipolytica sur glucose.

EXEMPLE 1 - Mise au point des paramètres de culture On utilisera dans cet exemple les abréviations et symboles ci-après. Sauf indication contraire, les différents paramètres seront en outre exprimés dans les unités mentionnées ci-après.

X : concentration en biomasse totale à l'instant t (exprimée en g/1) X ^* : concentration en biomasse catalytique à l'instant t (en g/1)

C : carbone

P : phosphore

Cit : citrate

Lip : lipides

PS : polysaccharides

[Glc] : concentration en glucose dans le milieu de culture (exprimée en g/l)

[P] : concentration intracellulaire en phosphore à l'instant t (exprimée en mg/gX ^* )

q _g iucose : vitesse spécifique de consommation du glucose à l'instant t

(exprimée en Cmol/Cmol X7h)

qcit : vitesse spécifique de production du citrate à l'instant t (exprimée en Cmol/Cmol X h)

qu _P : vitesse spécifique de production de lipides à l'instant t (exprimée en Cmol/Cmol X7h)

q _P : vitesse spécifique de consommation du phosphore à l'instant t

(exprimée en Cmol/Cmol X7h)

qps : vitesse spécifique de production des polysaccharides à l'instant t (exprimée en Cmol/Cmol X7h)

μ : vitesse spécifique de croissance des levures (exprimée en h ^"1 )

1 / Matériel et méthodes 1 .1 / Microorqanisme

La souche sauvage de Yarrowia lipolytica utilisée est la souche W29 (ATCC 20460, Mat A) isolée d'eaux usées. Des stocks de souche ont été réalisés à partir de précultures axéniques réalisées dans des fioles Erlenmeyer bafflées placées sur une table agitante, avec un milieu de culture riche ayant une concentration initiale en glucose de 10 g. ¹ . En milieu de phase de croissance exponentielle, des échantillons de 1 ml ont été prélevés et additionnés de glycérol stérile (30 % en volume/volume). Puis ces stocks ont été conservés dans des flacons stériles à une température de -80 °C. Ces cultures concentrées et congelées ont été utilisées ultérieurement pour ensemencer les différentes précultures à des fins de culture en mode d'alimentation discontinue. 1 .21 Milieu de culture

La composition du milieu de culture minéral est la suivante :

(NH ₄ ) ₂ S0 ₄ 3,0 g.l ^"1 ; KCI 2,57 g.l ^"1 ; NaCI 0,55 g.l ^"1 ; MgS0 ₄ ,7H ₂ 0 1 ,0 g.l ^"1 ; glutamate de sodium 2,0 g.l ^"1 ; NaH ₂ P0 ₄ ,H ₂ 0 0,92 g.l ^"1 ; CaCI ₂ 0,64 g.l ^"1 ; ZnS0 ₄ ,7H ₂ 0 0,04 g.l ^"1 ; MnS0 ₄ ,H ₂ 0 0,0038 g.l ^"1 ; CoCI ₂ ,6H ₂ 0 0,0005 g.l ^"1 ; CuS0 ₄ ,5H ₂ 0 0,0009 g.l ^"1 ; Na ₂ MoS0 ₄ ,2H ₂ 0 0,00006 g.l ^"1 ; H ₃ B0 ₃

0.05 g.l ^"1 ; (NH ₄ ) ₂ FeS0 ₄ 0,023 g.l ^"1 ; 10 ml de solution de vitamines.

La solution de vitamines a la composition suivante : d-biotine 0,05 g.l ^"

¹ , chlorhydrate de thiamine 1 g.l ^"1 , acide panthoténique 1 g.l ^"1 , chlorhydrate de pyridoxol 1 g.l ^"1 , acide nicotinique 1 g.l ^"1 , acide p-aminobenzoïque 0,2 g.l ^"1 , myo-inositol 25 g.l ^"1 .

Avant stérilisation, le pH de ce milieu a été ajusté à 4,5 avec une solution de H ₂ S0 ₄ . Le pH a été ajusté à la valeur de travail (soit un pH de 5,5) avec une solution d'ammoniaque ou de potasse (5 M).

1 .31 Méthodes analytiques La concentration en levure est évaluée par mesure spectrophotométrique à 600 nm dans un spectrophotomètre HITACHI U- 1 100, dans une cellule en quartz ayant un trajet optique de 0,2 cm.

