REVERSIBLEMENT PHOTOCOMMUTABLES A HAUTE FREQUENCE L'invention porte sur un procédé de détection d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables à haute fréquence. Un tel procédé présente de nombreuses applications, notamment en chimie, en biologie et dans le domaine des mesures et du criblage environnementaux. On entend par « espèce » une espèce chimique telle qu'une molécule ou un complexe, ou un objet physique tel qu'une nanoparticule. On entend par « espèce réversiblement photocommutable » (« photoswitchable » ou « photoconvertible » dans la littérature en anglais) une espèce présentant au moins deux états distincts, ayant des propriétés de fluorescence différentes, et pouvant passer d'un état à l'autre de manière réversible par effet de la lumière. Des exemples d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables sont la protéine « Dronpa » et le complexe « Spinach - DFHBI » (« Spinach » étant un aptamère d'ARN et DFHBI une sonde fluorogène). Ces espèces peuvent, en particulier, être utilisées comme sondes ou marqueurs. D'autres exemples d'espèces fluorescentes réversiblement commutables peuvent être des dérivés azoïques ou bien des échafaudages protéiques.

L'imagerie, et plus particulièrement la microscopie par fluorescence est devenue un outil indispensable en biologie, mais également dans d'autres disciplines telles que la science des matériaux. Ses applications, cependant, sont limitées par la capacité d'observer un signal d'intérêt dans un fond de fluorescence ou de bruit. Ce problème est particulièrement aigu dans les applications d'imagerie in vivo, animale ou végétale, dans lesquelles les marqueurs fluorescents à détecter sont dispersés dans un milieu complexe auto- fluorescent et/ou diffusant ; le signal utile se retrouve alors noyé dans un bruit de fond intense.

Une autre limite des techniques de détection et d'imagerie par fluorescence réside dans la largeur de la bande spectrale des fluorophores généralement employés par rapport à la largeur de la bande spectrale visible : il est difficile de détecter sélectivement plus de quatre marqueurs fluorescents dans un même échantillon, car leurs spectres d'émission tendent à se superposer.

Pou r surmonter ces limites, la demande de brevet WO 201 5075209 A1 et l'article de J . Querard et al. « Photoswitching Kinetics and Phase-Sensitive Détection Add Discriminative Dimensions for Sélective Fluorescence I maging » , Angew. Chem. I nt. Ed. 201 5, 54, 266-2637 (201 5), divulguent une méthode utilisant des sondes fluorescentes réversiblement photocommutables, dans laquelle on illumine u n échantillon, contenant une espèce de fluorophore photocommutable avec une lumière modulée périodiquement. La composante de l'intensité émise par les fluorophores à la même pulsation est alors détectée, en quadrature de phase par rapport à l'onde d'excitation. Cette méthode permet de détecter sélectivement certains fluorophores réversiblement photocommutables en minimisant, dans certaines conditions calculées analytiquement en fonction des caractéristiques du fluorophore, le bruit apporté dans les méthodes traditionnelles par l'auto-fluorescence et/ou la diffusion du milieu de l'échantillon. Un des problèmes de cette méthode réside dans la fréquence d'acquisition d'images successives. Les différentes espèces fluorescentes réversiblement photocommutables utilisées dans l'état de l 'art passent d'un état activé à leur état initial non activé de manière thermo-induite : le temps caractéristique de cette transition est par exemple de 5 à 1 0 secondes et correspond au temps d'acquisition d'u ne image en utilisant cette méthode. Cette échelle de temps est trop grande pour réaliser un grand nombre de mesu res pertinentes en biologie.

U ne autre technique de l'art antérieu r est divulguée dans l'article de Yen- Cheng Chen et al. (Chen, Y. C , Jablonski, A. E. , Issaeva, I . , Bou rassa, D. , Hsiang, J. C , Fah rni, C. J. , & Dickson, R. M. , 201 5, Optically Modulated Photoswitchable Fluorescent Proteins Yield Improved Biological Imaging Sensitivity, Journal of the American Chemical Society, 1 37(40), 1 2764-1 2767) qui propose une méthode de détection de fluorophore mettant en œuvre une excitation hétérodyne d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable par deux sou rces d'illumination laser monoch romes de longueurs d'onde d'excitation différentes. Cette technique propose un choix empirique des paramètres de mesure de la fluorescence d'une d'espèce, ce qui ne permet pas de transposer facilement ce type de mesure à d'autres espèces. De plus, le rapport signal sur bruit lors de la mesure d'une d'espèce fluorescente réversiblement photocommutable n 'est pas optimal . Enfin, la méthode divulguée n'indique pas à l 'homme du métier comment observer deux d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables en même temps.

Encore une autre technique de l'art antérieur permettant d'exploiter la dynamique temporelle d'une sonde réversiblement photoconvertible - qui lui est propre et est différente de celle de fluorophores interférents - pour extraire un signal utile du bruit de fond est connue sous le nom de OLI D, acronyme de «Optical Lock-ln Détection », c'est-à-dire « détection synchrone optique ». Elle est décrite dans l'article de G. Marriott et al. « Optical lock-in détection imaging microscopy for contrast-enhanced imaging in living cells », PNAS, vol. 1 05, n°46, pages 17789-1 7794 (1 8 novembre 2008), ainsi que dans l'article de Y. Yan et al. « Optical switch probes and optical lock-in détection (OLI D) imaging microscopy : high-contrast fluorescence imaging with living Systems », Biochem J (201 1 ), 41 1 - 422 et dans celui de C. Petchprayoon et al. "Rational design, synthesis, and characterization of highiy fluorescent optical switches for high-contrast optical lock-in détection (OLI D) imaging microscopy in living cells », Bioorganic & Médicinal Chemistry 1 9 (201 1 ), 1 030 - 1 040. Un inconvénient de cette technique est qu'elle ne fournit pas d'information quantitative sur la concentration du fluorophore réversiblement photoconvertible.

L'invention vise à remédier aux inconvénients précités de l'art antérieur, et plus particulièrement à :

• imager un échantillon en discriminant plusieurs fluorophores différents ; · permettre d'imager des fluorophores selon une technique permettant d'éliminer le bruit de diffusion/d'auto-fluorescence à haute fréquence ;

• d'une manière générale, imager sélectivement et quantitativement une ou plusieurs sondes fluorescentes dans un mélange. U n objet de l'i nvention permettant d'atteindre ce but, partiellement ou totalement, est un procédé de détection d'au moins une espèce fluorescente réversiblement photocommutable , comportant les étapes suivantes :

(a) éclairer un échantillon contenant ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable avec une première lumière d'éclairage, de longueur d'onde À _{l t} et modulée périodiquement à une pulsation ω et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde λ ₂ différente de À _{l t} modulée périodiquement à ladite pulsation ω ;

(b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit échantillon ainsi éclairé ; et

(c) extraire l 'amplitude de la composante de l'i ntensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même périodicité que ladite première lumière d'éclairage modulée périodiquement et en quadratu re de phase par rapport à elle ;

· ladite seconde lumière d'éclairage étant modulée en antiphase par rapport à ladite première lumière d'éclairage et

• l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage, l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclai rage, et leu r pulsation ω étant choisies de manière à s'approcher d'u n maximum de ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence. Par exemple, l'amplitude peut prendre une valeu r égale à au moins 75%, de préférence 80%, de manière encore préférée 90% du maximum.

