in einer Probe

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe. Stand der Technik

Biopharmazeutische Produkte teilen sich in Biologics und deren Nachahme- Präparate Biosimilars ein und sind jene Kategorie von Therapeutika, die in lebenden Organismen hergestellt werden. Zu diesen Produkten zählen unter anderem rekom- binante Proteine und Antikörper. Diese Produkte spielen eine Schlüsselrolle bei der Behandlung von unterschiedlichen Krankheiten wie Diabetes, verschiedener Krebsarten und Entzündungserkrankungen.

Biopharmazeutische Produkte stellen aus medizinischer Sicht höchst attraktive Therapeutika dar, da Proteine und Antikörper bezüglich ihrer Wirkung herausragende Aktivitäten und Spezifitäten besitzen. Allerdings befinden sich die größten Herausfor- derungen, bedingt durch die strukturelle Komplexität dieser hochmolekularen Stoffe gegenüber klassischen niedermolekularen Pharmazeutika, im Bereich der physikalischen und chemischen Stabilität. Fehlfaltung solcher Proteine, und in weiterer Folge, die Aggregation, kann während jeder einzelnen Phase des Produktzyklus eines solchen Therapeutikums stattfinden. Diese Stufen beinhalten die Expression, Faltung, Aufreinigung, Sterilisation, Versand, Lagerung und die Lieferung des Produkts.

Die Folgen von Protein-Aggregation sind einerseits eine Reduktion an Aktivität und, besonders nachteilig, eine erhöhte Immunogenität des Produktes. Wenn das Immunsystem den Wirkstoff als Antigen erkennt und Antikörper dagegen bildet, führt dies zu dessen Abbau oder sogar zu einer allergischen Reaktion. Dies macht die Therapie unwirksam gegebenenfalls sogar gefährlich.

Als homogene Proteinaggregate werden jegliche selbst-assoziierte Protein Spezies definiert, wobei das Monomer die kleinste natürlich vorkommende Einheit oder Un- tereinheit darstellt. Aggregate werden nach den fünf Charakteristika Größe, Reversibilität (Dissoziation), Konformation, chemische Modifikation, und Morphologie eingeteilt [1].

Die kleinste Aggregate-Einheit entspricht zwei Monomeren (Dimer), wobei der Anzahl an Monomeren im Weiteren nach oben hin keine Grenze gesetzt sind [1]. Nachteilig wurden selbst für die kleinsten Aggregateinheiten von biopharmazeutischen Proteinprodukten bereits Immunantworten gefunden [2].

Zusätzlich zu den homogenen Protein Aggregaten gibt es auch heterogene Aggregate, bei denen das Protein Monomer mit einer oder mehreren anderen Proteinspezies oder auch organischen oder anorganischen Verunreinigungen assoziieren kann.

Die unterliegenden Mechanismen, welche eine Immunantwort durch Aggregate hervorrufen bzw. verstärken können sind unterschiedlich. Zu diesen zählen a) eine erhöhte Vernetzung von B-Zellen Rezeptoren, die deren Aktivierung hervorrufen können [3], b) eine erhöhte Antigenaufnahme, Prozessierung und Präsentation mit da- rauf folgender Auslösung immunstimulierender Signale [4]. Solche Mechanismen können T-Zellen zur Herstellung von Antikörpern anregen. Die größte klinische Gefahr einer durch Aggregate verursachten Immunantwort hängt von der Erhaltung oder Entartung von Monomer Epitopen im Aggregat ab. Im Falle einer Erhaltung der Epitope können Antikörper, welche ursprünglich nur gegen das Aggregat gerichtet waren auch Monomere binden und deren Wirkung vermindern oder neutralisieren. Im Falle einer Entartung richten sich die Antikörper exklusiv gegen Aggregate, während die Wirkstoffaktivität des nativen Proteins nicht beeinträchtigt wird. In beiden Fällen kann die Immunantwort bis hin zur Anaphylaxie führen, die für den Patienten gefährlich sein kann. Gegenwertig gibt es kein standardisiertes Verfahren zur Analyse von Verunreinigungen, des Aggregatanteils und dessen Größe in biopharmazeutischen Präparaten. Aggregate werden der Größe nach in zwei Kategorien eingeteilt und geeignete Messverfahren vorgeschlagen.

Aggregate >1 μιτι: Für die Bestimmung großer Aggregate und Verunreinigungen werden typischerweise optische Methoden angewendet, wie z. B. die Licht Abschwä- chung (LO), Dynamic Imaging Particle Analysis (DIPA) und Micro-flow imaging (MFI) sowie das elektrochemische Verfahren des Coulter Zähler (CC). Mit ausgereiften Formen dieser Verfahren können auch die Anzahl, die Größe und die Form der vorhandenen Aggregate festgestellt werden.

