Domaine de l'invention

L'invention concerne un procédé de culture d'adipocytes, une culture d'adipocytes, et son utilisation pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire.

Arrière-plan technique

La prévalence de l'obésité, liée à une hypertrophie du tissu adipeux blanc, est en augmentation constante dans la population générale. Ainsi, la proportion des personnes en surpoids ou obèses a progressé de 36,7% à 41,6% entre 1997 et 2003 en France, en outre, la prévalence de l'obésité (définie par un index de masse corporelle (IMC) supérieur 30 kg/m ² ) y est de 14,5% en 2009. Par ailleurs, l'obésité est un facteur de risque pour de nombreux troubles pathologiques, dont notamment les accidents cardiovasculaires, rendant d'autant plus urgente sa prise en charge thérapeutique.

Si les principaux axes de lutte contre cette épidémie restent l'amélioration de l'alimentation et l'augmentation de la dépense physique des individus obèses, d'autres approches, notamment chirurgicales et médicamenteuses sont également explorées.

Les approches médicamenteuses actuelles visent principalement à réduire les apports énergétiques, par exemple en limitant l'absorption intestinale de lipides (orlistat), ou en diminuant l'appétit, soit en favorisant la sensation de satiété (sibutramine), soit en diminuant le plaisir associé à la prise alimentaire (rimonabant).

Toutefois, l'efficacité limitée de ces méthodes ou leurs effets secondaires - il a ainsi été rapporté que le rimonabant pouvait provoquer des troubles dépressifs sévères - ont notamment conduit au retrait de la sibutramine et du rimonabant du marché, laissant des options thérapeutiques très limitées et rendant nécessaires l'exploration d'autres voies, permettant par exemple de moduler le métabolisme des cellules adipocytaires pour limiter le stockage des lipides ou au contraire favoriser leur utilisation. Cette dernière voie est cependant rendue difficile d'approche par l'absence de modèles in vitro ou animaux d'étude du métabolisme adipocytaire véritablement représentatifs de la situation in vivo chez l'homme.

En effet, s' agissant des modèles in vitro, les cellules adipocytaires matures, notamment caractérisées par la présence d'une vacuole lipidique unique, qui forment le tissu adipeux blanc, sont particulièrement fragiles et, de fait, ces cellules perdent généralement en moins de 48 h leurs propriétés métaboliques et sécrétoires en culture.

Plusieurs systèmes de culture ont ainsi été proposés pour surmonter ces difficultés. Toutefois, ces cultures comprennent des types cellulaires additionnels en plus des adipocytes, tels que des pré-adipocytes ou des cellules endothéliales (Sonda et al. (2008) Endocrinology 149:4794-4798) ou se font généralement à l'aide d'adipocytes différenciés in vitro à partir de cellules souches (Choi et al, (2010) Tissue Engineering: Part C, Kang et al. (2007) Biomaterials 28:450-458) ou de pré- adipocytes (Daya et al. (2007) Differentiation 75:360-370, WO 2007/1 13591 , Stacey et al. (2009) Tissue Engineering: Part A 15:3389-3399), dont le phénotype est relativement éloigné de celui des adipocytes matures isolés de tissu adipeux (voir les Figures 1 à 3).

Ainsi, ces systèmes n'apparaissent pas être spécifiquement et directement représentatifs du métabolisme d'adipocytes matures isolés du tissu adipeux.

C'est donc un objet de la présente invention que de fournir un tel système de culture, proche de la physiologie, notamment humaine.

Résumé de l'invention

La présente invention résulte de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que des adipocytes matures isolés de tissu adipeux pouvaient être cultivés, en l'absence d'autres types cellulaires, à l'aide d'un support de culture tridimensionnel et que les adipocytes ainsi cultivés conservent pendant au moins 48 h un phénotype semblable à celui d'adipocytes matures fraîchement isolés.

La présente invention concerne ainsi un procédé de culture d'adipocytes, dans lequel une population homogène d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux est cultivée sur un support de culture tridimensionnel. La présente invention concerne également une culture d'adipocyte, comprenant une monoculture d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux au contact d'un support de culture tridimensionnel.