Des dilutions de l'échantillon sont effectuées de telle sorte que la densité optique soit comprise dans la plage de 0,1 à 0,6 UA. Pour la détermination de la masse sèche des cellules, des échantillons de culture (5 à 10 ml) sont recueillis par filtration sur une membrane de 0,45 μιτι (Sartorius) et sont séchés à 200 mm de Hg et 60 °C pendant 48 h, jusqu'à obtention d'une masse constante. La quantité de cendre est déterminée après deux combustions totales des filtres de masse sèche avec biomasse en présence de 200 μΙ de solution à 20 g.l ^"1 de NH ₄ N0 ₃ dans un four à moufle à 550 °C, pendant 12 h à chaque fois.

La détermination des concentrations en alcools, en acides organiques et en sucres des surnageants est effectuée par chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) en utilisant une colonne Aminex® HPX-87H ⁺ (300 mm x 7,8 mm), dans les conditions suivantes : température de 50 °C, éluant H ₂ S0 ₄ 5 mmol.l ^"1 (débit de 0,5 ml. min ^"1 ) et détection double (réfractomètre et UV à 210 nm). Les composés sont identifiés et quantifiés par référence à des solutions pures de chaque composé.

La détermination de la concentration en glucose à partir des surnageants de culture est également effectuée au cours de la culture, au moyen d'un analyseur de glucose YSI modèle 27 A, Yellow Springs Instruments.

Une électrode à ion ammonium (PH/ISE meter modèle 710A + électrode de captage de gaz ammoniac modèle 95-12, Orion Research Inc) est utilisée pour quantifier la concentration résiduelle en ammoniaque dans le milieu de culture. L'analyse des gaz de sortie C0 ₂ , 0 ₂ , N ₂ et Ar, est effectuée toutes les

20 secondes, par spectroscopie de masse en sortie du condenseur de gaz du fermenteur, au moyen d'un spectromètre de masse PRIMA 600s, VG Gas.

La vitesse de consommation d'0 ₂ et la vitesse de production de C0 ₂ sont calculées d'après les bilans de matière, en combinant le volume du gaz dans le réacteur, le débit d'air entrant mesuré par un débitmètre massique, la température, l'humidité et la pression, et la composition des gaz d'entrée et de sortie.

Les cellules sont observées avec un microscope optique (Olympus BH2, objectif DplanApoUVPL et DA po 100 UV PL) équipé d'une caméra CCD (DXM 1200, Nikon). Les images sont numérisées en un réseau de 977 ^* 715 pixels par un système de capture d'image (Matrox 975-0201 ).

Les lipides sont extraits des cellules lyophilisées par des mélanges de solvants injectés sous pression (< 100 bar) et à des températures élevées (< 100 °C) par un ASE® (Accelerated Solvent Extraction 200, Dionex). Les solvants chargés de composés sont récupérés sous pression d'un gaz inerte (azote). Quatre mélanges successifs de solvants sont utilisés : méthanol/chloroforme 2:1 (vol/vol) ; 1 :1 (vol/vol) ; 1 :2 (vol/vol), et hexane pur. Afin d'éliminer les éventuels contaminants non lipidiques (sucres, aminoacides, protéines et sels) pouvant être entraînés lors de l'extraction, la phase organique est confrontée à une solution de KCI à 0,08 g. ¹ pendant 15 min sous agitation douce, et une technique de séparation liquide/liquide est ensuite mise en œuvre après centrifugation à 5000 g pendant 10 min.

Finalement, les lipides sont recueillis après évaporation des solvants dans un évaporateur multiposte à une température de 40 °C (programme mixed solvent, EZ-2, Genevac). La teneur totale en lipides est quantifiée par une méthode gravimétrique.