Aggregate zwischen 0,1 pm und 1 μητι: In diesem Größenbereich kommen komplexe Systeme zur Detektion kleiner Aggregate zum Einsatz. Zu diesen zählen Größenauf- schlusschromatographie (SEC), Analytische Ultrazentrifugation (AUC) und asymmetrische Feld-Fluss Fraktionierung (AF4). Um die Sensitivität solcher Geräte zu erhöhen, werden sie oftmals mit einem Massenspektrometer gekoppelt. Diese Techniken erlauben zwar die Quantifizierung und die Verteilung von Aggregaten. Nachteilig ist es die Zusammensetzung zu ermitteln und diese Verfahren eignen sich nur bedingt für Hochdurchsatzanwendungen.

Informationen über den Aggregat-Typ und die Quantität an Aggregaten sind notwendig um festzustellen, ab welchem Aggregatanteil eine Immunantwort auf das therapeutische Protein stattfindet-f8]. Bislang wurde die Immunantwort hauptsächlich gro- ßen Aggregaten und Partikeln zugeschrieben [3], obwohl es denkbar ist, dass die gebildeten Aggregate und Mengen von Produkt zu Produkt variieren und zu verschiedenen klinischen Szenarien führen können.

Die Erkenntnis, dass auch Partikel und Aggregate im Bereich von 0,1-10 pm potentiell immunogen wirken können, setzt sich zwar langsam durch, doch es fehlt den derzeit eingesetzten Methoden an Präzision, um dies festzustellen [5].

Aufgabe der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein hochsensitives Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe bereit zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Kit zur Durchführung des Verfahrens bereit zu stellen.

Weitere Aufgaben und Lösungsansätze hierzu ergeben sich aus der Beschreibung zur Erfindung sowie den Unteransprüchen. Lösung der Aufgabe

Die Aufgabe wird gelöst mit dem Verfahren nach Patentanspruch 1 und dem Kit nach dem Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausgestaltungen hierzu ergeben sich jeweils aus den hierauf rückbezogenen Patentansprüchen. Beschreibung der Erfindung

Die Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Aggregaten biotherapeutischer Substanzen in einer Probe, umfassend folgende Schritte: a. Auftragen der zu untersuchenden Probe auf ein Substrat, b. Hinzufügen von für den Nachweis geeigneten Sonden, die durch

spezifische Bindung an die Aggregate biotherapeutischer Substanzen diese markieren und c. Nachweis der markierten Aggregate biotherapeutischer Substanzen wobei Schritt b) vor Schritt a) durchgeführt werden kann.

Es kann also auch zunächst die Sonde und sodann die Probe zum Substrat hinzuge- fügt werden.

Das Verfahren zum Nachweis und insbesondere zur quantitativen und/oder qualitativen Bestimmung von homogenen und heterogenen Aggregaten ist dadurch gekennzeichnet, dass Aggregate von und in biopharmazeutischen Produkten mindestens eine Bindungsstelle für eine Sonde enthalten. Optional umfasst das Aggregat auch mindestens eine Bindungsstelle für ein Fängermolekül.

Das Verfahren umfasst dann folgende Schritte: a) Immobilisieren von Fängermolekülen auf einem Substrat, b) In Kontakt bringen der Probe mit einem biopharmazeutischen Produkt in

Lösung mit den Fängermolekülen, c) Immobilisieren von Monomeren und/oder Aggregaten eines oder mehrerer sich in Lösung eines biopharmazeutischen Produktes befindenden Moleküls auf dem Substrat durch Bindung an die Fängermoleküle, d) In Kontakt bringen einer Sonde mit den Monomeren und/oder Aggregaten, e) Binden der Sonde an die Monomere und/oder Aggregate, wobei die Sonde in der Lage ist, ein definiertes Signal zu erzeugen und die Schritte b) und d) gleichzeitig erfolgen können oder der Schritt d) vor dem Schritt b) erfolgen kann.

Sofern die Schritte b) und d) gleichzeitig erfolgen, werden somit auch die Schritte c) und e) gleichzeitig durchgeführt. In der weiteren Variante, in welcher Schritt d) vor Schritt b) durchgeführt wird, erfolgt somit in Schritt c) eine Immobilisierung von mit Sonden markierten Monomere und Aggregate auf dem Substrat. Mithin erfolgt also auch Schritt e) vor den Schritten b) und c).

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„quantitative Bestimmung" zu- nächst die Bestimmung der Konzentration der Aggregate, mithin also auch die Bestimmung ihrer An- und/oder -Abwesenheit.

Bevorzugt bedeutet die quantitative Bestimmung auch die selektive Quantifizierung von Aggregatzusammensetzungen. Eine solche Quantifizierung kann über die entsprechenden Sonden erfolgen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet die„qualitative Bestimmung" die Charakterisierung der Aggregatzusammensetzung.