L'invention concerne également l'utilisation d'une culture d'adipocytes selon l'invention, pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire.

L'invention concerne également une méthode de criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire, dans laquelle :

on met en contact un composé à cribler avec une culture d'adipocytes selon l'invention ;

- on détermine si au moins un paramètre représentatif du métabolisme adipocytaire de la culture d'adipocytes est modifié par rapport à une culture d'adipocytes selon l'invention n'ayant pas été mise en contact avec le composé à cribler ;

on sélectionne le composé s'il modifie au moins paramètre représentatif du métabolisme adipocytaire.

Description détaillée de l'invention

Comme on l'entend ici l'expression « adipocytes matures » représente des adipocytes différenciés. Les adipocytes matures peuvent être aisément identifiés par l'homme du métier. En particulier, un adipocyte mature selon l'invention présente habituellement une vacuole lipidique unique, une activité lipolytique, notamment inductible par des agents β-adrénergiques, tels que l'adrénaline et la noradrénaline, ainsi qu'une sensibilité à l'insuline, en particulier définie par un transport inductible par l'insuline, depuis le milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaires, de glucose et d'acides gras, lequel transport est notamment lié à la translocation insulino-dépendante, au sein de la membrane plasmique des adipocytes matures, des transporteurs GLUT-4 et CD36 respectivement. Les adipocytes matures selon Γ invention se distinguent en particulier des pré-adipocytes, notamment en ce que l'expression du marqueur spécifique des pré-adipocytes DelKl/Prefl, bien connu de l'homme du métier, qui peut être mesurée par PCR en temps réelle, est essentiellement absente dans les adipocytes matures selon l'invention. Les adipocytes matures selon l'invention sont isolés de tissu adipeux. Ainsi, les adipocytes matures selon l'invention sont notamment tels qu'ils ne proviennent pas de la différenciation in vitro de précurseurs adipocytaires, tels que les pré- adipocytes ou les cellules souches, totipotentes, multipotentes, ou pluripotentes.

S'agissant du tissu adipeux selon l'invention, il peut provenir de n'importe quelle espèce animale. Toutefois, on préfère que le tissu adipeux selon l'invention ait été prélevé chez un ou plusieurs individus humains.

Les adipocytes matures peuvent être isolés à partir de tissu adipeux par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier, prenant notamment avantage de la faible densité des adipocytes matures. En particulier, le tissu adipeux peut être traité à la collagénase, puis après digestion, être filtré sur de la gaze de coton tissé ; le filtrat est laissé à décanter dans un milieu aqueux et une population homogène d' adipocytes matures selon l'invention peut être récupérée en récoltant les cellules flottantes.

Comme on l'entend ici, « une population homogène d' adipocytes matures » est notamment telle qu ^' elle est essentiellement exempte d ^' autres types cellulaires, notamment de cellules endothéliales ou de pré-adipocytes. En particulier, une population homogène d' adipocytes matures selon l'invention comprend moins de 10%, plus particulièrement moins de 5% de cellules autres que des adipocytes matures, notamment de pré-adipocytes. La quantité de pré-adipocytes dans une population homogène d' adipocytes matures peut être déterminée en quantifiant le nombre de cellules exprimant un marqueur spécifique des pré-adipocytes, tel que DelKl/Prefl par exemple.

Comme on l'entend ici, une « monoculture d' adipocytes mature » est une culture d'une population homogène d'adipocytes matures.

Une population homogène d'adipocytes matures est dite « cultivée » ou en « culture » lorsqu'elle est incubée, c'est-à-dire conservée in vitro, dans des conditions permettant la survie des cellules constituant la population. De telles conditions ainsi que les milieux de culture adéquats sont bien connus de l'homme du métier. Ces milieux de culture sont tels qu'ils contiennent l'ensemble des éléments, notamment nutritifs, susceptibles d'assurer la survie des cellules constituant la population pendant au moins 12 h, de préférence au moins 24 h, plus préférablement au moins 48 h. A titre d'exemple, la population peut être incubée dans un milieu DMEM/F12, 1% Pénicilline-Streptomycine, 50 nM Insuline, sous agitation, à 37°C et dans une atmosphère à 5% C0 ₂ , le milieu étant régulièrement renouvelé. De manière avantageuse, les milieux de culture des adipocytes matures selon l'invention peuvent comprendre des composés destiné à moduler l'activité métabolique des adipocytes matures, tels que la forskoîine et la dexaméthasone, par exemple. Par ailleurs, la culture de la population d'adipocytes matures est de préférence réalisée pendant au moins 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, ou 48 h.