Les polysaccharides intracellulaires sont dosés par la méthode phénol-acide sulfurique (Dubois et al., Analytical Chemistry, 28 (3), 350-356, 1956). Les échantillons sont lavés trois fois à l'eau physiologique glacée, puis dilués afin d'amener la valeur de la densité optique entre 0,4 et 0,5. Ceci permet de déterminer la biomasse utilisée pour le dosage. Dans un tube en verre sont introduits 1000 μΙ d'échantillon dilué, additionnés de 1 ml d'une solution de phénol à 0,5 g/l dans de l'eau distillée. Après vortexage et 5 min de repos, sont introduits 5 ml d'acide sulfurique à 95 %. Après vortexage et 5 min de repos, les tubes sont introduits dans un bain marie à 30 °C pendant 20 min. La réaction est ensuite stoppée en plaçant les tubes dans un bain glacé pendant 20 min. Pour chaque échantillon ce procédé est répété 4 fois. L'absorbance de l'échantillon est mesurée à 486 nm. La concentration ainsi mesurée est exprimée en équivalent glucose / g de biomasse.

La concentration en ions phosphates extracellulaires est réalisée par dosage colorimétrique à 750 nm après complexation des ions phosphate avec du sulfomolybdate (Briggs, Journal of Biological Chemistry, 53 (1 ), 13-16, 1922). 4 ml de surnageant sont mélangés à 400 μΙ d'acide perchlorique à 65 %, 400 μΙ de solution d'amidol (amidol à 0,1 g/l, métabisulfite à 2 g/l dans de l'eau) et 200 μΙ de molybdate d'ammonium à 0,83 g/l. Les échantillons sont soumis à vortexage et leur absorbance est mesurée après 5 min à 750 nm. La gamme étalon est réalisée avec une solution de KH ₂ P0 ₄ .

1 .4/ Conditions opératoires et stratégies de culture

Des cultures en mode d'alimentation discontinue (8 L par culture) sont effectuées dans un bioréacteur de 20 L en utilisant un fermenteur Braun Biostat E (Braun, Melsungen, Allemagne), sans limitation d'oxygène.

La température est fixée à 28 °C et le pH est régulé à 5,5 par addition d'une solution à 14 moU ^"1 de NH ₄ OH.

Le fermenteur est relié à un ordinateur équipé d'un logiciel permettant l'acquisition en ligne des paramètres tels que vitesse d'agitation, pH, température, pression partielle d'oxygène dissous (p0 ₂ ), addition de la base et de l'agent anti-mousse, pour le contrôle et la régulation des paramètres opératoires.

La pression dans le fermenteur est régulée à 0,3 bar (pression relative). Le fermenteur est équipé de systèmes d'alimentation stériles utilisant des pompes péristaltiques (Masterflex et Gilson).

La masse de la solution de glucose et de la solution de phosphate introduites dans le fermenteur sont mesurées de manière continue par le suivi des masses des flacons stock des solutions (balance de marque Sartorius). Les concentrations en glucose et en azote dans le fermenteur sont estimées d'après l'équation des bilans de carbone et redox. Le débit d'évaporation est estimé à partir de la température de culture, de l'efficacité du condenseur du fermenteur et du débit d'aération. Le volume de culture est calculé d'après un bilan de matière réalisé à partir des apports en substrat, sels, phosphate, base, vitamines et agent anti-mousse, et des sorties par évaporation et échantillonnage.

Agents chimiques

Les produits chimiques (sels, oligoéléments, acide orthophosphorique et NH ₄ OH) sont fournis par Prolabo® (France), les vitamines par Sigma (USA) et le glucose par Roquette (France).

Conditions d'alimentation en sels concentrés

Le fermenteur est alimenté par un débit d'une solution de sels concentrés correspondant à 1 /10 ^eme du débit d'alimentation en substrat. La composition de la solution de sels est la suivante : KCI 20 g.l ^"1 ,

CuS0 ₄ ,5H ₂ 0 0,6 g.l ^"1 , NaCI 20 g.l ^"1 , Na ₂ Mo0 ₄ ,2H ₂ 0 0,094 g.l ^"1 , MgS0 ₄ ,7H ₂ 0 27 g.l ^"1 , ZnS0 ₄ ,7H ₂ 0 7,7 g.l ^"1 , (NH ₄ ) ₂ FeS0 ₄ 5,6 g.l ^"1 , MnS0 ₄ ,H ₂ 0 0,47 g.l ^"1 , H ₃ BO ₃ 0,3 g.l ^"1 , CoCI ₂ ,6H ₂ 0 0,3 g.l ^"1 , H ₂ S0 ₄ 140 g.l ^"1 .