Die Aggregate werden mit einer oder mehreren für die Detektion dienlichen Sonden markiert. Die Sonden enthalten ein affines Molekül, welches eine Bindungsstelle des Aggregats oder seines Monomers erkennt und daran bindet. Außerdem enthalten die Sonden mindestens ein Detektionsmolekül oder ein Molekülteil, welches an das affine Molekül oder Molekülteil gebunden ist und mittels chemischer oder physikalischer Verfahren detektierbar bzw. messbar ist. Die Sonden können in einer Alternative identische affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen (oder Teile) aufweisen. In einer weiteren Alternative können unterschiedliche affine Moleküle oder Molekülteile mit unterschiedlichen Detektionsmolekülen oder Teilen kombiniert sein, oder alternativ unter- schiedliche affine Moleküle oder Teile mit identischen Detektionsmolekülen oder Teilen. Es können auch Mischungen verschiedener Sonden eingesetzt werden.

Der Einsatz mehrerer unterschiedlicher Sonden, die an unterschiedliche Detektions- moleküle oder Molekülteile gekoppelt sind, erhöht zum einen die Spezifität des Signals (Korrelationssignals), zum anderen ermöglicht dies die Identifikation von Aggre- gaten, die sich in ihrer Zusammensetzung unterscheiden. Dies ermöglicht eine selektive Quantifizierung und Charakterisierung der Aggregate.

In einer Ausführung erfolgt eine ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals, also eine ortsaufgelöste Detektion des Signals, welches von der Sonde emittiert wird. Demgemäß sind in dieser Ausführung der Erfindung Verfahren, die auf einem nicht- ortsaufgelösten Signal beruhen, wie ELISA oder Sandwich-ELISA, ausgeschlossen.

Bei der Detektion ist eine hohe Ortsauflösung vorteilhaft aber nicht essentiell. In einer Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei so viele Datenpunkte gesammelt, dass die Detektion eines Aggregates vor einem Hintergrundsignal, welches z. B. durch ein gerätespezifisches Rauschen, andere unspezifische Signale oder unspezifisch gebundene Sonden verursacht wird, erlaubt. Auf diese Weise werden so viele Werte ausgelesen (Read-out- Werte), wie ortsaufgelöste Ereignisse, wie z. B. Pixel, vorhanden sind. Durch die Ortsauflösung wird jedes Ereignis vor dem jeweiligen Hintergrund bestimmt und stellt so einen Vorteil gegenüber ELISA- Verfahren ohne ortsaufgelöstes Signal dar. In einer Ausführung beruht die ortsaufgelöste Bestimmung des Sondensignals auf der Untersuchung eines kleinen Volumenelements im Vergleich zum Volumen der Probe, im Bereich von wenigen Femtolitern bis unterhalb eines Femtoliters, oder eines Volumenbereichs oberhalb der Kontaktoberfläche der Fängermoleküle mit einer Höhe von 500 nm, bevorzugt 300 nm, besonders bevorzugt 250 nm, insbeson- dere 200 nm, aber auch 150 nm und 90 nm. Im Sinne der Erfindung handelt es sich bei Aggregaten entweder um homogene Aggregate, bestehend aus mindestens zwei gleichen Monomereinheiten, oder heterogenen Aggregaten bestehend aus mindestens zwei unterschiedlichen Monomereinheiten. Im Falle von heterogenen Aggregaten können auch beide Monomere in ihrer Primärsequenz identisch sein, sich aber in ihrer Konformation unterscheiden.

In einer Ausführung wird das Material des Substrats ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus Kunststoff, Silizium und Siliziumdioxid. In einer bevorzugten Alternative wird als Substrat Glas eingesetzt.

In einer weiteren Ausführung der Erfindung sind die Fängermoleküle kovalent an das Substrat gebunden.

Hierzu wird in einer Alternative ein Substrat eingesetzt, das eine hydrophile Oberfläche aufweist. In einer Alternative wird dies durch das Auftragen einer hydrophilen Schicht, vor Schritt a), auf das Substrat erreicht. Mithin binden die Fängermoleküle kovalent an das Substrat bzw. an die hydrophile Schicht, mit welcher das Substrat beladen ist.

Die hydrophile Schicht ist eine Biomolekül-abweisende Schicht, so dass die unspezifische Bindung von Biomolekülen an das Substrat minimiert wird. Auf diese Schicht werden optional die Fängermoleküle, bevorzugt kovalent, immobilisiert. Diese sind affin gegenüber einem Merkmal der Monomere oder deren Aggregaten. Die Fänger- moleküle können alle identisch sein, oder Mischungen unterschiedlicher Fängermoleküle sein.