Selon l'invention, les adipocytes matures sont « cultivés sur un support de culture tridimensionnel » lorsque les adipocytes sont au contact du support, c'est dire qu'ils reposent sur le support ou qu'ils adhèrent au support.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de culture d'adipocytes scion l'invention comprend les étapes suivantes :

mettre en contact une population homogène d'adipocytes avec un support de culture tridimensionnel ;

incuber les adipocytes matures en contact avec le support de culture, en particulier dans des conditions permettant la survie des cellules, notamment pendant au moins 48 h.

Un « support de culture tridimensionnel » selon l'invention est constitué d'un matériau, notamment biocompatible, adapté à l'obtention d'une culture tridimensionnelle de cellules ; autrement dit, le support de culture tridimensionnel est adapté, en particulier, à l'obtention de plusieurs couches de cellules superposées. Ainsi, un support de culture ne permettant que la culture d'un tapis cellulaire bidimensionnel, à savoir une monocouche de cellules, n'est pas un support de culture tridimensionnel selon l'invention.

De préférence, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est un hydrogel. Plus préférablement, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est un hydrogel formé de l'association non covalente de peptides comprenant de 10 à 30 résidus, tels que des peptides comprenant une répétition de la séquence R-A-D-A, et notamment une séquence R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A- D-A (SEQ ID NO : 11). Les peptides formant l'hydrogel peuvent être modifiés, par exemple par l'adjonction de groupements acétyles sur l'extrémité N-terminale des peptides et par l'adjonction d'un groupement -N¾ à l'extrémité C-terminale des peptides. Ainsi, les peptides peuvent être représentés par la séquence : Ac-R-A-D-A- R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH ₂ . De manière particulièrement préférée, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est l ^' hydrogel PuraMatrix™ (3DM, Inc.).

Les composés susceptibles d'être criblés selon l'invention peuvent être de tout type. En particulier, il peut s'agir de composés issus de chimiothèques. Par ailleurs, la culture d'adipocytes selon l ^' invention peut être utilisée pour cribler des composés activant la lipolyse, ou des composés activant le facteur de transcription PPARy2 ; ou des composés modulant la sensibilité à l'insuline.

Comme on l'entend ici, la lipolyse (ou activité lipolytique), la sensibilité à l'insuline, ou l'activité du facteur de transcription PPARy2, sont des paramètres représentatifs du métabolisme adipocytaire.

La détermination de la lipolyse peut être mise en œuvre par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. En particulier, Γ activité lipolytique peut être déterminée en mesurant la quantité de glycérol et d'acides gras libres libérée par une culture d'adipocytes selon l'invention, notamment par spectrophotométrie comme cela est décrit dans Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128:747-753. La sensibilité à l'insuline des adipocytes peut être évaluée d'après la mesure du transport du glucose dans l'adipocyte comme cela est décrit dans Wood et al. (2007) B toc hem. Biophys. Res. Commun. 361:468-473. L'activité du facteur de transcription PPARy2 peut être mesurée en déterminant la quantité d'ARNm le codant dans une cellule, par exemple par RT-PCR ou par mesure directe de l'activité de liaison à ses sites spécifiques de l'ADN comme cela est notamment décrit dans Keophiphath et al. (2009) J. Nutr. 139 : 2055-2060.