Selon un mode de réalisation particulier d'un tel procédé, au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut présenter un premier et un deuxième état chimique, au moins un desdits états étant fluorescent, ladite ou chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable étant susceptible d'être convertie dudit premier état audit deuxième état par une première réaction photo-induite, puis de retou rner audit premier état par une seconde réaction photo-induite, et ladite première lumière d'éclairage peut présenter une intensité moyenne 7° et être modulée à une pulsation ω et ladite seconde lumière d'éclai rage présenter une intensité moyenne 7° avec :

( ^σ 12,1 + C? ^° 21,l) ⁼ ( ^σ 12,2 + σ·2ΐ .2 ) Ι·2 et

ω = 2 (σ ₁₂ , ι + σ ₂ ι , ι ) /? où σ _12<1 /° et σ _21<1 /° sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage ; et où σ _{12 2} / ₂ et σ _{21 2} / ₂ sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite seconde lumière d'éclairage.

Par ailleurs, l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage, l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage, et leur pulsation ω peuvent également être choisies de manière à assurer un contraste minimum entre ladite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence et l'amplitude d'une composante d'intensité de fluorescence, présentant la même périodicité, issue d'une espèce interférente.

Un autre objet de l'invention est un procédé de détection d'au moins deux espèces fluorescentes réversiblement photocommutables présentant des propriétés dynamiques différentes, comportant les étapes suivantes :

(a) éclairer un échantillon contenant chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable avec une première lumière d'éclairage de longueur d'onde λ ₁ et modulée périodiquement selon une première fonction sommant au moins deux premières composantes d'éclairage modulées par des pulsations ω,, chaque dite pulsation co, de chaque dite première composante d'éclairage étant associée à une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable, et étant différente de la ou des autres dites pulsations co, ; et éclairer avec une seconde lumière d'éclairage, de longueur d'onde λ ₂ différente de À _{l t} et modulée périodiquement selon une seconde fonction sommant au moins deux secondes composantes d'éclairage modulées par desdites pulsations ω,, chaque dite pulsation co, de chaque dite seconde composante d'éclairage étant égale à une dite pulsation co, d'une dite première composante d'éclairage ;

(b) détecter un rayonnement de fluorescence (FLU) émis par ledit échantillon ainsi éclairé ; (c) extraire chaque amplitude (algébrique) de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence présentant la même pulsation co, que chaque dite composante d'éclairage, et en quadrature de phase par rapport à chaque dite première composante d'éclairage ;

· pour chaque dite pulsation ω,, chaque dite seconde composante d'éclairage modulée par ladite pulsation co, étant en antiphase par rapport à chaque dite première composante d'éclairage modulée par ladite pulsation co, ; • et l'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclairage, l'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage, et lesdites pulsations étant choisies de manière à s'approcher d'un maximum de chaque dite amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence.

Selon des modes de réalisation particuliers d'un tel procédé :

Chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut présenter un premier et un deuxième état chimique, au moins un desdits états étant fluorescent, chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable étant susceptible d'être convertie dudit premier état audit deuxième état par une première réaction photo-induite, puis de retourner audit premier état par une seconde réaction photo-induite, et ladite première lumière d'éclairage peut présenter une intensité moyenne 7° et être modulée périodiquement selon une dite première fonction, et ladite seconde lumière d'éclairage peut présenter une intensité moyenne 7° avec pour chaque dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable :

( ΐ2,ι + σ ₂ ι ,ι ) Ι _γ = (σ ₁₂ ,2 + σ ₂ ι,2) où σ _12< ι7° et σ _21<1 7° sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage de ladite espèce ; et où σ ₁₂ , ₂ 7 ₂ et σ _{21 2} 7 ₂ sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite seconde lumière d'éclairage de ladite espèce.

Pour chaque dite pulsation o correspondant à une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable on peut avoir :

où σ ₁₂ ,ι/ι et a _{21 1} l sont, respectivement, les constantes cinétiques de ladite première et de ladite seconde réaction photo-induite par ladite première lumière d'éclairage de ladite espèce. Avantageusement, le rapport entre au moins deux dites pulsations co, peut être strictement supérieur à 1 0.

- Lors de ladite étape a), ledit échantillon peut être éclairé par au moins une lumière d'éclairage sensiblement monochromatique.

Lesdites étapes b) et c) peuvent être mises en œuvre par détection synchrone dudit rayonnement de fluorescence.

Le procédé peut comporter également l'étape suivante : d) déterminer la concentration de ladite ou d'au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors d'une dite étape c).

Ladite ou au moins une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut être choisie parmi : une protéine fluorescente photochrome ; et un complexe d'une biomolécule avec une sonde fluorogène.

L'échantillon peut comporter de la matière biologique.

Encore un autre objet de l'invention est un procédé d'imagerie à fluorescence (et notamment de microscopie à fluorescence) mettant en œuvre un tel procédé de détection. Dans ce cas, ledit échantillon peut comprendre un organisme vivant, et au moins un élément choisi parmi la présence et la concentration d'une dite espèce fluorescente réversiblement photocommutable peut être mesuré à partir de la composante de l'intensité dudit rayonnement de fluorescence extraite lors de ladite étape c) sans effectuer de prélèvement sur ledit organisme vivant.

- Une dite lumière d'éclairage peut comprendre une partie de la lumière du jour et ladite partie de la lumière du jour peut participer à l'intensité lumineuse reçue par ladite espèce fluorescente réversiblement photocommutable en restant inférieure ou égale aux intensités moyennes desdites lumières d'éclairage.

L'invention sera mieux comprise et d'autres avantages, détails et caractéristiques de celle-ci apparaîtront au cours de la description explicative qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés dans lesquels : la figure 1 illustre un procédé de détection d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P selon l'invention ; - la figure 2 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P dans le cas d'une réalisation appartenant à l'art antérieur ; la figure 3 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable dans une réalisation de l'invention ; la figure 4 illustre une réalisation de l'invention permettant d'imager plusieurs espèces fluorescentes réversiblement photocommutables lors de la même détection d'image ; la figure 5 illustre une simulation numérique correspondant à la quantification d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable en présence de composés interférents X ; la figure 6 est un graphique illustrant des propriétés photochimiques d'un ensemble d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables ; la figure 7 est un ensemble de photographies illustrant une comparaison expérimentale entre des réalisations de l'art antérieur et une réalisation de l'invention ; la figure 8 illustre une détection de l'image en fluorescence d'une cellule selon une réalisation de l'invention ; la figure 9 illustre un système mettant en œuvre un procédé selon un mode de réalisation de l'invention. La figure 1 illustre un procédé de détection d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P selon l 'invention. Le procédé comprend l'éclairage d'un échantillon E par u ne première lumière d'éclai rage FEX1 , de longueur d'onde λ ₁ et une seconde lumière d'éclairage FEX2, de longueur d'onde λ ₂ , différente de Chacu ne des lumières d'éclai rage FEX1 , FEX2 est de préférence sensiblement monochromatique, c'est-à-di re que son spectre présente un seul maximum d'intensité, et/ou une largeur spectrale inférieure ou égale à 50 nm. L'espèce fluorescente réversiblement photocommutable P présente deux états différents échangeables sous l 'action de la lumière. Il peut s'agir d'une espèce fluorescente photochrome, ou de tout autre système dont le comportement dynamique peut se rédui re à un échange entre deux états sous l'action de la lumière ; ces états peuvent correspondre à des configurations stéréochimiques différentes d'une molécule, à un état lié/non lié d'un complexe, etc. Sur la figure 1 , le premier état - thermodynamiquement plus stable - est indiqué par 1 et représenté par un carré plein ; le second état - thermodynamiquement moins stable - est indiqué par 2 et représenté par un carré creux. Ces deux états possèdent des brillances différentes. Dans un souci de simplicité, et à titre d'exemple non limitatif, on peut considérer que seul l'état 1 est fluorescent de manière significative.