In einer Alternative werden als Fängermoleküle und Sonden dieselben Moleküle eingesetzt, bevorzugt enthalten die Fängermoleküle kein Detektionsmolekül bzw. Molekülteile. In einer Ausführung wird die hydrophile Schicht ausgewählt aus der Gruppe enthaltend oder bestehend aus PEG, Poly-Lysin, bevorzugt Poly-D-Lysin, und Dextran oder Derivate davon, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD). Derivate im Sinne der Erfindung sind Verbindungen, die sich in einigen Substituenten von den Stammverbindungen unterscheiden, wobei die Substituenten gegenüber dem erfindungs- gemäßen Verfahren inert sind. In einer Ausführung wird die Oberfläche des Substrats vor Auftrag der hydrophilen Schicht zunächst hydroxyliert und anschließend mit geeigneten chemischen Gruppen, bevorzugt Aminogruppen, funktionalisiert. Diese Funktionalisierung mit Amino- gruppen erfolgt in einer Alternative durch in Kontaktbringen des Substrats mit Amino- silanen, bevorzugt APTES (3-Aminopropyltrietoxysilan), oder mit Ethanolamin.

Zur Vorbereitung des Substrats auf die Beschichtung können ein oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden:

• Waschen eines Substrats aus Glas bzw. eines Glasträgers im Ultraschallbad oder Plasma-cleaner, alternativ dazu in 5 M NaOH mindestens 3 Stunden inkubieren,

• Spülen mit Wasser und anschließendem Trocknen unter Stickstoff oder unter Vakuum,

• Eintauchen in eine Lösung aus konzentrierter Schwefelsäure und Wasserstoffperoxid im Verhältnis 3:1 für die Aktivierung der Hydroxylgruppen, · Spülen mit Wasser bis zu einem neutralen pH, anschließend mit Ethanol und

Trocknen unter Stickstoffatmosphäre,

• Eintauchen in eine Lösung mit 3-Aminopropyltrietoxysilan (APTES) (1 - 7 %), bevorzugt in trockenem Toluol, oder einer Lösung von Ethanolamin,

• Spülen mit Aceton oder DMSO und Wasser und Trocknen unter Stickstoffatmosphäre.

In einer Alternative erfolgt das in Kontakt bringen des Substrats mit Aminosilanen, bevorzugt APTES, in der Gasphase; das gegebenenfalls vorbehandelte Substrat wird mithin mit den Aminosilanen bedampft.

Für die Beschichtung mit Dextran, bevorzugt Carboxymethyl-Dextran (CMD), wird das Substrat mit einer wässrigen Lösung von CMD (in einer Konzentration von 10 mg/ml oder 20 mg/ml) und mit einem Katalysator für die Kovalente Kopplung, gegebenenfalls N-Ethyl-N-(3-Dimethylaminpropyl) Carbodiimid (EDC), (200 mM) und N- Hydroxysuccinimid (NHS), (50 mM) inkubiert, und anschließend gewaschen. Das Carboxymethyl-Dextran ist in einer Variante kovalent an die Glasoberfläche gebunden, die zunächst hydroxyliert und anschließend mit Amingruppen funktionali- siert wurde, wie oben beschrieben.

Als Substrat können Mikrotiterplatten, bevorzugt mit Glasboden, eingesetzt werden. Da bei der Verwendung von Polystryrolrahmen der Einsatz von konzentrierter

Schwefelsäure nicht möglich ist, erfolgt die Aktivierung der Glasoberfläche in einer Ausführungsvariante der Erfindung analog.

Auf diese hydrophile Schicht werden, bevorzugt kovalent, Fängermoleküle immobilisiert, welche affin gegenüber einem Merkmal (z. B.: Proteine) des Aggregats sind. Die Fängermoleküle können alle identisch sein oder Mischungen verschiedener Fängermoleküle sein.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung werden die Fängermoleküle, bevorzugt Antikörper gegen Monomere des Aggregats, gegebenenfalls nach einer Aktivierung des mit CMD beschichteten Trägers durch eine Mischung aus EDC/NHS, be- vorzugt 200 bzw. 50 mM, auf dem Substrat immobilisiert.

Verbleibende Carboxylat-Endgruppen, an die keine Fängermoleküle gebunden wurden, können deaktiviert werden. Zur Deaktivierung dieser Carboxylat-Endgruppen auf dem CMD-Spacer wird Ethanolamin verwendet. Vor dem Auftrag der Proben werden die Substrate bzw. Träger gegebenenfalls mit Puffer gespült. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung, wird das Substrat vor dem Auftragen der Probe mit Protein oder Peptid haltigen Lösungen geblockt und mit Puffer gewaschen.

Die zu vermessende Probe wird mit dem so präparierten Substrat in Kontakt gebracht und gegebenenfalls inkubiert. Als zu untersuchende Probe können unter- schiedlich formulierte Lösungen des biopharmazeutischen Produktes, des Produkts in Zellüberständen und Kulturmedien oder körpereigene Flüssigkeiten eingesetzt werden. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird die Probe ausgewählt aus Liquor (CSF), Blut, Plasma und Urin. Die Proben können unterschiedliche, dem Fachmann bekannte, Aufbereitungsschritte durchlaufen. In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung erfolgt das Auftragen der Probe unmittelbar auf dem Substrat (nichtbeschichteten Substrat), gegebenenfalls durch kova- lente Bindung auf der gegebenenfalls aktivierten Oberfläche des Substrats.