Description des figures

Figures 1 , 2 et 3

Les figures 1 à 3 représentent respectivement le niveau d'expression relative (axe des ordonnées, unités arbitraires) mesuré par PCR en temps réel de trois marqueurs spécifiques des adipocytes matures, à savoir PPARy2, FABP4 (un transporteur d'acide gras dont le gène est une cible de PPARy2), et une adipokine, l'adiponectine, dans des adipocytes matures fraichement isolés de tissu adipeux d'une part (barres noires) et dans des adipocytes obtenus par différenciation in vitro de pré-adipocytes comme cela est décrit dans Lacasa et al Endocrinology 148:868-877, d'autre part (barres blanches).

Figure 4

La figure 4 représente un gel d'immunoélectrophorèse de lysats cellulaires préparés à partir d ^' adipocytes matures maintenus en culture sur le support tridimensionnel pendant 48 heures (3D) et d'adipocytes matures fraichement isolés (J0) puis marqués à l'aide d'un anticorps dirigé contre le marqueur adipocytaire aP2/FABP4 et d'un anticorps dirigé contre un témoin positif (actine).

Figures 5 et 6

Les figures 5 et 6 représentent respectivement les niveaux d'activité lipolytique (axe des ordonnées, en unités arbitraires) basale et stimulée par la forskoline (FK) d ^' adipocytes matures cultives (i) dans le support de culture tridimensionnel (3D) en l'absence (barres blanches) et en présence de dexaméthasone (Dex) (barres noires), et (ii) en monocouches (2D) (barres grisées), en fonction de la durée de culture (axe des abscisses, en jours). L'expérience présentée est représentative d'un ensemble de trois expériences répliquées.

Figures 7 et 8

Les figures 7 et 8 représentent respectivement les quantités de leptine et d'adiponectine sécrétées (axe des ordonnées, en pg/ml/24h) par des adipocytes mature cultivés dans le support de culture tridimensionnel (3D) en l'absence (barres blanches) et en présence de dexaméthasone (Dex) (barres noires). L'expérience présentée est représentative d'un ensemble de trois expériences répliquées.

Figure 9

La figure 9 représente l'expression génique relative de marqueurs adipocytaires (axes des ordonnées, unités arbitraires) mesurée par PCR en temps réel à partir d'extraits d'adipocytes matures fraichement isolés (barres noires) et d'adipocytes mature maintenus 48 h en culture dans le support de culture tridimensionnel (barres blanches).

Figure 10

La figure 10 représente un gel d'immunoélectrophorèse de lysats cellulaires préparés à partir d'adipocytes matures maintenus en culture sur le support tridimensionnel pendant 48 heures (3D) et d'adipocytes matures fraîchement isolés (2D) incubés en présence d ^' insuline ( 1 nM) aux temps indiqués puis marqués à l'aide d'un anticorps dirigé contre la forme phosphorylée d'Akt et d'un anticorps dirigé contre un témoin positif (actine).

Exemples

A. Matériels et Méthodes

1. Matériels

L'hydrogel peptidique BDTM PuramatrixTM est obtenu de BD Biosciences (Two oak Park, Bedford, MA, USA).

Les anticorps primaires anti cavéoline- 1 (N-20, SC-894) et antiCD36 (1.BB.3414, CS-70642) utilisés proviennent de Santa Cruz Biotcchnology (Santa Cruz, CA, USA). Les anticorps correspondants couplés à Cy3 sont obtenus auprès de GE healthcare (Little Chalfont, UK).

2. Préparation des adipocytes matures isolés

Les adipocytes matures sont isolés par traitement à la collagénase de tissu adipeux humain. Le tissu adipeux humain sous-cutané de femmes jeunes (<45 ans) et non obèses (IMC<30) est découpé dans du milieu de digestion (DMEM, 2% albumine pauvre en acides gras (A6003, Sigma St Louis, MI, USA), lmg/ml collagénase A (Roche Diagnostics, Mannhein, Allemagne) dans la proportion de lg de tissu pour 2 ml de milieu de digestion dans des tubes en polypropylène. Les tubes sont placés à 37°C pendant 30 minutes sous agitation (200 cycles /minute). Après digestion, le milieu est filtré sur de la gaze de coton tissé. Les adipocytes matures sont laissés à décanter par flottaison pendant 5 minutes puis sont lavés 3 fois avec 5 volumes de saccharose 10%. A la fin du dernier lavage, le saccharose est soutiré et les adipocytes matures sont prêts à être incorporés dans l'hydrogel Puramatrix™.