Conditions d'alimentation en vitamines Toutes les cultures sont effectuées avec une alimentation séquencée en vitamines lorsque 10 g.l ^"1 de biomasse sont produites.

Conditions d'alimentation en glucose et phosphate

Les cultures sont conduites selon trois phases :

Phase 1 : phase de croissance Au cours de cette Phase 1 , un profil exponentiel du débit de la pompe d'alimentation en glucose permet le maintien d'un taux de croissance des levures constant compris entre 0,10 h ^"1 et 0,25 h ^"1 . Le phosphate présent dans le milieu de culture initial permet une croissance exponentielle non limitée des levures jusqu'à la formation de 10 g.l ^"1 de biomasse. Phase 2 : épuisement en phosphore exocellulaire et limitation en phosphore intracellulaire

Lors de la mise en place de la Phase 2 de limitation en phosphore, durant laquelle l'apport en phosphore est stoppé ou limité à une valeur inférieure à celle nécessaire pour la croissance, l'apport en glucose est fixé à un débit constant pour permettre la formation de 30 g.l ^"1 de biomasse totale, avec un taux de croissance moyen de 0,06 h ^"1 sur l'ensemble de la phase.

Phase 3 : accumulation de lipides intracellulaires

Lorsque la concentration en phosphore intracellulaire est estimée inférieure à 15 mg / g de biomasse totale (soit 30 g.l ^"1 de biomasse totale formée), deux conditions d'expériences sont réalisées :

- une carence en phosphore,

- un apport contrôlé de phosphore : le phosphore est ajouté par une pompe péristaltique avec un débit constant de solution d'acide phosphorique à 0,6 mol.l ^"1 permettant un taux de croissance moyen de 0,03 h ^"1 (débit de 0,0019 mg de phosphore.l ^"1 .h ^"1 ).

Le flux volumique d'apport en glucose est ajusté pour éviter l'accumulation excessive de substrat carboné en correspondant à la demande théorique exprimée précédemment dans l'équation (I).

21 Résultats

Trois cultures différentes, désignées par Culture 1 , Culture 2, Culture 3, sont réalisées. Le glucose est utilisé en tant que seul substrat carboné. 2.1 / Phase 1

Les différents paramètres relevés/calculés pour la Phase 1 de croissance des levures, pour chacune de ces cultures, sont indiqués dans le Tableau 1 ci-après.

Tableau 1 - Résultats expérimentaux en Phase 1 de croissance

Comme le montrent ces résultats, en Phase 1 de croissance, en l'absence de toute limitation nutritionnelle, le flux de carbone est orienté vers la production de biomasse. La croissance est exponentielle et on n'observe ni accumulation de lipides ou polysaccharides intracellulaires, ni accumulation de coproduit exocellulaire comme l'acide citrique.

La teneur en phosphore intracellulaire est égale à environ 27 mg / g de biomasse catalytique quelles que soient les valeurs de la vitesse spécifique de croissance μ*. Lorsqu'on atteint une concentration de 10 g.l ^"1 de biomasse dans le fermenteur, la Phase 2 débute.

2.2/ Phase 2

En début de Phase 2, l'apport en phosphore extracellulaire est stoppé (Culture 1 , Culture 3), ou limité (Culture 2) à une valeur inférieure à l'apport en phosphore indispensable pour la croissance.

Les résultats obtenus durant cette Phase 2, à deux valeurs de concentration en phosphore intracellulaire [P] successives respectivement voisines de 1 1 g/l et de 5,5 g/l, sont indiqués respectivement dans les Tableaux 2 et 3 ci-après.

Tableau 2 -Résultats expérimentaux en cours de Phase 2 ([P] voisine de 1 1 g/l)

Comme le montrent ces résultats, au cours de la Phase 2, la teneur en phosphore intracellulaire diminue ; lorsque cette teneur est égale à environ 10 mg / g de biomasse catalytique, on observe une production de lipides et de polysaccharides, mais aucune production de citrate, y compris lors de la Culture 2 en présence d'un excès de glucose (concentration en glucose extracellulaire supérieure à 20 mg/L). De plus on observe que la vitesse spécifique de consommation de glucose varie de façon importante (Culture 1 , Culture 2, Culture 3), de même que le rapport de alors que la vitesse spécifique de production de lipides reste du même ordre de grandeur. Ceci suggère que la synthèse des polysaccharides permet d'absorber l'overflow de carbone (Culture 2).