In einer Variante der vorliegenden Erfindung erfolgt eine Vorbehandlung der Probe nach einem oder mehreren der folgenden Verfahren:

- Erhitzen der Probe,

- Ein oder mehrere Gefrierauftauzyklen,

- Mechanischer Aufschluss,

- Homogenisierung der Probe, - Verdünnen mit Wasser oder Puffer,

- Behandlung mit Enzymen, zum Beispiel Nuklease, Lipasen,

- Zentrifugieren,

- Kompetition mit Sonden, um eventuell vorhandene Antikörper zu verdrängen.

Bevorzugt wird die Probe unmittelbar und/oder ohne Vorbehandlung mit dem Sub- strat in Kontakt gebracht.

Unspezifisch gebundene Substanzen können durch Waschschritte entfernt werden.

In einem weiteren Schritt werden immobilisierte Aggregate mit einer oder mehreren für die weitere Detektion dienlichen Sonden markiert. Wie oben beschrieben können die einzelnen Schritte auch in einer anderen Reihenfolge erfindungsgemäß durchge- führt werden.

Durch geeignete Waschschritte werden überschüssige Sonden, die nicht an die Aggregate gebunden sind, entfernt.

In einer Alternative werden diese überschüssigen Sonden nicht entfernt. Dadurch entfallen die letzten Waschschritte und es findet auch keine Gleichgewichtsverschie- bung in Richtung der Dissoziation der Aggregat-Sonden-Komplexe oder - Verbindungen statt. Durch die orts-aufgelöste Detektion werden die überschüssigen Sonden bei der Auswertung nicht erfasst und beeinträchtigen die Messung nicht.

In einer Variante werden die Proben-Fängermolekül-Komplexe chemisch fixiert.

In einer Alternative werden Detektionssonden-Proben-Fängermolekül-Komplexe chemisch fixiert und somit auch die Proben-Fängermolekül-Komplexe.

In einer besonderen Ausführung des Verfahrens sind die Bindungsstellen der Aggregat Epitope und die Fängermoleküle und Sonden Antikörper. In einer Variante der vorliegenden Erfindung können Fängermoleküle und Sonden identisch sein.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich Fängermoleküle und Sonden. So können z. B. unterschiedliche Antikörper als Fängermoleküle und als Sonden eingesetzt werden.

In einer weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung werden Fängermoleküle und Sonden eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind. In einer weiteren Alternative der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Sonden eingesetzt, die mit Ausnahme der eventuellen (Farbstoff-) Markierung identisch zueinander sind.

In weiteren Alternativen der vorliegenden Erfindung werden mindestens zwei oder mehrere unterschiedliche Fängermoleküle und/oder Sonden eingesetzt, die unter- schiedliche Antikörper enthalten und gegebenenfalls auch unterschiedliche Farb- stoffmarkierung haben.

In einer Alternative des Erfindung werden zwei oder mehrere Sonden mit entsprechenden Farbstoffen markiert, dass ein FRET, ein sogenannter Förster resonanter Energie Transfer, stattfindet wobei ein Farbstoff angeregt wird und ein anderer in der Nähe befindlicher emittiert, wobei es sich bei beiden Farbstoffen um unterschiedliche Moleküle handelt.

Zur Detektion sind die Sonden so gekennzeichnet, dass sie ein optisch detektier- bares Signal aussenden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz-, Phosphoreszenz, Biolumineszenz-, Chemolumineszenz und Elektrochemolumines- zenz-Emission sowie Absorption.

In einer Alternative sind die Sonden somit mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. Als Fluoreszenzfarbstoff können die dem Fachmann bekannten Farbstoffe eingesetzt werden. Alternativ können auch fluoreszente Biomoleküle, bevorzugt GFP (Green Fluorescence Protein), Konjugate und/oder Fusionsproteine davon, sowie fluoreszente Nanopartikel, bevorzugt Quantendots verwendet werden.

Zur späteren Qualitätskontrolle der Oberfläche, zum Beispiel Gleichmäßigkeit der Beschichtung mit Fängermolekülen, können Fängermoleküle, gekennzeichnet mit Fluoreszenzfarbstoffen, eingesetzt werden. Hierzu wird bevorzugt ein Farbstoff verwendet, der nicht mit der Detektion interferiert. Dadurch wird eine nachträgliche Kontrolle des Aufbaus möglich sowie eine Normierung der Messergebnisse.

Die Detektion der immobilisierten und markierten Aggregate erfolgt mittels Abbildung der Oberfläche (z. B. Laser Mikroskopie). Eine möglichst hohe Ortsauflösung ermittelt eine hohe Anzahl an Bildpunkten, wodurch die Sensitivität sowie die Selektivität des Assays erhöht werden können, da strukturelle Merkmale mit abgebildet und analysiert werden können. Somit erhöht sich das spezifische Signal vor dem Hintergrundsignal (z. B. unspezifisch gebundener Sonden).