3. Préparation de l'hydrogel contenant les adipocytes matures

Comme préconisé par le fabricant, l'hydrogel est soniqué pendant 30 minutes afin de réduire sa viscosité. Le gel est ensuite dilué V/V avec du saccharose 20% puis centrifugé 5 minutes à 1000g pour éliminer les bulles d'air. Les adipocytes matures lavés sont rapidement incorporés à ce mélange avec une homogénéisation par aspiration douce à la pipette. Le mélange adipocytes/gel est ensuite distribué dans la proportion de 100 μL· par puits dans des plaques de culture de 96 puits. Très rapidement, le milieu d'incubation ( 150 μί) (DMEM/F12, 1% Pénicilline- Streptomycine, 50 nM Insuline) (DMI) est ajouté dans les puits et les plaques placées dans un incubateur à 37°C sous atmosphère à 5% de C0 ₂ . Après 30 minutes, le milieu DMI est renouvelé. Le changement de milieu est répété deux fois. Le lendemain, le milieu DMI est changé et cette opération est renouvelée tous les jours. Dans certaines expériences, le DMI contient 100 nM dexaméthasone (Sigma Aldricht, saint Louis, MO, USA) ou 100 nM de rosiglitazone (Merck, Nottingham, UK).

4. Mesure de l'activité lipolvtique

Les puits contenant l'ensemble hydro gel/adipocytes sont lavés une première fois avec 150 μΐ _^ de milieu Krebs Ringer (115 m M NaCl, 4,7 m M KC1, 1,2 m M CaCl ₂ , 1 ,2 m M KH ₂ P0 ₄ , 1 ,2 mM MgS0 ₄ , 20 m NaHC0 ₃ ), 5 m M glucose, 3% Albumine pauvre en acides gras (KRB/ALB) pour équilibrer l'hydrogel. 100 μϊ, de RB/ALB contenant soit 0,1% DMSO ou 10 μΜ Forskoline (Sigma) sont distribués dans les puits. Les plaques sont ensuite placées dans Γ incubateur pendant 4 heures. Le milieu est prélevé et placé 10 minutes à 70°C afin d'inactiver les enzymes adipocytaires pouvant interférer avec le dosage du glycérol. Le glycérol libéré est dosé par spectrophotométrie (Trousse de dosage du Glycerol, R-Biopharm) comme décrit dans Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128:747-753.

5. Mesure de la sécrétion des adipokines

Le milieu DMI est prélevé 24 heures après le dernier changement de milieu.

Le dosage des adipokines (leptine, adiponectine) est réalisé directement sur ce milieu (100 μΐ) par la technique ELIS A (Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN USA) comme décrit par le fabricant.

6. Mesure de l'expression génique

Le milieu DMI est rapidement éliminé des puits et l'ensemble gel/adipocytes est homogénéisé par le tampon de lyse dans la proportion de 1ml de tampon de lyse/ lml d'ensemble gel/adipocytes. Les ARN sont ensuite extraits avec au préalable un traitement délipidant par le chloroforme en utilisant le kit d'extraction RNeasy (Qiagen, Courtaboeuf, France) comme décrit dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. Les ARNs totaux (1 μ«) sont ensuite transcrits en ADNc comme décrits dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. La liste des amorces utilisées est indiquée dans le tableau 1. Les essais de PCR en temps réel sont effectués avec 25ng d ^' ADNc et les amorces sens et antisens en utilisant le mélange PCR universel Sybergreen (Applied Biosystems, Minneapoîis, MN USA) et mesurés dans un appareil de détection (Applied Biosystems). Toutes les valeurs sont normalisées par rapport à l'expression de la protéine ribosomalc RPLPO.