On n'observe aucune production d'acide citrique dans les trois cultures. Lorsque la teneur en phosphore intracellulaire atteint 5 mg/g, les valeurs mesurées/calculées pour les différents paramètres d'intérêt sont indiquées dans le Tableau 3 ci-après.

Tableau 3 - Résultats expérimentaux en cours de Phase 2 ([P] voisine de

5,5 g/l) II apparaît que lorsque la teneur en phosphore intracellulaire diminue de 27 mg/g à environ 5,5 mg/g de biomasse catalytique, en présence d'un flux de glucose non limitant (Culture 1 ), la vitesse spécifique de production de lipides est restée sensiblement constante. Par contre, une limitation en glucose (Culture 2 et Culture 3) a engendré une mobilisation des polysaccharides et une nette réduction de la vitesse spécifique de production de lipides. La vitesse spécifique de consommation de glucose est réduite (Cultures 2 et 3 versus Culture 1 ) et devient inférieure à la demande telle que décrite précédemment dans l'équation (I), pour satisfaire la production de lipides et la croissance ; ceci engendre une réduction de la vitesse spécifique de la production de lipides et une consommation des polysaccharides (Cultures 2 et 3 versus Culture 1 ).

On n'observe toujours aucune production de citrate.

2.3/ Phase 3

Les résultats des mesures/calculs des différents paramètres pour cette Phase 3, correspondant à la mise en place d'une alimentation contrôlée en phosphore (Culture 1 et Culture 3), ou d'une carence en phosphore

(Culture 2), sont montrés dans le Tableau 4 ci-après.

Résultats expérimentaux en cours de Phase 3 d'alimentation contrôlée ou de carence en phosphore

En l'absence d'alimentation en phosphore (Culture 2), il est observé que la teneur intracellulaire en phosphore diminue pour atteindre une valeur proche de 4 mg/g de biomasse catalytique. Pour cette concentration faible en phosphore intracellulaire, il est en outre observé un arrêt de la croissance des levures, et une augmentation de la vitesse spécifique de production de polysaccharides au détriment de la production de lipides, qui s'arrête. Ceci suggère l'existence d'une teneur en phosphore intracellulaire limite pour la production de biomasse. Il peut en être déduit qu'il existe une valeur seuil de la teneur en phosphore intracellulaire de 4 mg/g, en deçà de laquelle la croissance des levures devient impossible ; l'excédent de glucose, lié à un flux volumique correspondant à un apport supérieur à la demande telle que décrite précédemment dans l'équation (I) pour satisfaire la production de lipides et la croissance, est orienté vers la production de lipides et de polysaccharides.

Ces résultats montrent en outre qu'il existe une vitesse spécifique de production de lipides maximale comprise entre 0,018 Cmol/CmolX7h et 0,044 Cmol/CmolX7h lorsque la teneur en phosphore intracellulaire est comprise entre 7 et 15 mg/g de biomasse catalytique.

On n'observe par ailleurs aucune production de citrate dans toutes les conditions de cultures réalisées.

En fin de Phase 3, il est en outre imposé une condition particulière, à savoir un excès de carbone. Les résultats expérimentaux de cette condition de culture, au cours de laquelle l'apport en glucose augmente et le flux de carbone dans les voies métaboliques centrales de la levure devient largement excédentaire par rapport aux capacités anaboliques et cataboliques de cette dernière (on parle d' « overflow » de glucose), sont montrés sur le Tableau 5 ci-après, pour une seule culture.

Tableau 5 - Résultats expérimentaux en présence

d'un excès de glucose suite à la Phase 3

Les résultats ci-dessus montrent que, en présence d'un excès de glucose (la concentration en glucose résiduelle dans le milieu de culture est non nulle), lorsque la teneur intracellulaire en phosphore est très réduite et égale à environ 2 mg / g de biomasse catalytique, la production de polysaccharides et de lipides se poursuit jusqu'à l'accumulation de substances de réserve à hauteur de 50% ; au delà, il y a production de citrate.