Die Detektion erfolgt bevorzugt mit konfokaler Fluoreszenzmikroskopie, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS), insbesondere in Kombination mit Kreuzkorrelation und Laser-Scanning-Mikroskop (LSM).

Die Detektion bzw. der Nachweis wird in einer Alternative der vorliegenden Erfindung mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durchgeführt.

In einer Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Laserfokus, wie er z. B. in der Laser-Scanning-Mikroskopie verwendet wird, oder ein FCS (Fluorescence Corre- lation Spectroscopy System) dazu eingesetzt, sowie die entsprechenden superauflösenden Varianten wie zum Beispiel STED, PALM oder SIM.

In einer weiteren Ausführung kann die Detektion bzw. der Nachweis mittels ortsauflösender Fluoreszenzmikroskopie, bevorzugt durch ein TIRF-Mikroskop erfolgen, so- wie die entsprechenden superauflösenden Varianten davon, wie zum Beispiel STORM, dSTORM.

Im Unterschied zu ELISA entstehen durch diese Verfahren so viele Readout-Werte, wie Orts-aufgelöste Ereignisse (z. B. Pixel) vorhanden sind. Abhängig von der Anzahl 5 an unterschiedlichen Sonden wird diese Information sogar vervielfacht. Diese Vervielfachung gilt für jedes Detektionsereignis und führt zu einem Informationsgewinn, da sie weitere Eigenschaften (z. B. zweites Merkmal) über Aggregate offenbart. Durch so einen Aufbau kann für jedes Ereignis die Spezifität des Signales erhöht werden.

Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass im Falle von heterogenen Agi o gregaten die Anwesenheit von einzelnen Bestandteilen oder Konformationen, das Messergebnis nicht beeinflussen. Die Sonden können derart ausgewählt werden, dass homogene und heterogene Aggregate und unterschiedliche heterogene Aggregate in einer Messung bestimmt werden können.

Zur Auswertung werden die ortsaufgelösten Informationen (z. B. die Fluoreszenz- 15 Intensität) aller eingesetzten und detektierten Sonden herangezogen, um z. B. die Anzahl Aggregate, deren Größe und deren Merkmale zu bestimmen. Dabei können z. B. auch Algorithmen der Hintergrundminimierung und/oder auch Intensitäts- Schwellenwerte für die weitere Auswertung sowie der Mustererkennung angewandt werden. Weitere Bildanalyse-Optionen beinhalten z. B. die Suche nach lokalen In- 0 tensitätsmaxima, um aus der Bildinformation die Zahl an detektierten Aggregaten zu erhalten.

Um die Testergebnisse miteinander über Entfernungen, Zeiten und Experimentatoren hinweg vergleichbar zu machen, können Standards z. B. interne und/oder externe Standards eingesetzt werden. Diese Standards können auch zur Kalibration der 5 Messung dienen, um die Größenverteilung, Quantität und/oder Zusammensetzung von Aggregaten biopharmazeutischer Produkte festzustellen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Standards, die eine enge Größenverteilung aufweisen und die aus zwei oder mehreren identischen oder unterschiedlichen Polypeptidsequenzen bestehen. Bei den Po- 30 lypeptidsequenzen kann es sich auch um die native monomere Form des biopharmazeutischen Wirkstoffs handeln. In einer Variante besteht der Standard aus einer Mischung verschiedener Größenverteilungen.

In einer Variante ist der Standard markiert.

In einer Variante besteht der Standard aus zwei oder mehreren Monomeren, die kovalent miteinander verknüpft sind.

In einer Variante besteht der Standard aus einem Nanopartikel, an dessen Oberfläche zwei oder mehrere Monomere oder eine Polypeptidsequenz kovalent gebunden sind und die Polypeptidsequenz identisch in einem Teilbereich mit der Sequenz des Monomers der biotherapeutischen Substanzen ist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, enthaltend eine oder mehrere der folgenden Komponenten:

Substrat, ggf. mit hydrophiler Oberfläche, Fängermolekül, Sonde, Standard, Substrat mit Fängermolekül, Lösungen, Puffer.

Die Verbindungen und/oder Komponenten des Kits der vorliegenden Erfindung kön- nen in Behältern gegebenenfalls mit/in Puffern und/oder Lösung, verpackt sein. Alternativ können einige Komponenten in demselben Behälter verpackt sein. Zusätzlich dazu oder alternativ dazu könnten eine oder mehrere der Komponenten an einem festen Träger, wie z. B. einer Glasplatte, einem Chip oder einer Nylonmembran oder an die Vertiefung einer Mikrotiterplatte, adsorbiert sein. Ferner kann das Kit Anwei- sungen für den Gebrauch des Kits für eine Beliebige der Ausführungsformen enthalten.