L'échantillon E, et plus précisément l'espèce P qu'il contient, éclairé par une première lumière d'éclairage FEX1 et par une seconde lumière d'éclairage FEX2, émet un rayonnement de fluorescence FLU dont l'intensité est, elle-aussi, modulée et peut être décomposée en :

une composante en phase avec la première lumière d'éclairage FEX1 , indiquée sur la figure par l _F ' ⁿ ; et

une composante en quadrature avec le faisceau d'excitation, indiquée sur la figure par l _F ^0Ut . La demande de brevet WO 201 5075209 A1 divulgue l'intérêt et le fondement d'une observation de la composante l _F ^0Ut lors de l'observation d'espèces P. Le comportement dynamique d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P peut être décrit de la manière suivante. Sous l'illumination d'une espèce P par une lumière d'intensité /(t) comprenant deux composantes ^(t) et / ₂ (t), correspondant respectivement à une première lumière d'éclairage FEX1 , de longueur d'onde λ ₁ et à une seconde lumière d'éclairage FEX2, de longueur d'onde λ ₂ , le comportement dynamique de l 'espèce P peut être décrit par l'échange à deux états suivant : k ₁₂ (t)

1 ^ 2

f ^e 2l (i)

dans lequel l'état 1 , thermodynamiquement plus stable, est converti par une réaction photochimique en un état thermodynamiquement moins stable 2 avec une constante cinétique _e t peut retourner vers l'état initial 1 plus stable par un processus photochimique et/ou thermique avec une constante cinétique ^fc 2i(i) = v ₂ i,i (t) + a ₂ i,2h(t) + dans lesquels σΐ2,ι/ι (ί),

<7ΐ2,2 ^2(έ), o~2i,iIi (t), C i ,2h (t) représentent les contributions photochimiques et

^21 la contribution thermique aux constantes de vitesse, ^σ ΐ2,ι étant la section efficace de photoconversion de l'état 1 vers l'état 2 éclairée par la lumière FEX1 , ^σ ΐ2, étant la section efficace de photoconversion de l'état 1 vers l'état 2 éclairé par la lumière FEX2, ^σ 2ΐ,ι étant la section efficace de photoconversion de l'état 2 vers l'état 1 éclairée par la lumière FEX1 et ^σ 2ΐ, étant la section efficace de photoconversion de l'état 2 vers l'état 1 éclairée par la lumière FEX2. L'ensemble de ces constantes définissent le comportement de l'espèce P. Par hypothèse, le système est éclairé de manière uniforme ou peut être considéré comme homogène à tout temps. L'évolution des concentrations 1 (concentration en état 1 de l'espèce P) et 2 (concentration en état 2 de l'espèce P) peut alors être décrite par le système d'équations suivant : fil

k (t) 1 - k ₂ i (t) 2

dt

En considérant que l'échantillon E est éclairé soudainement par deux sources d'éclairage constant, respectivement de longueur d'onde λ ₁ et λ ₂ , l'éclairage est caractérisé par l'intensité -^) ⁼ + ' — 1° et les constantes cinétiques peuvent être écrites sous la forme :

k2l (t) = ^21 ⁼ ^21,1 + ^21,2 + ^21 · (5)

OÙ

En considérant que l'état initial ne contient que l'espèce 1 , les concentrations de 1 et 2 évoluent selon : ou

Tl2

f ^c 12 + ^fc 21 (1 1 ) correspond au temps de relaxation d'un fluorophore réversiblement photocommutable et 1° et 2° aux concentrations 1 et 2 à l'état photostationnaire atteint au temps τ° ₂ . On a également :

(12) ou : et la concentration totale en espèce P vaut P _tot = 1 + 2.

Il est possible d'analyser la réponse en émission fluorescente, ou rayonnement de fluorescence FLU d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P quand elle est soumise à deux lumières d'éclairage modulées périodiquement FEX1 , FEX2, correspondant à des réalisations de l'invention.

De manière générale, on peut considérer qu'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P est soumise à un éclairage comprenant deux composantes : un éclairage périodique ^(t) à la longueur d'onde λ ₁ et un éclairage / ₂ (t) à la longueur d'onde λ ₂ , qui peut être constant dans une réalisation différente de l'invention, ou modulé périodiquement dans l'ensemble des réalisations de l'invention. On peut écrire, dans le cas le plus général : avec j = 1 ou 2. Dans l'équation (36), a correspond à l'amplitude de la modulation lumineuse et h _j (t correspond à des fonctions périodiques. Les équations (4) et (5) deviennent ici : kn (t) = À ^' j .1 [1 + + k _{V2 2} [1 + aJ¾2 (i)] (37) et . (38)

En introduisant une fonction /(t), on peut développer l'expression des concentrations de la manière suivante :

et 1 _ 1° - af (£)_ (40 ) Le système d'équations différentielles gouvernant les évolutions temporelles des concentrations 1 et 2 peut être résolu avec les équations (2) et (3) pour obtenir : df (x

-/ (x) + [a , - b (x)] hi {x) + [ ₂ - b _z f (x)] h ₂ (x

(41 ) où :

(43) x = « (σΐ2. ι + ₂ ι ,ι ) /, r _{] 2} (44) 2 — Pl2^12,2 ^r 12 (45) β ₂ = « (^12,2 + σ ₂ 1,2) ₂ ^Τ 12 (46) et où

= H2 ¹ = ^ft 21 (47)

désignent respectivement la vitesse de la réaction correspondant à l 'équation (1 ) à l'état stationnaire (avec 1° et 2° donnés dans l 'équation (1 2)) et les différences des contributions relatives des moyennes des éclairages modulés (respectivement 7° et 7° ) aux constantes cinétiques menant respectivement de l'état 1 vers l'état 2 ou de l'état 2 vers l'état 1 . Après le temps de relaxation τ° ₂ , un régime permanent est établi, dans lequel f(x) est une fonction périodique continue. De manière plus générale, f(x) peut être une fonction périodique. Dans les différentes réalisations de l'invention, la modulation d'un éclairage FEX1 , FEX2 peut être réalisée par une pulsation fondamentale ω ou deux pulsations fondamentales (ω ₁ et ω ₂ ) ou au moins deux pulsations fondamentales, chacune des différentes pulsations fondamentales étant appelées dans ce cas par un terme générique ω _£ .