Ces résultats démontrent une bascule du métabolisme vers la production de citrate, résultant de l'arrêt de la synthèse de polysaccharides, le taux maximal d'accumulation des substances de réserve ayant été atteint, de l'ordre de 50% (polysaccharides+lipides).

Les résultats ci-avant démontrent qu'il est possible pour la levure du genre Yarrowia d'accumuler des substances de réserve (lipides et polysaccharides), aux vitesses maximales de production, sans production de citrate, et ce y compris en présence d'un excès de glucose. La production de citrate n'est observée que lorsque la teneur en phosphore intracellulaire est très faible et que la capacité maximale de stockage de substances de réserve est atteinte et en présence d'un large excès de glucose. Ces résultats démontrent clairement l'existence d'un contrôle par le phosphore intracellulaire de la consommation du carbone et de sa répartition entre biomasse, polysaccharides, et lipides sans production d'acide citrique même en présence d'un excès de glucose dans la limite du taux maximal d'accumulation de substances de réserve (polysaccharides et lipides).

A partir des résultats ci-avant, il a été tiré une courbe illustrant l'évolution de la vitesse spécifique de production de lipides en fonction de

la teneur intracellulaire en phosphore [P], qui est représentée sur la Figure 1 . On y observe clairement une fourchette optimale entre 7 et 17 mg / g de biomasse catalytique pour la concentration en phosphore intracellulaire, du point de vue strict de la vitesse spécifique de production de lipides.

Toujours tirée des résultats ci-avant, une courbe illustrant l'évolution des vitesses spécifiques de production de lipides , de polysaccharides

et du carbone de réserve en fonction de la vitesse spécifique de

croissance des levures μ, est montrée sur la Figure 2. On en déduit, dans les conditions conformes à l'invention de contrôle de la concentration en phosphore intracellulaire, une plage de vitesses spécifiques de croissance optimale pour la production de lipides comprise entre 0,03 et 0,06 h ^"1 .

EXEMPLE 2

A partir des résultats obtenus dans l'Exemple 1 ci-après, on peut définir un exemple de procédé de culture selon l'invention comme suit.

Les conditions de culture qui ne sont pas définies ci-après sont choisies de manière classique en elle-même.

La formule brute de la Cmole de biomasse catalytique étant la masse molaire de la Cmole de biomasse

catalytique, MM _X , exprimée en g. Cmole ^"1 , est égale à :

Dans cet exemple, on utilisera notamment les symboles figurant dans le Tableau 6 suivant :

Tableau 6 - Symboles utilisés dans l'Exemple 2

1 / Première phase : phase de croissance exponentielle

Le procédé comprend une première phase, dite de croissance exponentielle, qui est contrôlée par l'apport de substrat carboné dans le milieu de culture, avec un taux de croissance inférieur au taux de croissance maximal de la souche, et qui est fixé au cas par cas, notamment en fonction des caractéristiques du réacteur, des levures, du milieu de culture et de la quantité de lipides à produire.

La masse de substrat en Cmole ayant été utilisée pour l'obtention de la biomasse initialement présente dans le réacteur, , peut être estimée à

partir de la connaissance de la concentration initiale en biomasse, selon l'équation :

Durant cette première phase, le débit d'alimentation en source carbonée dans le réacteur à l'instant t, est fixé par la loi :

Cette consigne est appliquée jusqu'à épuisement du phosphore initial présent dans le milieu de culture.

La durée de cette phase, peut être calculée de la façon suivante :

et X concentration en biomasse en fin de cette phase, est tel que

où Q ₀ ^S est le débit initial en début de cette phase.

Le volume de fermentation à l'épuisement en phosphore est égal à :

La concentration initiale en phosphore P ₀ dépend quant à elle de l'objectif en terme de concentration en biomasse Xi que l'on désire obtenir lorsqu'intervient l'épuisement. concentration intracellulaire en phosphore correspondant à la composition en phosphore en mg ramenée à une Cmole de biomasse, étant égal à 27. MM _X , on détermine P ₀ par l'équation :

ou encore :

Durant cette phase de croissance, l'épuisement du milieu de culture en azote est révélé par une diminution brusque de la vitesse de consommation d'oxygène, identifiée en ligne par l'analyse de la composition des gaz de sortie (réduction du la fraction molaire en dioxyde de carbone), ou par la remontée brusque de la concentration en oxygène dissous si l'on est dans des conditions stabilisées de transfert d'oxygène (agitation et coefficient de ventilation constants).