In einer weiteren Variante des Kits sind auf dem Substrat die oben beschriebenen Fängermoleküle immobilisiert. Zusätzlich kann das Kit Lösungen und/oder Puffer enthalten. Zum Schutz der Biomolekül-abstoßenden Oberfläche (z. B. Dextranober- fläche) und/oder der darauf immobilisierten Fängermoleküle können diese mit einer Lösung oder einem Puffer überschichtet werden. In einer Alternative enthält die Lösung ein oder mehrere Biozide, welche die Haltbarkeit der Oberfläche erhöhen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von homogene und heterogene Aggrega- te von und in biopharmazeutischen Produkten in beliebigen Proben, zur Quantifizierung (Titerbestimmung) von homogenen und heterogenen Aggregaten von und in biopharmazeutischen Produkten, direkte und/oder absolute Quantifizierung der Partikelzahl. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Optimierung und Überwachung von Prozess- Schritten während der Produktion von biopharmazeutischen Wirkstoffen und/oder Qualitätsbestimmung von End-Produkten.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfin- dungsgemäßen Verfahrens zur Detektion von homogenen und heterogenen Aggregaten von biopharmazeutischen Produkten in klinischen Tests, Studien als auch beim Therapie-Monitoring werden. Hierzu werden Proben gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren vermessen und die Ergebnisse verglichen.

Ausführungsbeispiele: Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispiels und der beigefügten Figur erläutert, ohne dass es hierdurch zu einer Einschränkung auf dieses spezielle Ausführungsbeispiel kommt.

Es zeigen:

Fig. 1 Aggregate (schraffierte Balken) und Monomere (weiße Balken) des humanen IgG Antikörper als Probe.

Die Figur 1 zeigt Aggregate (schraffierte Balken) und Monomere (weiße Balken) des humanen IgG Antikörper (Isotypen Kontrolle, ThermoFisher Scietific, RF237824) in einer dekadischen Verdünnungsreihe.

Als Monomer wurde der Antikörper, so wie er vorlag, verwendet und in salinem Phosphat Puffer (PBS) bei pH 7,4 verdünnt. Für die Herstellung von Aggregaten wurde die Probe (5 mg/ml) für 10 min bei 70°C erhitzt und nach Erreichen von 25°C dekadisch verdünnt.

Die Ergebnisse zeigen einen linearen Zusammenhang zwischen der Konzentration und dem Messsignal über 6 Log Stufen. Monomere hingegen zeigen über weite Bereiche weit geringere Messsignale. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass selbst in der Monomer Lösung geringe Aggregatmengen vorhanden waren, welche für Werte bei hohen Konzentrationen verantwortlich waren. Als Negativkontrolle (schwarzer Balken) wurde der Verdünnungspuffer verwendet. Konkrete Ausführung

Für das Experiment wurden kommerzielle Mikrotiter Platten (Greiner Bio-one; Sensopiate Plus) mit 384 Reaktionskammern (RK) und Glasboden als Substrat verwendet.

Zunächst wurde die Oberfläche der Mikrotiterplatte aufgebaut bzw. funktionalisiert. Hierfür wurde die Platte in einen Exsikator platziert, in dem sich eine Schale mit

5%igem APTES in Toluol befand. Der Exsikator wurde mit Argon geflutet und eine Stunde inkubiert. Danach wurde die Schale entfernt und die Platte für 2 Stunden im Vakuum getrocknet. In die Reaktionskammer der trockenen Platte wurden 20 μΙ einer 2 mM Lösung an SC-PEG-CM (MW 3400; Laysan Bio) in deionisiertem H ₂ O zur hydrophilen Beschichtung eingefüllt und für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktionskammer dreimal mit Wasser gewaschen und im Anschluss mit je 20 μΙ einer wässrigen 200 mM EDC-Lösung (1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)carbodiimide; Sigma) und mit 50 mM NHS (N- Hydroxysuccinimide, Sigma) für 30 Minuten inkubiert. Hierdurch erhält die hydrophile Beschichtung mit PEG eine Funktionalität zur Kopplung von Biomolekülen.

Die Platte wurde wieder dreimal mit deionisertem Waser gewaschen. Danach wurden die Reaktionskammer mit Klon 8A4 (Thermo-Fischer), einem monoklonalen Antikörper als Fängermolekül, der spezifisch die CH2 Domäne im FC Teil von humanen Antikörpern bindet, beschichtet (20μΙ; 10 pg/ml in PBS; 1 Stunde). Anschließend wurde die Reaktionskammer mit dem Waschprogramm bestehend aus jeweils dreimal Waschen und Leersaugen mit TBS mit 0,1 % Tween-20 und TBS behandelt.