Dans un premier cas, la série de Fourier correspondant à f(x) peut être écrite sous la forme :

+00

f{0x) = a ⁰ + ^ [ ^{n, os} cos ( ^η θ ^χ ) + b ^n,sm sin ( ^η θ ^χ )]

n= i (50) où :

0 = <T?2. (51 ) et où a ^n,c et &" ^,sm désignent les amplitudes des n-ièmes composantes de la série de Fourier.

Dans le second cas, la série de Fourier correspondant à f(x) peut être écrite sous la forme : f (t¼x, θ ₂ χ) = a ⁰ + ∑ ∑ {« ⁿ ' ^m,cos + ιηθ ₂ ) x] + l>' ^m' ' ^sin sin [(ηθι + πιθ ₂ ) χ]} n=— o m=—co

(52) ou :

01 = ^ω 1 ^τ Γ2 , (53) θ = O ^J 2oTT?? ₂ (54) et où a ⁰ , _a ⁿ ' ^m ' ^cos et b ⁿ ' ^m ' ^sin correspondent aux amplitudes du 0-ième et des {n,m}- ièmes composantes de la série de Fourier. a ⁰ et/ou _a ⁿ ' ^m ' ^cos et/ou b ⁿ ' ^m ' ^sin peuvent être extraits de l'équation (41 ) en identifiant les composantes du même ordre.

L'ensemble d'équations obtenues peut être transformé de manière à expliciter les modulations de concentration pour toutes les pulsations. On peut alors écrire : +00

+

n=l (55)

+00

1 = i°-a [2 ⁿ ' ^sin sin (ηθχ) + 2 ⁿ ' ^cos cos (ηθχ

n—1 (56) ou

2° + αα°, (57) a (58)

.n.sin n.sm i i,sm

(59) n,cos cos n.cos

1 (60) ou bien

2 = 2° + «

(62)

OU

2" 2' + ÎIÎI 0

(63)

1°— αα° (64) Ί n,m,sin i.n,m,sin

n,m,cos , n.m,c05 „ 71, ^■ 771, ^■ cos

2 — 1 - ⁵ = (66)

On peut également exprimer l'intensité fluorescente. On définit, dans l'équation (67), l'observable O _j correspondant à l'observation à la longueur d'onde A _y - avec j = 1 ou 2 :

Oj{t) = Q ₃ l(t) + Q _2j 2(t) ₍₆₇₎ soit, en extrayant l'émission en fluorescence I _f (t) dans l'équation (68) :

hit) = Οι (ί)7ι(ΐ) + 0 ₂ {t)h {t). (68)

On a, avec la dépendance temporelle donnée par les équations (55) et (56) :

oo

O _j (t) = O? -∑ D† ^sin sin (ηθχ) + D ^cos cos (ηθζ

n—1 (69) avec

et

~n,sm _n \ , ~,n,cos

sm [ηθχ) + cos (nra

n=l (73)

Alors que les expressions des amplitudes des termes O _j t) sont génériques, les expressions des amplitudes des termes / _F (t) varient avec les dépendances temporelles de l'éclairage.

On a, avec les dépendances temporelles de 1 (t) et de 2(t) données par les équations (61 ) et (62) :

-oo +00

Oj (*) = Of + ∑ ∑ {û"' ^m ' ^sin sin [( ^η θι + m$ ₂ ) x] + D* ^>m - ^(es cos [{ni?! + m» ) } n=— oo m=— oo

(74) avec :

Of = Qijl ⁰ + Q ₂ j ° + (¾j - Qij) αο' (75) (76) ^n,m,cos _ n,ra,cos

v - 2,j - Qi ) aa ₍₇₇₎ et

+∞ +00

I _F (t) = 3 + ∑ ∑ { ¾ ^m,fiin sin [(nût + m¾ ) ] + ¾'" ^, ' ^os cos [(«0χ + m<¾ ) x]} .

—

(78) dans lesquelles, de la même manière, les expressions des amplitudes des termes O _j t) sont génériques, les expressions des amplitudes des termes / _F (t) varient avec les dépendances temporelles de l'éclairage.

Les inventeurs ont, dans un premier temps, considérés des cas dans lesquels les modulations des deux amplitudes d'éclairage sont faibles, et notées ε à la place de a par la suite. Ce cas permet de linéariser les équations et de dériver des expressions analytiques.

Dans des réalisations appartenant à l'art antérieur, on réalise des modulations sinusoïdales de l'un des deux éclairages, par exemple l'éclairage FEX1 à la longueur d'onde λ ₁ oscillant autour d'une intensité moyenne 7° à la pulsation ω et avec une faible amplitude ε7° (ε « 1) sur lequel on superpose un éclairage d'intensité constante 7° à une longueur d'onde λ ₂ . On a alors :

lit) ⁼ I [1 ^~ l ^~ s in (WÎ)] -t~ 1^1 (79) hi (t) = sin (ut) ₍₈₀ ) h ₂ (t) = 0. (81 )

En développant au premier ordre l'expression de la perturbation lumineuse, l'équation (41 ) devient :

= -f (ex) + *jn{Bx)

dx (82)

Après le temps de relaxation τ° ₂ donné dans l'équation (1 1 ), on peut dériver

2° = 2° (83) (84)

(85)

(86) et :

3$ - (Q ₁ , ₁ 1 ⁰ + Q2 _! I 2 ⁰ ) / ₁ ⁰ + (QI _J2 1 ⁰ + Q2 _! 22 ⁰ ) / ₂ ⁰

(87)

¾ ^sm = ^ε { + ¾i2°) I? + - Q ₂ ,i) + (Qia - Qi ) i?] i ¹ '^}

(88)

En utilisant deux longueurs d'ondes différentes, les échanges entre les états 1 et 2 sont essentiellement gouvernés par les contributions photochimiques en choisissant les intensités moyennes (7°, 7°) de manière à ce

La figure 2 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P dans le cas d'une réalisation appartenant à l'art antérieur. Le diagramme de la figure 2 illustre la valeur de l'amplitude normalisée des oscillations en quadrature de phase pour une concentration 1 ( en fonction des paramètres de contrôle 72 /7° et ω/7° . Ce cas correspond à un éclairage FEX1 à la longueur d'onde λ ₁ oscillant autour d'une intensité moyenne 7° à la pulsation ω et avec une faible amplitude ε7° (ε « 1) auquel on superpose un éclairage constant d'intensité 7° à une longueur d'onde λ ₂ . L'espèce fluorescente réversiblement photocommutable P considérée est « Dronpa-2 » , dont les inventeurs ont mesuré les paramètres cinétiques, correspondant à σ _{12 1} = 1 96 m ² . mol ^"1 , σ _{21 1} = 0 m ² . mol ^"1 , σ _12<2 = 0 m ² . mol ^"1 , σ _21<2 = 41 3 m ² . mol ^"1 et /c ₂₁ =

1 ,4.1 0 ^"2 s ^"1 et avec .