21 Deuxième phase : réduction de la concentration intracellulaire en phosphore Au cours de cette phase, la concentration intracellulaire en phosphore est ramenée de 27 mg.g ^"1 à 15 mg.g ^"1 , par accroissement de la biomasse catalytique, sans apport de phosphore, jusqu'à obtention d'une concentration en biomasse X ₂ égale à

Durant cette phase, on impose un flux de carbone réduit assurant un taux de croissance, dit voisin de 0,1 h ^"1 . L'apport d'azote est fonction de la régulation de pH, selon les conditions décrites ci-après.

Le débit d'alimentation en source carbonée est réglé pour suivre la loi exponentielle suivante, en prenant comme origine des temps de cette seconde hase, c'est-à-dire que t ₀ = t _exp : Ms ¹ représente la masse totale de substrat carboné consommée en fin de phase exponentielle de croissance, soit : si bien que le débit est fixé par l'équation :

La durée de cette phase est celle nécessaire pour atteindre la concentration en biomasse X soit :

Le volume de fermentation V ₂ en fin de cette phase est de :

La fin de cette phase doit correspondre à l'épuisement en azote dans le milieu de fermentation. Afin d'arriver à cet épuisement soit durant la phase exponentielle de croissance, soit durant la deuxième phase, la régulation du pH de culture, assurée initialement par l'ammoniaque en tant que liquide correcteur de pH, doit être remplacée par un agent alcalin autre, par exemple une solution de potasse ou de soude. La bascule de la régulation du pH par l'azote, vers la régulation du pH par une solution ne contant pas d'azote, s'opère lorsque la quantité totale d'azote (quantité initiale plus quantité ajoutée dans le milieu de culture) correspond à la quantité d'azote nécessaire pour la production de la biomasse durant la seconde phase, et est égale à : étant la fraction molaire en azote dans la

composition élémentaire de la biomasse catalytique. Le moment où doit s'opérer la bascule est celui pour lequel le volume de liquide correcteur de pH est égal à :

La concentration initiale en azote dans le milieu, N ₀ , doit être inférieure à :

3/ Troisième phase : phase de production

Au cours de cette phase, la croissance est contrôlée par une alimentation en source azotée qui contrôle le taux de croissance choisi,

à une valeur comprise entre 0,03 et 0,06 h ^"1 . le nombre de moles d'azote consommées en fin de la

deuxième phase, peut être estimé en ligne à partir du volume de liquide correcteur de pH azoté ajouté en fin de phase 2 selon l'équation :

Le flux d'alimentation en source azotée s'effectue selon le profil suivant, en prenant comme origine des temps de cette phase :

Un apport de phosphore est également assuré, pour maintenir une concentration intracellulaire en phosphore dans la fourchette conforme à l'invention et régulatrice de la distribution des flux carbonés, évitant les overflow cataboliques conduisant à la production d'acide citrique. Cette concentration intracellulaire en phosphore exprimée en mg.Cmole ^"1 , est comprise entre 7.MM _X et 15.ΜΜχ. Le flux de phosphore est proportionnel au flux d'azote, selon le rapport :

Le flux de carbone est le plus proche possible de la demande biologique correspondant à la production de biomasse et à l'accumulation des lipides microbiens. Le flux initial en carbone peut être estimé à partir de la vitesse spécifique de consommation de substrat satisfaisant à la demande biologique :

où correspond à la vitesse spécifique maximale de production

de lipides. Pour le couple « Yarrowia lipolytica - glucose », est égal à

0,044 Cmole.Cmole ^"1 .h ^"1 .

Ainsi, le flux de substrat carboné initial <P _S est égal à :

Le débit d'alimentation initial est alors égal à :

Le profil d'alimentation pendant la phase de production suit l'équation :

Le débit d'alimentation en solution saline est ajusté en fonction de la seule fraction du flux total de carbone utilisé pour la production de biomasse, soit :

Le rapport de débit entre le débit de source carbonée et le débit de solution saline concentrée, S, est réajusté à la valeur :

Au cours de cette phase de production, il est possible de modifier les flux contrôlant la croissance des levures, de sorte à modifier le taux de croissance En prenant comme origine des temps le temps auquel

s'opère la modification, la détermination des différents flux est effectuée selon la procédure décrite ci-avant, en réinitialisant la quantité d'azote consommé à :

où est le nombre de moles d'azote ajouté depuis le démarrage

de la troisième phase.