Tableau 1 : Amorces utilisées

7. Techniques d ^' immunotluorcsccnce

Après élimination du milieu DMI et lavage par du PBS, l'ensemble gel/adipocytes est déposé dans des puits de plaques à 96 puits et fixé par 4% paraformaldéhyde (PAF) pendant 1 heure. Après inactivation du PAF par traitement par un tampon PBS/Glycinc 0,1 M, les cellules sont perméabilisées 5 minutes à température ambiante par 0,1% Triton X-100 dans du PBS/3% albumine. Les sites non spécifiques sont bloqués par le tampon PBS/3% albumine pendant 4 heures à température ambiante puis les anticorps primaires sont ajoutés et l'incubation se poursuit pendant 14 heures à 4°C. Après 6 lavages (1 heure), l'ensemble gel/adipocytes est incubé avec les anticorps secondaires pendant 4 heures à température ambiante dans l'obscurité. L'ensemble gel/adipocytes est ensuite lavé (1 heure) et des fragments de ce gel sont déposés dans du milieu de montage (Fluomount, Birmingham, Alabama, USA) entre lame et lamelles. Les lames sont examinées en fluorescence après 24 heures.

8. Techniques d ^' immuno-clectrophorèsc

Après élimination du milieu DMI et lavage par du PBS, l'ensemble gel/adipocytes est rapidement lysé par un volume de tampon de lyse (PBS, 2% IGEPAL, 0,2% SDS, 1% desoxycholate de sodium) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Complète mini et Phosphostop, Roche diagnostics). L'homogénat est ensuite gardé 15 minutes à 4°C puis centrifugé 10 minutes à 5000g. Le lysat cellulaire est ensuite collecté et dilué dans du tampon de Laemmli et soumis à une électrophorèse comme décrit dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. Après transfert des protéines sur membrane de cellulose, une coloration au rouge Ponceau permet de vérifier la charge et la qualité du transfert. Les membranes sont ensuite incubées avec les anticorps primaires à 4°C pendant 14 heures. Puis, après lavages, les membranes sont incubées avec les anticorps secondaires (GE Healthcare, Littlc Chai font, U ). Les signaux sont détectés par chimioluminescence (Détection ECL, GE Healthcare) et quantifiés par densitométrie.

9. Mesure de la sensibilité à l'insuline

Les puits contenant Phydro gel/adipocytes déprivés la veille en insuline sont incubés avec le milieu d ^' incubation ( 150 (DMEM/F 12 et 10 nM Insuline). Les plaques sont ensuite placées dans l'incubateur pendant 15 à 30 minutes. Le gel/adipocytes est rapidement lysé par un volume de tampon de lyse (PBS, 2% IGEPAL, 0,2% SDS, 1% déoxycholate de sodium) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Complète mini et Phosphostop, Roche diagnostics) L'homogénat est ensuite gardé 15 minutes à 4°C puis centrifugé 10 minutes à 5000 g. Le lysat est ensuite collecté et dilué dans du tampon de Laemmli et soumis à une électrophorèse comme décrit précédemment. Les membranes sont alors incubées avec les anticorps primaires respectivement dirigés contre la forme phosphorylée de Akt au niveau de la Ser ⁴⁷³ (réf. G7441 Promega) ou contre l'actine (témoin positif) (MAB1501R, Millipore) à 4°C pendant 14 heures. Puis après lavages, les membranes sont incubées avec les anticorps secondaires (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Les signaux sont détectés par chimioluminescence {Détection ECL, GE Healthcare) et quantifiés par densitométrie.

B. Résultats

1. Homogénéité de la population adipocytaire mature

La proportion de pré-adipocytes contaminants présent dans la population d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux utilisée pour la culture a été déterminée en mesurant l'expression par PCR en temps réel du marqueur Del l/Prefl spécifique des pré-adipocytes.

Cette mesure montre que la population d'adipocytes matures utilisée est essentiellement homogène, dans la mesure où elle comprend moins de 5% de pré- adipocytes (environ 4%).