Dans ce cas, l-Hiotm l présente un maximum singulier quand les deux conditions de résonance suivantes sont remplies :

+ 0

Cette optimisation résulte d'une optimisation indépendante des termes ^α ι et ^ t ¹ + ^ ² ] de l'équation (86). °i correspond à la variation Δ2 ⁰ d _u régime stationnaire 2° après un saut d'amplitude ^ΔΙ ? ^{= εΙ} ι . Il est maximisé quand les constantes cinétiques des réactions photochimiques induites par les deux éclai rages sont égales. Le second terme optimisé, ^ E ¹ + ² ], est maximisé en ajustant la pulsation ω au temps de relaxation τ° ₂ de manière à avoir 9 = 1. Quand ·- ^{' 1} / ^r i2, l'échange est lent par rapport aux variations de l'éclairage et le couple {1 ,2} n'a pas assez de temps pour répondre, de manière à faire disparaître les termes i ^1,sin et i ^1,cos . A l'opposé, quand ^ω « ^l / ^r i2 , i ^1>cos s'annule, et les concentrations 1 et 2 oscillent en phase avec la modulation de l'éclairage. De manière plus générale et dans l'ensemble des réalisations de l'invention, l 'intensité moyenne de ladite première lumière d'éclai rage (FEX1 ), l 'intensité moyenne de ladite seconde lumière d'éclairage (FEX2), et leur pulsation ω sont choisies de manière à maximiser l 'amplitude de la composante d'intensité dudit rayonnement de fluorescence (FLU) en quadrature de phase par rapport à la première lumière d'éclairage.

Dans des réalisations de l'i nvention , on module les deux lumières d'éclairage FEX1 , FEX2 de manière sinusoïdale (ou plus généralement périodiquement), à la même pulsation ω. Les inventeurs ont découvert la possibilité d'augmenter l'amplitude au premier ordre de la réponse aux modulations d'éclairage d'une espèce P par rapport au cas dans lequel la seconde lumière d'éclairage excite une espèce P avec une intensité constante. On considère, à titre d'exemple, qu ' 7(t) comprend une superposition de deux modulations sinusoïdales de faibles amplitudes : d'une part, à la longueur d'onde λ ₁ autour de l'i ntensité moyenne 7° et à la pulsation ω et d'autre part, à la longueur d'onde λ ₂ autour de l'intensité moyenne 7° et à la pulsation ω. On considère :

J(t) = i? [1 + £*! (*)] + # [1 + eh ₂ (t)}

(92) I) i (t) = sin ( t)

(93) h>2(t) = sin (e t + φ) (94) avec ε « 1.

En développant au premier ordre la pertu rbation de l'éclai rage, f(x) = h{0x) + Ϊ {θ ^χ ) _{est u ne} solution de l'équation (41 ) quand Λ (^) et Μθχ) sont des solutions de l 'équation (95) suivante : avec respectivement j = 1 ou 2. On peut remarquer que cette équation est similaire à l 'équation (82). Après le temps de relaxation τ° ₂ donné dans l'équation (1 1 ), on peut dériver :

(96)

-° = 1° (97)

, 1,S1I1 , 1,S1I1 a, a ₂ (cos ψ + Θ sin φ)

l + θ ^{2 +} 1 + θ ² , (98)

,l,COS l,COS a ⁾ a ₂ (sin φ— Θ cos φ)

1 + Θ ² + 1 + Θ ² (gg)

Pou r des espèces P utilisées dans des réalisations de l'invention, de manière non limitative, la transition induite par effet photochimique de l'état 1 à l'état 2 (respectivement de l 'état 2 à l'état 1 ) est gouvernée exclusivement par un éclairage à la longueur d'onde λ ₁ (respectivement λ ₂ ). En considérant que la constante cinétique de réaction de l'état 2 à l'état 1 est principalement gouvernée par la photochimie, on peut déduire que ^α ι ^{= ~~ a} i. Les équations 98 et 99 deviennent :

₂ ⁱ ,sm _ _ ₁ ⁱ ,sm _ [(1— cos ψ)— Θ sin ψ]

1 ^~ F Θ (100) i,cos ₌ _ ₁ i,cos ₌ <¾_ Ιβ M _ _{œs φ} \ _{+ sin ψ} λ

l + θ ^{2 1 V Ψ) Ψ1} (101)

Les équations (100) et (101) montrent que φ = π est typiquement favorable pour augmenter les amplitudes de la réponse en fluorescence. Les équations (100) et (101) deviennent alors :

I .S 11 )

1 + Θ ² (102)

. l.COS , l.COS 2 )

i ^■ o- (103) et les termes des intensités en fluorescence sont :

¾ = + <¾i2°) Ii + (QL21° + <¾22°) I2 ( ₁₀₄ ) +

ε { [(Qi,i - Q21) Il + (Qi,2 - Q2.2) 4] i ^1,sm }

(105)

¾ 5 ^∞S l - ¹ - ¹ ' · (106)

En particulier, les inventeurs ont découvert que la variation d'éclairage correspondant à l'équation (92) avec φ = π produit qualitativement les mêmes

i.COS

résultats pour ï par rapport à une excitation lumineuse gouvernée par l'équation (79) mais avec une amplitude qui, en théorie, est deux fois plus grande. Cette augmentation de l'amplitude permet de résoudre plusieurs problèmes techniques posés par l'art antérieur, en imageant de manière sélective une espèce P, obéissant aux conditions de résonance données par les équations (90) et (91), avec une plus grande résolution temporelle et un rapport signal sur bruit plus grand. De manière plus générale, dans l'ensemble des réalisations de l'invention dans lesquelles une première lumière d'éclairage FEX1 est modulée périodiquement à une pulsation ω et une seconde lumière d'éclairage FEX2 est modulée périodiquement à la même pulsation ω, la seconde lumière d'éclairage FEX2 est modulée en antiphase, c'est-à-dire à φ = π par rapport à la première lumière d'éclairage FEX1 .

La figure 3 illustre un diagramme présentant un calcul théorique de la réponse d'une espèce fluorescente réversiblement photocommutable P dans une réalisation de l'invention. Le diagramme de la figure 3 illustre la valeur de l'amplitude normalisée des oscillations en quadrature de phase pour une concentration 1 ( _e n fonction des paramètres de contrôle et ω//°. Ce cas correspond à un éclairage FEX1 à la longueur d'onde λ ₁ oscillant autour d'une intensité moyenne 7° à la pulsation ω et avec une faible amplitude ε7° (ε « 1) auquel on superpose un éclairage FEX2 à la longueur d'onde λ ₂ oscillant autour d'une intensité moyenne 7° à la pulsation ω et avec une faible amplitude ε7° (ε « 1). Les autres paramètres sont similaires aux paramètres utilisés dans la réalisation correspondant à la figure 2. Dans ce cas,

|inotm | présente un maximum singulier quand les deux conditions de résonance, correspondant à l'équation (90) et (91 ), sont remplies, comme dans la réalisation illustrée en figure 2, mais dont la norme est sensiblement deux fois plus grande, se traduisant par une augmentation d'un facteur 4 du rapport signal sur bruit. Le rapport signal sur bruit pourra être considéré comme un rapport signal sur interférences (SI R).