Le débit d'alimentation en source carbonée est également

modifié selon le profil : , avec

étant le débit nominal en source carbonée lorsque s'opère la

modification.

Il peut être prévu au cours de cette phase d'ajuster le flux en source carbonée, par une diminution de l'apport en source carbonée dans le milieu de culture, lorsqu'on observe que la concentration en carbone extracellulaire dans le milieu n'est pas nulle ou que les levures produisent des polysaccharides.

Ceci peut être réalisé en observant l'évolution de la valeur du coefficient respiratoire. L'accumulation lipidique entraîne en effet une augmentation de la valeur du coefficient respiratoire calculé durant les phases de croissance non limitées (phases 1 et 2). En cours de phase de production, le flux de source carbonée peut être réajusté en fonction de l'évolution de la potentialité de synthèse pouvant être identifiée par une réduction de la valeur du coefficient respiratoire caractérisée en phase de production lipidique. Le débit d'alimentation peut alors être linéairement réduit de 10% de la valeur nominale par heure jusqu'à restaurer un accroissement de la valeur du coefficient respiratoire.

Autrement, il est possible d'observer l'évolution du rapport C/N cellulaire. L'accumulation lipidique est caractérisée par un accroissement de ce rapport, qui évolue au cours de la phase de production d'une valeur voisine de 4, caractéristique de la biomasse catalytique, à une valeur voisine de 15, correspondant à l'accumulation maximale en lipides (sans accumulation de polysaccharides). L'évolution de ce rapport, fonction de la durée de la phase 3 de production, dépend des vitesses spécifiques de croissance et de production considérées constantes sur une durée significative. Ce rapport est plus précisément défini par la loi :

Une valeur excessive de ce rapport par rapport à cette loi est le reflet d'une accumulation de source carbonée dans le moût de fermentation, ou d'accumulation de polysaccharides intracellulaires. L'invention prévoit alors de réduire, selon la procédure décrite ci-avant, le flux de source carbonée afin de réorienter le métabolisme des levures vers la seule production de lipides et de biomasse catalytique.

Le rapport C/N peut par exemple être estimé en ligne comme suit :

L'accumulation de source carbonée dans le moût de fermentation ou la réorientation d'une fraction du carbone consommé vers la production des polysaccharides peut autrement être révélée par l'évolution du degré de réduction du carbone accumulé dans le réacteur,

Le degré de réduction de la biomasse catalytique, est égal à :

Il varie, selon les souches, entre 4,05 et 4,15.

Le degré de réduction des lipides de réserve, est quant à lui

voisin de 5,6. étant corrélé linéairement au % d'accumulation de la fraction lipidique dans la biomasse totale, son évolution doit être monotone croissante en cours de phase de production. Toute diminution de la valeur de sera indicative d'une accumulation de source carbonée dans le moût de fermentation ou de la réorientation d'une fraction du carbone consommé vers la production des polysaccharides. 4/ Quatrième phase Cette phase assure l'épuisement de polysaccharides intracellulaires éventuellement accumulés durant la phase de production, et leur conversion en fraction lipidique. Elle peut être obtenue en réduisant le flux d'azote nominal de la phase 3 d'un facteur 2, sans opérer de modification sur le flux de phosphore et en réduisant du même facteur 2 le flux de solution saline. Le flux de source de carbone est en outre réajusté selon la procédure décrite ci- dessus. Cette phase peut se poursuivre jusqu'à ce que l'on observe une mise en route ou une accélération de l'apport de liquide alcalin correcteur de pH.

L'homme du métier saura transposer l'ensemble des enseignements ci-dessus, établis en référence à un milieu de culture synthétique, à tout milieu de culture issu de l'industrie ou de l'agro-alimentaire, en complémentant ce dernier de manière adéquate en fonction de sa composition particulière en source de carbone, source d'azote, source de phosphore et sels.