Im nächsten Schritt wurden die Reaktionskammer mit 50 μΙ Smartblock (Candor Bioscience GmbH) über Nacht bei Raumtemperatur (RT) beschichtet und nach Ablauf der Zeit wieder dreimal mit salinem tris(hydroxymethyl)aminomethan (TBS;

pH=7,4) gewaschen. Die Proben wurden sequentiell in tris(hydroxymethyl)aminomethan (TRIS) Puffer mit Farbstoff Hoechst Stain (1 pg ml-1 ) verdünnt und für eine Stunde inkubiert. Danach wurde in dreifacher Ausführung je 20 μΙ Probe in die Reaktionskammer aufgetragen und bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Re- aktionskammer dreimal mit TBS gewaschen und mit 20 μΙ Detektionsantikörper versetzt. Die Detektionsantikörper wurden jeweils mit einer Art Fluoreszenzfarbstoff markiert: Separat wurde 8A4 (ThermoFisher Scientific, MA1-81864,) mit Fluores- zensfarbstoffen CF488 und mit CF633 markiert. Diese Sondenantikörper bzw Detektionsantikörper wurden zusammen in TBS zu einer finalen Konzentration 1 ,25 ng/ml für jeden Antikörper verdünnt. Sie binden spezifisch Epitope der Monomere und Aggregate der biotherapeutischen Substanz.

Je Reaktionskammer wurden 20 μΙ Antikörperlösung aufgetragen und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Ablauf der Zeit wurde die Platte dreimal mit TBS gewaschen und die Platte mit einer Folie versiegelt. Zum Nachweis der Aggregate wurde eine ortsaufgelöste Mikroskopie durchgeführt. Die Messung erfolgte im TIRF Mikroskop (Leica) mit einem 100 fach Öl Immersionsobjektiv. Hierfür wurde der Glasboden der Mikrotiterplatte reichlich mit Immersions-Öl bestrichen und die Platte in die automatisierte Bühne des Mikroskops eingebracht. Danach wurde je Reaktionskammer an 5 x 5 Positionen in zwei Fluoreszenzkänalen (Ex/Em=633/715 nm und 488/525 nm) je ein Bild (1000 x 100 pixel) konsekutiv aufgenommen um so viele Datenpunkte zu erhalten, dass die Detektion einzelner Aggregate vor dem Hintergrundsignal möglich wurde. Es wurde die maximale Laserleistung (100%), eine Belichtungszeit von 500 ms und ein Verstärkungswert von 800 gewählt. Die Bilddaten wurden danach ausgewertet. Intensitätsschwellenwerte wurde für jeden Kanal bei 0,0001 % Graustufen der gemittelten negativ Kontrolle im entsprechenden Kanal gesetzt. Im Auswertungsschritt wurde zunächst für jedes Bild in jedem Kanal der Intensitätsschwellenwert angewandt und anschließen Bilder gleicher Position in beiden Werten miteinander verglichen. Es wurden nur jene Pixel pro Bild gezählt bei denen in beiden Kanälen der Pixel an der exakt gleichen Position über dem Intensitätsschwellenwert des Kanals liegt. Abschließend wird die Anzahl der

Pixel über alle Bilder in jedem RK gemittelt und danach die Mittelwerte der Mittleren Pixelzahlen der Replikatwerte ermittelt und die Standardabweichung angegeben. Die Werte sind in der Figur 1 gezeigt.

Diese Kalibrationsreihe kann dann als Einstieg dienen in komplexere Nachweis- Verfahren biotherapeutischer Substanzen, im konkreten Fall des IgG, welches sich als biotherapeutische Substanz in Lösung eines pharmatzeutischen Präparats als Probe befinden kann und auf Aggregate hin untersucht werden soll. Der fluoreszierende Sonden-Antikörper kann dabei nicht an einem Fängermolekül gebundenes Monomer binden, da dessen Bindungsstelle durch das Fängermolekül belegt ist. Er bindet stattdessen nur an die Monomerepitope der Aggregate. Dieses wird somit auf die gezeigte Weise quantifizierbar.

Referenzen:

[1] Narhi, L. O. , J. Schmit, et al. (2012). "Classification of protein aggregates." J Pharm Sei 101 (2): 493-498.

[2] Gamble, C. N. (1966). "The role of soluble aggregates in the primary immune response of mice to human gamma globulin." Int Arch Allergy Appl Immunol 30(5): 446-455.

[3] Bachmann, M. F., U. H. Rohrer, et al. (1993). "The influence of antigen Organization on B cell responsiveness." Science 262(5138): 1448-1451 .

[4] Seong, S. Y. and P. Matzinger (2004). "Hydrophobicity: an ancient damage- associated molecular pattern that initiates innate immune responses." Nat Rev Immunol 4(6): 469-478.

[5] den Engelsman, J., Garidel, P., et al. (2011 ). Strategies for the Assessment of Protein Aggregates in Pharmaceutical Biotech Product Development. Pharm. Res. 28: 920-933.