La figure 4 illustre une réalisation de l'invention permettant d'imager plusieurs espèces fluorescentes réversiblement photocommutables lors de la même détection d'image. Dans cette réalisation de l'invention, une première lumière d'éclairage FEX1 de longueur d'onde λ ₁ est modulée périodiquement selon une première fonction sommant au moins deux premières composantes d'éclairage modulées par des pulsations ω,, les pulsations étant différentes les unes des autres. Dans l'exemple non limitatif illustré dans la figure 4, la première lumière d'éclairage FEX1 est modulée par une fonction sommant une composante de pulsation OH et une composante de pulsation co _2. Chacune des pulsations co, est associée, ou correspond, à une espèce fluorescente réversiblement photocommutable de l'échantillon E imagé. Dans le cas illustré en figure 4, la pulsation OH correspond à l'espèce P représentée par un carré plein et un carré vide, et la pulsation co ₂ correspond à l'espèce P' représentée par un hexagone plein et un hexagone vide. L'espèce P" représentée par un rond ne correspond à aucune pulsation particulière. L'échantillon est également éclairé avec une seconde lumière d'éclairage FEX2 de longueur d'onde λ ₂ , modulée périodiquement selon une seconde fonction sommant au moins deux premières composantes d'éclairage modulées par les mêmes pulsations ω,, c'est-à-dire dans le cas non limitatif de la figure 4, par les pulsations OH et co _2.

Analytiquement, on peut considérer, de manière non limitative, que l'intensité 7(t) de l'éclairage est une superposition de deux modulations sinusoïdales de petites amplitudes, aux pulsations OH et co ₂ , oscillant autour d'une intensité moyenne 7° à la longueur d'onde λ ₁ et autour d'une intensité moyenne 7° à la longueur d'onde λ ₂ . Dans d'autres réalisations de l'invention, les modulations peuvent être périodiques, de différentes formes, et de plus larges amplitudes. On considère : (ί) = I _l [1 + c/i] (t)] -f 12 ⁽ [1 -f 6Ïl2 (*)] (-) 21 ) ht(t) = sin (ωιί) + β αίιι (ω ₂ ί) _{( 1 2} 2) h ₂ (t) = - sin (ωιί) - β sin (ω ₂ ί) (1 23)

avec ε « 1. Dans ce cas, -^ι I ¹ + correspond à une première fonction et Ι·2 [1 + e/i2(t)])rrespond à une seconde fonction.

En développant au premier ordre les perturbations de l'éclairage, f( ^x ) = /i (6>i^) + /3/ ₂ (0 ₂ ^)est une solution de l'équation (41 ) quand Ιι (θιχ)βΙ f'Â&ix) sont solutions de l'équation (1 24) suivante : Μ < ₌ - ¾ (^) ₊ ( _αι - α ₂ ) 8ίη(^· )

dx ^{J J} (1 24) avec respectivement j = 1 ou 2. A rès le temps de relaxation τ° ₂ , on peut dériver :

= 1 o (126) sxn _ i,o. sm

1 + 0? (127)

.0,1, cos ^0,1, co (a.i - a ₂ ) é

(130)

Les équations (127) à (130) mènent à :

-χ,ο,ώη

(131)

l + farg,) ² (l + ¾) ² 1+( _ωι τ¾) ² "

132)

₂ o,x, ₈ in

(134) et les termes associés des émissions en fluorescence oscillantes sont :

¾ = (Qi.ii ⁰ + Q¾i2°) i? + (Qi, ₂ i° + Q ₂ , ₂ 2°) il ₍₁₃₅₎

¾°' ^sin = e { (Qi,il° + <¾.i2°) Iï ^" (Qi,2-° + ¾ ₂ 2°) ^} +

e { [(Qi,i - Q2,i) i? + (Qi,2 - Q ₂ , ₂ ) II] i ^win } ₍₁₃₆₎

3j ^1,sin = εβ { (Q _1:l l° + Q _2iI 2 ⁰ ) /? - (Q _li2 l° + ¾ ₂ 2») /»} +

= {[(¾y-¾i)Jj ^l + «3y- ⁽ ¾i)Îli ^w *} _{3t (138)}

Dans cette réalisation de l'invention, la réponse en fluorescence de l'échantillon E à la superposition de deux modulations en antiphase de faibles amplitudes à deux différentes pulsations OH et co ₂ permet d'utiliser les réalisations de l'invention correspondant aux figures 1 et 3 pour détecter simultanément et sélectivement deux espèces P' et P". Avantageusement, les espèces photocommutables partagent des conditions de résonance identiques en intensité d'éclairage 7° et 7°, correspondant à l'équation (90). Avantageusement, chacune des espèces photocommutables est associée aux pulsations OH et ω ₂ telles que définies dans l'équation (91 ), et correspondant aux pulsations de résonance de chacune des espèces P' et P". En particulier, les expressions de fluorescence dérivées dans les équations (1 36) et (1 37) sont similaires à l'équation (1 07), mais avec une amplitude deux fois plus grande dans le cas particulier de cette réalisation de l'invention dans laquelle o, = _Zi permettant une détection sélective et simultanée de deux espèces P' et P" distinctes. Avantageusement, les modulations périodiques appliquées aux intensités de la première lumière d'éclairage FEX1 et de la seconde lumière d'éclairage FEX2 ne sont pas faibles devant l 'intensité moyenne de ses lumières d'éclairage. Elles peuvent être par exemple du même ordre de grandeur. Dans le cas de modulations périodiques de larges amplitudes des intensités des lumières d'éclairage FEX1 , FEX2, c'est à dire dans le cas où a < 1, les inventeu rs ont découvert que les conditions décrites précédemment restent valides. Ces validations ont été réalisées en calculant numériquement les différents ordres de séries de Fou rier tronquées dont les fonctions correspondantes ont été linéarisées dans les cas précédents considérant de faibles amplitudes de modulation d'intensité.

Les flèches de la figure 4 illustrent différentes images I m obtenues après post-traitement du signal d'intensité I F ^ouî . Ces images I m peuvent être obtenues par démodulation du signal acquis associée à la pulsation co, correspondant à l'espèce réversiblement photocommutable d'intérêt.