2. Détection des protéines adipocytaircs

Les adipocytes matures cultivés dans le support tridimensionnel formé par l'hydrogel présentent bien un aspect uniloculaire après marquage par immuno fluorescence des protéines membranaires CD36 et cavéoline-1, ce qui démontre la possibilité de détecter des protéines adipocytaircs membranaires. Par ailleurs, les lysats adipocytaircs peuvent être analysés par immuno-électrophorèse comme le montre la détection de la protéine cytosolique adipocytaire aP2/FABP4 et de l'actine (Figure 4),

3. Activité lipolytique

L ^' activité lipolytique est mesurée en conditions basalcs et en conditions stimulées par 10 μΜ de forskoline sur les adipocytes matures maintenus dans l'hydrogel pendant 7 jours. Cette activité est également comparée à celle des mêmes cellules fraîchement isolées. Les résultats présentés dans les Figures 5 et 6 montrent que l'activité lipolytique basale ( Figure 5) et stimulée par la forskoline (Figure 6) est du même ordre que celle des adipocytes fraîchement isolés et reste constante pendant 5-7 jours. Par ailleurs, la présence de dexaméthasone (gluco corticoïde de synthèse) dans le milieu de culture ne modifie pas les activités basales et stimulées.

4. Sécrétion des adipokines : adiponectine et leptine

La sécrétion d' adiponectine (Figure 7) et de leptine (Figure 8) est mesurée jusqu'à 7 jours de maintien des adipocytes matures dans l'hydrogel en présence ou non de dexaméthasone (glucocorticoïde de synthèse). Par ailleurs, comme le montre la Figure 7, la sécrétion de leptine diminue au cours de la culture en l'absence de dexaméthasone alors que cette sécrétion augmente en présence du glucocorticoïde démontrant ainsi que la réponse à ces hormones reste fonctionnelle dans les adipocytes en culture. La sécrétion d' adiponectine reste quant à elle constante pendant 7 jours (Figure 8).

5. Expression génique des adipocytes

L'expression de gènes adipoeytaires est comparée entre des adipocytes matures fraîchement isolés et les mêmes cellules maintenues pendant 2 jours en hydrogel. La Figure 9 montre que l'expression des adipokines (leptine et adiponectine), du facteur de transcription majeur adipocytaire PPARy2 et de ses gènes cibles aP2/FABP4 et LPL reste constante.

6. Mesure de la sensibilité à l'insuline

Les adipocytes constituent une cible privilégiée de l'insuline, hormone anabolique majeure. Dans les adipocytes humains, l'insuline stimule la consommation du glucose entraînant une synthèse accrue de triglycérides et en revanche inhibe la dégradation de ces lipides. L'enzyme Akt transmet les effets métaboliques de l'insuline qui provoque son activation par phosphorylation de la senne 473 (Ser ⁴⁷³ Akt). Ainsi, le niveau de phosphorylation de Akt constitue un index de sensibilité à l'insuline des cellules.

L'insuline (10 nM) stimule la phosphorylation d'Akt d'une manière identique dans les adipocytes fraîchement isolés (2D) et ceux maintenus pendant 48h dans l'hydrogel (3D) indiquant ainsi un bon maintien de la réponse à l'insuline de ces cellules (Figure 10). Conclusions

Les adipocytes matures maintenus dans un support de culture tridimensionnel d'hydrogel avec un milieu d'incubation, qui peut être supplémenté avec des glucocorticoïdes et des thiazolinidinediones, présentent une activité lipolytique et de sécrétion des adipokines (leptine et adiponectine) comparable à celles d' adipocytes fraîchement isolés. De plus, les adipocytes matures maintenus dans l'hydrogel conservent pendant au moins 7 jours la capacité de réponse aux glucocorticoïdes, hormones cruciales pour le métabolisme et le développement adipocytaires (Macfarlane et al. (2008) J. Endocrinol. 197:189-204).

Ainsi, ce système peut être utilisé pour le criblage de composés pharmacoîogiques présentant des activités lipolytiques ou d'activation du facteur de transcription adipo-spécifiques PPARy2, par exemple.

Par ailleurs, les inventeurs ont montré que les adipocytes matures maintenus dans un support de culture tridimensionnel d ^' hydrogel selon Γ invention conservent au moins 2 jours leur sensibilité à l'insuline par rapport à des adipocytes matures fraîchement isolés. Ceci confirme que la culture d ^' adipocyte selon Γ invention est un modèle représentatif des adipocytes matures in vivo.