La figu re 5 illustre une simulation numérique correspondant à la quantification d'une espèce P en présence de composés interférents X. En l'absence d'information su r les différentes espèces fluorescentes présentes dans un échantillon, on peut optimiser la réponse du premier ordre en quadrature de phase en fluorescence l _F ^0Ut en choisissant un triplet (7°, 7_ ^ω ) qui vérifie les conditions de résonance données dans les équations (90) et (91 ), de manière à imager sélectivement et quantitativement une espèce P parmi des espèces es par l'ensemble de paramètres _de concentration totale X _tot . Une espèce X peut dans ce cas ne pas être photocommutable, ce cas correspondant aux paramètres σ _{12 ίιΧ} = σ _{21 ίιΧ} = 0 (pour i = 1 ou 2) et k _{2X X} = 0. La figure 5 illustre le cas d'un mélange d'espèces fluorophores réversiblement commutables P, dont seulement l'état 1 émet en fluorescence, caractérisés par la même brillance

Dans ce cas, un protocole consistant à illuminer à des intensités constantes 7° donne un signal 7° proportionnel à la somme des contributions des différents fluorophores, tel que : )0

1% oc l + Ιχ - (lp/Ptot)Ptt<i,tration

X (223) ou :

X \ p/ ^r tot, _ (224)

Quand le signal 7° est utilisé pour titrer des espèces P, le résultat de la titration surestime la concentration totale P _to t en raison des contributions des espèces interférentes. En revanche, la réponse du premier ordre en quadrature de phase à l'éclairage ^J ï peut s'exprimer :

«l,COS i l ,COS , \ l .COS -| l ,COS / p \ p l .COS

^J ,v ^{i; L} P ' A ^" — lp / rtot) titration

X (225) ou pl ,cos _ p

titration ^{~ r} o T

xp / -Ptot (226) et permet de déterminer P _to t quand le triplet de paramètres (7°, 7°, ω) est ajusté dans les conditions de résonance pour une espèce P. En effet, le terme l _p ^C0S est maximum alors que les termes l] ^os sont négligeables. Le signal issu de l'espèce P est prédominant par rapport à celui des autres espèces interférentes, et le résultat de titration Parution ^est approximativement égal à P _tot .

Le panneau A de la figure 5 illustre une simulation numérique des amplitudes normalisées l°/lp (illustrées par des disques gris) et des amplitudes normalisées de i_ ^i<cos /i_ ^i<cos (illustrées par des carrés noirs) pour quatre mélanges équimolaires incluant l'espèce cible caractérisée par le quintuplet ( σ 12,1 , σ ₂ ι ,ι , σ ι ₂ ,2, σ 2i ,2,k2i ^A ) et seize autres espèces interférentes. Dans chaque échantillon marqué n, ces espèces interférentes correspondent aux seize quintuplets ( σ _2, ι _, χ, σ ₂ ι _, ι _, χ, σ ₂ ,2 _, x, σ ₂ i ,2 _, x,k ₂ i ^A ), dont les quatre paramètres photochimiques diffèrent par n ordres de grandeur de ( σ ^ 2^ , σ ₂ ι _, ι , σ ι _2,2 , σ ₂ -ι _,2 ).

La figure 6 illustre des propriétés photochimiques d'un ensemble d'espèces fluorescentes réversiblement photocommutables. Pou r chacune des espèces considérées, les conditions de résonance selon les équations (90) et (91 ) ont été mesurées et sont illustrées par des courbes iso-valeur absolue de l'amplitude normalisée de la réponse en quadrature de phase en fluorescence du premier ordre. La cou rbe (a) correspond à l 'espèce « Dronpa » , la courbe (b) correspond à l'espèce « Dronpa-2 » , la courbe (c) correspond à l'espèce « Dronpa-3 » , la courbe (d) correspond à l'espèce « RS-FastLime » , la courbe (e) correspond à l'espèce « Padron » , la cou rbe (f) correspond à l'espèce « Kohinoor » , la cou rbe (g) correspond à l'espèce « rsEFG P » et la courbe (h) correspond à l'espèce « rsEFG P2 » .

Dans l'une des réalisations de l 'invention, on éclai re l'échantillon E avec deux lumières d'éclai rage de longueu rs d'onde différentes, et on module périodiquement chacune des lumières d'éclai rage, pou r imager plusieurs espèces réversiblement photocommutables sélectivement, com me illustré dans la figu re 4, le triplet Ι°, ΐ , ω étant choisi pou r chacune des espèces de manière à maximiser la composante I F ^ouî du rayonnement de fluorescence.

Dans une réalisation particulière de l 'invention, on se place dans les conditions de résonances imposées par les deux i ntensités moyen nes des lumières d'éclairage, c'est-à-dire selon la relation

(σΐ2,ι + σ ₂ ι,ι) I? = (σ _12>2 + σ ₂₁ , ₂ ) 1% Graphiquement, cette solution consiste à imager deux espèces réversiblement photocommutables dont les conditions de résonance peuvent être illustrées par des points sensiblement proches de la même droite verticale sur la figure 6.

U ne variante de l'i nvention consiste à se placer dans ces conditions et de choisir deux fréquences ω ₁ et ω ₂ (dans le cas d'une détection de deux espèces P' et P") vérifiant les conditions de résonances de chacune des espèces. Autrement dit, chaque pulsation ω vérifie la condition ^{ω =} ^ ( ^σ ΐ2,ι + ^σ 2ΐ,ι) - Cette réalisation permet de maximiser l'amplitude de chaque réponse du premier ordre en quadrature de phase en fluorescence l _F ^0Ut . U ne autre variante de l 'i nvention consiste à se placer dans les conditions vérifiant la relation ( ^σ ΐ2,ι + ^σ 2ΐ,ι) J ^" ? = (<¾2 + σ ₂ ι, ₂ ) J ₂ ° _{(t de} choisir deux pulsations de modulation des lumières d'éclairage, chacu ne associée à une espèce réversiblement photocommutable, dont le rapport est, par exemple, strictement supérieur à 1 0, préférentiellement à 1 00. En effet, quand la relation (90) est vérifiée, le rapport des pulsations de résonance propre à deux espèces P' et P" peut être faible, par exemple inférieu r à 1 0. Dans ce cas, en se plaçant dans des conditions vérifiant la relation (91 ), on maxi mise l'amplitude l _F ^0Ut correspondant à chaque espèce, mais la contribution des interférences d'une amplitude associée à une espèce sur l'autre empêche d'obteni r un contraste optimal d'une espèce vis-à-vis de l'autre. On peut, dans cette variante, utiliser la relation (1 06) pour choisir des pulsations de modulation des lumières d'éclai rage FEX1 , FEX2 de manière à imposer un rapport entre les pulsations supérieur à une valeur prédéfinie, par exemple 1 0, pou r augmenter le contraste. D'une manière plus générale, il est possible de s'écarter du maximum d'amplitude du signal de fluorescence afin d'augmenter le contraste par rapport à une ou plusieurs espèces interférentes. On peut par exemple maximiser l'amplitude de la fluorescence sous contrainte d'assurer un contraste minimum, maximiser le contraste sous réserve d'assurer une amplitude minimale (exprimée généralement en pou rcentage du maximum d'amplitude), voire déterminer une région de l'espace de paramètres (co/ , /l ₂ ) assu rant à la fois une amplitude suffisamment importante et un contraste suffisamment élevé. De même, dans le cas où l'on vise la détection d'une seule espèce fluorescente, il peut être avantageux de s'écarter des conditions de résonance pou r améliorer le contraste avec la fluorescence d'espèces interférentes, aux prix d'une diminution de l 'amplitude du signal. Le plus souvent, néanmoins, on choisi ra des conditions d'illumination assu rant une amplitude du signal égale à au moi ns 75%, de préférence 80% et de manière encore préférée 90% du maximum atteignable.

La figu re 7 est un ensemble de photographies illustrant une comparaison expérimentale entre des réalisations de l 'art antérieur et une réalisation de l'invention .

Le panneau A de la figu re 7 est une photographie illustrant des noyaux cellulai res, marqués par une espèce P. La photographie est réalisée, selon une méthode de l'art antérieur, en imageant le signal I F ^ouî avec une première lumière d'éclairage de longueur d'onde λ ₁ = 480 nm modulée périodiquement, et avec une seconde lumière d'éclai rage de longueur d'onde λ ₂ = 405 nm, d'intensité constante. Le panneau B de la figu re 7 est une photographie illustrant les mêmes noyaux cellulaires, marqués par la même espèce P. La photographie est réalisée, selon une méthode de l'art antérieur, en imageant le signal I F ^ouî avec une première lumière d'éclai rage de longueur d'onde λ ₁ = 480 nm d'i ntensité constante, et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde λ ₂ = 405 nm modulée périodiquement.

Le panneau C de la figure 7 est une photographie illustrant les mêmes noyaux cellulaires, marqués par la même espèce P. La photographie est réalisée, selon une méthode réalisation de l 'invention , en imageant le signal I F ^OUÎ avec une première lumière d'éclai rage de longueu r d'onde λ ₁ = 480 nm modulée périodiquement, et avec une seconde lumière d'éclairage de longueur d'onde λ ₂ = 405 nm modulée à la même période et en antiphase.

Dans le panneau A de la figure 7, les intensités sont multipliées par deux. Dans le panneau B de la figure 7, les intensités sont multipliées par -2. Les pics d'intensité sont sensiblement égaux dans l 'ensemble des pan neaux de la figure, illustrant l'augmentation du signal, décrite en figu re 3, lors d'une réalisation mettant en œuvre deux éclairages, modulés périodiquement en antiphase comparativement à un éclairage modulé périodiquement, ou à un éclai rage modulé périodiquement et un second éclai rage à éclairage constant. L'amplitude I F ^ouî mesu rée, dans des réalisations de l 'art antérieur et/ou dans des réalisations de l'invention est algébrique : on peut discriminer des l _F ^0Ut mesurés par leurs valeurs absolues et/ou par leurs signes.

La figu re 8 illustre une détection de l'image en fluorescence d'une cellule selon une réalisation de l 'invention. Dans cet exemple, le noyau de la cellule est marqué par une espèce P, en l 'occu rrence « Dronpa-2 » . Les mitochondries de la cellule sont marquées par une autre espèce P' « Padron » . L'espèce P' « Padron » est caractérisée par un état 1 sombre et un état 2 fluorescent. Dans cet exemple, deux pulsations de modulation sont fixées. On impose un rapport de 1 00 entre les deux pulsations de modulation. Une première pulsation, n-i ₀ o<¾(D - 2) est associée à l'espèce P' « Dronpa-2 » ; cette pulsation est supérieure à la pulsation de résonance de « Dronpa-2 » . Une seconde pulsation, ω(Ραάτοή), est associées à l'espèce P"« Padron » ; cette pulsation est inférieu re à la pulsation de résonance de « Padron » . Les légendes « Padron » et « D-2 » à gauche des images indiquent respectivement une démodulation du signal de fluorescence aux pulsations associée à « Padron » et à « Dronpa-2 » . Les légendes « P » et « N » à droite des images indiquent respectivement que l'amplitude représentée de I F ^ouî est de signe positif (P) ou négatif (N).

La colonne de gauche de la figu re 8 illustre des images obtenues selon une réalisation de l'invention, en éclai rant avec deux lumières d'éclairage de longueurs d'onde différentes modulées en antiphase, à la pulsation η^ ₀ ω(Ω - 2). On observe de manière significative le noyau de la cellule, correspondant à une amplitude positive de l _F ^0Ut et à une démodulation à la pulsation correspondant à D-2. La colonne du milieu de la figure 8 illustre des i mages obtenues selon une réalisation de l'invention, en éclairant avec deux lumières d'éclairage FEX1 , FEX2 de longueurs d'onde différentes modulées en antiphase, à la pulsation ω(Ραάνοη). On observe de manière significative les mitochondries de la cellule, correspondant à une amplitude négative de I F et à une démodulation à la pulsation correspondant à Padron.

La colonne de droite de la figure 8 illustre des images obtenues selon une réalisation de l'invention, en éclairant deux lumières d'éclairage FEX1 , FEX2 de longueurs d'onde différentes, et modulées par des composantes aux pulsations n ₀ o<¾(D - 2) et ω(Ραάτοή), chaque composante de la seconde lumière d'éclairage FEX2 étant en antiphase de la composante correspondante de la première lumière d'éclairage FEX1 . On observe de manière significative à la fois le noyau de la cellule, correspondant à une amplitude positive de I F ^ouî et à une démodulation à la pulsation correspondant à D-2 et les mitochondries de la cellule, correspondant à une amplitude négative de l _F ^0Ut et à une démodulation à la pulsation correspondant à Padron. La figure 9 illustre un système mettant en œuvre un procédé selon un mode de réalisation de l'invention. Ce système, illustré à titre d'exemple non limitatif, comprend deux sources de lumière SLM1 et SLM2 constituées chacune d'une diode électroluminescente. La source de lumière SLM1 est alimentée par une source d'alimentation AM 1 et la source de lumière SLM2 est alimentée par une source d'alimentation AM2. La modulation de chacune des sources lumineuses SLM 1 et SLM2 est obtenue par modulation de la puissance électrique d'alimentation respective au moyen d'un générateur de fonctions GF présentant deux sorties indépendantes. L'émission des diodes électroluminescentes étant à bande large, les faisceaux FEX1 et FEX2, émis par SLM 1 et SLM2 respectivement, sont collimatés par des lentilles, puis filtrés par deux filtres optiques avant d'être dirigés sur un échantillon, constitué par un dispositif microfluidique DMF ; dans un souci de simplicité, les filtres optiques ne sont pas représentés sur la figure. L'échantillon éclairé est observé, par sa face arrière, par un objectif OBJ qui collecte le rayonnement en fluorescence et le focalise en un faisceau FLU. Ce dernier est filtré (filtre F2) et dirigé, par un miroir M et une lentille LF, sur le capteur d'une caméra CAM. Un ordinateur comprend un processeur PR pilotant la caméra CAM de manière à détecter en quadrature de phase telle que décrit précédemment. Avantageusement, la fréquence d'acquisition de la caméra est commensurable de la fréquence de modulation des sources FEX1 , FEX2. Pour réaliser une détection et/ou un titrage simples, sans imagerie, la caméra CAM peut être remplacée par un capteur ponctuel de lumière.